CN112462052A - 一种免疫层析的检测试纸条及其使用方法 - Google Patents

一种免疫层析的检测试纸条及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及免疫检测技术领域，具体公开了一种免疫层析的检测试纸条及其使用方法。一种免疫层析的检测试纸条包括基片区和位于基片区上表面的免疫检测区；所述免疫检测区包括：（1）样品区：所述样品区上设置有样品垫；（2）反应区：所述反应区是具有荧光线、检测线和质控线的硝酸纤维素膜；（3）吸收区：所述吸收区上设置有吸收垫；其使用方法为：S1.将待测复合物和样本稀释液混合均匀后滴加在样品垫上，平放静置180‑900秒；S2.通过荧光仪器读取信号。本申请的一种免疫层析的检测试纸条可用于检测CRP、SAA和D‑Dimer，其具有改善项目性能的优点。

Description

一种免疫层析的检测试纸条及其使用方法
技术领域
本申请涉及免疫检测技术领域，更具体地说，它涉及一种免疫层析的检测试纸条及其使用方法。
背景技术
荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型，从而能够定量检测待测物的浓度。
现有的免疫层析的检测试纸条基本由聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、吸收垫组成。一般采用喷微球的方式将发光物质固定在材质为玻璃纤维的样品垫上。当人或动物的体液样品滴在样品垫上，随着层析作用体液样品与发光物质结合，形成抗原-抗体复合物，接着复合物扩散至免疫检测区内，随着层析作用复合物扩散至免疫检测区。免疫检测区一般由包被检测抗体的检测线、包被质控抗体的质控线组成，当待测复合物流经检测线，样品中的待测的抗原抗体复合物，随着层析作用复合物扩散至免疫检测区。当待测复合物流经检测线，样品中的待测的抗原抗体复合物会被检测线的另一检测抗体捕获。通过对检测线、质控线的荧光信号值进行定量检测从而测得样品中目标抗原的含量。测线、质控线的荧光信号值进行定量检测从而测得样品中目标抗原的含量。
目前，市场采用的基本上是喷微球的方式，将荧光微球抗体复合物固定在玻璃纤维上，形成结合垫，这种喷微球的方式，在针对一些高灵敏度的项目时，没办法达到规定的线性范围上限，导致试剂的性能达不到技术要求。
发明内容
为了避免检测试剂达不到规定的线性范围上限，从而导致试剂的性能达不到技术要求的发生，本申请提供一种免疫层析的检测试纸条及其使用方法。
本申请提供的一种免疫层析的检测试纸条及其使用方法，采用如下的技术方案：
第一方面，本申请提供一种免疫层析的检测试纸条，采用如下的技术方案：
一种免疫层析的检测试纸条，包括基片区和位于基片区上表面的免疫检测区；
所述免疫检测区包括：
(1)样品区：所述样品区上设置有样品垫；
(2)反应区：所述反应区是具有荧光线、检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(3)吸收区：所述吸收区上设置有吸收垫。
通过取消现有技术中喷涂在样品垫上的荧光标记抗体，并在反应区上对应设置含有荧光标记抗体的荧光线，使得本申请中以固定有荧光线、检测线和质控线的条状纤维层析材料为固定相，待测复合物为流动相，待测复合物通过毛细管作用在反应区上移动。待测复合物先通过荧光线，并与荧光标记抗体结合，然后到达检测线，再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型，从而达到定量检测待测物浓度的目的。
通过改变荧光标记抗体的位置，使得检测试纸条在使用过程中，待测复合物快速通过样品垫后，与临近样品垫的荧光标记抗体复合物结合，在毛细管作用下，荧光标记抗体复合物能够更加快速的释放，在不影响检测灵敏度的情况下改善了线性范围的相关性，防止提前产生HOOK效应，进一步改善检测上限，改善临床的相关性。
优选的，所述样品垫为玻璃纤维膜或无纺布，所述吸收垫为滤纸。
优选的，所述基片区可选用聚乙烯底板、聚氯乙烯底板、聚丙烯底板或聚苯乙烯底板中的一种。
优选的，所述荧光线靠近样品垫，质控线远离样品垫，检测线位于荧光线和质控线之间。
通过采用上述技术方案，随着待测复合物的毛细管作用，荧光线对经过的待测复合物进行标记，然后随着待测复合物的流动，检测线对待测复合物进行检测以判断待测复合物是否存在，控制线则用来证明待测复合物确实经过了整个测试纸条，以确保待测复合物经过检测线。
