CN112513613A - 用于放大侧向流动测定信号的系统、装置和方法 - Google Patents

Abstract

本文所述的侧向流动测定装置、系统和方法通过放大检测区产生的信号来检测以低含量或低浓度存在于样品中的分析物。产生的信号可以超过测量系统的检测阈值并增加侧向流动测定装置、系统和方法的灵敏度。在一方面，侧向流动装置包括信号放大缀合物，其结合至在检测区中结合至固定化捕获剂的复合物，在检测区中引起结合事件的链式反应，其导致检测区中产生的信号放大。

Description

用于放大侧向流动测定信号的系统、装置和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月18日提交的美国临时申请号62/686,606的权益，其因而通过引用以其全部并入。

技术领域

本公开内容一般地涉及侧向流动装置、测试系统和方法。更具体地，本公开内容涉及能够通过放大检测信号测量以低含量或低浓度存在于样品中的分析物的侧向流动测定(lateral flow assay)装置。

背景技术

包括侧向流动测定的免疫测定系统提供了可靠、廉价、便携式、快速、简单的诊断测试。侧向流动测定可以快速且准确地检测样品中是否存在目标分析物，并在一些情况下对其进行定量。有利地，侧向流动测定可以是微创的，并用作即时(point-of-care)测试系统。

侧向流动测定产生可被测量以指示样品中目标分析物的存在、不存在或含量的信号。然而，当分析物以低含量或低浓度存在于样品中时，由在侧向流动测定的测试区域中捕获的标记分析物产生的信号可能不超过测量系统读取并处理该信号的检测阈值。因此，侧向流动测定可能无法提供目标分析物存在于样品中的可靠或准确的指示。

发明内容

因此，本公开内容的一方面是提供可以检测样品中分析物的存在、不存在或含量的改进的侧向流动测定。本文所述的方法和系统的实施方式可以测量分析物的存在，并且在一些情况下，测量分析物的含量或浓度，即使当分析物以低含量或低浓度存在并且通常会导致产生的信号处于低于测量系统的检测阈值的水平时。因此，本文所述的系统、装置和方法的实施方式对于甚至处于低含量或低浓度的目标分析物也非常灵敏。另外，本文所述的方法和系统的实施方式可以以比现有方法和系统更高的置信度确定样品中不存在目标分析物。本公开内容的实施方式中不存在可检测的信号可以可靠地指示样品中不存在目标分析物(与分析物实际存在但处于如此的低浓度——所产生的信号落在系统的检测阈值以下——的情况相反)。因此，本公开内容的实施方式可以减少假阴性读数。如以下将详细描述的，根据本公开内容的侧向流动测定将侧向流动测定的测试区域比如捕获区中产生的信号放大至允许常规测量系统检测样品中以低含量或低浓度存在的目标分析物的水平。

在由反射型标记物(比如但不限于金纳米颗粒标记物和不同颜色的乳胶颗粒)产生的光学信号的背景下，本文描述了由根据本公开内容的测定产生的信号。虽然在本文中通过参考“光学”信号描述了本公开内容的实施方式，但是应当理解，本文所述的测定可以使用用于标记物以便产生信号的任何适当的材料，其包括但不限于产生荧光信号的荧光型乳胶珠标记物和产生指示与测定相关的磁场变化的信号的磁性纳米颗粒标记物。

本文所述的侧向流动测定的实施方式在其中目标分析物以低含量或低浓度存在于测试条上的诊断测试中特别有利。目标分析物可能出于许多原因而以低浓度存在于测试条上，其包括但不限于施加至测试条的样品中存在有限含量的目标分析物和有限体积的样品被施加至测试条。虽然参考检测处于低浓度的目标分析物描述了本公开内容的实施方式，但是应当理解，本公开内容还可以检测低含量的目标分析物。

本文公开的一些实施方式涉及用于检测样品中的目标分析物的侧向流动测定。侧向流动测定包括包含第一标记物、配置为特异性结合至目标分析物的试剂和第一结合伴侣的第一缀合物；沿着侧向流动测定的流体流动路径在第一缀合物上游的第二缀合物，其中第二缀合物包含第二标记物和配置为特异性结合至第一结合伴侣的第二结合伴侣；和沿着侧向流动测定的流体流动路径在第一缀合物和第二缀合物下游的检测区，检测区包含特异性结合目标分析物的固定化捕获剂。

第一缀合物可以存在于侧向流动测定的样品接收区中，或者其中第一缀合物存在于在样品接收区下游的第一缀合物区中。第二缀合物可以存在于在样品接收区上游的缓冲液接收区中，或者其中第二缀合物存在于缓冲液接收区下游和样品接收区上游的第二缀合物区中。第一缀合物可以配置为在将流体样品施加至侧向流动测定之后溶解并移动至检测区。第二缀合物可以配置为在第一缀合物移动至检测区之后溶解和移动至检测区。

配置为特异性结合至目标分析物的试剂可以是特异性结合目标分析物的抗体或抗体结合片段。第一结合伴侣和第二结合伴侣可以包括选自以下的结合对：抗原/抗体、半抗原/抗体、激素/受体、核酸链/互补核酸链、底物/酶、抑制剂/酶、碳水化合物/凝集素、生物素/抗生物素蛋白、受体/配体和病毒/细胞受体。第一结合伴侣和第二结合伴侣包括生物素/抗生物素蛋白结合对，并且抗生物素蛋白可以包括链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白(neutravidin)。第一结合伴侣和第二结合伴侣可以包括抗原/抗体结合对，并且抗原可以包括肽或十肽。目标分析物可以是目标生物物质或环境物质。目标分析物可以是流感病毒。流感病毒可以是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。固定化捕获剂可以是特异性结合目标分析物的抗体或抗体结合片段。测试条可以包括硝化纤维膜。侧向流动测定还可以包括对照区，该对照区包含特异性结合第一缀合物的固定化捕获剂。

第一和第二标记物可以选自金属纳米颗粒、蓝色乳胶珠、金属纳米颗粒、有色乳胶颗粒、有色乳胶珠、磁性颗粒、碳纳米颗粒、量子点、上转换磷光体(up convertingphosphor)、有机荧光团、纺织染料、酶或脂质体。第一标记物和第二标记物可以包括金纳米颗粒。第一标记物和第二标记物可以配置为产生光学信号、荧光信号或磁信号。

侧向流动测定还可以包括外壳，该外壳包含横向定位在第一缀合物上方或上游的样品孔、横向定位在第二缀合物区的上方或上游的缓冲液孔和可进入检测区的读取窗口。缓冲液孔、第二缀合物区、样品接收孔和第一缀合物区可沿着侧向流动测定的流体流动路径空间上分离。

本文公开的进一步的实施方式涉及进行侧向流动测定的方法。该方法包括在侧向流动测试条的样品接收区处或其下游，将第一缀合物施加至侧向流动测试条；和在样品接收区上游的缓冲液接收区处或其下游，将第二缀合物施加至测试条。可以将第一缀合物和第二缀合物同时施加至测试条。可以通过空气喷射沉积将第一缀合物和第二缀合物施加至测试条。

本文所述的其他实施方式涉及检测样品中目标分析物的方法。该方法包括将样品施加至侧向流动测定。侧向流动测定包括包含第一标记物、配置为特异性结合至目标分析物的试剂和第一结合伴侣的第一缀合物；沿着侧向流动测定的流体流动路径在第一缀合物上游的第二缀合物，其中第二缀合物包含第二标记物和配置为特异性结合至第一结合伴侣的第二结合伴侣；和沿着侧向流动测定的流体流动路径在第一缀合物和第二缀合物下游的检测区，该检测区包含特异性结合目标分析物的固定化捕获剂。该方法还包括将复合物结合至检测区中的固定化捕获剂，其中该复合物包含结合至第一缀合物的目标分析物。在结合复合物之后，该方法包括释放第二缀合物以沿着侧向流动测定的流体流动路径流动。该方法进一步包括将第二缀合物结合至在检测区中结合的复合物。

该方法可以包括检测由在检测区中结合的复合物和第二缀合物产生的信号。该方法还可以包括将未结合至目标分析物的第一缀合物结合至在检测区中结合至复合物的第二缀合物。第一标记物和第二标记物可以配置为产生光学信号、荧光信号或磁信号。可以在将样品施加至侧向流动装置之后5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟释放第二缀合物。

将复合物结合至检测区中的固定化捕获剂可以包括用第一缀合物标记目标分析物以形成复合物；和将复合物结合至检测区中的固定化捕获剂。释放第二缀合物可以包括将缓冲溶液施加至第二缀合物或施加至在第二缀合物上游的侧向流动测定上的位置。施加缓冲溶液可以包括将缓冲溶液倒入横向定位在第二缀合物上方或上游的缓冲液接收孔。

附图说明

图1示出了根据本公开内容的实例侧向流动装置的顶视图，其包括缓冲液孔、样品孔和读取窗口。

图2示出了根据本公开内容的侧向流动信号放大测定的实例测定测试条。

图3示意性地示出了根据本公开内容的放大由测定测试条产生的信号的实例方法。

图4示出了根据本公开内容在侧向流动装置上进行的信号放大反应的结果，其指示信号强度为对照信号(不存在信号放大缀合物-◆)和测试信号(具有信号放大缀合物-■)的读取时间的函数。

图5示出了根据本公开内容在侧向流动装置上进行的信号放大反应的结果，该结果指示信号强度为分析物浓度的函数，包括在10分钟(◆)和20分钟(▲)后在没有信号放大缀合物的情况下进行的测定的对照信号，和在10分钟(■)和20分钟(●)后具有信号放大缀合物的情况下的测试信号。

图6示出了使用侧向流动测定来检测样品中低浓度的目标分析物的实例方法的流程图。

具体实施方式

常规侧向流动夹心测定包括具有沿着流体流动路径布置的缀合物垫(pad)(或标记区)、捕获或测试区和吸收垫的测试条，其通常但不一定沿着测试条的纵轴布置。测试条可以包括缀合物垫上游的样品接收区或孔。缀合物垫包括标记的分析物特异性抗体，其通常被称为缀合物。该缀合物中的标记物可以包括缀合至检测器分子的分析物特异性抗体，比如但不限于金纳米颗粒。捕获区包括固定化捕获剂，例如固定在载体材料比如硝化纤维膜上的分析物特异性抗体。吸收垫辅助施加至缀合物垫(或样品接收区，如果存在)的液体样品流动通过载体材料至捕获区。当将液体样品施加至测试条(在样品接收孔或缀合物垫处)时，标记的分析物特异性抗体被再水合并变得可移动。当存在抗体特异性目标分析物时，分析物将结合至标记的分析物特异性抗体并形成分析物–抗体–检测器复合物，该复合物向下游移动通过载体材料至测试区。在测试区中，分析物–抗体–检测器复合物中的分析物与固定化在捕获区中的分析物特异性抗体相互作用以形成抗体–分析物–抗体–检测器结构，其通常被称为夹心结构。当在捕获区中形成阈值数量的这些夹心结构时，可以通过测量系统检测由夹心结构中的检测器分子产生的信号。

