JP2654698B2 - 免疫測定装置 - Google Patents

免疫測定装置

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JP2654698B2 JP1257423A JP25742389A JP2654698B2 JP 2654698 B2 JP2654698 B2 JP 2654698B2 JP 1257423 A JP1257423 A JP 1257423A JP 25742389 A JP25742389 A JP 25742389A JP 2654698 B2 JP2654698 B2 JP 2654698B2
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【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、抗原抗体反応を利用して、例えば血液等の
被測定液中の所定の抗原あるいは抗体の量を測定する免
疫測定装置に関するものである。
(従来の技術) 抗原抗体反応を定量化した種々の免疫測定法が現在迄
に考えられ、実用化されている。この種々の免疫測定法
を大別すると二種類に分類される。その一つは免疫拡散
法と呼ばれ、抗原抗体反応の結果生じた不溶性の複合体
がゲル内で沈降し、その量を測定するものであり、代表
的なものとしてレーザの散乱を利用したレーザ濁度測定
法(LASER NEPHELOMETRY)と呼ばれる方法がある。他の
一つは、標識免疫測定法と呼ばれ、抗原あるいは抗体の
一方を何らかで識別することにより、上記免疫拡散法の
感度限界を越えたより高い感度の測定を可能とするもの
である。標識としては、放射性同位原素,バクテリオフ
ァージ,酵素,蛍光物質,金属等がある。
上記種々の測定法のうち、標識として酵素を用いた標
識免疫測定法の一つとして、所定の抗原(抗体)と反応
する抗体(抗原)が固定化された支持体を用い、該支持
体上に上記所定の抗原が含まれていることが期待される
被測定液を点着して抗原抗体反応を生じさせ、さらに標
識の付された前記所定の抗原(抗体)を点着し、さらに
その後上記標識の触媒作用により蛍光物質に変化する基
質を含有する洗浄液を上記支持体上に流して上記抗体
(抗原)と反応していない標識の付された所定の抗原
(抗体)を流し出すとともに上記抗体(抗原)と反応し
ている標識の付された所定の抗原(抗体)により上記蛍
光物質を生成させ、該蛍光物質の量を測定し、これによ
り上記被測定液中の上記所定の抗原(抗体)の有無やそ
の量の測定を行なう逐次反応法が考えられている。
また、支持体上に固定された抗体と被測定液中の抗原
とが反応し、さらに抗原と反応する標識抗体を点着し、
抗原と標識抗体とを反応させた後洗浄液により反応して
いない標識抗体を流し出すサンドイッチ法や被測定液に
標識抗原あるいは標識抗体を加え、同時に支持体上に点
着する競合法などが知られている。
上記方法は、支持体を用いることにより従来の湿式法
と比べ取扱いが格段に容易となり、多数の被測定液につ
いて順次自動的に測定を行なう装置を構成することが可
能となるという長所を有する。
上記原理を用いた免疫測定装置において、生成された
上記蛍光物質の量を測定するには、所定の波長領域の励
起光を該蛍光物質が生成された支持体に照射して該蛍光
物質を励起し、該蛍光物質から発せられる蛍光の光量を
光電的に測定することにより行なわれる。
(発明が解決しようとする課題) 上記のようにして蛍光の光量を測定するにあたり、従
来は、支持体に照射される励起光の光量をモニタし、こ
の励起光の光量を励起光の光源にフィードバックして励
起光の光量を安定化したり、またこの励起光の光量を信
号処理の際に考慮することにより測定の精度の向上を目
指しているが、それでもなお必要な精度で測定を行なう
ためには上記の蛍光光量測定部全体をたとえば±1.0℃
等の精度で温度調節する必要があり、このため装置が大
がかりとなり複雑となってしまっていた。
本発明は、上記事情に鑑み、蛍光光量測定部全体の温
度調節を不要とするかもしくは粗い温度調節のみで済ま
