CN117890578A - 一种胰蛋白酶原2（Try-2）的检测用单试剂及其制备方法 - Google Patents
一种胰蛋白酶原2（Try-2）的检测用单试剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种胰蛋白酶原2（Try‑2,Procalcitonin）的胶乳增强免疫比浊检测单试剂以及制备方法。该试剂包括Try‑2抗体致敏胶乳颗粒、乙二胺四乙酸二钠、曲拉通‑X100、牛血清白蛋白、十二烷基聚乙二醇醚以及Proclin300。本发明采用单一试剂，无需混合，灵敏度高，检测速度快，能够直接测量尿液样本，可广泛应用于各种透射或者散射分析仪，包括普通生化分析仪、特定蛋白分析仪等。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫诊断领域，具体涉及一种胰蛋白酶原2（Try-2）的胶乳增强免疫比浊检测单试剂的制备及其应用。
背景技术
胰蛋白酶原2（Try-2）属于丝氨酸蛋白酶类，由T-8氨基酸编码，绝大部分由胰腺腺泡分泌，以酶原的形式分泌到胰液中。有研究表明胰蛋白酶原2（Try-2）是诊断胰腺炎，尤其是急性胰腺炎（AP）的良好指标，也有文献报道其浓度与肿瘤的侵袭和扩散机制相关。
Try-2的常见检测方法有免疫荧光层析法。免疫荧光层析法是一种基于层析技术和免疫荧光分析相结合的快速检测方法。即将荧光染料颗粒作为示踪标记物用于抗原抗体反应，当待测溶液中Try-2抗原与试纸条上Try-2抗体发生反应后，使用激发光照射试纸条上检测区域根据敏感物质浓度大小而呈现不同的荧光强度，通过与分析物校准曲线比较即可得到待测溶液中目标物质浓度的检测结果。该检测方法重复性较差；不能即时得到检测结果，通常需要10分钟左右；无法满足连续大通量检测的要求。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种单一胶乳免疫比浊试剂，采用的是免疫比浊法，免疫比浊法与免疫荧光层析法最大的不同在于该方法无需标记抗体或者抗原，属于非标记的免疫分析方法。在使用免疫比浊法检测Try-2时，Try-2的抗体通过化学偶联或者物理偶联的方法包被在直径为几十到几百纳米的胶乳微球上。当待测样本中的Try-2与胶乳溶液中胶乳微球上偶联的Try-2抗体发生接触时，抗体抗原之间的特异性反应会导致溶液中胶乳微球的凝集反应，从而改变溶液的浊度。该凝集反应引起的浊度变化与样本中Try-2的浓度在一定范围内呈线性关系。通过测定溶液的浊度变化并与标准曲线进行对照，可以定量/定性地检测出样品中Try-2的含量。本发明Try-2免疫比浊法试剂，是一种单一试剂，无需多试剂混合，操作简便，检测速度快，1分钟出结果，灵敏度高，重复性好，该试剂既可以在大型自动生化分析仪上进行测试，也可以在特定蛋白仪等小型POCT设备上进行测试。
在本发明中，选用不同的缓冲体系、改变微球表面电荷、改变溶液离子强度、添加稳定剂、添加表面活性剂等手段稳定胶乳溶液。这样我们就制备了一种单试剂形式的Try-2胶乳试剂。在储存时，该试剂可以稳定存放，在接触样品时，该试剂可以迅速发生凝集反应，不再需要混合其他的稀释液来促进凝集反应。
本发明所述的胰蛋白酶原2（Try-2）检测试剂包括Try-2抗体致敏胶乳颗粒、乙二胺四乙酸二钠、曲拉通-X100、牛血清白蛋白、十二烷基聚乙二醇醚以及Proclin300。
所述的Try-2抗体包被的胶乳颗粒的浓度为0.15mg/mL。
所述的乙二胺四乙酸二钠浓度为10mM。
所述的曲拉通-X100浓度为0.1g/L。
所述的牛血清白蛋白浓度为3g/L。
所述的十二烷基聚乙二醇醚浓度为1-2g/L。
所述的Proclin300浓度为1g/L。
优选的，Try-2检测单试剂是按照如下方法制备的：
（1）取粒径333nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀。
（2）1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的Try-2多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液。将（1）中获得的胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h。12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂胰蛋白酶原2（Try-2）胶乳增强免疫比浊试剂。封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、0.1g/L曲拉通-X100、3g/L牛血清白蛋白、1-2g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/L Proclin300，pH=6.5。
本发明所述的试剂检测方法如下：