测量系统可以处理检测到的信号以确定样品中目标分析物的存在和在某些情况下确定其含量。如果样品中不存在目标分析物，那么不会形成分析物–抗体–检测器复合物，并且因此，在捕获区中不会形成夹心结构。在该实例中，捕获区中不存在检测器分子，并且测量系统将不存在来自捕获区的信号与样品中不存在目标分析物相关联。在其中目标分析物实际存在于样品中但以非常低含量或浓度的情况下，捕获区中形成的夹心结构的数量可非常少。在一些实例中，夹心结构的数量如此低使得由检测器分子产生的信号低于测量系统的检测阈值。在这种情况下，测量系统将不存在来自捕获区的信号(或不存在系统检测阈值以上的信号)与样品中不存在目标分析物相关联，即使目标分析物实际存在于样品中但以非常低的含量或浓度。因此，常规侧向流动夹心测定对于以低含量或低浓度存在的目标分析物具有有限的灵敏度。

本文所述的装置、系统和方法通过放大在施加至侧向流动测定的样品中在目标分析物存在下产生的信号解决了这些和其他缺点。有利地，即使当目标分析物以低浓度存在时，根据本公开内容的装置、系统和方法的实施方式可以将在侧向流动测定的测试区域比如捕获区处产生的信号放大至高于常规读取器的检测阈值的水平。根据本公开内容的侧向流动装置、测试系统和方法包括信号放大缀合物，其结合至(1)在捕获区结合至固定化捕获剂的第一分析物特异性缀合物，和(2)存在于捕获区但不结合至固定化捕获剂的第二、残余分析物特异性缀合物二者。在捕获区中的结合事件的多级链式反应中，第二、先前未结合的残余分析物特异性缀合物(已在捕获区中结合至第一信号放大缀合物)包括与第二信号放大缀合物相互作用并与其结合的另外的结合位点，第二信号放大缀合物本身与存在于捕获区中的第三、残余分析物特异性缀合物相互作用并与其结合，等等。

在捕获区存在可能通过与信号放大缀合物的结合相互作用已结合的另外的分析物特异性缀合物，可以将在捕获区产生的信号的强度增大至超过常规测量系统的检测阈值的水平。在捕获区中存在结合的信号放大缀合物还可以将在捕获区产生的信号的强度增大至超过测量系统的检测阈值的水平。本公开内容的实施方式通过将由侧向流动测定产生的信号增大到常规可检测的范围而不是更改测量系统的特征来提高侧向流动测定的灵敏度，这有利地允许根据本公开内容的侧向流动测定向后(backwards)兼容常规侧向流动测定测试系统。

不受任何理论的束缚，据信，信号放大缀合物形成支架(scaffold)，在该支架上可以捕获通常将穿过捕获区的另外的分析物特异性缀合物并将其保留在捕获区中，从而导致在捕获区产生放大的信号。除了分析物特异性缀合物中的检测器分子之外，信号放大缀合物也可以包括检测器分子，使得已结合在捕获区中的信号放大缀合物也在捕获区中产生信号，由此有助于将在捕获区产生的信号的强度增大至高于检测阈值的水平。有利地，本公开内容的实施方式不依赖于或不要求存在于样品中的所有或基本上所有目标分析物均结合至分析物特异性缀合物和结合至捕获区中的固定化捕获剂以便捕获区中的信号被放大。本公开内容的优点是，甚至非常低水平的目标分析物(例如，在具有以低浓度存在的目标分析物的样品的情况下)结合至分析物特异性缀合物和捕获区中固定化的捕获剂也允许在捕获区中发生结合事件的链式反应，而与支架内存在或不存在目标分析物无关——其在一些量的(在一些情况下非常少量的)目标分析物在捕获区中与固定化捕获剂结合之后形成。因此，本文描述的系统、装置和方法的实施方式可以极大地提高侧向流动测定对于以甚至少量存在于样品中的目标分析物的灵敏度。

除了增加用于测量样品中处于低浓度的目标分析物的存在、不存在或含量的侧向流动测定的灵敏度之外，本文所述的装置、系统和方法可以有利地在即时环境中进行，而无需使用高度专业化的，在一些情况下耗时的，通常用于分析样品中低浓度的分析物的样品制备技术和检测系统，比如聚合酶链式反应(PCR)。本文描述的侧向流动装置的实施方式为使用者提供了方便、易于使用的格式，快速产生可以由常规读取器检测到的信号，并且可以在即时环境(point-of-care setting)而不是场外实验室设施中进行。

本描述旨在说明用于测量测试样品中的目标分析物——即使当以低浓度存在时——的测试条。本领域技术人员将认识到，该实例旨在是示例性的，并且可以对本文描述的侧向流动测定进行各种更改和变化。例如，样品可以包括以低浓度存在的一种或多种目标分析物，并且测定测试条可以测量一种或多种目标分析物。在各种迭代(iteration)的每个中，侧向流动测定包括根据本公开内容的特征以放大检测处区的信号以便测量测试样品中的分析物。

当要检测超过一种目标分析物——例如样品中的多种目标分析物时，检测区可以包括特异于每种目标分析物的单独捕获区。例如，样品可以包括三种目标分析物：第一目标分析物、第二目标分析物和第三目标分析物。侧向流动测定的检测区因而将包括三个捕获区：特异于第一目标分析物的第一捕获区、特异于第二目标分析物的第二捕获区和特异于第三目标分析物的第三捕获区。

因此，本公开内容提供了用于测量测试样品中的目标分析物——即使当以低浓度存在时——的测定测试条；包括测试条的侧向流动测定；使用本文所述的测试条测量目标分析物的方法；以及制造本文所述的测定测试条的方法。

本文所述的侧向流动测定的实施方式在其中测试条上存在低含量的目标分析物的诊断测试中是特别有利的。虽然本公开内容的实施方式在本文中参考由于分析物以低浓度存在于样品中因此低含量的分析物存在于测试条上进行描述，应当理解，当样品含有能够产生高于检测阈值的信号的分析物量但仅有限量的样品被施加至测试条时，本公开内容的实施方式也适用。

下文参考附图更全面地描述了装置、测试系统和方法的各个方面。然而，本公开内容可以以许多不同形式实施。基于本文教导，本领域技术人员将领会，本公开内容的范围旨在覆盖本文公开的装置、测试系统和方法的任何方面，无论独立于本公开内容的任何其他方面实施还是与本公开内容的任何其他方面组合实施。例如，使用本文阐述的任何数量的方面，可以实施装置或者可以实践方法。

虽然本文描述了具体方面，但是这些方面的许多变化和置换都落在本公开内容的范围内。虽然提及了一些益处和优点，但是本公开内容的范围不旨在限于具体的益处、用途或目的。相反，本公开内容的方面旨在更广泛地适用于不同的检测技术和装置配置，其中一些在附图中和以下描述中以实例方式示出。

常规侧向流动装置

本文描述的侧向流动装置是在侧向流动层析中使用的分析装置。侧向流动测定是可以在本文所述的侧向流动装置上进行的测定。侧向流动装置可以在测定测试条上实施，但其他形式可以是合适的，例如浸量尺、流通装置或微流体装置。在测试条格式中，将含有或怀疑含有分析物的流体样品放置在样品接收区。在目标分析物接触测试条之后，其变为被标记的。然后使现在标记的目标分析物(例如，通过毛细作用)流动通过该条。该条可以由介质比如纸、硝化纤维素、纤维素、纤维或尼龙或允许样品流动通过介质的其他材料制成。

这种测定被称为夹心测定。在产生光学信号的反射型标记物(比如金纳米颗粒标记物和不同颜色的乳胶颗粒)的背景下描述了根据本公开内容的夹心测定，但应当理解，根据本公开内容的测定可以包括配置为产生荧光信号的乳胶珠标记物，配置为产生磁信号的磁性纳米颗粒标记物，或配置为产生可检测信号的任何其他标记物。夹心型侧向流动测定包括沉积在固体基质上样品接收区处的标记的缀合物。在将样品施加至样品接收区之后，标记的缀合物在样品中溶解或增溶，随后标记的缀合物识别并特异性结合样品中分析物上的第一表位，形成标记物–缀合物–分析物复合物。该复合物沿着液体前沿从样品接收区流动通过固体基质至固定化捕获剂(例如固定化的分析物特异性抗体)定位其中的检测区(有时被称为“测试线”或“捕获区”)。在其中分析物为多聚体或在相同单体上含有多个相同表位的一些情况下，沉积在样品接收区处的标记的缀合物可以与在检测区中固定化的捕获剂相同。固定化捕获剂识别并特异性结合分析物上的表位，由此在检测区处捕获标记物–缀合物–分析物复合物。如果分析物以足够的含量存在，则在检测区存在标记的缀合物在检测区处提供了可检测的信号。在一个非限制性实例中，金纳米颗粒用于标记缀合物，因为它们相对便宜、稳定，并且由于金纳米颗粒的表面等离子体共振特性而提供易于观察的颜色指示。

在检测区产生的信号的检测可以指示目标分析物存在于样品中。例如，如果信号超过测量系统的检测阈值，则测量系统可以检测样品中分析物的存在以及在一些情况下样品的含量。然而，在检测区不存在任何可检测的信号可以指示目标分析物不存在于样品中或者其可能以低于检测限存在。例如，如果样品不含有任何目标分析物，则样品将仍然溶解标记的缀合物并且标记的缀合物将仍然流动至检测区。然而，标记的缀合物在检测区将不结合至固定化的缀合物。相反，它将流动通过检测区，穿过对照线(如果存在)，并且，在一些情况下，流动至任选的吸收区。一些标记的缀合物将结合至沉积在对照线上的对照试剂并在对照线上产生可检测的信号，指示装置正常工作。在其中存在分析物但其量低于检测限的情况下，标记物–缀合物–分析物复合物在检测区结合，但不会被检测到。在这些情况下，不存在从检测区发出的可检测的信号意味着使用者无法确定性地确认样品中不存在分析物还是样品中存在低于测量系统的检测限的分析物。

根据本公开内容的实例侧向流动信号放大装置

本文所述的侧向流动测定、测试系统和方法解决了侧向流动测定不能够确定样品不存在分析物与存在量低于检测限的分析物之间的差异的这些和其他缺点。除了改进分析物的定性测量之外，本公开内容的测定、测试系统和方法的实施方式还可以极大地提高通过常规读取器的测量灵敏度，在一些情况下允许定量测量分析物。

