JPH1010049A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】励起光の輝度変化や光検出器の感度変化等に起
因する誤差を低減でき、試料中の被分析成分を正確に定
量分析することのできる分析方法を提供する。 【解決手段】標識用蛍光物質を被分析成分を収容した反
応容器１中で反応させた後、反応容器１に励起光を照射
して、被分析成分と反応した標識用蛍光物質の蛍光強度
を測定し、標識用蛍光物質の蛍光強度を測定するときに
標準蛍光物質１８を収容したガラスセル１７に対して励
起光を照射して蛍光強度を測定し、この標準蛍光物質の
蛍光強度と標識用蛍光物質の蛍光強度との比に基づいて
被分析成分を定量分析することにより、被分析成分を定
量分析する分析方法であって、標識用蛍光物質と標準蛍
光物質とに用いられる蛍光物質は同一の蛍光特性を有す
ることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血清等の試料を分
析検査する時に用いられる分析方法に係り、特に試料中
の被分析成分を免疫学的な方法により定量分析する分析
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血清等の試料を分析検査する方法の１つ
として、試料中の被分析成分を免疫学的な方法により定
量分析する方法が従来から知られている。この種の分析
方法は試料中の被分析成分と免疫反応を生ずる抗原また
は抗体を例えばガラスビーズや磁性粒子に固定化した不
溶性の担体を用い、この担体を透明な容器（以下、「反
応容器」と称する。）に第１の試薬として添加して試料
中の被分析成分と反応させ、次いで担体を洗浄液で洗浄
して被分析成分を除いた不要成分を反応容器内から除去
した後、被分析成分と免疫反応を生ずる標識用蛍光物質
を反応容器に第２の試薬として添加し、被分析成分と反
応した標識用蛍光物質の蛍光強度を測定して被分析成分
を定量分析する方法であり、標識用蛍光物質としては、
被分析成分と免疫反応を生ずる抗原または抗体を蛍光物
質に固定化したものが用いられる。

【０００３】ところで、このような分析方法は標識用蛍
光物質を励起させる励起光を反応容器に照射すると、被
分析成分と反応した標識用蛍光物質のみから蛍光が発せ
られるばかりでなく、例えば反応容器内を浮遊するゴミ
等の浮遊物や反応容器からも自家蛍光が発せられるた
め、測定値に誤差が生じ易いという問題がある。

【０００４】そこで、ゴミ等の浮遊物や反応容器から発
せられた自家蛍光による影響を低減するために、励起光
を照射してから所定時間後に標識用蛍光物質の蛍光強度
を測定するようにした分析方法が提案されている（特開
平３−２２１８３７号参照）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このような分析方法に
よると、ゴミ等の浮遊物や反応容器から発せられた蛍光
は標識用蛍光物質から発せられた蛍光に比較して比較的
短時間のうちに減衰してしまうため、ゴミ等の浮遊物や
反応容器から発せられた自家蛍光による影響を低減する
ことができるが、励起光を発生する光源の輝度変化や光
検出器の感度変化などに起因する誤差を低減することが
困難であった。

【０００６】本発明は上記のような点に鑑みてなされた
もので、その目的は励起光を発生する光源の輝度変化や
光検出器の感度変化等に起因する誤差を低減でき、試料
中の被分析成分を正確に定量分析することのできる免疫
学的分析方法を提供せんとするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、請求項１に係る発明は、標識用蛍光物質を被分析成
分を収容した収容体中で反応させた後、前記収容体に励
起光を照射して、前記被分析成分と反応した前記標識用
蛍光物質の蛍光強度を測定し、前記標識用蛍光物質の蛍
光強度を測定するときに標準蛍光物質を収容した収容体
に対して励起光を照射して蛍光強度を測定し、この標準
蛍光物質の蛍光強度と前記標識用蛍光物質の蛍光強度と
の比に基づいて前記被分析成分を定量分析することによ
り、前記被分析成分を定量分析する分析方法であって、
前記標識用蛍光物質と標準蛍光物質とに用いられる蛍光
物質は同一の蛍光特性を有することとした。