优选的，所述荧光线与样品垫端之间的距离为1-2mm。
通过采用上述技术方案，荧光线与样品垫端之间的距离控制在1-2mm，以保证待测复合物和荧光线上的抗体荧光荧光标记抗体充分结合；若荧光线与样品垫端之间的距离大于2mm，则存在在层析过程中待测复合物与荧光线反应时间过短，造成测试结果的精确度降低。
优选的，所述检测线与荧光线之间的距离为6-9mm，所述检测线与质控线之间的距离为4-6mm。
通过采用上述技术方案，控制检测线和荧光线之间的距离，检测线和质控线之间的距离，能够有利于进一步提高该检测试纸条的检测性能。
优选的，所述荧光线为硝酸纤维素膜包被有偶联抗体的荧光微球的识别位点。
通过采用上述技术方案，由于荧光微球的荧光具有持续稳定的特性，通过包被有偶联抗体的荧光微球能够使得检测试纸条具有测量时间较短、检测结果较为稳定的优点。
优选的，所述质控线为硝酸纤维素膜包被有质控抗体的识别位点；所述检测线为硝酸纤维素膜包被有检测抗体的识别位点。
通过采用上述技术方案，检测抗体的存在，使得检测线能够被用于确定待测物是否存在的依据；质控抗体的存在，则使控制线被用来质控试剂的系统偏差。
优选的，所述检测抗体包括但不限定为CRP单克隆抗体-2、SAA单克隆或其他克隆抗体中的一种，所述质控抗体包括但不限定为DNP抗体,羊抗鸡IgY或羊抗鼠IgG中的一种。
第二方面，本申请提供一种免疫层析的检测试纸条的使用方法，采用如下的技术方案：
一种免疫层析的检测试纸条的使用方法，包括以下步骤：
S1.将待测复合物和样本稀释液混合均匀后吸取75-100ul滴加在加样孔上，平放静置180-900秒；
S2.通过荧光仪器读取信号。
通过采用上述技术方案，采用待测复合物和样本稀释液的混匀液滴加在加样孔上，使得待测复合物能够扩散到免疫检测区。
优选的，所述待测复合物和样本稀释液混合液滴加量为75-100ul。
通过采用上述技术方案，控制待测复合物和样本稀释液混合液滴加量为75-100ul，保证检测试纸条能够得到检测效果，若用量过低则存在待测复合物凝固过快导致待测复合物无法渗透到质控线；同时，若用量过高则容易造成层析速率过快，待测复合物与检测线抗体的结合时间果断，存在结合不充分，造成信号值偏低的情况。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请采用将荧光微球点喷在硝酸纤维素膜上，取消现有技术位于样品垫上的荧光微球，获得了在不影响试剂检测灵敏度的情况下改善了线性范围的相关性，防止提前产生HOOK效应，进一步改善了检测上限，改善临床相关性的效果。
2、荧光线与样品垫端之间的距离控制在1-2mm，以保证待测复合物和荧光线上的抗体荧光微球复合物充分结合；若荧光线与样品垫端之间的距离大于2mm，则存在在层析过程中待测复合物与荧光线反应时间过短，造成测试结果的精确度降低。
3、本申请采用Tris-HCL缓冲液对生物化学过程的干扰很小，能够为偶联抗体的荧光微球提供一个最合适的化学反应环境，且由于Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液。
附图说明
图1是本实施例中免疫层析的检测试纸条示意图。
附图标记：1、基片区；2、样品区；3、反应区；31、荧光线；32、检测线；33、质控线；34、硝酸纤维素膜；4、吸收区
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
在以下实施例中所使用的原料来源如下表1所示：
表1-原料来源
原料 货号 产家
荧光微球 IF8827 Bangs
硝酸纤维素膜 B10600004 赛多利斯
Tris-HCL缓冲液 T6455 Sigma
吐温-20 93773 Sigma
吐温-80 / Sigma
牛血清白蛋白 A1933 Sigma
聚乙二醇 PEG4000 Sigma
蔗糖 / 市售
proclin300 48912 Sigma
磷酸盐缓冲液 17202 Sigma
实施例
本申请文件公开了一种免疫层析的检测试纸条，参照图1，包括基片区1和位于基片区1上表面的免疫检测区，其中基片区1为聚乙烯底板，在其他实施方式中基片区1为聚氯乙烯底板、聚丙烯底板或聚苯乙烯底板中的一种；
免疫检测区包括：
(1)样品区2：样品区2上设置有样品垫，本实施例中样品垫的材料为玻璃纤维膜或无纺布；