图1示出了根据本公开内容的实例侧向流动装置100。测定测试条被接收在装置100的外壳内。在侧向流动装置100的该非限制性实例中，外壳限定了缓冲液孔110、样品孔120和读取窗口130。侧向流动装置100的尺寸和形状可以适于易于使用、快速递送测试结果、便携、自动读取器内的适当运行和放置、材料使用和成本的经济性或其他考虑事项。因此尺寸和形状不限于任何特定尺寸或形状，并且可以容易地更改以适合特定需求或特定使用情况的要求。

图2示出了根据本公开内容的实例测定测试条101。测定测试条101可以被接收或容纳在图1的侧向流动装置100内。在该非限制性实施方式中的实例测定测试条101包括基质、具有样品接收区和缓冲液接收区的测定膜、检测区和吸收垫。应当理解，本公开内容不限于该实例测定测试条，并且可以根据本公开内容实施具有不同特征的其他测定测试条。

在图2的实施方式中，测定测试条101包括背衬卡102、具有样品接收区121和缓冲液接收区111的缀合物垫103、具有检测区131的膜104和吸收垫105。膜104可以为硝化纤维素材料。测定测试条101被容纳在侧向流动装置100内，使得可通过缓冲液孔110进入缓冲液接收区111，可通过样品孔120进入样品接收区121，并且可通过读取窗口130进入检测区131。可以通过测量在检测区131产生的信号(如果有的话)在读取窗口130处测量测定的结果。

背衬卡102可以是足以支撑测定测试条的任何合适的材料，例如，不透水层，比如固体塑料、层压片、复合材料等。吸收垫105有助于促进毛细作用以及流体流动通过膜，并且可以包括用于吸收流体的任何合适的材料，其包括，例如，硝化纤维素、纤维素材料、多孔聚乙烯垫、玻璃纤维滤纸等。吸收性材料可以用表面活性剂处理以辅助芯吸过程。

流体配置为沿着测定测试条101的纵轴从缀合物垫103流动至吸收垫105。将参考该流体流动方向来描述测定测试条101的部件。例如，膜104位于缀合物垫103的下游和吸收垫105的上游。对于另一个实例，样品接收区121位于缓冲液接收区111的下游和检测区131的上游。

膜104的检测区131包括配置为当目标分析物存在于样品中时特异性结合目标分析物的固定化捕获剂。膜104可以进一步包括用于检测一种以上目标分析物的另外的检测区，并且可以包括一个或多个对照区。膜104在可见区域可以是透明的以最小化不期望的读取干扰以便准确地确定目标分析物的存在和/或含量。捕获剂可以使用任何合适的方法固定在膜104上或膜104内，所述方法包括，例如，沉积、喷涂、浸泡、沉浸、倾倒或注入捕获剂在膜104上或膜104内。例如，可以通过制备包括捕获剂的溶液并用空气喷射技术将该溶液喷涂到膜104上来将捕获剂沉积并固定化在膜104上。在另一个实例中，通过制备具有捕获剂的溶液并倾倒该溶液、喷涂该溶液、配制该溶液为放置或摩擦在测试条上的粉末或凝胶、或任何其他合适的方法来沉积捕获剂。

可以以任何合适的量将捕获剂固定化在测定测试条101的检测区131中。有利地，本公开内容的实施方式可以使用对常规侧向流动夹心测定典型的类型和量的捕获剂来检测处于低浓度的目标分析物的存在、不存在和含量。在一些实施方式中，固定化捕获剂以大约0.1-20μL/测试条范围内的量存在。

在该实例实施中，缀合物垫103被放置在背衬卡102的一部分上方。当测定测试条101被容纳在侧向流动装置100内时，缓冲液接收区111可通过缓冲液孔110进入，并且在该情况下横向位于缓冲液孔110下方。样品接收区121可通过样品孔120进入，并且在该情况下横向位于样品孔120下方。在一些情况下，缀合物垫103可以被紧固至背衬卡102。缀合物垫103可以是允许流体流动通过材料的任何合适的材料，比如纤维(包括玻璃纤维)、聚酯或提供流体流动通过缀合物垫103的其他材料。在该实例实施中，缀合物垫103包括沉积在样品接收区121处的分析物特异性缀合物200。根据本公开内容，分析物特异性缀合物200的实施方式还可以被称为“第一缀合物”。分析物特异性缀合物200配置为当流体被接收在样品接收区121时溶解。如以下将参考图3所述的，分析物特异性缀合物200包括第一标记物210(比如，检测器分子)、第一结合伴侣230和特异性结合目标分析物221(当存在于样品中时)的试剂220。因而，分析物特异性缀合物200配置为特异性结合至被接收在样品接收区的样品中的目标分析物(如果存在)。

在一个实例中，分析物特异性缀合物200被放置在样品接收区121上或在样品接收区121内。在另一个实例中，分析物特异性缀合物200被放置在位于样品接收区121下游的第一缀合物区上或其内，使得添加至样品接收区121的样品(和任何目标分析物，如果存在)将流动通过第一缀合物区和与分析物特异性缀合物200相互作用。可以使用任何合适的方法将分析物特异性缀合物200放置在测定测试装置101上或其内，所述方法包括，例如，沉积、喷涂、浸泡、沉浸、倾倒或注入分析物特异性缀合物在样品接收区121上或其内。例如，可以通过制备具有分析物特异性缀合物的溶液并用空气喷射技术喷涂该溶液来沉积分析物特异性缀合物。在另一个实例中，分析物特异性缀合物可以以溶液制备并且通过倾倒该溶液、喷涂该溶液、将该溶液配制为放置或摩擦在测试条上的粉末或凝胶、或任何其他合适的方法来沉积。

可以以任何合适的量将分析物特异性缀合物200提供在测定测试条101的样品接收区121(或其他合适位置)。有利地，本公开内容的实施方式可以使用对常规侧向流动夹心测定典型的类型和量的分析物特异性缀合物200来检测处于低浓度的目标分析物的存在、不存在和含量。在一些实施方式中，以大约0.1-20μL/测试条范围内的量沉积分析物特异性缀合物。

根据本公开内容的系统、装置和方法的实施方式包括信号放大缀合物250。根据本公开内容，信号放大缀合物250的实施方式还可以被称为“第二缀合物”。如以下参考图3所述的，信号放大缀合物250包括第二标记物211和第二结合伴侣231。第二结合伴侣231配置为特异性地结合分析物特异性缀合物200的第一结合伴侣230。信号放大缀合物250存在于或被添加至分析物特异性缀合物200上游的位置。在参考图2所述的一个实例中，信号放大缀合物250在制造过程期间被添加至测定测试条101。在另一个实例中，在测试事件期间信号放大缀合物250由操作者添加至测定测试条101。应当理解，本公开内容的实施方式不被将信号放大缀合物250引入到侧向流动测定的方式所限制，并且在本文描述的那些之外的其他实例也是合适的。

在图2中示出的一个实例中，信号放大缀合物被放置在缓冲液接收区111上或其内。在另一个实例中，信号放大缀合物250被放置在位于缓冲液接收区111下游和样品接收区121上游的第二缀合物区上或其内，使得添加至样品接收区121的样品(和任何目标分析物，如果存在)将不会与第二缀合物区中的信号放大缀合物250相互作用。该空间取向还确保添加至缓冲液接收区111的缓冲液将向下游流动通过第二缀合物区并使信号放大缀合物250溶解。虽然图2的非限制性实施没有使用样品溶液使信号放大缀合物250再水合，但应当理解，其他实施是合适的。例如，本公开内容的另一个实施可以使用单一溶液(比如样品溶液)来将分析物特异性缀合物200和信号放大缀合物250二者再水合。在这种情况下，可以在不同的时间施加样品溶液以确保在分析物特异性缀合物200已沿着流体路径向下移动至检测区之后信号放大缀合物250沿着流体路径向下移动至测试条的检测区。

可以使用任何合适的方法将信号放大缀合物250放置在测定测试装置上或其内，所述方法包括，例如，沉积、喷涂、浸泡、沉浸、倾倒或注入信号放大缀合物250在缓冲液接收区111(或其他合适位置)上或其内。例如，可以通过制备具有信号放大缀合物250的溶液并用空气喷射技术喷涂该溶液来沉积信号放大缀合物25。在另一个实例中，信号放大缀合物250可以以溶液制备并通过倾倒该溶液、喷涂该溶液、将该溶液配制为放置或摩擦在测试条上的粉末或凝胶、或任何其他合适的方法来沉积。

应当理解，可以在除了缓冲液接收区111之外的区域中将信号放大缀合物250添加至测定测试条。例如，在一个非限制性实施方式中，侧向流动装置100不包括单独或专用的位置，比如缓冲液孔或缓冲液接收区，来将信号放大缀合物250接收到测定测试条101上。在分析物特异性缀合物200已在样品接收区121中溶解并移动至检测区131之后，可以在任何合适的位置将信号放大缀合物250添加至测定测试条101。

本公开内容的信号放大缀合物250的实施方式可以以任何合适的量提供在测定测试条101的缓冲液接收区111(或其他合适位置)中。在一些实施方式中，以大约0.1-20μL/测试条范围内的量沉积信号放大缀合物250。在一些实施方式中，信号放大缀合物250以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μL/测试条的量沉积在测定测试条101上。

将信号放大缀合物250放置在或添加至测定测试条101上，其在将分析物特异性缀合物200放置在或添加至测定测试条101上的位置的上游。在制造测定测试条101的过程期间或由使用测定测试条101进行测试事件的操作者，可以将信号放大缀合物250和分析物特异性缀合物200同时或在不同时间放置在测试条上。在一个非限制性实例中，信号放大缀合物250和分析物特异性缀合物200二者同时或基本上同时但在测定测试条101的不同位置处添加至测定测试条101，例如，通过同时或几乎同时在测试条上引入或沉积信号放大和分析物特异性缀合物。在该实例中，分析物特异性缀合物200被添加至或定位在测定测试条101上，其在添加或定位信号放大缀合物250的位置的下游。在分析物特异性缀合物移动至检测区131并在检测区131处结合之前，该空间取向使缀合物之间的相互作用最小化。在另一个非限制性实例中，在任何合适的位置并使用任何合适的方法或技术——包括但不限于本文描述的那些，添加分析物特异性缀合物200之前或之后，将信号放大缀合物250添加至测定测试条101。例如，如果在分析物特异性缀合物200已移动至检测区131并在检测区131处结合之后添加信号放大缀合物250，那么信号放大缀合物250可以被添加至与初始添加分析物特异性缀合物200的相同或基本上相同的位置。