【０００８】請求項２に係る発明は、標識用蛍光物質を
被分析成分を収容した収容体中で反応させた後、前記収
容体に励起光を照射すると共に、前記被分析成分と反応
した前記標識用蛍光物質が前記励起光によって励起され
た蛍光強度を測定して、前記標識用蛍光物質の蛍光強度
を測定するときに前記標識用蛍光物質と同一の蛍光特性
を有する標準蛍光物質を収容した収容体に対して励起光
を照射して蛍光強度を測定し、前記標準蛍光物質の蛍光
強度測定用光学と前記標識用蛍光物質の蛍光強度測定用
光学とが合流する部位から前記標準蛍光物質及び／又は
前記標識用蛍光物質を収容する収容体の蛍光出射面まで
の光路中で励起光の遮断をするようにして、前記標準蛍
光物質及び前記標識用蛍光物質の何か一方を収容する収
容体に対して励起光を照射しているときに、前記収容体
を通過した励起光が他方の収容体に照射して影響を与え
ることを防止するようにした。請求項３に係る発明は、
請求項１又は２に記載の発明において、前記標準蛍光物
質は、希土類金属キレートであることが好ましい。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図面
を参照して説明する。図１は血清等の検体試料を標識用
蛍光物質を用いて分析検査する時に使用される分析装置
の概略構成図であり、この分析装置は、反応容器１内の
標識用蛍光物質に励起光を照射する励起光照射系２と、
被分析成分と反応した標識用蛍光物質の蛍光強度を測定
する蛍光強度測定系３とを備えている。

【００１０】前記励起光照射系２は、光源としてのキセ
ノンフラッシュランプ４と、このキセノンフラッシュラ
ンプ４から発せられた光源光を平行光に修正するコリメ
ータレンズ５とを備えており、このコリメータレンズ５
の光出射側にはフィルタ６が設けられている。

【００１１】前記フィルタ６はキセノンフラッシュラン
プ４で発生した光のうち反応容器１内の標識用蛍光物質
を励起させる波長光（例えば３５０ｎｍ付近）のみを選
択的に透過させるものであり、このフィルタ６を透過し
た光はハーフミラー７、第１のシャッター８、ミラー９
および集光レンズ１０を経て反応容器１に励起光として
照射されるようになっている。

【００１２】一方、前記蛍光強度測定系３は反応容器１
内で発生した蛍光を集光する集光レンズ１１を備えてお
り、この集光レンズ１１に入射した光はハーフミラー１
２を透過してフィルタ１３に入射するようになってい
る。

【００１３】前記フィルタ１３は反応容器１内の標識用
蛍光物質で発生した蛍光（例えば６１５ｎｍ付近）のみ
を選択的に透過させるものであり、このフィルタ１３を
透過した光は光拡散板１４を透過してフォトマルトラン
ジスタ（以下、「ＰＭＴ」と称する。）等からなる光検
出器１５の光電変換面に照射されるようになっている。

【００１４】また、前記フィルタ６を透過した光は、ハ
ーフミラー７および第２のシャッター１６を経てガラス
セル１７に照射されるようになっている。このガラスセ
ル１７内には反応容器１内の標識用蛍光物質と同一の蛍
光物質（例えば希土類金属キレート、好ましくはユーロ
ピウムキレート）である標準蛍光物質１８が封入されて
おり、この標準蛍光物質１８で発生した標準蛍光はフィ
ルタ１９に入射するようになっている。

【００１５】前記フィルタ１９は標準蛍光物質１８で発
生した蛍光（例えば６１５ｎｍ付近）のみを選択的に透
過させるものであり、このフィルタ１９を透過した光は
ハーフミラー１２、フィルタ１３および光拡散板１４を
経て光検出器１５の光電変換面に照射されるようになっ
ている。なお、フィルタ１９の詳細な機能については後
述する。

【００１６】前記光検出器１５から出力された信号は、
Ａ／Ｄ変換器２０でデジタル信号に変換された後、ＣＰ
Ｕ（中央処理装置）２１に供給されるようになってい
る。前記ＣＰＵ２１は光検出器１５からの信号に基づい
て試料中の被分析成分を定量演算したり、キセノンフラ
ッシュランプ４を点灯制御したり、あるいは第１のシャ
ッター８および第２のシャッター１６を開閉制御したり
するものであり、このＣＰＵ２１には記憶装置２２が接
続されているとともに、分析結果等を表示するＣＲＴ表
示器２３やプリンタ（不図示）が接続されている。

