JP3720458B2 - 分析装置 - Google Patents
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清等の試料を分析検査する時に用いられる分析方法に係り、特に試料中の被分析成分を免疫学的な方法により定量分析する分析方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
血清等の試料を分析検査する方法の1つとして、試料中の被分析成分を免疫学的な方法により定量分析する方法が従来から知られている。この種の分析方法は試料中の被分析成分と免疫反応を生ずる抗原または抗体を例えばガラスビーズや磁性粒子に固定化した不溶性の担体を用い、この担体を透明な容器(以下、「反応容器」と称する。)に第1の試薬として添加して試料中の被分析成分と反応させ、次いで担体を洗浄液で洗浄して被分析成分を除いた不要成分を反応容器内から除去した後、被分析成分と免疫反応を生ずる標識用蛍光物質を反応容器に第2の試薬として添加し、被分析成分と反応した標識用蛍光物質の蛍光強度を測定して被分析成分を定量分析する方法であり、標識用蛍光物質としては、被分析成分と免疫反応を生ずる抗原または抗体を蛍光物質に固定化したものが用いられる。
【0003】
ところで、このような分析方法は標識用蛍光物質を励起させる励起光を反応容器に照射すると、被分析成分と反応した標識用蛍光物質のみから蛍光が発せられるばかりでなく、例えば反応容器内を浮遊するゴミ等の浮遊物や反応容器からも自家蛍光が発せられるため、測定値に誤差が生じ易いという問題がある。
【0004】
そこで、ゴミ等の浮遊物や反応容器から発せられた自家蛍光による影響を低減するために、励起光を照射してから所定時間後に標識用蛍光物質の蛍光強度を測定するようにした分析方法が提案されている(特開平3−221837号参照)。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
このような分析方法によると、ゴミ等の浮遊物や反応容器から発せられた蛍光は標識用蛍光物質から発せられた蛍光に比較して比較的短時間のうちに減衰してしまうため、ゴミ等の浮遊物や反応容器から発せられた自家蛍光による影響を低減することができるが、励起光を発生する光源の輝度変化や光検出器の感度変化などに起因する誤差を低減することが困難であった。
【0006】
本発明は上記のような点に鑑みてなされたもので、その目的は励起光を発生する光源の輝度変化や光検出器の感度変化等に起因する誤差を低減でき、試料中の被分析成分を正確に定量分析することのできる免疫学的分析方法を提供せんとするものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、請求項1に係る発明は、被分析成分と標識用蛍光物質と反応させる第一の収容体と、標準蛍光物質を収容した第二の収容体と、これら第一及び第二の収容体に励起光を照射するための光源と、上記第一の収容体に収容された標識用蛍光物質と第二の収容体に収容された標準蛍光物質の、上記励起光により選択的に励起される蛍光強度を測定する測定手段と、上記第一の収容体と測定手段との間を光学的に連結する第一の光路と、上記第二の収容体と測定手段との間を光学的に連結するよう、上記第一の光路に合流する第二の光路と、上記第二の光路内に配置され、蛍光物質が発する蛍光のみを選択的に透過させる第一のフィルタと、上記第一の光路における上記第二の光路との合流部と測定手段との間に配置され、蛍光物質が発する蛍光のみを選択的に透過させる第二のフィルタと、を具備することとした。
【0009】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
図1は血清等の検体試料を標識用蛍光物質を用いて分析検査する時に使用される分析装置の概略構成図であり、この分析装置は、反応容器1内の標識用蛍光物質に励起光を照射する励起光照射系2と、被分析成分と反応した標識用蛍光物質の蛍光強度を測定する蛍光強度測定系3とを備えている。
【0010】
前記励起光照射系2は、光源としてのキセノンフラッシュランプ4と、このキセノンフラッシュランプ4から発せられた光源光を平行光に修正するコリメータレンズ5とを備えており、このコリメータレンズ5の光出射側にはフィルタ6が設けられている。
【0011】
前記フィルタ6はキセノンフラッシュランプ4で発生した光のうち反応容器1内の標識用蛍光物質を励起させる波長光(例えば350nm付近)のみを選択的に透過させるものであり、このフィルタ6を透過した光はハーフミラー7、第1のシャッター8、ミラー9および集光レンズ10を経て反応容器1に励起光として照射されるようになっている。
【0012】
一方、前記蛍光強度測定系3は反応容器1内で発生した蛍光を集光する集光レンズ11を備えており、この集光レンズ11に入射した光はハーフミラー12を透過してフィルタ13に入射するようになっている。
【0013】