在一些实施方式中，侧向流动装置100不包括单独或专用位置，比如缓冲液孔或缓冲液接收区，其在使用测定测试条101的测试事件之前包括信号放大缀合物250。相反，在测试事件期间，操作者将信号放大缀合物250引入至测定测试条101。例如，在将样品引入至测定测试条之后可以将信号放大缀合物250引入至测定测试条。具体地，首先将样品放置在样品接收区，并且使得样品在合适的时间段迁移通过测试测定条。该时间段可以是用于分析物特异性缀合物200溶解、与样品中的目标分析物(如果存在)形成结合相互作用、移动至检测区、并与检测区中的固定化捕获剂形成结合相互作用的足够时间量。在温育合适的时间段之后，将包括信号放大缀合物250的溶液引入至侧向流动装置100。然后信号放大缀合物250迁移通过测定测试条101至检测区131。

将样品和信号放大缀合物250添加至测定测试条101之间的延迟时间段可以基于各种参数进行调节，其包括但不限于目标分析物的特性、含有或怀疑含有目标分析物的流体、分析物特异性缀合物200、信号放大缀合物250和测定测试条101的材料性质。延迟时间段的实例包括但不限于5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、12分钟和15分钟。因而，在该实例中，在测试事件开始时，测定测试条101上不存在信号放大缀合物250。因此，应当理解，用于放大以低浓度——比如以低于检测限的浓度——存在的分析物的信号的本公开内容的实施方式，可以通过多种方式使用n个信号放大缀合物250来实现，包括制备存在信号放大缀合物250的测试条或在以后的步骤中添加信号放大缀合物250。

根据本公开内容的系统、装置和方法的实施方式可以非常快速地检测目标分析物。从测试事件开始(限定为当样品被添加至测试条的时间)至测试事件结束(限定为当测量系统检测到在检测区产生的信号(如果存在)的时间)的总时间可以为但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、12分钟和15分钟。

图3示意性地示出了根据本公开内容的系统、装置和方法的实例实施方式。不受任何特定理论的束缚，现在将参考图3描述分析物特异性缀合物200与目标分析物221、固定在捕获区242中的捕获剂240和信号放大缀合物250结合的过程，但应当理解，本公开内容不限于图3的示意图。

分析物特异性缀合物200包括第一标记物210、第一结合伴侣230和特异性结合目标分析物221(当存在于样品中时)的试剂220。试剂220配置为特异性结合目标分析物221，并且可以包括特异性结合目标分析物221的抗体或抗体的结合片段。使用例如以上参考图2描述的方法将分析物特异性缀合物200沉积在或添加至测定测试条101的样品接收区121(或任何其他合适位置)。样品被添加至测定测试条101，例如在样品接收区121处。分析物特异性缀合物200溶解到样品中，并且当目标分析物221存在于样品中时试剂220特异性结合至目标分析物221，形成分析物–试剂–第一标记物复合物225。该复合物225流动通过测定测试条101至检测区131，所述检测区131包括配置为特异性结合目标分析物221的固定化捕获剂240。复合物225在检测区131被捕获，如图3所示。

在经过合适的时间段以允许复合物225行进至检测区131并在其中被捕获之后，使得根据本公开内容的信号放大缀合物250沿着测定测试条101向下游行进至检测区131。信号放大缀合物250包括第二标记物211和第二结合伴侣231。在一个非限制性实施中，在添加样品之前，信号放大缀合物250存在于测定测试条101上(以以包括以上参考图2描述的那些的任何合适的方式沉积)，并且通过将缓冲溶液施加至信号放大缀合物250使得其向下游行进至检测区131。在该实施中，先前沉积的信号放大缀合物250沉积在样品接收区121的上游，例如在位于样品接收区121上游的缓冲液接收区111中。缓冲液接收区111中的信号放大缀合物250在样品接收区121中的分析物特异性缀合物200的上游的该空间取向确保了将样品添加样品接收区121将使分析物特异性缀合物200而非信号放大缀合物250溶解并移动。在另一个非限制性实施中，在将样品添加至样品接收区中经过合适的时间段之后，将信号放大缀合物250添加至测定测试条101。在该实施中，包括信号放大缀合物250的缓冲溶液可以在缓冲液接收区111(如果存在)处、在样品接收区121处或测定测试条101的任何其他合适位置被添加至测定测试条101。

在这些实施中，本公开内容的实施方式允许分析物特异性缀合物200在暴露于信号放大缀合物250并与其形成结合相互作用之前移动并结合至检测区131中的捕获剂240。本公开内容的实施方式有利地允许信号放大缀合物250的释放时机被调整以适应侧向流动测定的特定特性，并且仅当缓冲溶液被添加至系统(或者添加至含有信号放大缀合物250的缓冲液接收区111，或者当缓冲溶液本身含有信号放大缀合物250时添加至任何合适位置)时被触发。这些本公开内容的实施方式还有利地防止分析物特异性缀合物200与信号放大缀合物250之间的相互作用发生在测定测试条101的不需要它们的位置中，即，检测区131上游的位置。因而，允许信号放大缀合物250的释放时机为最佳时间(在足量的分析物特异性缀合物200已移动至并结合在检测区131之后)的本公开内容的实施方式有利地最大化存在于检测区中的分析物特异性缀合物200(无论是结合还是未结合至捕获剂240)与最佳位置——检测区131中的信号放大缀合物250之间的结合相互作用的发生。这导致将由检测区中的缀合物200、250产生的信号聚集和增大至高于检测阈值的水平。

在将缓冲溶液添加至测定测试条101并或者将信号放大缀合物250直接引入到系统或者使已存在于系统中的信号放大缀合物250溶解之后，由于本公开内容的信号放大缀合物250的性质，将发生第二系列的结合事件。如以上所述，第二结合伴侣231特异性结合至分析物特异性缀合物200的第一结合伴侣230。不受任何特定理论的束缚，据信，当信号放大缀合物250流动通过测定测试条101至检测区131时，信号放大缀合物250的第二结合伴侣231特异性结合至与捕获剂240结合的复合物225的第一结合伴侣230，由此信号放大缀合物250被捕获在检测区131。现在结合的信号放大缀合物250的第二标记物211在检测区中产生信号。以这种方式，来自结合在检测区的单个分析物特异性缀合物200的信号被放大。在一些实施方式中，复合物225中的单个分析物特异性缀合物200结合至多个信号放大缀合物250，其本身有助于由复合物225中单个分析物特异性缀合物200产生的信号。在本公开内容的一些实施方式中，即使复合物225与一个或多个信号放大缀合物250之间的这种第一级结合相互作用可以足以将检测区中产生的信号增大至阈值检测水平以上。

有利地，本公开内容的实施方式可以产生比仅通过第一级结合相互作用所可能实现的信号放大甚至更高水平的信号放大。在本文所述的系统、装置和方法的实施方式中，通过现在结合的信号放大缀合物250与存在于检测区但未结合至捕获剂240的残余分析物特异性缀合物200结合的能力，进一步增强了在检测区产生的信号的放大。在常规侧向流动测定中，这种残余分析物特异性缀合物200通常可以穿过检测区131或保持散布在检测区中。在根据本公开内容的信号放大缀合物250的存在下，该残余分析物特异性缀合物200可以结合在通过复合物225锚定至检测区131的缀合物的支架中，并且进一步有助于在检测区131产生的聚集信号。由本公开内容的实施方式产生的信号可以以指数方式增大强度。因而，在一些实施方式中，在检测区131产生的信号强度可以由于信号放大而增大2-100倍的量，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100倍的量。应当理解，本公开内容不限于这些实例放大水平，并且使用本公开内容的实施方式使得放大其他放大级别成为可能。

有利地，结合事件的上述链式反应可以在样品中存在甚至非常低含量的目标分析物的情况下发生。不受任何特定理论的束缚，据信，残余分析物特异性缀合物200可以与信号放大缀合物250形成结合相互作用，而与残余分析物特异性缀合物200是否结合至样品中的分析物无关。换句话说，在复合物225与信号放大缀合物250之间的第一相互作用之后发生的结合相互作用依赖于该第一相互作用以确保结合事件的链式反应在局部区域(检测区)发生，但它们不依赖于另外的目标分析物来形成结合缀合物200、250对的支架，其放大由复合物225产生的信号。

本公开内容还有利的是，在检测区131不存在信号可以以高置信度与样品中不存在目标分析物相关联。在样品中不存在目标分析物的情况下，复合物225将不会在检测区131形成并结合至捕获剂240。在不存在该结合事件的情况下，信号放大缀合物250将不会在检测区131中被结合并将穿过检测区131至吸收垫151。

如本文所使用，缓冲液是指在侧向流动测定中使用的溶液，其不干扰结合相互作用，不使目标分析物或装置的其他组分变性，并且为了使组分流动通过测试条而保持中性。各种缓冲液是众所周知的，并且各种缓冲液中的任一种可以用于本文所述的侧向流动测定中使用的特定分析物、化合物和组分。在一些实施方式中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

已参考将追踪缓冲液添加至位于样品接收区上游的缓冲液接收区，以及参考在已添加样品之后将包括信号放大缀合物的缓冲溶液添加至测定测试条的任何合适位置，描述了本公开内容的实施方式。然而，应当理解，将缓冲溶液添加或释放到系统的其他方法将是合适的并且可以在本公开内容的实施方式中使用。例如，追踪缓冲溶液可以预先包装在囊袋或其他适当结构中并且并入在测定测试条上沉积的信号放大缀合物和测定测试条的样品接收孔上游。在已将样品添加至测定测试条之后的合适时间，可以通过使用任何适当地机构使囊袋破裂而释放追踪缓冲溶液。

在一些实施方式中，信号放大缀合物250在到达检测区131之前不结合至其他缀合物(比如结合至分析物特异性缀合物200)。在一些实施方式中，信号放大缀合物250与其他缀合物的结合可以导致结合的缀合物沉淀，导致沉淀的标记物通过测试条涂抹，从而干扰或混淆结果。如以上所述，本公开内容的实施方式包括防止或最小化在检测区131上游结合缀合物的这种沉淀的特征。这些特征确保信号放大缀合物250在溶液中保持溶解，并且在到达已捕获在检测区131的复合物225中的分析物特异性缀合物200之前不与分析物特异性缀合物200结合。在一个实例中，本公开内容的实施方式包括将信号放大缀合物250沉积在测定测试条101上样品接收区121中的分析物特异性缀合物200的上游，并且仅在分析物特异性缀合物首先有机会流动通过侧向流动装置至检测区131之后使信号放大缀合物250溶解。在另一个实例中，本公开内容的实施方式包括将信号放大缀合物250添加至在仅在分析物特异性缀合物20首先有机会流动通过侧向流动装置至检测区131之后施加至测定测试条101的缓冲溶液中。

