KR20080067543A

KR20080067543A - 시분할 레이저 유발 표면형광 검출 카트리지 및 검출장치

Info

Publication number: KR20080067543A
Application number: KR1020070004962A
Authority: KR
Inventors: 박상열
Original assignee: 박상열
Priority date: 2007-01-16
Filing date: 2007-01-16
Publication date: 2008-07-21

Abstract

본 발명은 크로마토그래피 매질 상의 한쪽 말단에 시료를 적하하여 매질을 통해 이동되도록 하고, 분석물인 검출 표지자는 형광이 결합되어 있는 항체 단백질과 반응하여 검출 표지자-형광표지 항체 단백질의 결합체를 형성하며, 이 결합체는 크로마토그래피 매질을 통해 이동하면서 검사선에 고정된 포획 항체와 반응함으로써 표지된 검출항체 단백질과 비표지된 포획항체 단백질 사이에 검출 표지자가 샌드위치 형태로 포획되어 형성된 복합체의 양을 측정하여 시료 중의 분석물을 검사하는 측방유동검정스트립, 상기 측방유동검정스트립을 일정 거리만큼 이동시키는 이동 장치인 측방유동기 및 레이저 유발 표면형광 검출장치를 포함하는 면역반응 정량 분석 장치 및 이를 이용하여 면역 반응의 시분할 분석 및/또는 정량 분석을 하는 방법에 관한 것이다.

측방유동검정스트립, 측방유동기, 레이저 유발 표면형광 검출장치, 시분할 분석, 정량 분석

Description

시분할 레이저 유발 표면형광 검출 카트리지 및 검출장치{A Cartridge and Apparatus for the Detection of Laser-induced Epifluoresecne}

도 1은 본 발명에서 사용되는 측방유동검정스트립의 구조를 도시한 그림이다.

도 2는 본 발명의 방법에 의한 펄스 형광측정(pulse fluorometry)의 일반적인 측정 데이터를 도식화한 그림이다.

도 3은 본 발명의 면역반응 정량 분석 장치를 도시화한 그림이다.

도 4는 측방유동검정스트립에서의 나노입자 기초 면역법의 원리를 도시화한 그림이다.

도 5는 본 발명의 측방유동기의 주사방향의 일례를 나타낸 그림이다.

도 6은 본 발명의 방법에 의하여 측정한 시료의 각 농도에서의 형광 분포를 나타낸 그림이다.

도 7은 면적 맞춤(fitting)을 통한 시료의 각 농도별로 측방유동검정스트립 내 형광 분포를 구하여 농도 대 형광의 개수 그래프로 나타낸 그림이다.

혈액 또는 뇨와 같은 생검물에 함유된 미량의 물질을 정성 또는 정량함으로써 이루어지는 새로운 진단방법과 진단기구의 개발이 지난 30여년간 빠르게 진행되었고, 현재도 빠른 속도로 발전하고 있다. 1950년대 방사선 동위원소를 이용한 방사능면역분석법(RIA)이 처음으로 도입된 이래 효소면역분석법(ELISA)이 70년대와 80년대에 개발되고 발전되었다. 현재 ELISA 면역분석법은 가장 많이 사용되고 있는 방법 중의 하나이며, 의학이나 생명과학의 연구에서 필수적인 도구가 되었다. 최근에는 변형된 ELISA 분석법이 개발되었는데, 96-웰 내부에 다수의 항체를 고정화하여 한꺼번에 많은 수의 시료를 분석하는 방법도 이들 중의 하나이다.

RIA나 ELISA를 포함하는 전형적인 면역진단법에서는 대개 시료 당 한 종류의 분석물을 복잡하고, 다단계과정을 거치며, 실험실에서만 구비된 고가의 분석기기를 사용하여 정량화할 수 있다. 따라서, 이러한 시설이나 설비가 갖추어 지지 않은 소규모의 병원, 응급실, 가정 등에서 사용하는 것은 용이하지 않다. 이러한 약점을 보완하기 위하여 고안된 진단제품이 면역크로마토그라피 방법을 이용한 간편용 진단 키트이다.