检测样品时，本发明提供的试剂中胶乳颗粒上的Try-2抗体与样品中的Try-2抗原发生抗体抗原反应，从而使得胶乳逐渐凝聚，改变了测试液的浊度。浊度的变化可以通过透射仪或者散射仪来测定。透射的吸光度或者散射光强度与样品中的Try-2浓度在一定浓度范围内成线性关系。通过参考Try-2校准品建立的定标曲线，可以定量地计算出被测样品中Try-2的浓度。
本发明的有益效果包括：
1.采用胶乳免疫比浊法，比市场上免疫荧光层析法的试剂灵敏度高、重复性好、检测速度快、使用场景广。
2.检测试剂的组成简单，只有单一试剂，不需要像市场现有试剂那样在测试时进行多试剂的混合操作，简化了操作程序。尤其是在使用半自动POCT设备的时候，为操作人员带来极大的便利，同时也更好地保障了测试的精确性。
3.该试剂反应快速，反应时间只需要1分钟。相比现有免疫荧光层析法试剂10到15分钟的检测时间，速度提高至少10倍，从而大大提升了检测效率,尤其有利于门诊的快速检测。
4.试剂适用性好，可以在透射或者散射仪上使用。既可以在全自动大型生化仪上使用，也可以在小型POCT设备上使用。可以同时满足大型医院检验科、住院部、小型医院门诊、以及急诊科室的检测需要。
附图说明
图1为实施例1在POCT设备上的定标曲线
实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细阐述。下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
实施例1
1）Try-2检测单试剂的制备
（1）取粒径333nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀。
（2）1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为5.0mg/mL的Try-2单克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液。将（1）中获得的胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h。12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂胰蛋白酶原2（Try-2）胶乳增强免疫比浊试剂。封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、0.1g/L曲拉通-X100、3g/L牛血清白蛋白、5g/L Triton X-100、1g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/LProclin300，pH=6.5。
2）在POCT设备上建立定标曲线
将6个Try-2校准品，浓度从0到2000ng/mL，分别与配制的Try-2胶乳单试剂在反应杯中反应，用POCT设备（本例中使用劳拉电子半自动特定蛋白分析仪EZ-400）进行检测，记录反应度。检测波长为650nm，检测散射光强度，采用两点速率法，反应时间60s，计算两点反应度差值。根据浓度和反应度差值可以建立定标曲线。图1是实施例1中按制备方法得到的胶乳单试剂建立的定标曲线。
实施例2
试剂的分析灵敏度（空白限）比对
使用实施例1中的试剂和国产上市试剂（广州一步医疗科技有限公司的尿胰蛋白酶原-2检测试剂盒（免疫荧光层析法），以下简称广州一步试剂），分别测试空白样本纯化水，重复测试20次，计算20次测试结果的平均值（X）和标准差（SD），计算X+2SD作为试剂的分析灵敏度。测试结果如表1所示，显示实施例1试剂的分析灵敏度为1.00ng/mL，广州一步试剂的分析灵敏度由于不显示具体数值而无法计算获得。胰蛋白酶原2（Try-2）的检测临床参考值在50ng/mL左右，本发明中实施例1中制备的Try-2胶乳增强免疫比浊单试剂的分析灵敏度比参考值要小50倍，完全符合使用的需要。
表1. 实施例1的试剂分析灵敏度测试结果
| 测试序号 | 实施例1试剂的测定结果（ng/mL） | 广州一步试剂的测定结果（ng/mL） |
| 1 | 0.14 | ＜20 |
| 2 | 0.56 | ＜20 |
| 3 | 0.54 | ＜20 |
| 4 | 1.56 | ＜20 |
| 5 | 0.16 | ＜20 |
| 6 | 0.09 | ＜20 |
| 7 | 0.16 | ＜20 |
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| 9 | 0.14 | ＜20 |
| 10 | 0.07 | ＜20 |
| 11 | 0.59 | ＜20 |
| 12 | 0.19 | ＜20 |
| 13 | 0.19 | ＜20 |
| 14 | 0.18 | ＜20 |
| 15 | 0.16 | ＜20 |
| 16 | 0.16 | ＜20 |