分析物特异性缀合物200的第一标记物210可以是与信号放大缀合物250的第二标记物211相同的标记物。在一个非限制性实例中，第一标记物210和第二标记物211可以是胶体金标记物。胶体金标记物可以包括金纳米颗粒。第一标记物210和第二标记物211可以包括可以提供可检测信号的任何合适的标记物。因而，在一些实施方式中，第一标记物210和第二标记物211是酶、胶体金属颗粒(也被称为金属纳米颗粒，比如金或银纳米颗粒)、有色乳胶颗粒、放射性同位素、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、蛋白质吸附的银颗粒、蛋白质吸附的铁颗粒、蛋白质吸附的铜颗粒、蛋白质吸附的硒颗粒、蛋白质吸附的硫颗粒、蛋白质吸附的碲颗粒、蛋白质吸附的碳颗粒、或蛋白质偶联的染料囊、或任何其他合适的标记物。

如以上所述，试剂220是特异性结合目标分析物221的试剂，并且可以包括特异性结合目标分析物221的抗体或抗体结合片段。因而，试剂220可以是抗分析物抗体。分析物特异性缀合物200的第一结合伴侣230特异性结合至信号放大缀合物250的第二结合伴侣231，并且因而第一和第二结合伴侣230、231构成结合对。该结合对可以包括，例如，选自抗原/抗体、半抗原/抗体、激素/受体、核酸链/互补核酸链、底物/酶、抑制剂/酶、碳水化合物/凝集素、生物素/抗生物素蛋白、受体/配体或病毒/细胞受体的结合对。在一个非限制性实例中，第一结合伴侣230是抗生物素蛋白(或其衍生物或类似物)并且第二结合伴侣231是生物素(或其衍生物或类似物)。例如，分析物特异性缀合物200可以是被生物素化的并且信号放大缀合物250可以包括抗生物素抗体或链霉抗生物素蛋白结合伴侣。在另一个非限制性实例中，结合对是抗原/抗体，比如肽和抗体。在一些实施方式中，肽是十肽。在进一步非限制性实例中，结合对是阿霉素(doxorubicin)和抗阿霉素。在仍进一步的非限制性实例中，结合对是甲氨蝶呤和抗甲氨蝶呤。在又另一个非限制性实例中，结合对是FITC和抗FITC抗体。应当理解，本公开内容的实施方式可以使用特异性结合第二结合伴侣231的任何合适的第一结合伴侣230并且不限于以上实例。

本公开内容的实施方式有利的是，可以选择信号放大缀合物240的第二结合伴侣231以特异性结合至分析物特异性缀合物200的第一结合伴侣230而不干扰目标分析物221与分析物特异性缀合物200的分析物特异性抗体的结合。在一个实例中，可以将不同的蛋白质/肽与分析物特异性抗体共缀合在第一标记物210上以形成分析物特异性缀合物200。在另一个实例中，可以将另一种蛋白质/肽首先生物素化并且然后与分析物特异性抗体共缀合在第一标记物210上以形成分析物特异性缀合物200。在进一步地实例中，将小分子，比如生物素，添加至分析物特异性抗体，该分析物特异性抗体随后缀合至分析物特异性缀合物200的第一标记物210，并且信号放大缀合物250包括小分子特异性结合蛋白质/抗体。在该实例中，选择添加至分析物特异性抗体的小分子使得它们不干扰分析物与分析物特异性缀合物200中的分析物特异性抗体的结合。在仍另一个实例中，除了生物素，蛋白质/肽可以缀合至另一种分子——存在针对其的另一种抗体或结合蛋白质。因而，所添加的蛋白质/肽、生物素或缀合至第一标记物210的其他分子可以提供在信号放大缀合物250上针对该蛋白质/肽、生物素或其他分子的抗体的结合位点，而不会干扰目标分析物221与缀合至第一标记物210的分析物特异性抗体之间的分析物特异性结合相互作用。

在一些实施方式中，侧向流动装置包括一个或多个对照区。对照区可以在检测区中或与检测区分离。在一些实施方式中，对照区可以是阳性对照区，其可以包括与蛋白质缀合的小分子，比如牛血清白蛋白(BSA)。特异性结合小分子的阳性对照标记的抗体可以沉积在缀合物垫上。当阳性对照标记的抗体被用液体样品再水合时，它朝向阳性对照区流动并其结合至小分子，形成半夹心结构。在一些实施方式中，阳性对照区包括特异性结合至分析物特异性缀合物的固定化捕获剂，使得未结合至目标分析物的分析物特异性缀合物穿过检测区(测试线)并在对照线处特异性结合至固定化捕获剂，产生指示侧向流动装置的正常运行的信号。应当理解，在本公开内容的实施方式中可以实施任何合适的对照区。

本文公开的读取器和数据分析器的实施方式可以处理从对照区获得的信号测量，以校正在检测区测量的信号或者警告操作者测试无效。

如本文所使用的，“分析物”通常是指待检测的物质。在一些实施方式中，分析物是有时在样品中发现的低浓度的那些，比如处于低于测量系统的检测限的浓度。一些分析物通常以高浓度存在于样品中，但可能由于特定病症、由于病症的阶段或由于样品处理而以低浓度存在于待测试的特定样品中。例如，在疾病或病症的初始阶段或在疾病或病症的峰值阶段之后，分析物可以以低浓度存在于样品中。应当理解，本公开内容的实施方式适用于测量以低含量存在于或怀疑存在于样品中的任何分析物或者其中测量这种分析物的灵敏度较低的侧向流动测定。

分析物可以包括抗原物质、半抗原、抗体和其组合。分析物包括，但不限于，毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物(包括用于治疗目的的那些以及用于非法目的的那些)、药物中间体或副产物、细菌、病毒颗粒以及任何上述物质的代谢物或抗体。在一些实施方式中，目标分析物是流感病毒，比如甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。出于生物或环境目标物质的目的，可以包括另外的分析物。

在一些实施方式中，样品可以包括一种或多种目标分析物，并且因而侧向流动装置可以配置用于检测一种或多种目标分析物。为了检测一种或多种目标分析物，根据本公开内容的侧向流动装置可以包括一种或多种分析物特异性缀合物200，其中每种分析物特异性缀合物250特异性结合至目标分析物。因而，例如，对于期望数量的目标分析物存在于或怀疑存在于样品中，第一分析物特异性缀合物200A特异性结合至第一目标分析物221A，第二分析物特异性缀合物200B特异性结合至第二目标分析物221B，第三分析物特异性缀合物200C特异性结合至第三目标分析物221C，等等。在一些实施方式中，特异性结合至目标分析物的每种分析物特异性缀合物不特异性结合至任何其他目标分析物。此外，在一些实施方式中，每种分析物特异性缀合物可以具有相同的标记物或不同于每种其他分析物特异性缀合物的标记物。因而，例如，每种分析物特异性缀合物可以包括不同于分析物特异性缀合物的任何其他标记物的独特标记物。此外，在存在一种或多种目标分析物的情况下，侧向流动装置可以包括一条或多条捕获线，每条捕获线包括特异性结合一种特定目标分析物的固定化捕获剂。例如，对于测试样品中正被分析的期望数量的目标分析物，固定化在捕获区242A中的第一捕获剂240A特异性结合第一目标分析物221A，固定化在捕获区242B中的第二捕获剂240B特异性结合第二目标分析物221B，固定化在捕获区242C中的第三捕获剂242C特异性结合第三目标分析物221C，等等。

在其中侧向流动装置配置用于测量一种或多种目标分析物的一些实施方式，装置进一步包括信号放大缀合物250。信号放大缀合物250可以包括结合对的一个结合伴侣，其特异性结合至结合对的另一个结合伴侣。在一些实施方式中，对于期望数量的目标分析物，信号放大缀合物结合至第一分析物特异性缀合物、第二分析物特异性缀合物、第三分析物特异性缀合物，等等，由此放大了每种目标分析物的信号。在一些实施方式中，信号放大缀合物结合至一个、两个、三个或更多个分析物特异性缀合物，由此仅对期望数量的分析物放大信号，例如，仅对已知或怀疑以低浓度存在于样品中的目标分析物放大信号。

应当理解，目标分析物通常以各种浓度存在于样品中，因而，可能不需要对每种目标分析物进行信号放大，而仅对于已知或怀疑以低浓度存在——比如以低于测量系统的检测限的浓度——存在的那些目标分析物进行信号放大。因此，在一些实施方式中，特异性结合以低浓度存在的第一分析物的第一分析物特异性缀合物包括结合伴侣，而特异性结合以高于检测限的浓度存在的第二分析物的第二分析物特异性缀合物不包括结合伴侣，由此信号放大缀合物将结合至第一分析物特异性缀合物而不结合至第二分析物特异性缀合物，从而放大第一目标分析物的信号。例如，可以通过放大任何期望的信号(包括低于测量系统的检测限的信号)来实施本公开内容的各种迭代。

以下非限制性实例示出了本文所述的侧向流动装置、测试系统和方法的特征，并且绝不旨在限制本公开内容的范围。

实施例1

根据本公开内容的侧向流动测定的制备

以下实施例描述了制备根据本公开内容的侧向流动测定以测量以低浓度存在于样品中的分析物。在该非限制性实施例中，目标分析物是甲型流感病毒(“Flu A”)。

制备具有缀合物垫的测试条，该缀合物垫带有样品接收区和缓冲液接收区。以溶液制备分析物特异性缀合物并且通过空气喷射沉积将该溶液喷涂在样品接收区上。简而言之，将抗Flu A抗体和生物素与金纳米颗粒一起温育以形成分析物特异性缀合物。通过用空气喷射喷涂包括分析物特异性缀合物的溶液将分析物特异性缀合物以7μL/测试条的量沉积在缀合物垫上样品接收区处。加热缀合物垫以将分析物特异性缀合物干燥至缀合物垫。用于配制沉积在缀合物垫上的分析物特异性缀合物的抗Flu A抗体的量为大约260ng每测试条。

以溶液制备信号放大缀合物并且通过空气喷射沉积将溶液喷涂在缓冲液接收区上。简而言之，将抗生物素与金纳米颗粒一起温育以形成信号放大缀合物。通过用空气喷射喷涂包括信号放大缀合物的溶液将信号放大缀合物以2μL/测试条的量沉积在缀合物垫上缓冲液接收区处。加热缀合物垫以将信号放大缀合物干燥至缀合物垫。用于配制沉积在缀合物垫上的信号放大缀合物的抗生物素抗体的量为大约74ng每测试条。

另外，制备具有检测区的测试条。检测区包括特异性结合Flu A的固定化捕获剂。在该实施例中，以0.75μL/cm将2.4mg/mL量的抗Flu A抗体沉积在检测区。