【００１７】なお、Ａ／Ｄ変換器２０は反応容器１に励
起光が照射されて所定時間（ゴミ等の浮遊物や反応容器
から発せられた自家蛍光の強度が零レベルに減衰するま
での時間）が経過した後に、光検出器１５の出力信号を
取り込むように構成されている。

【００１８】図２はＣＰＵ２１の制御を示すフローチャ
ートであり、以下、同図を参照して本発明の一実施形態
について説明する。図２に示すように、本発明の一実施
形態では、標識用蛍光物質が添加された反応容器１を励
起光の照射位置にセットすると、ＣＰＵ２１からの光路
開放信号により第２のシャッター１６が作動し、ハーフ
ミラー７とガラスセル１７との間に形成された第２のシ
ャッター１６が開き光路が開放される（ステップＳＴ
１）。なお、キセノンフラッシュランプ４は常時点灯さ
れていると共に、第１、第２のシャッター８，１６の双
方は通常遮断されているものとする。ハーフミラー７と
ガラスセル１７との間に形成された第２のシャッター１
６が開き光路が開放されると、キセノンフラッシュラン
プ４で発生した光がコリメータレンズ５、フィルタ６、
ハーフミラー７を経てガラスセル１７内の標準蛍光物質
１８に励起光として照射される（ステップＳＴ２）。

【００１９】このとき、標準蛍光物質１８で発生した蛍
光はフィルタ１９、ハーフミラー１２、フィルタ１３、
光拡散板１４を経て光検出器１５の光電変換面に照射さ
れ、標準蛍光物質１８の蛍光強度信号として光検出器１
５から出力される。そして、光検出器１５から出力され
た標準蛍光物質１８の蛍光強度信号は、Ａ／Ｄ変換器２
０を経てＣＰＵ２１に供給され、標準蛍光物質１８の標
準蛍光値として記憶装置２２に格納される（ステップＳ
Ｔ３）。

【００２０】標準蛍光物質１８の標準蛍光値が記憶装置
２２に格納されると、ＣＰＵ２１から第２のシャッター
１６に光路遮断信号が送出され、ハーフミラー７とガラ
スセル１７との間に形成された光路が第２のシャッター
１６により遮断されると共に、ＣＰＵ２１から第１のシ
ャッター８に光路開放信号が送出され、ハーフミラー７
とミラー９との間に形成された光路が開放される（ステ
ップＳＴ４，ＳＴ５）。ハーフミラー７とミラー９との
間に形成された光路が第１のシャッター８により開放さ
れると、キセノンフラッシュランプ４で発生した光がコ
リメータレンズ５、フィルタ６、ハーフミラー７、第１
のシャッター８、ミラー９、集光レンズ１０を経て反応
容器１内の標識用蛍光物質に励起光として照射される
（ステップＳＴ６）。

【００２１】このとき、反応容器１内の標識用蛍光物質
で発生した蛍光は集光レンズ１１、ハーフミラー１２、
フィルタ１３、光拡散板１４を経て光検出器１５の光電
変換面に照射され、標識用蛍光物質の蛍光強度信号とし
て光検出器１５から出力される。そして、光検出器１５
から出力された標識用蛍光物質の蛍光強度信号は、Ａ／
Ｄ変換器２０を経てＣＰＵ２１に供給され、標識用蛍光
物質の検体蛍光値として記憶装置２２に格納される（ス
テップＳＴ７）。

【００２２】標識用蛍光物質の検体蛍光値が記憶装置２
２に格納されると、ＣＰＵ２１は記憶装置２２に格納さ
れた検体蛍光値を下記に示す式（１）に基づいて補正す
る（ステップＳＴ８）。そして、式（１）により得られ
た補正蛍光値に基づいて被分析成分の濃度を定量演算
し、その演算結果をＣＲＴ表示器２３や図示しないプリ
ンタ等に出力する（ステップＳＴ９，ＳＴ１０）。