すことのできる免疫測定装置を提案することを目的とす
るものである。
(課題を解決するための手段) 本発明の免疫測定装置は、 抗体あるいは抗原が固定された支持体上に抗原あるい
は抗体を含む被測定液を点着して第1の抗原抗体反応を
行わせると共に、 標識が付与された抗原あるいは抗体を前記第1の反応
を行っていない前記抗体あるいは抗原と第2の抗原抗体
反応を行わせ、または、標識が付与された抗体あるいは
抗原を前記第1の反応を行った抗原あるいは抗体と第3
の抗原抗体反応を行わせ、 次いで前記支持体上に前記標識の作用で蛍光物質とな
る基質を付与し、前記第2あるいは第3の反応を行った
標識を付与された抗原または抗体のその標識の作用によ
り前記基質を前記蛍光物質に変化させ、 該蛍光物質に励起光を照射して該蛍光物質が発する蛍
光の量を測定することで、前記被測定液中の抗原あるい
は抗体の量を測定する免疫測定装置において、 前記励起光を発する光源と、前記励起光を前記光源か
ら前記支持体に導く励起光用干渉フィルタを有する照射
光学系と、前記励起光の光量をモニタする第一の受光器
と、前記励起光用フィルタを透過した励起光の前記第一
の受光器に導くモニタ光学系と、前記蛍光物質から発せ
られた蛍光の光量を測定する第二の受光器と、前記蛍光
を前記支持体から前記第二の受光器に導く蛍光用干渉フ
ィルタを有する受光光学系と、前記第二の受光器で得ら
れた前記蛍光の光量を前記第一の受光器で得られた前記
励起光の光量で規格化する規格化手段とからなる蛍光光
量測定部を備え、前記第一の受光器と前記第二の受光器
が互いに略同一の温度・受光感度特性を有することを特
徴とするものである。
なお、本発明の免疫測定装置は、前述の逐次反応性、
サンドイッチ法および競合法のいずれをも対象とするも
のであり、例えば上記第1の反応を行わせた後第2の反
応を行わせるものは逐次反応法に、第1の反応と第2の
反応とを同時に行わせるものは競合法に、第1の反応と
第3の反応を行わせるものはサンドイッチ法に該当す
る。
(作用) 本発明の免疫測定装置は、前記第一の受光器と前記第
二の受光器が互いに略同一の温度−受光感度特性を有す
るため、後述する実施例において一例を示すように温度
ドリフトを非常に小さく押えることができ、蛍光光量測
定部全体の温度調節を行なわなくとも、もしくは粗い温
度調節を行なうだけで高精度の測定を行なうことができ
る。
(実 施 例) 第2図は、本発明の免疫測定の原理の一例を説明する
ための説明図である。
第2図(a)は、支持体の一例であるスライド1上に
抗体2が固定化されており、該スライド1上に抗原3を
含有する血液が点着される様子を模式的に表わした図で
ある。血液中の抗原3の量に応じて、第2図(b)に示
すように、抗原抗体反応の生じた抗体2aと反応の生じて
いない抗体2bとが生じ、血液中の抗原3の量が多いほど
反応の生じた抗体2aが増え、反応の生じていない抗体2b
が減る。
次に、第2図(c)に示すように標識4aの付された抗
原4がスライド1上に点着されると、第2図(d)に示
すようにその抗原4の一部は血液中の抗原3によってま
だ抗原抗体反応の生じていない抗体2と反応し、残りは
反応しない状態で残る。
その後、基質5を含有する洗浄液を例えば30秒間に渡
って一定量スライド上に流すと、先ず第2図(e)に示
すように反応の生じていない抗原4が流し出され、その
後標識4aの触媒作用により基質5が蛍光物質6に変化す
る。洗浄液を30秒間スライド上に流した後、例えば10秒
毎に5分間該スライドに励起光を照射し蛍光物質6から
発せられる蛍光の光量を測定することにより生成された
蛍光物質6の時間変化量が求められ、これを所定の検量
線に照合することにより上記血液中の抗原3の量が求め
られる。
第1図は、上記測定原理を応用した、本発明の免疫測
定装置の一実施例の、主に蛍光光量を測定する蛍光光量
測定部の構成を表わした図である。
スライド1が蛍光光量測定部20の上部に載置され、イ
ンキュベータ40に内蔵されたヒータ41により、一定温度
(例えば37.5℃)に保持される。
その状態で点着手段10のシリンジ11により容器12に収