(2)反应区3：反应区3是具有荧光线31、检测线32和质控线33的硝酸纤维素膜34，在其他实施方式中硝酸纤维素膜34可替换为通常所用的层析介质；
(3)吸收区4：吸收区4上设置有吸收垫，吸收垫为滤纸裁切而成。
免疫检测区的距离为25mm。荧光线31、检测线32和质控线33按照待测复合物在硝酸纤维素膜34上的渗透方向依次排列，荧光线31与样品垫端之间的距离为2mm，检测线32与荧光线31之间的距离为8mm，检测线32与质控线33之间的距离为4mm。
在另一种实施方式中，免疫检测区的距离为25mm，荧光线31与样品垫端之间的距离为2mm，检测线32与荧光线31之间的距离为9mm，检测线32与质控线33之间的距离为5mm。
本申请文件还公开了一种免疫层析的检测试纸条的制备方法及其使用方法，采用如下的技术方案：
S1、制备偶联抗体的荧光微球；
S2、制备微球稀释液：
S21、按重量份准备包含吐温、牛血清白蛋白、聚乙二醇、蔗糖、防腐剂和Tris-HCL缓冲液的原料；
S22、依次将吐温、牛血清白蛋白、聚乙二醇、蔗糖、防腐剂加入Tris-HCL缓冲液中，搅拌均匀，得到微球稀释液。
S3、制备微球复合物工作液：将偶联抗体的荧光微球与微球稀释液混匀，得到微球复合物工作液；
S4、包被抗体：通过点喷方式将检测抗体包被在硝酸纤维素膜34上形成检测线32，通过点喷方式将质控抗体包被在硝酸纤维素膜34上形成质控线33；
S5、包被荧光标记抗体复合物：通过点喷方式将荧光标记抗体复合物工作液包被于硝酸纤维素膜34上形成荧光线31；
S6、组装检测试纸条：将包被好的硝酸纤维素膜34和样品垫、吸收垫黏接在一起并固定在基片区1上，并切成所需宽度的检测试纸条。
S7、待测复合物和样本稀释液混合均匀后滴加在样品垫上，平放静置；
S8、通过荧光仪器读取信号
该制备方法和使用方法的实施例1-3为：人C反应蛋白(CRP)检测。
实施例1：本实施例提供了一种免疫层析的检测试纸条的制备方法及使用方法，采用如下的技术方案：
S1、制备偶联抗体的荧光微球：将抗体和荧光微球在偶联缓冲液中结合60min。偶联缓冲液为0.02M磷酸盐缓冲液。
S2、制备微球稀释液：
S21、按重量份(见表2)准备包含吐温、牛血清白蛋白、PEG4000、蔗糖、proclin300和Tris-HCL缓冲液的原料。
S22、依次将吐温、牛血清白蛋白、PEG4000、蔗糖、proclin300加入位于搅拌机中的Tris-HCL缓冲液，搅拌均匀，得到微球稀释液。
S3、制备荧光标记抗体复合物工作液：将偶联抗体的荧光微球与微球稀释液混匀，得到荧光标记抗体复合物工作液；
S4、包被抗体：将C反应蛋白(CRP)检测抗体(CRP单克隆抗体-2)用包被缓冲液稀释成固定浓度(1.0mg/ml)，质控抗体(羊抗鼠IgG抗体)稀释成固定浓度(0.2mg/ml)，采用划膜喷金一体机喷涂在硝酸纤维素膜34上。包被缓冲液为0.01M的磷酸缓冲液加3wt％的蔗糖作为保护剂。
S5、包被荧光标记抗体复合物：通过划膜喷金一体机将荧光标记抗体复合物工作液点喷在包被有检测线抗体和质控线抗体的硝酸纤维素膜34上。
S6、将包被有抗体和荧光标记抗体复合物的NC膜，置于45℃干燥箱干燥24小时，备用。
S7、组装检测试纸条：将包被好的硝酸纤维素膜34和样品垫、吸收垫黏接在一起并固定在基片区1上，并切成所需宽度的检测试纸条；
S8、检测试纸条的使用方法：用普通枪头取样品于样品稀释液中，混匀，再取75μL稀释后的样品加到加样孔上，反应一段时间后通过荧光仪器读取数据。样品稀释液为含有0.5wt％吐-20的20mmol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液。
实施例2-3，一种免疫层析的检测试纸条的制备方法，与实施例1区别点在于：各组分添加量及反应条件如表2所示。
实施例4为人血清淀粉样蛋白(SAA)检测，与实施例1的区别点在于：将S4步骤中的C反应蛋白(CRP)检测抗体(CRP单克隆抗体-2)替换为人血清淀粉样蛋白(SAA)检测抗体(SAA单克隆抗体-2)、S8步骤中放置时间180s替换为900s。
表2
Figure BDA0002786010200000061
Figure BDA0002786010200000071
对比例1：将公开号为CN108226466B公开的一种免疫层析试纸条作为参照对象。