면역크로마토그라피 방법은 진단 키트로 전혈, 혈청, 뇨 등의 생검물을 고안된 기구에 적용하여 15분 이내에 검사결과를 확인할 수 있다. 면역크로마토그라피 분석법의 대표적인 타입으로 측방유동분석법(lateral flow assay)을 들 수 있다. 이 측방유동분석 타입의 키트 구조를 살펴보면 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패트(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항체 항원 반응이 일어나는 전개용 막(주로, 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드(absorption pad)로 되어 있다. 탐지용 항체는 탐지를 표지하기 위하여 예를 들면 콜로이드성 금입자에 고정되어 있다. 금입자 대신 라텍스 비드(latex bead) 또는 탄소입자를 사용하기도 한다. 측방유동분석용 진단 키트는 대개 샌드위치 형태로 분석물을 탐지하도록 고안되어 있다. 액체 시료 속에 들어 있는 분석물은 샘플패드에 적용되어 이동하기 시작하면서 먼저 방출패드에 비고정적으로 코팅되어 있는 탐지용 항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속하여 전개된다. 이동하면서 전개막에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획 항체는 전개막에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획 항체는 전개막에 고정되어 있기 때문에 항원-항체 반응이 계속하여 일어나면 복합체의 축적이 포획 항체의 고정면에서 이루어진다. 단백질은 육안으로는 투명하기 때문에 복합체의 생성 여부와 상대적인 양을 부착된 금입자의 양으로 판단한다.

이와 같은 측방 유동 분석법은 임신진단, 암진단, 미생물탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 아주 간편하게 진단할 수 있으나, 판단이 육안으로 이루어지 는 까닭에 정확한 양을 확인하기 어려운 점이 따른다. 특히, 판단이 컷오프 값(cut-off value) 부근에서 이루어져야 할 경우에는 정확하게 진단하기가 용이하지 않다. 예를 들어, 전립선암의 경우 컷오프 값이 4ng/ml인데, 실제 값이 3.9ng/ml와 같이 아주 유사한 경우 정확한 판단이 매우 어렵다.

면역진단법은 빠르게 발전하고 있어 멀지 않은 미래에는 보다 단순하고 빠르게 시료를 확인하고 분석하여 질병의 상태를 진단할 수 있을 것이다. 현재까지 정량화가 가능한 RIA 방법이나 ELISA 방법은 시료에서 분석물의 정량화를 위하여 효소를 처리하고 세척하는 등의 몇 단계를 거쳐야 한다. 마찬가지로 기존의 간편용 진단 키트는 정량화에 어려움이 따른다. 따라서, 보다 빠르고, 간편하고, 고감도로 정량화가 가능한 일반적인 분석법이 더욱 더 필요한 시점이다. 이 방법은 훈련되지 않은 일반인이 장소에 구애받지 않고 진단이나 분석이 가능해야 하는 것이다.

또한, 종래의 측방 유동 정량 검정 스트립들은 문헌에 공지되어 있거나 실제로 시중에 시판되고 있는 제품 모두를 포함해서 감도가 낮아 대체로 분석물을 정량하기 보다는 단순히 정성을 위한 수단으로 이용되고 있으며, 또한 분석물의 종류도 하나 또는 두 종류밖에 검정할 수 밖에 없는 실정이다. 근래에는 질병을 검사하는데 보통 수십 종류의 분석물을 대상으로 하며 실제로 분자생물학 및 의학의 급격한 발전으로 인해 질병 검사를 위한 분석물의 종류는 점점 더 증가하는 추세이다. 그러나, 검사해야 할 분석물의 종류가 많아지는 한편 현재로서는 대체로 개개의 분석 물을 별도로 검정하는 실정에 있음으로써 시간적으로나 비용적으로 많은 부담이 되고 있다. 이러한 상황하에, 신속 정확하게 많은 종류의 분석물을 동시에 정량하는 것이 경제적 측면에서는 물론 기타 여러 가지 측면에서 유리하며 이러한 제품의 개발은 많은 의료 관계자를 포함한 일반 소비자들에 의해 더욱 더 간절히 요구되고 있다.