【００２３】式（１）は、 （検体蛍光値−暗電流）／（標準蛍光値−暗電流）×α×β＝補正蛍光値 …（１） ここで、αは（検体蛍光値−暗電流）／（標準蛍光値−
暗電流）を絶対濃度に換算するための定数である。ま
た、βは機差補正用の係数（機差の補正を行わない場合
はβ＝１とする）である。係数βについては後述する。

【００２４】なお、検体蛍光値の補正は、標識用蛍光物
質の蛍光強度を測定する度に標準蛍光値と暗電流を測定
して行なわれる。また、本発明の一実施形態では暗電流
を測定する時に測定値が一定値以上の場合には「シャッ
ター８，１６開エラー」をＣＲＴ表示器２３に表示し、
また標準蛍光を測定する時に測定値が一定値以上の場合
には「シャッタ８開エラー」をＣＲＴ表示器２３に表示
するように構成されている。

【００２５】次に上述した分析装置の較正について説明
する。キセノンフラッシュランプ４や光検出器１５は時
間とともに劣化する。このため、以下のようにして補正
を行う。すなわち、励起光の照射位置に基準試料（ユー
ロピウムキレートを硝子に溶し込んだものを反応容器内
に固定したもの）をセットする。そして、基準試料の蛍
光強度と標準蛍光物質１８の蛍光強度を測定し、基準試
料の蛍光強度測定値を初期基準蛍光値として、また標準
蛍光物質１８の蛍光強度測定値を初期標準蛍光値として
記憶装置２２に格納しておく。そして、電源をＯＮにし
てから３０分が経過した時点（ＰＭＴ周辺の温度が一定
になった時点）で標準蛍光物質１８の蛍光強度を再度測
定し、その測定値を記憶装置２２に記憶された初期標準
蛍光値と比較する。そして、初期標準蛍光値との差が一
定以下（例えば１０％以下）の場合には、光検出器１５
のゲインを自動的に必要なだけ上げ、標準蛍光物質１８
の蛍光強度測定値を初期標準蛍光値と同じ値にする。ま
た、比較した値が一定以下（例えば５０％以下）の場合
には、その旨をユーザに報知することにより調整やキャ
リブレーションを促すことができる。

【００２６】一方、本分析装置の設計上の測定値と実際
上の測定値の誤差、すなわち機差を除去するために以下
のようにして補正のための係数βを求める。なお、機差
は主に光路に起因するものである。

【００２７】機差を除去するためには、測定ダイナミッ
クレンジの上限及び下限近傍の蛍光値、すなわち基準蛍
光値及び標準蛍光値について設計上の値と実際の値を比
較する。予め蛍光値が判明しているサンプルＳ１，Ｓ２
の設計上の蛍光値をそれぞれ初期基準蛍光値Ａ１，初期
標準蛍光値Ａ２とする。一方、サンプルＳ１，Ｓ２の実
際の分析装置における蛍光値をそれぞれ計測基準蛍光値
Ｂ１，計測標準蛍光値Ｂ２とする。機差を除去するため
には、計測基準蛍光値Ｂ１，計測標準蛍光値Ｂ２を初期
基準蛍光値Ａ１，初期標準蛍光値Ａ２に合わせて比例配
分すればよい。すなわち、初期基準蛍光値Ａ１と初期標
準蛍光値Ａ２とを結んだ直線と、計測基準蛍光値Ｂ１と
計測標準蛍光値Ｂ２とを結んだ直線が一致するように調
整する。

【００２８】具体的には、計測標準蛍光値Ｂ２が初期標
準蛍光値Ａ２と一致するように光検出器１５のゲインを
調整する。このゲインの調整に伴なって変化した蛍光値
（以下、「較正基準蛍光値Ｂ１′」）を測定する。した
がって、Ａ１／Ｂ１′から直線の傾きを補正する係数β
が求められる。