检测方法1：取实施例1和对比例1中的检测试纸条，取2组人C反应蛋白(CRP)对照试剂(数据由浙江夸克生物科技有限公司提供)，每组对照试剂包括34份不同浓度的对照试剂，其浓度见表3，将2组对照试剂分别滴在实施例1和对比例1检测试纸条的样品垫上，放置180s，通过荧光仪器得到结果(见表3)。
表3
Figure BDA0002786010200000081
Figure BDA0002786010200000091
检测方法2：取实施例1和对比例1中的检测试纸条，取2组人血清淀粉样蛋白(SAA)对照试剂(对照试剂浓度由西门子免疫比蚀法检测获得)，每组对照试剂包括34份不同浓度的对照试剂，其浓度见表4，将2组对照试剂分别滴在实施例4和对比例1检测试纸条的样品垫上，放置900s，通过荧光仪器得到结果(见表4)。
表4
Figure BDA0002786010200000092
Figure BDA0002786010200000101
通过表3能够看出，在样本编号为25中，对照试剂的浓度为95.2，实施例1和对比例1中的检测试纸条的检测结果分别为96.464和52.959，可以看出本申请中的检测试纸条能够较为准确的测出样本标号为25中样品的浓度，而对比例1中测出结果与实际结果差别较大。
通过表3中样品编号26-34中实施例1和对比例1的检测结果看出，随着样品浓度的提高，本申请制备得到的检测试纸条能够得到较为准确的结果，而对比例1中的检测试纸条无法得到准确的结果。
通过表4能够看出，在样本编号为27中，对照试剂的浓度为111.27，实施例4和对比例1中的检测试纸条的检测结果分别为126.09和83.21，可以看出本申请中的检测试纸条能够较为准确的测出样本标号为27中样品的浓度，而对比例1中测出结果与实际结果差别较大。
通过表4中样品编号28-34中实施例4和对比例1的检测结果看出，随着样品浓度的提高，本申请制备得到的检测试纸条能够得到较为准确的结果，而对比例1中的检测试纸条无法得到准确的结果。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种免疫层析的检测试纸条，其特征在于，
包括基片区（1）和位于基片区（1）上表面的免疫检测区；
所述免疫检测区包括：
（1）样品区（2）：所述样品区（2）上设置有样品垫；
（2）反应区（3）：所述反应区（3）是具有荧光线（31）、检测线（32）和质控线（33）的硝酸纤维素膜（34）；
（3）吸收区（4）：所述吸收区（4）上设置有吸收垫。
2.根据权利要求1所述的一种免疫层析的检测试纸条，其特征在于：所述荧光线（31）靠近样品垫，质控线（33）远离样品垫，检测线（32）位于荧光线（31）和质控线（33）之间。
3.根据权利要求2所述的一种免疫层析的检测试纸条，其特征在于：所述荧光线（31）与样品垫端之间的距离为1-2mm。
4.根据权利要求3所述的一种免疫层析的检测试纸条，其特征在于：所述检测线（32）与荧光线（31）之间的距离为6-9mm，所述检测线（32）与质控线（33）之间的距离为4-6mm。
5.根据权利要求1所述的一种免疫层析的检测试纸条，其特征在于：所述免疫检测区的宽度为25mm。
6.根据权利要求1所述的一种免疫层析的检测试纸条，其特征在于： 所述荧光线（31）为硝酸纤维素膜（34）包被有偶联抗体的荧光微球的识别位点。
7.根据权利要求1所述的一种免疫层析的检测试纸条，其特征在于：所述质控线（33）为硝酸纤维素膜（34）包被有质控抗体的识别位点；所述检测线（32）为硝酸纤维素膜（34）包被有检测抗体的识别位点。
8.根据权利要求7所述的一种免疫层析的检测试纸条，其特征在于：所述检测抗体包括但不限定于为CRP单克隆抗体-2、SAA单克隆抗体或多克隆抗体中的一种，所述质控抗体包括但不限定为DNP抗体,羊抗鸡IgY或羊抗鼠IgG中的一种。
9.权利要求1-8所述免疫层析的检测试纸条的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将待测复合物和样本稀释液混合均匀后滴加在样品垫上，平放静置180-900秒；
S2.通过荧光仪器读取信号。
10.根据权利要求9所述的一种免疫层析的检测试纸条的使用方法，其特征在于：所述待测复合物和样本稀释液的体积比为1：（3-200）。
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