본 발명의 하나의 목적은 크로마토그래피 매질 상의 한쪽 말단에 시료를 적하하여 매질을 통해 이동되도록 하고, 분석물인 검출 표지자는 형광이 결합되어 있는 항체 단백질과 반응하여 검출 표지자-형광표지 항체 단백질의 결합체를 형성하며, 이 결합체는 크로마토그래피 매질을 통해 이동하면서 검사선에 고정된 포획 항체와 반응함으로써 표지된 검출항체 단백질과 비표지된 포획항체 단백질 사이에 검출 표지자가 샌드위치 형태로 포획되어 형성된 복합체의 양을 측정하여 시료 중의 분석물을 검사하는 측방유동검정스트립, 상기 측방유동검정스트립을 일정 거리만큼 이동시키는 이동 장치인 측방유동기 및 레이저 유발 표면형광 검출장치를 포함하는 면역반응 정량 분석 장치에 관한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 장치를 이용하여 면역반응을 시분할로 측정 및 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 장치를 이용하여 면역반응의 정량을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어, "감도(sensitivity)"는 포획자, 탐지자와 분석물의 복합체를 검출할 수 있는 최소 한계량을 의미한다.

본원에서 사용된 용어, "표면형광(epifluorescence)"은 크로마토그라피를 이용한 측방 유동 검정 스트립(lateral flow assay strip)의 검사창 및 표준선에 각각 고정되는 형광물질 표지된 탐지자-분석물-포획자의 복합체 및/또는 형광물질 표지된 표준 탐지자-표준물-표준 포획자의 표준 복합체로부터 발광되는 형광을 가리킨다.

본원에서 사용된 용어, "분석물(analyte)"은 액체 시료 중의 분석 대상 화합물 또는 조성물을 가리킨다. 본 발명에서 사용될 수 있는 시료는 상기 분석물을 함유하는 어떠한 시료로부터도 선택될 수 있으며, 예로는 뇨, 혈청, 혈장, 혈액, 타액, 척수액, 안구액, 양수 등과 같은 생리학적 유액, 밀크 및 와인과 같은 식품, 음식물 폐수와 같은 화학적 처리 스트림 등이 포함된다. 본 발명에서 검사될 수 있는 분석물은 완전 항원과 합텐(불완전 항원)으로 구분될 수 있다. 여기서, 완전 항원은 자체로서 항체 생성을 유도할 수 있는 능력(면역원성)을 갖는 항원성 물질을 가리키며 주로 고분자량의 펩타이드 호르몬을 포함한다. 상기 합텐은 항체와 결합할 수 있으나 자체로서는 항체 생성을 유도하는 능력이 없는 물질을 가리키며 비교적 작은 분자량(약 1,000 미만의 분자량)의 펩타이드를 포함한다. 합텐은 예를 들면, 소 혈청 알부민과 같은 단백질에 결합될 때 항체 생성능을 획득한다. 본 발명에 있어서, 완전 항원은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 본 출원인의 대한민국 등록특허 제639776호 및 제560174호 등을 참조할 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 크로마토그래피 매질 상의 한쪽 말단에 시료를 적하하여 매질을 통해 이동되도록 하고, 분석물인 검출 표지자는 형광이 결합되어 있는 항체 단백질과 반응하여 검출 표지자-형광표지 항체 단백질의 결합체를 형성하며, 이 결합체는 크로마토그래피 매질을 통해 이동하면서 검사선에 고정된 포획 항체와 반응함으로써 표지된 검출항체 단백질과 비표지된 포획항체 단백질 사이에 검출 표지자가 샌드위치 형태로 포획되어 형성된 복합체의 양을 측정하여 시료 중의 분석물을 검사하는 측방유동검정스트립, 상기 측방유동검정스트립을 일정 거리만큼 이동시키는 이동 장치인 측방유동기 및 레이저 유발 표면형광 검출장치를 포함하는 면역반응 정량 분석 시스템에 관한 것이다.