前記フィルタ13は反応容器1内の標識用蛍光物質で発生した蛍光(例えば615nm付近)のみを選択的に透過させるものであり、このフィルタ13を透過した光は光拡散板14を透過してフォトマルトランジスタ(以下、「PMT」と称する。)等からなる光検出器15の光電変換面に照射されるようになっている。
【0014】
また、前記フィルタ6を透過した光は、ハーフミラー7および第2のシャッター16を経てガラスセル17に照射されるようになっている。このガラスセル17内には反応容器1内の標識用蛍光物質と同一の蛍光物質(例えば希土類金属キレート、好ましくはユーロピウムキレート)である標準蛍光物質18が封入されており、この標準蛍光物質18で発生した標準蛍光はフィルタ19に入射するようになっている。
【0015】
前記フィルタ19は標準蛍光物質18で発生した蛍光(例えば615nm付近)のみを選択的に透過させるものであり、このフィルタ19を透過した光はハーフミラー12、フィルタ13および光拡散板14を経て光検出器15の光電変換面に照射されるようになっている。なお、フィルタ19の詳細な機能については後述する。
【0016】
前記光検出器15から出力された信号は、A/D変換器20でデジタル信号に変換された後、CPU(中央処理装置)21に供給されるようになっている。
前記CPU21は光検出器15からの信号に基づいて試料中の被分析成分を定量演算したり、キセノンフラッシュランプ4を点灯制御したり、あるいは第1のシャッター8および第2のシャッター16を開閉制御したりするものであり、このCPU21には記憶装置22が接続されているとともに、分析結果等を表示するCRT表示器23やプリンタ(不図示)が接続されている。
【0017】
なお、A/D変換器20は反応容器1に励起光が照射されて所定時間(ゴミ等の浮遊物や反応容器から発せられた自家蛍光の強度が零レベルに減衰するまでの時間)が経過した後に、光検出器15の出力信号を取り込むように構成されている。
【0018】
図2はCPU21の制御を示すフローチャートであり、以下、同図を参照して本発明の一実施形態について説明する。図2に示すように、本発明の一実施形態では、標識用蛍光物質が添加された反応容器1を励起光の照射位置にセットすると、CPU21からの光路開放信号により第2のシャッター16が作動し、ハーフミラー7とガラスセル17との間に形成された第2のシャッター16が開き光路が開放される(ステップST1)。なお、キセノンフラッシュランプ4は常時点灯されていると共に、第1、第2のシャッター8,16の双方は通常遮断されているものとする。ハーフミラー7とガラスセル17との間に形成された第2のシャッター16が開き光路が開放されると、キセノンフラッシュランプ4で発生した光がコリメータレンズ5、フィルタ6、ハーフミラー7を経てガラスセル17内の標準蛍光物質18に励起光として照射される(ステップST2)。
【0019】
このとき、標準蛍光物質18で発生した蛍光はフィルタ19、ハーフミラー12、フィルタ13、光拡散板14を経て光検出器15の光電変換面に照射され、標準蛍光物質18の蛍光強度信号として光検出器15から出力される。そして、光検出器15から出力された標準蛍光物質18の蛍光強度信号は、A/D変換器20を経てCPU21に供給され、標準蛍光物質18の標準蛍光値として記憶装置22に格納される(ステップST3)。
【0020】
標準蛍光物質18の標準蛍光値が記憶装置22に格納されると、CPU21から第2のシャッター16に光路遮断信号が送出され、ハーフミラー7とガラスセル17との間に形成された光路が第2のシャッター16により遮断されると共に、CPU21から第1のシャッター8に光路開放信号が送出され、ハーフミラー7とミラー9との間に形成された光路が開放される(ステップST4,ST5)。ハーフミラー7とミラー9との間に形成された光路が第1のシャッター8により開放されると、キセノンフラッシュランプ4で発生した光がコリメータレンズ5、フィルタ6、ハーフミラー7、第1のシャッター8、ミラー9、集光レンズ10を経て反応容器1内の標識用蛍光物質に励起光として照射される(ステップST6)。
【0021】
このとき、反応容器1内の標識用蛍光物質で発生した蛍光は集光レンズ11、ハーフミラー12、フィルタ13、光拡散板14を経て光検出器15の光電変換面に照射され、標識用蛍光物質の蛍光強度信号として光検出器15から出力される。そして、光検出器15から出力された標識用蛍光物質の蛍光強度信号は、A/D変換器20を経てCPU21に供給され、標識用蛍光物質の検体蛍光値として記憶装置22に格納される(ステップST7)。
【0022】
標識用蛍光物質の検体蛍光値が記憶装置22に格納されると、CPU21は記憶装置22に格納された検体蛍光値を下記に示す式(1)に基づいて補正する(ステップST8)。そして、式(1)により得られた補正蛍光値に基づいて被分析成分の濃度を定量演算し、その演算結果をCRT表示器23や図示しないプリンタ等に出力する(ステップST9,ST10)。