容された血液13がバルブ14を経由して取り出され、バル
ブ15,ノズル16を経由してスライド1上に所定量点着さ
れる(第2図(a),(b)参照)。
次に図示しない同様の点着手段により酵素標識抗原を
含有する液が上記血液と同様にして点着される(第2図
(c),(d)参照)。さらにその後、図示しない同様
の点着手段により、例えば蛍光基質として4メチルウン
ベリフェル燐酸(以下、「4MUP」と称する。)を含有す
る洗浄液が一定量ずつ30秒間に渡ってスライド1上に流
し出される(第2図(e)参照)。30秒後に洗浄液を停
止し、その後10秒間隔で5分間に渡って上記酵素標識に
よって4MUPが変化した4メチルウンベリフェロン(蛍光
物質)(以下、「4MU」と称する。)の量が測定され
る。
蛍光光量測定部20は楕円ミラー21aを備えた低圧水銀
ランプ21を光源として用いている。該低圧水銀ランプ21
から発せられた光22はスリット23,レンズ24,励起光用干
渉フィルタ25,平行平面基板26,レンズ27を経由して、下
方からスライド1を照射する。励起光用干渉フィルタ25
は、低圧水銀ランプ21から発せられた光22のうち波長λ
=365nmの輝線のみを通過させる透過波長帯域を備えて
おり、スライド1上の4MUはλ=365nmの励起光により励
起される。
平行平面基板26で反射された前記励起光用干渉フィル
タ25を透過した励起光はレンズ28を経由して第一の受光
器29によって受光され励起光の光量がモニタされる。こ
のモニタされた信号S1は光源電源部30に入力され低圧水
銀ランプ20から常に一定の光量が発せられるようにその
印加電圧が制御される。また信号S1は、信号処理部31に
も入力される。
スライド1がλ=365nmの励起光で照射されると、4MU
から蛍光が発せられる。この蛍光はレンズ32,蛍光用干
渉フィルタ33,レンズ34を経由し第二の受光器35により
光電的に検出される。この干渉フィルタ33はλ=450nm
を中心とした狭い波長帯域(例えば半値幅5nm)の光を
透過させるものである。
第二の受光器35で検出された蛍光の光量を表わす信号
S2は、信号処理部31に入力される。信号処理部31には前
述したように第一の受光器29で得られた信号S1も入力さ
れ、信号S2が信号S1で規格化される。このような測定,
演算が10秒毎に5分間に渡って行われ、4MUが生成され
る速度を表わすグラフが求められる。5分間の測定が終
了した後、得られたグラフに基づいて血液13中の抗原の
量が求められる。求められた抗原の量を表わす値は、デ
ィスプレイ36に表示される。
次に蛍光光量測定部の温度依存性について説明する。
低圧水銀ランプ21から発せられた光22の光量をI,励起
光用干渉フィルタ25の透過率をF1,蛍光用干渉フィルタ3
3の透過率をF2,第一の受光器の受光感度をS1,第二の受
光器の受光感度をS2とし、これらが温度Tの関数である
とする。
このとき、励起光の光量Iexは、 Iex=k0・I(T)・F1(T) ……(1) k0:定数 と表わされる。また、スライドから発せられる蛍光の光
量Iemは励起光の光量Iexと比例し、 Iem=η・Iex=η・k0・I(T)・F1(T)……(2) したがって第二の受光器35により検出される信号S2の値
は上記(2)式に蛍光用干渉フィルタ33の透過率および
第二の受光器35の受光感度を考慮して、 S2=k1・I(T)・F1(T)・F2(T)・S2(T) ……(3) k1:定数 と表わされる。
また、第一の受光器29により検出される信号S1は、 S1=k2・I(T)・F1(T)・S1(T) ……(4) と表わされる。
第二の受光器35によって検出された信号S2を第一の受
光器29によって検出された信号S1で規格して規格化出力
3を求めると、 となる。
ここで、第一の受光器29の受光感度S1(T)と第二の
受光器35の受光感度S2(T)が比例関係にある、即ち温
度依存姓があっても両者が同様に変化する場合は、S
2(T)/S1(T)=定数となり、また、干渉フィルタの
透過率、透過中心波長の温度依存性は非常に小さく、し
かも蛍光のスペクトルはかなり波長幅が広いため蛍光用