본 발명의 측방 유동 검정스트립은 직사각형, 원형, 난형, 삼각형, 기타 여러 모양을 취할 수 있는데 단 시험 용액이 모세관력에 의해 이동할 수 있는 적어도 하나의 방향이 존재하여야 한다. 시험 용액이 가운데서 접촉되는 난형 또는 원형과 같이 다른 이동 방향이 존재할 수 있다. 그러나, 고려되어야 하는 것은 시험 용액이 적어도 하나의 방향으로 예정된 위치로 이동되어야 한다. 본 발명에 따른 스트 립의 두께는 중요하지 않지만 보통 0.1 내지 2 mm, 더욱 보통은 0.15 내지 1 mm, 바람직하게는 0.2 내지 0.7 mm이다. 일반적으로, 최소 두께는 스트립 재질의 강도 및 용이한 검출 신호의 생성 필요성에 의해 결정되는 한편 최대 두께는 시약의 취급 용이성 및 시약의 비용에 의해 결정된다. 시약을 보존하고 한정된 크기의 샘플을 제공하기 위해, 스트립의 너비는 일반적으로 비교적 좁게 만들며, 보통은 20 mm 미만, 바람직하게는 10 mm 미만이다. 일반적으로, 스트립의 너비는 약 1.0 mm 미만이어서는 안되며 보통의 범위는 약 2 mm 내지 12 mm이고, 바람직한 범위는 약 4 mm 내지 8 mm이다. 스트립의 길이는 분석물의 종류, 크로마토그래피 매질상의 시험 선 또는 점 및 표준선의 수, 패드사이의 공간, 취급의 편리성 등을 고려하여 결정된다. 보통은 1 내지 40 cm이고, 바람직하게는 약 2 내지 25 cm이며, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 20 cm이다. 그러나, 스트립은 실질적으로 어떠한 길이로도 가능할 수 있다.

분석할 액체 시료를 위한 용매는 보통 수성 매질이며, 이러한 매질은 약 40 중량% 이하의 다른 극성 용매, 특히 알코올, 에테르 등을 포함하여 탄소수 1 내지 6, 더욱 보통은 탄소수가 1 내지 4인 산화 용매를 포함할 수 있다. 보통, 공동용매가 약 20 중량% 미만으로 존재한다. 시료의 성질에 따라 일부 환경하에서 수성 매질 중 일부 또는 전부가 시료 자체에 의해 제공될 수 있다.

매질에 대한 pH는 보통 4 내지 11, 더욱 보통은 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9이다. pH는 결합 요소들의 중요한 결합 친화성 부위 및 신호 생성 시스템에 의한 신호의 임의 생성을 유지하는 정도로 선택된다. 검정동안에 원하는 pH로 조절 하고 그 pH를 유지하기 위해 다양한 완충액을 사용할 수 있다. 대표적인 완충액으로는 보레이트, 포스페이트, 카르보네이트, 트리스, 바르비탈(barbital)이 포함된다. 사용되는 특정 완충액이 중요하지는 않지만 개개의 검정에서 한 완충액이 다른 완충액에 비해 바람직할 수 있다. 바람직하게는 약 0.05 내지 0.5 중량%의 비이온성 세정제(detergent)가 시료에 포함된다. 약 200 내지 20,000 달톤의 여러 폴리옥시알킬렌 화합물이 사용될 수 있다.

검정을 실시하는데는 보통 온화한 온도가 사용되며 바람직하게는 실질적으로 일정한 온도가 사용된다. 검정 신호의 생성을 위한 온도는 일반적으로 약 4℃ 내지 50℃, 더욱 보통은 약 10℃ 내지 40℃이고, 흔히는 주변 온도, 즉 약 15℃ 내지 25℃이다.

피검 수용액중의 검정될 분석물의 농도는 일반적으로 약 10^-4내지 약 10^-15M, 더욱 보통은 약 10^-6내지 10^-14M이다. 다른 시약의 농도는 목적하는 분석물의 농도 및 프로토콜과 같은 것을 고려하여 결정하는 것이 보통이다.