在该实施例中，检测区还包括阳性对照捕获区。制备阳性对照捕获区以确保测定正常运行。在该实施例中，阳性对照捕获区包括用抗生物素衍生的固定化的牛血清白蛋白(BSA-抗生物素)。固定化的BSA-生物素捕获存在于测试条上的信号放大缀合物，其用缓冲液再水合并流动至阳性对照区，这指示测定的正常运行。在阳性对照线处捕获信号放大缀合物，并且阳性对照信号指示测定的正常运行。

将测试条放置到具有外壳以容纳测试条的侧向流动装置中。该侧向流动装置包括放置在缓冲液接收区上方的缓冲液孔、放置在样品接收区上方的样品孔和放置在检测区上方的读取窗口，如图1所显示。

实施例2

低浓度分析物的信号的放大

以下实施例说明了使用实施例1中描述的侧向流动测定检测样品中低浓度的FluA。

将实施例1中制备的侧向流动测定与含有低浓度Flu A的样品接触。在该非限制性实例中，Flu A抗原是在大肠杆菌中表达的重组Flu A核蛋白的稀释液并用作粗细胞裂解。作为对照，使用如实施例1中制备的但缺乏信号放大缀合物的侧向流动测定。将具有Flu A的样品添加至侧向流动装置和对照侧向流动装置的样品孔。在各种时间点测量产生的信号，如图4和表1中所示。

表1：信号随着时间的变化

也将不含目标分析物的样品施加至用各种量的根据本公开内容的信号放大缀合物制备的侧向流动测定。具体地，将0.5、1、1.5和3μL的量的信号放大缀合物沉积在测试条上，并与对照条进行比较，其中在10分钟和20分钟获得读数。结果在表2中显示，其中每个时间点测量两次。将不含目标分析物的样品沉积在测定测试条上以验证当样品中不存在目标分析物时测试线处不会产生信号。如以下表2中所显示，对于所有不含目标分析物的样品，测试线处的信号保持为负(在测试线处测量的信号强度为0AU或基本上为0AU)。低于1AU的任何信号都可以视为系统噪音，因此等同于0AU的测量值。进一步地，如以下表2中所显示，系统噪音测量的强度不随信号放大缀合物的量的增大而增大。不受任何特定理论的束缚，据信，在不存在目标分析物的情况下，信号放大缀合物不会放大信号，这是因为没有初始信号要放大(换句话说，由于样品中不存在分析物，所以在测试线上没有形成夹心结构，并且因此不存在夹心结构来产生要通过信号放大缀合物放大的信号)。

表2:在不存在目标分析物的情况下将样品施加至测试条时产生的信号

*每个读数显示两个值，因为每个进行两次。

最后，在放置在侧向流动装置上之前，样品中Flu A的量是不同的。具体地，制备具有0％、0.04％、0.1％、0.2％和0.5％的量的Flu A(以样品中抗原浓度的百分比表示)的样品，并且将样品沉积到侧向流动装置上和没有任何信号放大缀合物的对照侧向流动装置上。在10分钟和20分钟时读取信号强度。结果在图5和表3中显示。

表3:具有不同量的目标分析物的信号强度

有利地，根据本公开内容的侧向流动测定放大以低浓度——比如低于检测限的浓度——存在于样品中的分析物的信号，由此允许可靠地测量以低浓度存在于样品中的分析物。除了确定目标分析物存在于样品中之外，本公开内容的实施方式还可以用于定量存在于样品中的目标分析物的量。例如，可以将具有已知含量的目标分析物的溶液施加至根据本公开内容的实施方式制备的测定测试条。测量系统可以测量由该条产生的信号的强度，并且可以使用该数据开发剂量响应曲线。在使用根据本公开内容的实施方式制备的测试条的测试事件之后，测量系统可以测量由测试条产生的信号，并将该测试信号与剂量响应曲线中绘制的信号进行比较以确定测试样品中目标分析物的含量。应当理解，使用本公开内容的实施方式来定量目标分析物的量的其他方法是可能的。

使用根据本公开内容的侧向流动测定检测样品中目标分析物的方法

图6示出了根据本公开内容的使用侧向流动测定来检测样品中低浓度的目标分析物的实例方法600。方法600开始于步骤605，其中提供了如本文所述的侧向流动测定。在步骤610处，将样品施加至侧向流动装置的样品孔。

在一些实施方式中，样品孔处施加样品包括将样品与侧向流动测定接触。通过外部施加——如使用滴管或其他施加器——将样品引入至样品孔，样品可以接触侧向流动测定。在一些实施方式中，样品储器可以直接沉浸在样品中，比如当测试条浸入到容纳样品的容器中时。在一些实施方式中，样品可以被倾倒、滴落、喷涂、放置或以其他方式与样品储器接触。

方法接着移动至步骤615，其中在样品孔处施加样品使存在于样品接收区或样品接收区下游的第一缀合物区中的分析物特异性缀合物(“第一缀合物”)溶解。分析物特异性缀合物可以包括第一标记物、第一结合伴侣和特异性结合目标分析物的试剂。如以上所述，取决于待分析的分析物的数量，装置可以包括包含标记物、结合伴侣和特异性结合第二目标分析物的试剂的第二分析物特异性缀合物，并且装置还可以包括包含标记物、结合伴侣和特异性结合第三目标分析物的试剂的第三分析物特异性缀合物，或另外的分析物特异性缀合物。在一些实施方式中，分析物特异性缀合物可以不包括结合伴侣，因为由于样品中特定目标分析物的预期或典型浓度，特定目标分析物可能不需要放大。

可以通过物理结合或化学键将分析物特异性缀合物(或超过一种分析物特异性缀合物，如果是这样的情况)整合在样品接收区上。在将样品添加至样品孔之后，样品使分析物特异性缀合物溶解，释放将分析物特异性缀合物保持至缀合物垫的键(结合)。

接着移动至步骤620，用分析物特异性缀合物标记目标分析物(如果存在于样品中)。分析物特异性缀合物结合至目标分析物(如果存在于样品中)，形成复合物。应当理解，步骤615和步骤620可以基本上同时发生。

方法接着移动至步骤625，其中复合物沿着测定测试装置的流体流动路径移动并且在侧向流动测定的检测区处结合至固定化捕获剂，形成夹心结构。还应当理解，本公开内容的实施可以以许多不同方式在检测区中形成夹心结构。例如，步骤615、620和625可以用步骤615A代替，其中目标分析物和分析物特异性缀合物分开地流动至检测区，目标分析物结合至检测区中的固定化捕获剂，然后分析物特异性缀合物结合至现在结合的目标分析物，形成抗体–分析物–抗体–第一标记物结构，通常被称为夹心结构。

在将复合物结合至固定化捕获剂(或以其他方式形成夹心结构)之后，方法接着移动至步骤630，其中将缓冲液施加至装置的缓冲液孔(或其他合适位置)。在步骤635处，缓冲液使存在于或定位在缓冲液接收区下游的信号放大缀合物(“第二缀合物”)溶解。信号放大缀合物包括第二标记物和特异性结合至分析物特异性缀合物的第一结合伴侣的第二结合伴侣。信号放大缀合物可以通过物理结合或化学键整合在缓冲液接收区(或其他合适位置)上。在将缓冲液添加至缓冲液孔之后，缓冲液使信号放大缀合物溶解，释放将信号放大缀合物保持至缓冲液接收区的缀合物垫(或其他合适位置)的键(结合)。应当理解，步骤630和635可以用可选的方法代替以将信号放大缀合物添加至侧向流动测定。

方法接着移动至步骤640，其中信号放大缀合物与缓冲液一起流动至检测区。在该检测区中，第二结合伴侣与检测区中结合至捕获剂的复合物中的分析物特异性缀合物的第一结合伴侣形成结合对。如以上所述，信号放大缀合物与结合至检测区中的捕获剂的复合物之间的这种第一结合相互作用可以将检测区中产生的信号放大至超过阈值检测水平的水平。因此，在一些实例实施中，方法接着移动至步骤650，其中在检测区中检测放大的信号。

根据本公开内容的方法的实施方式还可以包括如上所述的后续结合相互作用。根据本公开内容，发生结合事件的链式反应，并且一系列的第一结合对和第二结合对相互作用导致在检测区中形成分析物特异性缀合物和信号放大缀合物的聚集。缀合物在检测区的聚集导致放大在检测区产生的信号，在一些情况下引起信号的指数放大。结合事件的这种链式反应在图6的步骤645中示出，其中存在于检测区的残余的、未结合的第一缀合物结合至已结合至检测区中的复合物的信号放大缀合物。

接着移动至步骤650，方法包括检测在检测区产生的信号。检测区可以包括用于捕获每种复合物(其中超过一种目标分析物将被检测和/或定量)的捕获区。例如，检测区可以包括用于捕获第一复合物的第一捕获区、用于捕获第二复合物的第二捕获区和用于捕获第三复合物的第三捕获区。在第一捕获区的第一固定化捕获剂结合第一分析物(如果存在)和第一复合物。当第一复合物在第一捕获区结合至第一固定化捕获剂，并且信号放大缀合物结合至其时，检测到第一放大的信号。第一放大的信号可以包括如本文所述的光学信号。可以在步骤650处使用任何合适的测量系统检测在检测区产生的信号，包括但不限于装置的视觉检查和使用光学读取器的光学检测。在步骤650处检测的信号可以与样品中目标分析物的存在、不存在或含量相关联。

在一些实施方式中，样品获得自包括环境或生物来源在内的来源。在一些实施方式中，怀疑样品具有一种或多种目标分析物，包括以低浓度——比如低于测量系统的检测限的浓度——存在的一种或多种目标分析物。在一些实施方式中，怀疑样品不具有任何目标分析物。在一些实施方式中，获得并分析样品以验证不存在或存在多种分析物。在一些实施方式中，流体样品是血液或血浆。在一些实施方式中，以50至100μL的量施加流体样品。

在一些实施方式中，检测的信号是光学信号、荧光信号或磁信号。

包括根据本公开内容的侧向流动测定的实例测试系统

本文描述的侧向流动测定测试系统可以包括侧向流动测定测试装置(比如但不限于测试条)、包括配置为接收全部或部分测试装置的端口的系统外壳、包括光源和光检测器的读取器、数据分析器和其组合。系统外壳可以由多种材料中任一种制成，其包括塑料、金属或复合材料。系统外壳形成了用于诊断测试系统的部件的保护性封壳(enclosure)。系统外壳还限定了接收器(receptacle)，其将测试条相对于读取器机械地定位(register)。接收器可以被设计为接收各种不同类型的测试条中的任一种。在一些实施方式中，系统外壳是允许在各种环境中进行侧向流动测定的便携式装置，所述环境包括在工作台上、在现场、在家中或在用于家庭、商业或环境应用的设施中。