| 17 | 0.34 | ＜20 |
| 18 | 0.14 | ＜20 |
| 19 | 0.61 | ＜20 |
| 20 | 0.19 | ＜20 |
| 平均值（X） | 0.309 | 无法计算 |
| SD | 0.347 | 无法计算 |
| X+2SD | 1.002 | 无法计算 |
实施例
试剂的重复性比对
使用实施例1中的试剂和广州一步试剂，分别测试Try-2浓度为50ng/mL左右的控制物质，各重复测试10次，计算测量值的平均值（X）和标准差（SD）。按式（1）计算变异系数（CV）。测试结果见表2。根据测量结果，实施例1中的试剂重复性CV=3.1%，广州一步试剂的重复性CV=10.4%，表明本发明中实施例1中制备的Try-2胶乳增强免疫比浊单试剂的重复性要优于荧光层析法试剂。
CV =（SD/X）×100% …………………………(1)
式中：
CV ——变异系数；
SD ——标准差；
X ——测量值的平均值。
表2. 实施例1的重复性测量结果
| 测定序号 | 实施例1试剂的测定结果（ng/mL） | 广州一步试剂的测定结果（ng/mL） |
| 1 | 50.11 | 51.94 |
| 2 | 51.00 | 45.85 |
| 3 | 50.75 | 53.23 |
| 4 | 51.80 | 57.09 |
| 5 | 49.87 | 51.55 |
| 6 | 54.59 | 57.89 |
| 7 | 49.87 | 45.82 |
| 8 | 49.30 | 46.01 |
| 9 | 52.09 | 56.76 |
| 10 | 52.42 | 44.63 |
| 平均值（X） | 51.18 | 51.08 |
| SD | 1.59 | 5.19 |
| CV | 3.1% | 10.2% |
实施例
与市场上其他试剂的性能参数对比
本发明单试剂与市场上其他Try-2试剂盒性能参数对比情况如表3所列。
表3. Try-2试剂性能参数对比
| 产品来源 | 实施例1 | 国产上市试剂（广州一步医疗） |
| 方法学 | 胶乳增强免疫比浊法 | 免疫荧光层析法 |
| 试剂类型 | 液体 | 检测卡 |
| 灵敏度 | 在光径1cm时，试剂盒测试胰蛋白酶原2浓度约为200ng/mL的被测物时，其吸光度变化值△A应不小于0.0050 | 未标明 |
| 线性范围 | 20～2000ng/mL | 20～2000ng/mL |
| 重复性 | 变异系数（CV）≤10% | 变异系数（CV）≤15% |
| 检测耗时 | 1min | 10min |
| 使用方法 | 与适用仪器配套使用，适用仪器为全自动生化分析仪、半自动特定蛋白仪以及全自动特定蛋白仪。 | 与适用仪器配套使用，适用仪器为干式荧光免疫分析仪。 |
| 连续大通量检测 | 适用 | 不适用 |
从表3中可以看出，本发明的单试剂主要在试剂的重复性、灵敏度、检测速度、使用方法和范围等方面明显优于市场上的对比试剂。
Claims (2)
1.一种胰蛋白酶原2（Try-2）胶乳增强免疫比浊检测单试剂，其特征在于所述单试剂包括0.15mg/mL的Try-2抗体偶联胶乳颗粒、10mM乙二胺四乙酸二钠、0.1g/L曲拉通-X100、3g/L牛血清白蛋白、1-2g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/L Proclin300，pH=6.5；
其中所述的Try-2检测单试剂是按照如下方法制备的：
（1）取粒径333nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀；
（2）1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的Try-2多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液。将（1）中获得的胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h。12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂胰蛋白酶原2（Try-2）胶乳增强免疫比浊试剂。封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、0.1g/L曲拉通-X100、3g/L牛血清白蛋白、1-2g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/L Proclin300，pH=6.5。
2.根据权利要求1所述的胰蛋白酶原2（Try-2）胶乳增强免疫比浊检测单试剂，其特征在于，胰蛋白酶原2（Try-2）试剂原理采用的是胶乳增强免疫比浊法。
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