【００２９】したがって、係数βは、 β＝（初期基準蛍光値Ａ１）／（較正基準蛍光値Ｂ１′） …（２） で示される。

【００３０】例えば、初期基準蛍光値Ａ１＝４０００
万、初期標準蛍光値Ａ２＝２万の分析装置において、計
測基準蛍光値Ｂ１＝４１００万、計測標準蛍光値Ｂ２＝
１９０００とする。次に、計測標準蛍光値Ｂ２が２万と
なるように光検出器１５のゲインを上げる。これに伴な
い計測基準蛍光値Ｂ１が上昇し、較正基準蛍光値Ｂ１′
＝４２００万となる。したがって、β＝４０００万／４
２００万＝０．９５２…となる。

【００３１】フィルタ１９の機能について図３の
（ａ），（ｂ）を参照して説明する。図３の（ａ）に示
すように、フィルタ１９がなく、第１のシャッター８が
遮断している場合には、上述したステップＳＴ２におい
て、標準蛍光物質１８の蛍光値を計測している際に、ガ
ラスセル１７を通過するのは、励起光Ｒと蛍光Ｋ１とな
る。励起光Ｒはハーフミラー１２を経て励起光Ｒ１及び
励起光Ｒ２に分けられる。励起光Ｒ１はフィルタ１３で
吸収され、蛍光Ｋ１のみが光検出器１５に入射する。一
方、励起光Ｒ２は反応容器１内の標識用蛍光物質に照射
され、蛍光Ｋ２が発生する。蛍光Ｋ２はハーフミラー１
２を経て、光検出器１５に入射する。このため、光検出
器１５には蛍光Ｋ１と蛍光Ｋ２とが加算された蛍光が入
射され、測定の対象となっている標準蛍光物質１８の正
確な蛍光値が得られない。

【００３２】同様に、図３の（ｂ）に示すように、フィ
ルタ１９がなく、第２のシャッター１６が遮断している
場合には、上述したＳＴ６において、反応容器１内の標
識用蛍光物質の蛍光値を計測している際に、反応容器１
を通過するのは励起光Ｒ′と蛍光Ｋ′１となる。

【００３３】励起光Ｒ′はハーフミラー１２を経て励起
光Ｒ′１及び励起光Ｒ′２に分けられる。励起光Ｒ′１
はフィルタ１３で吸収され、蛍光Ｋ′１のみが光検出器
１５に入射する。一方、励起光Ｒ′２は標準蛍光物質１
８に照射され、蛍光Ｋ′２が発生する。蛍光Ｋ′２はハ
ーフミラー１２を経て、光検出器１５に入射する。この
ため、光検出器１５には蛍光Ｋ′１と蛍光Ｋ′２とが加
算された蛍光が入射され、測定の対象となっている標識
用蛍光物質の正確な蛍光値が得られない。

【００３４】したがって、フィルタ１９により測定中以
外の蛍光物質が励起することを防止することで正確な蛍
光値を得ることができる。なお、フィルタ１９の代わり
に励起光Ｒ２又はＲ′２を遮断するシャッタを両光路又
は合流部に設ける方法も考えられるが、装置の構成及び
制御が複雑となるという問題があり、好適ではない。

【００３５】上述したように、本発明の一実施形態で
は、標識用蛍光物質の蛍光強度を測定するときに標識用
蛍光物質と同一の蛍光物質１８の蛍光強度を測定し、こ
の標準蛍光物質１８の蛍光強度と標識用蛍光物質の蛍光
強度との比に基づいて被分析成分を定量分析することに
より、キセノンフラッシュランプ４の輝度変化や光検出
器１５の感度変化に起因する誤差を低減することがで
き、試料中の被分析成分を正確に定量分析することがで
きる。

【００３６】また、本発明の一実施形態では、試料中の
被分析成分を標識する標識用蛍光物質と標準蛍光物質１
８とが同一の蛍光物質であるので、蛍光物質の時間応答
特性や光検出器１５の波長特性等の影響を受けず被分析
成分を正確に定量分析することができる。

【００３７】また、本発明の一実施形態では、標準蛍光
物質１８として希土類金属キレートを硝子や樹脂等の透
明体に溶し込んだものを使用しているので、大きさが小
さくても十分で安定した蛍光量を得ることができ、蛍光
物質の温度による影響も少ない。