读取器可以包括一个或多个光学部件，其用于光学检查测试条的检测区的暴露区域并且能够检测检测区内的多个捕获区。在一些实施中，读取器包括至少一个光源和至少一个光检测器。在一些实施方式中，光源可以包括半导体发光二极管并且光检测器可以包括半导体光电二极管。取决于测试条所使用的标记物的性质，光源可以被设计为发射特定波长范围内的光或者具有特定偏振的光。例如，如果标记物是荧光标记物，比如量子点，光源将被设计为用诱导从标记物荧光发射的波长范围内的光照射测试条的捕获区的暴露区域。类似地，光检测器可以被设计为从捕获区的暴露区域选择性地捕获光。例如，如果标记物是荧光标记物，那么光检测器将被设计为选择性地捕获在由标记物发射的荧光的波长范围内的光或者具有特定偏振的光。另一方面，如果标记物是反射型标记物，那么光检测器将被设计为选择性地捕获在由光源发射的光的波长范围内的光。为此，光检测器可以包括限定捕获光的波长范围或偏振轴的一个或多个光学滤波器。可以使用视觉观察或分光光度计分析来自标记物的信号，以检测发色底物的颜色；检测辐射的辐射计数器，比如用于检测¹²⁵I的伽马计数器；或在某一波长的光存在下检测荧光的荧光计。在使用酶联测定的情况下，可以使用分光光度计进行目标分析物的量的定量分析。如果需要，本文所述的侧向流动测定可以是自动化的或自动进行的，并且可以同时检测来自多个样品的信号。此外，可以针对多个目标分析物检测多个信号，包括当用于每种目标分析物的标记物相同或不同时。

数据分析器处理由读取器获得的信号测量。通常，数据分析器可以在任何计算或处理环境中实施，包括在数字电子电路中或者在计算机硬件、固件或软件中。在一些实施方式中，数据分析器包括处理器(例如，微控制器、微处理器或ASIC)和模数转换器。数据分析器可以并入在诊断测试系统的外壳内。在其他实施方式中，数据分析器定位在单独装置中，比如计算机，其可以通过有线或无线连接与诊断测试系统通信。数据分析器还可以包括用于经由无线连接将结果传输至外部源以进行数据分析或审查结果的电路。

一般地，结果指示器可以包括用于指示测定测试的一个或多个结果的多种不同机构中的任何一个。在一些实施中，结果指示器包括被激活以指示，例如，测定测试完成的一个或多个灯(例如，发光二极管)。在其他实施中，结果指示器包括用于呈现测定测试结果的字母数字显示器(例如，两个或三个字符的发光二极管阵列)。

本文所述的测试系统可以包括向诊断测试系统的有源部件供电的电源，所述诊断测试系统包括读取器、数据分析器和结果指示器。电源可以通过可以通过，例如，可更换的电池或可充电的电池实施。在其他的实施方式中，诊断测试系统可以由外部主机装置(例如，通过USB电缆连接的计算机)供电。

实施例侧向流动装置的特征

本文所述的侧向流动装置包括装置外壳。本文所述的任何侧向流动装置的外壳——其包括顶部外壳或底部外壳——可以用任何合适的材料制成，包括例如，乙烯基树脂、尼龙、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚酯、氨基甲酸乙酯或环氧树脂。可以通过任何合适的方法制备外壳，包括，例如，通过注射成型、压缩成型、传递成型、吹塑成型、挤出成型、发泡成型、热成型、浇铸、层沉积或印刷。

本文所述的侧向流动装置可以包括其中流体样品被引入至测试条的样品孔，比如但不限于存在于侧向流动装置中的免疫层析测试条。在一个实例中，可以通过外部施加——如使用滴管或其他施加器——将样品引入至样品孔。可以将样品倾倒或挤压(express)在样品孔上。在另一个实例中，可以将样品孔直接沉浸在样品中，比如当测试条被浸入到容纳样品的容器中时。

本文所述的侧向流动装置可以包括其中缓冲液被引入至测试条的缓冲液孔，比如但不限于存在于侧向流动装置中的免疫层析测试条。在一个实例中，可以通过外部施加——如用滴管或其他施加器——将缓冲液引入至缓冲液孔。缓冲液可以被倾倒或挤压在缓冲液孔上。在另一个实例中，缓冲液孔可以直接沉浸在缓冲液中，比如当测试条被浸入到容纳缓冲液的容器中时。

本文所述的侧向流动装置可以包括固体载体或基底。合适的固体载体包括但不限于硝化纤维素、反应盘的孔壁、多孔板、试管、聚苯乙烯珠、磁珠、膜和微粒(比如乳胶颗粒)。可以在本文所述的侧向流动装置中使用任何合适的多孔材料，其具有足够的孔隙率以允许分析物特异性缀合物和信号放大缀合物通过以及合适的表面亲和力以固定化捕获剂。例如，硝化纤维素的多孔结构对多种试剂(例如，固定化捕获剂)具有优异的吸附和吸附质量。尼龙具有类似的特性，并且也是合适的。微孔结构是可用的，在水合状态下具有凝胶结构的材料也是有用的。

有用的固体载体的进一步实例包括：天然聚合碳水化合物及其经合成改性的、交联的或取代的衍生物，比如琼脂、琼脂糖、交联的藻酸、取代的和交联的瓜尔豆胶、纤维素酯——尤其是具有硝酸和羧酸的、混合的纤维素酯和纤维素醚；含氮的天然聚合物，比如蛋白质和衍生物，包括交联或改性的明胶；天然碳氢化合物聚合物，比如乳胶和橡胶；可以制备有合适的多孔结构的合成聚合物，比如乙烯基聚合物，其包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯和其部分水解的衍生物，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酸酯，上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，比如聚酯，聚酰胺，和其他聚合物，比如聚氨酯或聚环氧化物；多孔无机材料比如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙，碱金属和碱土金属、铝和镁的硅酸盐；和铝或硅氧化物或水合物，比如粘土、氧化铝、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可以用作上述聚合物材料的过滤器)；以及以上分类的混合物或共聚物，比如通过使合成聚合物在预先存在的天然聚合物上引发聚合而获得的接枝共聚物。

本文所述的侧向流动装置可以包括片或条形式的多孔固体载体，比如硝化纤维素。这种片或条的厚度可以在宽范围内变化，例如，大约0.01至0.5mm、大约0.02至0.45mm、大约0.05至0.3mm、大约0.075至0.25mm、大约0.1至0.2mm或大约0.11至0.15mm。这种片或条的孔尺寸可以类似地在宽范围内变化，例如大约0.025至15微米，或更具体地大约0.1至3微米；然而，孔尺寸不旨在是选择固体载体的限制因素。固体载体的流速(如果适用)，也可以在宽范围内变化，例如大约12.5至90sec/cm(即，50至300sec/4cm)、大约22.5至62.5sec/cm(即，90至250sec/4cm)、大约25至62.5sec/cm(即，100至250sec/4cm)、大约37.5至62.5sec/cm(即，150至250sec/4cm)或大约50至62.5sec/cm(即，200至250sec/4cm)。在本文所述的装置的具体实施方式中，流速为大约35sec/cm(即，140sec/4cm)。在本文所述的装置的其他具体实施方式中，流速为大约37.5sec/cm(即，150sec/4cm)。

固体载体的表面可以通过化学过程活化，该化学过程导致试剂(例如，固定化缀合物)与载体共价连接。如以下所述，固体载体可以包括缀合物垫。许多其他合适的方法可以用于将试剂(例如，固定化捕获剂)固定化至固体载体，其包括，但不限于，离子相互作用、疏水相互作用、共价相互作用等。

除非另外受到物理限制，固体载体可以以任何合适的形状使用，比如膜、片、条或板，或者可以将其涂布在或结合或层压到适当的惰性载体上，比如纸、玻璃、塑料膜或织物。

本文所述的侧向流动装置可以包括缀合物垫，比如包括捕获剂的膜或其他类型的材料。缀合物垫可以是乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚酰胺、聚碳酸酯、玻璃纤维、膜、聚醚砜、再生纤维素(RC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯)、聚碳酸酯(例如，4,4-羟基-二苯基-2,2′-丙烷)、氧化铝、混合纤维素酯(例如，乙酸纤维素和硝酸纤维素的混合物)、尼龙(例如，聚酰胺、六亚甲基二胺和尼龙66)、聚丙烯、PVDF、高密度聚乙烯(HDPE)+成核剂“二苯甲酸铝”(DBS)(例如80u 0.024HDPE DBS(Porex))和HDPE。

本文所述的侧向流动装置用于低灵敏度样品，比如样品具有低浓度的分析物或具有典型浓度的分析物但低样品体积。“灵敏度”是指这样正确识别为如此的实际阳性的比例(例如，被正确识别为患有病症的感染、潜伏或有症状的受试者的百分比)。可以将灵敏度计算为真阳性的数量除以真阳性的数量和假阴性的数量的总和。

本文所述的侧向流动装置可以精确地测量许多不同种类的样品中的多种目标分析物。样品可以包括从任何来源获得的样本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可以从动物(包括人类)获得，并且包括流体、固体、组织和气体。在施加至本公开内容的侧向流动装置之前，可以对样品进行处理。在第一非限制性实例中，可以处理全血样品以获得血浆或血清，并且可以将血浆或血清施加至根据本公开内容的侧向流动装置。在第二非限制性实例中，使用一个或多个样品制备步骤，比如但不限于细胞裂解步骤对含有细胞的样品进行处理以释放细胞内蛋白质以供检测。可以将处理的样品施加至根据本公开内容的侧向流动装置。生物样品包括尿液、唾液和血液制品，比如血浆、血清等。然而，这种实施例不应被解释为限制适用于本公开内容的样品类型。

本文所述的侧向流动装置可以包括标记物。标记物可以采取许多不同的形式，包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的结合或能够结合至分析物、分析物类似物、检测器试剂或结合伴侣的分子或组合物。标记物的实例包括酶、胶体金颗粒(也被称为金纳米颗粒)、有色乳胶颗粒、放射性同位素、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、蛋白质吸附的银颗粒、蛋白质吸附的铁颗粒、蛋白质吸附的铜颗粒、蛋白质吸附的硒颗粒、蛋白质吸附的硫颗粒、蛋白质吸附的碲颗粒、蛋白质吸附的碳颗粒和蛋白质偶联染料囊。化合物(例如，检测器试剂)与标记物的附连可以通过共价键、吸附过程、疏水键和/或静电键，如在螯合物中等，或这些键和相互作用的组合和/或可能涉及连接基团。

术语“特异性结合伴侣”或“结合伴侣”是指一对分子中的成员，其通过依赖于所涉及分子的三维结构的特异性、非共价相互作用的方式进行相互作用。典型的特异性结合伴侣对包括抗原/抗体、半抗原/抗体、激素/受体、核酸链/互补核酸链、底物/酶、抑制剂/酶、碳水化合物/凝集素、生物素/(链霉)抗生物素蛋白、受体/配体和病毒/细胞受体，或其各种组合。