干渉フィルタ33の透過中心波長が多少変化しても該蛍光
用干渉フィルタ33の透過する蛍光の光量はほとんど変化
しない。したがって最終的な出力S3は、温度依存性の非
常に小さなものとなる。このため蛍光光量測定部20は温
度調節がほとんど不要となる。
(発明の効果) 以上詳細に説明したように、本発明の免疫測定装置
は、励起光の光量をモニタする第一の受光器と蛍光の光
量を測定する第二の受光器とが互いに略同一の温度−受
光感度特性を有するものであるため、たとえ受光器の温
度ドリフトが大きくても蛍光測定部全体の温度依存性が
非常に小さくなり、蛍光測定部全体の温度調節はほとん
ど不要となる。
特に、励起光および蛍光に対して干渉フィルタを用い
る免疫測定装置においては、前記受光器の温度依存性の
みでなく干渉フィルタの温度依存性も影響するので測定
結果の温度依存性が非常に大きくなるという問題がある
が、本発明では上記の様に規格化を行うと共に第一の受
光器と第二の受光器の温度−受光感度特性を略同一とし
たので、結局測定結果の温度依存性は蛍光用干渉フィル
タの温度依存性によるもののみとなり、かつ干渉フィル
タの透過率、透過中心波長の温度依存性は非常に小さ
く、しかも蛍光のスペクトルはかなり波長幅が広いため
蛍光用干渉フィルタの透過中心波長が多少変化しても該
蛍光用干渉フィルタを透過する蛍光の光量はほとんど変
化しないこと相俟って、測定結果の温度依存性を極めて
小さく抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明の免疫測定装置の一実施例の、主に蛍
光光量を測定する蛍光光量測定部の構成を表わした図、 第2図は、本発明の免疫測定装置の測定原理を説明する
ための説明図である。 1……スライド、2……抗体 3……抗原、4……標識抗原 5……基質、6……蛍光物質 10……点着手段、13……血液 20……蛍光光量測定部、21……低圧水銀ランプ 25,33……干渉フィルタ、29……第一の受光器 35……第二の受光器、30……光源電源部 31……信号処理部、36……ディスプレイ 40……インキュベータ

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】抗体あるいは抗原が固定された支持体上に
    抗原あるいは抗体を含む被測定液を点着して第1の抗原
    抗体反応を行わせると共に、 標識が付与された抗原あるいは抗体を前記第1の反応を
    行っていない前記抗体あるいは抗原と第2の抗原抗体反
    応を行わせ、または、標識が付与された抗体あるいは抗
    原を前記第1の反応を行った抗原あるいは抗体と第3の
    抗原抗体反応を行わせ、 次いで前記支持体上に前記標識の作用で蛍光物質となる
    基質を付与し、前記第2あるいは第3の反応を行った標
    識を付与された抗原または抗体のその標識の作用により
    前記基質を前記蛍光物質に変化させ、 該蛍光物質に励起光を照射して該蛍光物質が発する蛍光
    の量を測定することで、前記被測定液中の抗原あるいは
    抗体の量を測定する免疫測定装置において、 前記励起光を発する光源と、前記励起光を前記光源から
    前記支持体に導く励起光用干渉フィルタを有する照射光
    学系と、前記励起光の光量をモニタする第一の受光器
    と、前記励起光用干渉フィルタを透過した励起光を前記
    第一の受光器に導くモニタ光学系と、前記蛍光物質から
    発せられた蛍光の光量を測定する第二の受光器と、前記
    蛍光を前記支持体から前記第二の受光器に導く蛍光用干
    渉フィルタを有する受光光学系と、前記第二の受光器で
    得られた前記蛍光の光量を前記第一の受光器で得られた
    前記励起光の光量で規格化する規格化手段とからなる蛍
    光光量測定部を備え、前記第一の受光器と前記第二の受
    光器が互いに略同一の温度・受光感度特性を有すること
    を特徴とする免疫測定装置。
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