【0023】
式(1)は、
ここで、αは(検体蛍光値−暗電流)/(標準蛍光値−暗電流)を絶対濃度に換算するための定数である。また、βは機差補正用の係数(機差の補正を行わない場合はβ=1とする)である。係数βについては後述する。
【0024】
なお、検体蛍光値の補正は、標識用蛍光物質の蛍光強度を測定する度に標準蛍光値と暗電流を測定して行なわれる。
また、本発明の一実施形態では暗電流を測定する時に測定値が一定値以上の場合には「シャッター8,16開エラー」をCRT表示器23に表示し、また標準蛍光を測定する時に測定値が一定値以上の場合には「シャッタ8開エラー」をCRT表示器23に表示するように構成されている。
【0025】
次に上述した分析装置の較正について説明する。キセノンフラッシュランプ4や光検出器15は時間とともに劣化する。このため、以下のようにして補正を行う。すなわち、励起光の照射位置に基準試料(ユーロピウムキレートを硝子に溶し込んだものを反応容器内に固定したもの)をセットする。そして、基準試料の蛍光強度と標準蛍光物質18の蛍光強度を測定し、基準試料の蛍光強度測定値を初期基準蛍光値として、また標準蛍光物質18の蛍光強度測定値を初期標準蛍光値として記憶装置22に格納しておく。そして、電源をONにしてから30分が経過した時点(PMT周辺の温度が一定になった時点)で標準蛍光物質18の蛍光強度を再度測定し、その測定値を記憶装置22に記憶された初期標準蛍光値と比較する。そして、初期標準蛍光値との差が一定以下(例えば10%以下)の場合には、光検出器15のゲインを自動的に必要なだけ上げ、標準蛍光物質18の蛍光強度測定値を初期標準蛍光値と同じ値にする。また、比較した値が一定以下(例えば50%以下)の場合には、その旨をユーザに報知することにより調整やキャリブレーションを促すことができる。
【0026】
一方、本分析装置の設計上の測定値と実際上の測定値の誤差、すなわち機差を除去するために以下のようにして補正のための係数βを求める。なお、機差は主に光路に起因するものである。
【0027】
機差を除去するためには、測定ダイナミックレンジの上限及び下限近傍の蛍光値、すなわち基準蛍光値及び標準蛍光値について設計上の値と実際の値を比較する。予め蛍光値が判明しているサンプルS1,S2の設計上の蛍光値をそれぞれ初期基準蛍光値A1,初期標準蛍光値A2とする。一方、サンプルS1,S2の実際の分析装置における蛍光値をそれぞれ計測基準蛍光値B1,計測標準蛍光値B2とする。機差を除去するためには、計測基準蛍光値B1,計測標準蛍光値B2を初期基準蛍光値A1,初期標準蛍光値A2に合わせて比例配分すればよい。すなわち、初期基準蛍光値A1と初期標準蛍光値A2とを結んだ直線と、計測基準蛍光値B1と計測標準蛍光値B2とを結んだ直線が一致するように調整する。
【0028】
具体的には、計測標準蛍光値B2が初期標準蛍光値A2と一致するように光検出器15のゲインを調整する。このゲインの調整に伴なって変化した蛍光値(以下、「較正基準蛍光値B1′」)を測定する。したがって、A1/B1′から直線の傾きを補正する係数βが求められる。
【0029】
したがって、係数βは、
β=(初期基準蛍光値A1)/(較正基準蛍光値B1′) …(2)
で示される。
【0030】
例えば、初期基準蛍光値A1=4000万、初期標準蛍光値A2=2万の分析装置において、計測基準蛍光値B1=4100万、計測標準蛍光値B2=19000とする。次に、計測標準蛍光値B2が2万となるように光検出器15のゲインを上げる。これに伴ない計測基準蛍光値B1が上昇し、較正基準蛍光値B1′=4200万となる。したがって、β=4000万/4200万=0.952…となる。
【0031】
フィルタ19の機能について図3の(a),(b)を参照して説明する。図3の(a)に示すように、フィルタ19がなく、第1のシャッター8が遮断している場合には、上述したステップST2において、標準蛍光物質18の蛍光値を計測している際に、ガラスセル17を通過するのは、励起光Rと蛍光K1となる。励起光Rはハーフミラー12を経て励起光R1及び励起光R2に分けられる。励起光R1はフィルタ13で吸収され、蛍光K1のみが光検出器15に入射する。一方、励起光R2は反応容器1内の標識用蛍光物質に照射され、蛍光K2が発生する。蛍光K2はハーフミラー12を経て、光検出器15に入射する。このため、光検出器15には蛍光K1と蛍光K2とが加算された蛍光が入射され、測定の対象となっている標準蛍光物質18の正確な蛍光値が得られない。
【0032】
同様に、図3の(b)に示すように、フィルタ19がなく、第2のシャッター16が遮断している場合には、上述したST6において、反応容器1内の標識用蛍光物質の蛍光値を計測している際に、反応容器1を通過するのは励起光R′と蛍光K′1となる。
【0033】