시료 및 시약 용액중에 여러 많은 시약의 농도는 일반적으로 목적하는 분석물의 농도 범위에 의해 결정되는 한편, 각 시약의 최종 농도는 목적하는 범위에서 검정의 감도를 경험에 의해 최적화하는 정도로 결정된다. 특정 프로토콜과 함께 개개의 시약은 검정의 감도를 저하시키지 않는 한 과량으로 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 측방유동검정스트립의 구조는 예를 들어, 도 1과 같은 구조를 가지고 있다. 즉, 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 시료가 이동하여 분리되는 전개용 막, 및 시료가 계속해서 이동하기 위해 반대편에서 계속 시료를 흡수하는 흡수패드(absorption pad)로 구성되는 구조를 가지고 있다. 전개용 막의 검사선(capture line)에는 특정 항체를 고착시켜 놓아 시료를 흘려보내면 그 항체와 결합할 수 있는 항원만이 결합하고, 결합하지 않은 나머지 시료는 흡수패드로 이동하여 흡수된다.

본 발명에서 사용되는 측방유동검정스트립의 지지대(backing)는 보통 수불용성, 비다공성 및 경직성이고 보통은 이의 위에서 시료를 전개하는 패드의 길이와 너비가 동일하나 보다 크거나 작을 수 있다. 아주 다양한 천연 및 합성의 유기 및 무기 재료를 사용할 수 있는데 다만 지지대는 흡수 물질의 모세 작용을 방해하거나, 분석물과 비특이적으로 결합하거나, 분석물과 탐지자의 반응을 방해해서는 안된다. 대표적인 중합체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 유리, 세라믹, 금속 등이 포함된다.

지지대는 그 위로 보통 접착제가 코팅되어 각종 패드가 부착된다. 적절한 접착제의 선택은 스트립의 성능을 개선하고 수명을 연장하는데 도움을 줄 수 있다. 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립에 사용되는 것으로는 감압성 접착제(pressure-sensitive adhesives, PSA)가 대표적이다. 전형적인 측방 유동 검정 스트립에서 각종 패드의 결합은 접착제가 그들 패드의 기공내로 침투하고 이에 따라 패드가 지지대와 함께 결합함으로써 달성된다. 이와 같이 접착제가 정상적인 조건하에서 이동하는 과정을 콜드 플로우(cold flow)라고 한다. PSA를 패드에 적층하는 과정에서는 가열을 하지 않기 때문에 어느 정도의 콜드 플로우는 패드와 지지대사이의 결합이 형성되기 위해서는 필수적이다. 콜드 플로우의 정도가 너무 낮으면 초기 결합력이 낮아 패드와 지지대의 적절치 못한 결합을 초래할 수 있다. 반대로, 콜드 플로우의 정도가 너무 높으면 특히 스트립의 저장 기간 동안에 함께 결합되어 있는 패드내로 접착제가 이동하여 기공이 차단되거나 소수성 얼룩이 형성되거나 패드의 재습윤 문제가 발생할 수 있다. 이러한 접착제의 콜드 플로우와 연관된 문제는 직접-주조 막을 사용함으로써 해결될 수 있다. 예를 들면, 이러한 막들은 지지 플라스틱 시트에 의해 접착제가 막의 기공으로 들어가는 것을 차단해 주기 때문에 저장동안에 접착제의 상하 이동을 예방할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 측방유동검정스트립의 시료 패드(sample pad)는 기본적으로 분석물이 함유된 시료를 접수하는 역할을 한다. 이러한 기능에 더하여 시료 패드는 시료 중의 불용성 입자를 여과하는 기능을 가질 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 시료 패드는 여과 기능을 부가하는 재질인 셀룰로즈 여과지 또는 유리 섬유 여과지가 바람직하다. 일반적으로, S & S사의 셀룰로즈 막(등급 903)이 사용된다.