【００３８】さらに、本発明の一実施形態では、反応容
器１とガラスセル１７との間にフィルタ１９が設けられ
ているので、励起光が測定中以外の蛍光物質を励起させ
て蛍光が発生することを防止できる。

【００３９】また、本発明の一実施形態では、集光レン
ズ１１と光検出器１５との間に光拡散板１４を設けたこ
とにより、反応容器の位置が変化し、光検出器１５の光
電変換面上での受光位置が変化しても影響が少ない。

【００４０】なお、本発明は上述した実施の形態に限定
されるものではない。すなわち、上記実施の形態では、
蛍光物質として、希土類金属キレートを使用したが、こ
れに限られるものではなく、例えば蛍光寿命の長い蛍光
物質であれば代用することは可能である。また、上記実
施の形態では、標識用蛍光物質を収容した反応容器１を
セットした後、標準蛍光物質１８の測定を行うようにし
ているが、反応容器１をセットされるまでの間に標準蛍
光物質１８の測定を行うことで、計測に用いられる標準
蛍光物質１８の値を正確に求めることができる。このほ
か、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変形実施可能
であるのは勿論である。

【００４１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
励起光を発生する光源の輝度変化や光検出器の感度変化
等に起因する誤差を低減でき、試料中の被分析成分を正
確に定量分析することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】試料中の被分析成分を標識用蛍光物質を用いて
定量分析する時に使用される分析装置の概略構成図。

【図２】本発明の一実施形態に係る分析方法を説明する
ためのフローチャート。

【図３】分析装置に組み込まれたフィルタの機能を説明
する説明図。

【符号の説明】

１…反応容器 ４…キセノンフラッシュランプ ５…コリメータレンズ ６…フィルタ ７…ハーフミラー ８…第１のシャッター ９…ミラー １０…集光レンズ １１…集光レンズ １２…ハーフミラー １３…フィルタ １４…光拡散板 １５…光検出器 １６…第２のシャッター １７…ガラスセル １８…標準蛍光物質 １９…フィルタ ２０…Ａ／Ｄ変換器 ２１…ＣＰＵ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】標識用蛍光物質を被分析成分を収容した収
   容体中で反応させた後、 前記収容体に励起光を照射して、 前記被分析成分と反応した前記標識用蛍光物質の蛍光強
   度を測定し、 前記標識用蛍光物質の蛍光強度を測定するときに標準蛍
   光物質を収容した収容体に対して励起光を照射して蛍光
   強度を測定し、 この標準蛍光物質の蛍光強度と前記標識用蛍光物質の蛍
   光強度との比に基づいて前記被分析成分を定量分析する
   ことにより、 前記被分析成分を定量分析する分析方法であって、 前記標識用蛍光物質と標準蛍光物質とに用いられる蛍光
   物質は同一の蛍光特性を有することを特徴とする分析方
   法。
2. 【請求項２】標識用蛍光物質を被分析成分を収容した収
   容体中で反応させた後、 前記収容体に励起光を照射すると共に、 前記被分析成分と反応した前記標識用蛍光物質が前記励
   起光によって励起された蛍光強度を測定して、 前記標識用蛍光物質の蛍光強度を測定するときに前記標
   識用蛍光物質と同一の蛍光特性を有する標準蛍光物質を
   収容した収容体に対して励起光を照射して蛍光強度を測
   定し、 前記標準蛍光物質の蛍光強度測定用光学と前記標識用蛍
   光物質の蛍光強度測定用光学とが合流する部位から前記
   標準蛍光物質及び／又は前記標識用蛍光物質を収容する
   収容体の蛍光出射面までの光路中で励起光の遮断をする
   ようにして、 前記標準蛍光物質及び前記標識用蛍光物質の何か一方を
   収容する収容体に対して励起光を照射しているときに、
   前記収容体を通過した励起光が他方の収容体に照射して
   影響を与えることを防止するようにしたことを特徴とす
   る分析方法。
3. 【請求項３】前記標準蛍光物質は、 希土類金属キレートであることを特徴とする請求項１又
   は２に記載の分析方法。