励起光R′はハーフミラー12を経て励起光R′1及び励起光R′2に分けられる。励起光R′1はフィルタ13で吸収され、蛍光K′1のみが光検出器15に入射する。一方、励起光R′2は標準蛍光物質18に照射され、蛍光K′2が発生する。蛍光K′2はハーフミラー12を経て、光検出器15に入射する。このため、光検出器15には蛍光K′1と蛍光K′2とが加算された蛍光が入射され、測定の対象となっている標識用蛍光物質の正確な蛍光値が得られない。
【0034】
したがって、フィルタ19により測定中以外の蛍光物質が励起することを防止することで正確な蛍光値を得ることができる。
なお、フィルタ19の代わりに励起光R2又はR′2を遮断するシャッタを両光路又は合流部に設ける方法も考えられるが、装置の構成及び制御が複雑となるという問題があり、好適ではない。
【0035】
上述したように、本発明の一実施形態では、標識用蛍光物質の蛍光強度を測定するときに標識用蛍光物質と同一の蛍光物質18の蛍光強度を測定し、この標準蛍光物質18の蛍光強度と標識用蛍光物質の蛍光強度との比に基づいて被分析成分を定量分析することにより、キセノンフラッシュランプ4の輝度変化や光検出器15の感度変化に起因する誤差を低減することができ、試料中の被分析成分を正確に定量分析することができる。
【0036】
また、本発明の一実施形態では、試料中の被分析成分を標識する標識用蛍光物質と標準蛍光物質18とが同一の蛍光物質であるので、蛍光物質の時間応答特性や光検出器15の波長特性等の影響を受けず被分析成分を正確に定量分析することができる。
【0037】
また、本発明の一実施形態では、標準蛍光物質18として希土類金属キレートを硝子や樹脂等の透明体に溶し込んだものを使用しているので、大きさが小さくても十分で安定した蛍光量を得ることができ、蛍光物質の温度による影響も少ない。
【0038】
さらに、本発明の一実施形態では、反応容器1とガラスセル17との間にフィルタ19が設けられているので、励起光が測定中以外の蛍光物質を励起させて蛍光が発生することを防止できる。
【0039】
また、本発明の一実施形態では、集光レンズ11と光検出器15との間に光拡散板14を設けたことにより、反応容器の位置が変化し、光検出器15の光電変換面上での受光位置が変化しても影響が少ない。
【0040】
なお、本発明は上述した実施の形態に限定されるものではない。すなわち、上記実施の形態では、蛍光物質として、希土類金属キレートを使用したが、これに限られるものではなく、例えば蛍光寿命の長い蛍光物質であれば代用することは可能である。また、上記実施の形態では、標識用蛍光物質を収容した反応容器1をセットした後、標準蛍光物質18の測定を行うようにしているが、反応容器1をセットされるまでの間に標準蛍光物質18の測定を行うことで、計測に用いられる標準蛍光物質18の値を正確に求めることができる。このほか、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変形実施可能であるのは勿論である。
【0041】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、励起光を発生する光源の輝度変化や光検出器の感度変化等に起因する誤差を低減でき、試料中の被分析成分を正確に定量分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】試料中の被分析成分を標識用蛍光物質を用いて定量分析する時に使用される分析装置の概略構成図。
【図2】本発明の一実施形態に係る分析方法を説明するためのフローチャート。
【図3】分析装置に組み込まれたフィルタの機能を説明する説明図。
【符号の説明】
1…反応容器
4…キセノンフラッシュランプ
5…コリメータレンズ
6…フィルタ
7…ハーフミラー
8…第1のシャッター
9…ミラー
10…集光レンズ
11…集光レンズ
12…ハーフミラー
13…フィルタ
14…光拡散板
15…光検出器
16…第2のシャッター
17…ガラスセル
18…標準蛍光物質
19…フィルタ
20…A/D変換器
21…CPU
Claims (1)
- 被分析成分と標識用蛍光物質と反応させる第一の収容体と、
標準蛍光物質を収容した第二の収容体と、
これら第一及び第二の収容体に励起光を照射するための光源と、
上記第一の収容体に収容された標識用蛍光物質と第二の収容体に収容された標準蛍光物質の、上記励起光により選択的に励起される蛍光強度を測定する測定手段と、
上記第一の収容体と測定手段との間を光学的に連結する第一の光路と、
上記第二の収容体と測定手段との間を光学的に連結するよう、上記第一の光路に合流する第二の光路と、
上記第二の光路内に配置され、蛍光物質が発する蛍光のみを選択的に透過させる第一のフィルタと、
上記第一の光路における上記第二の光路との合流部と測定手段との間に配置され、蛍光物質が発する蛍光のみを選択的に透過させる第二のフィルタと、
を具備することを特徴とする分析装置。
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