如本文所使用，术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指结合特异性抗原的蛋白质。免疫球蛋白包括，但不限于，多克隆、单克隆、嵌合和人源化抗体、Fab片段、F(ab′)2片段，并且包括以下分类的免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE和分泌型免疫球蛋白(sIg)。免疫球蛋白通常包括两个相同的重链和两个轻链。然而，术语“抗体”和“免疫球蛋白”也包括单链抗体和双链抗体。本文所使用的术语抗体是指作为整体的抗体或其任何片段，包括其结合片段。因而，可以设想，当提及特异性结合目标分析物的标记的抗体时，该术语是指特异性结合目标分析物的标记的抗体或其片段。类似地，当提及捕获剂或抗体时，该术语是指特异性结合至目标分析物的捕获抗体或其片段。

根据本公开内容的侧向流动装置、测试系统和方法中的抗体可以包括多克隆抗体。用于测量本文公开的任意目标分析物的多克隆抗体包括但不限于通过以下的一种或多种的主动免疫从血清中产生的抗体：兔、山羊、绵羊、鸡、鸭、豚鼠、小鼠、驴、骆驼、大鼠和马。根据本公开内容的侧向流动装置、测试系统和方法中的抗体可以包括单克隆抗体。用于结合至目标分析物的抗体在本领域是已知的，或者可以通过本领域已知的方法容易地开发。

根据本公开内容的侧向流动装置包括固定化捕获剂。固定化捕获剂包括能够结合至分析物的试剂，所述分析物包括游离的(未标记的)分析物和/或标记的分析物(比如，结合至分析物特异性缀合物的分析物，如本文所述)。固定化捕获剂包括未标记的特异性结合伴侣，其对于(i)被分析物特异性缀合物结合的目标分析物、(ii)游离分析物或(iii)辅助特异性结合伴侣具有特异性，后者本身对于分析物具有特异性，如在间接测定中。如本文所使用，“辅助特异性结合伴侣”是结合至分析物的特异性结合伴侣的特异性结合伴侣。例如，辅助特异性结合伴侣可以包括对另一种抗体特异性的抗体，例如，山羊抗人抗体。

本文所述的侧向流动装置可以包括“检测区域”或“检测区”，其是包括一个或多个捕获区域或捕获区的区域并且为其中可以检测到可检测的信号的区域。本文所述的侧向流动装置可以包括“捕获区”或“捕获区域”，其为其中捕获剂被固定化的侧向流动装置的区域。本文所述的侧向流动装置可以包括一个以上的捕获区。在一些情况下，将不同的捕获剂固定化在不同的捕获区(比如在第一捕获区的第一固定化捕获剂和在第二捕获区的第二固定化捕获剂)。在侧向流动基底上，多个捕获区可以相对于彼此具有任何取向；例如，第一捕获区可以沿着流体流动的路径在第二(或其他)捕获区的远端或近端，反之亦然。可选地，第一捕获区和第二(或其他)捕获区可以沿着垂直于流体流动路径的轴对准使得流体同时或大约同时接触捕获区。

根据本公开内容的侧向流动装置包括固定化捕获剂，其被固定化使得在侧向流动装置的正常操作期间固定化捕获剂的移动受到限制。例如，在将流体样品施加至侧向流动装置之前和之后，固定化捕获剂的移动受到限制。可以通过物理手段比如屏障、静电相互作用、氢键、生物亲和力、共价相互作用或其组合来实现固定化捕获剂的固定化。

根据本公开内容的侧向流动装置可以测量生物制品。生物制品包括由活生物体产生的化学或生物化学化合物，其包括原核细胞系、真核细胞系、哺乳动物细胞系、微生物细胞系、昆虫细胞系、植物细胞系、混合细胞系、天然发生的细胞系或合成的工程化细胞系。生物制品可以包括大的大分子，比如蛋白质、多糖、脂质和核酸，以及小的分子，比如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。

应当理解，说明书、具体实施例和数据，虽然指示示例性实施方式，但是通过示例的方式给出并且不旨在限制本公开内容的各种实施方式。根据说明书和本文含有的数据，本公开内容中的各种改变和更改对于本领域技术人员来说将变得显而易见，并且因此被认为是本公开内容的各种实施方式的一部分。

Claims (31)

1.一种用于检测样品中目标分析物的侧向流动测定，其包含：

第一缀合物，其包含第一标记物、配置为特异性结合至所述目标分析物的试剂和第一结合伴侣；

沿着所述侧向流动测定的流体流动路径在所述第一缀合物上游的第二缀合物，其中所述第二缀合物包含第二标记物和配置为特异性结合至所述第一结合伴侣的第二结合伴侣；和

沿着所述侧向流动测定的流体流动路径在所述第一缀合物和所述第二缀合物下游的检测区，所述检测区包含特异性结合所述目标分析物的固定化捕获剂。

2.根据权利要求1所述的测定，其中所述第一缀合物存在于所述侧向流动测定的样品接收区中，或者其中所述第一缀合物存在于所述样品接收区下游的第一缀合物区中。

3.根据权利要求1所述的测定，其中所述第二缀合物存在于所述样品接收区上游的缓冲液接收区中，或者其中所述第二缀合物存在于所述缓冲液接收区下游和所述样品接收区上游的第二缀合物区中。

4.根据权利要求1所述的测定，其中所述第一缀合物配置为在将流体样品施加至所述侧向流动测定之后溶解并移动至所述检测区。

5.根据权利要求4所述的测定，其中所述第二缀合物配置为在所述第一缀合物移动至所述检测区之后溶解并且移动至所述检测区。

6.根据权利要求1所述的测定，其中所述配置为特异性结合至目标分析物的试剂是特异性结合所述目标分析物的抗体或抗体结合片段。

7.根据权利要求1所述的测定，其中所述第一结合伴侣和所述第二结合伴侣包括选自以下的结合对：抗原/抗体、半抗原/抗体、激素/受体、核酸链/互补核酸链、底物/酶、抑制剂/酶、碳水化合物/凝集素、生物素/抗生物素蛋白、受体/配体和病毒/细胞受体。

8.根据权利要求1所述的测定，其中所述第一结合伴侣和所述第二结合伴侣包括生物素/抗生物素蛋白结合对，并且所述抗生物素蛋白包含链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。

9.根据权利要求1所述的测定，其中所述第一结合伴侣和所述第二结合伴侣包括抗原/抗体结合对，并且所述抗原是肽或十肽。

10.根据权利要求1所述的测定，其中所述目标分析物是目标生物或环境物质。

11.根据权利要求1所述的测定，其中所述目标分析物是流感病毒。

12.根据权利要求11所述的测定，其中所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。

13.根据权利要求1所述的测定，其中所述固定化捕获剂是特异性结合所述目标分析物的抗体或抗体结合片段。

14.根据权利要求1所述的测定，其中所述测试条包含硝化纤维膜。

15.根据权利要求1所述的测定，进一步包括包含特异性结合所述第一缀合物的固定化捕获剂的对照区。

16.根据权利要求1所述的测定，其中所述第一标记物和第二标记物选自金属纳米颗粒、蓝色乳胶珠、金属纳米颗粒、有色乳胶颗粒、有色乳胶珠、磁性颗粒、碳纳米颗粒、量子点、上转换磷光体、有机荧光团、纺织染料、酶或脂质体。

17.根据权利要求1所述的测定，其中所述第一标记物和所述第二标记物包括金纳米颗粒。

18.根据权利要求1所述的测定，其中所述第一标记物和所述第二标记物配置为产生光学信号、荧光信号或磁信号。

19.根据权利要求3所述的测定，进一步包括：

外壳，其包含横向定位在所述第一缀合物上方或上游的样品孔、横向定位在所述第二缀合物区上方或上游的缓冲液孔和可进入所述检测区的读取窗口。

20.根据权利要求19所述的测定，其中所述缓冲液孔、所述第二缀合物区、所述样品接收孔和所述第一缀合物区沿着所述侧向流动测定的所述流体流动路径空间上分离。

21.一种制造权利要求1的侧向流动测定的方法，其包含：

在所述侧向流动测试条的样品接收区处或其下游，将所述第一缀合物施加至侧向流动测试条；和

在所述样品接收区上游的缓冲液接收区处或其下游，将所述第二缀合物施加至所述测试条。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一缀合物和所述第二缀合物同时施加至所述测试条。

23.根据权利要求21所述的方法，其中通过空气喷射沉积将所述第一缀合物和所述第二缀合物施加至所述测试条。

24.一种检测样品中目标分析物的方法，其包括：

将样品施加至侧向流动测定，其包括

第一缀合物，其包含第一标记物、配置为特异性结合至所述目标分析物的试剂和第一结合伴侣；

沿着所述侧向流动测定的流体流动路径在所述第一缀合物上游的第二缀合物，其中所述第二缀合物包含第二标记物和配置为特异性结合至所述第一结合伴侣的第二结合伴侣；和

沿着所述侧向流动测定的流体流动路径在所述第一缀合物和所述第二缀合物下游的检测区，所述检测区包含特异性结合所述目标分析物的固定化捕获剂；

将复合物结合至所述检测区中的所述固定化捕获剂，其中所述复合物包含结合至所述第一缀合物的目标分析物；

在结合所述复合物之后，释放所述第二缀合物以沿着所述侧向流动测定的流体流动路径流动；

将所述第二缀合物结合至在所述检测区中结合的所述复合物。

25.根据权利要求24所述的方法，进一步包括检测由在所述检测区中结合的所述复合物和所述第二缀合物产生的信号。

26.根据权利要求25所述的方法，进一步包括将未结合至所述目标分析物的第一缀合物结合至已在所述检测区结合至所述复合物的所述第二缀合物。

27.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一标记物和所述第二标记物配置为产生光学信号、荧光信号或磁信号。

28.根据权利要求24所述的方法，其中在将样品施加至所述侧向流动装置之后5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟释放所述第二缀合物。

29.根据权利要求24所述的方法，其中将复合物结合至所述检测区中的所述固定化捕获剂包括：

用所述第一缀合物标记所述目标分析物以形成复合物；和

将所述复合物结合至所述检测区中的所述固定化捕获剂。

30.根据权利要求24所述的方法，其中释放所述第二缀合物包含将缓冲溶液施加至所述第二缀合物或者至所述第二缀合物上游的所述侧向流动测定上的位置。

31.根据权利要求30所述的方法，其中施加缓冲溶液包括将缓冲溶液倾倒在横向定位在所述第二缀合物上方或上游的缓冲液接收孔中。

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