시료 패드는 이의 재질에 시료 중의 분석물이 비특이적으로 흡착되는 것을 막고, 더불어 시료의 성분들이 크로마토그래피 매질을 통해 용이하게 이동할 수 있 도록 보조하며 반응의 감도를 유지하고 라벨-표지된 탐지자와 시료의 성분 사이에 이루어질 수 있는 원치 않는 비특이적 반응을 최대한 방지하기 위하여 전처리하는 것이 바람직하다. 시료 패드의 전처리는 보통 불활성 단백질로 샘플 패드를 처리하거나 계면활성제로 처리하여 실시된다. 불활성 단백질로의 전처리는 예를 들면 패드를 0.1 내지 10% 소 혈청 알부민(BSA)-함유 0.1 M 트리스 완충액(pH 6-9), 0.1 M 트리스 완충액(pH 6-9)중의 0.1% 내지 10% 탈지유분의 용액 및/또는 0.1% 내지 10% 카제인 용액에 침지시키고 이 상태로 37℃에서 1시간 또는 4℃에서 24시간 방치한 후 패드를 트리스 완충액으로 세척한 다음 건조시킴으로써 수행된다. 계면활성제로의 전처리는 예를 들면 패드를 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-100 또는 트윈 20의 0.01% 내지 1%를 함유한 용액중에 침지시킨 후 건조시킴으로써 수행된다. 바람직한 전처리는 불활성 단백질로 처리하고 또한 계면활성제로 처리하는 것이다. 그러나, 이러한 전처리의 결정은 분석물 및 시료의 종류에 따라 결정될 것이다.

본 발명에서 사용되는 측방유동검정스트립의 방출 패드(conjugate releasing pad)는 시료중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성할 수 있는 형광물질-표지된 탐지자가 고정되지 않고 흡착되어 있다. 탐지자는 고정되지 않고 흡착되어 있음으로써 시료중의 분석물과의 반응에 의해 결합체를 형성한 후 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 전개 이동됨에 따라 함께 이동한다.

결합체 방출 패드를 위한 재질은 신속한 여과 속도와 함께 양호한 입자 보유를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 것으로는 폴리에스테르와 같은 합성소재 및 유리 섬유 필터가 사용될 수 있다. 일반적으로, S & S사의 유리 섬유 및 폴리에스테르가 사용된다. 이들은 생물학적으로 불활성이고 천연 소재보다 정교한 섬유질을 갖고 있기 때문에 수성 시약이나 시료가 투입되었을 때 뒤틀리거나 팽창하지 않는다. 바람직하게는, 결합체 방출 패드는 이에 분석물과 형광물질-표지된 탐지자가 비특이적으로 흡착되는 것을 방지하면서 결합체의 방출과 이동이 원활이 이루어질 수 있도록 계면활성제와 같은 시약으로 전처리한다.

결합체 방출 패드에 시약을 흡착시키는 방법은 특정적으로 제형된 고밀도 시약 용액에 유리 섬유와 같은 패드를 담그고 말리는 침지 방법(impregnation process)을 포함한다. 침지 방법은 단순하지만 몇 가지 문제점이 있다. 첫째는 패드를 말리는 동안에 구겨지거나 비틀릴 수 있다는 것이다. 둘째는 패드를 오븐에서 말리는 동안 패드의 위치에 따라 시약이 표면 장력 및 중력 효과로 인해 이탈되거나 재구성될 수 있다는 점이다. 셋째는 패드 침지욕에서 시간이 경과함에 따라 화학 변화가 일어나 여러 시약간에 상이한 흡착 속도를 초래할 수 있으며 이에 따라 패드상에 시약이 균일하지 않게 코팅된다는 점이다. 이러한 문제점을 최소화하기 위한 한 가지 방법으로는 패드의 건조를 40℃ 미만의 오븐에서 수 시간에 걸쳐서 행하는 것이다. 다른 방법은 오븐에서 건조시키는 대신에 동결건조시키는 것이다. 이러한 동결건조는 탐지자의 안정성을 확보할 수 있다는 점에서 오븐에서 건조하는 것보다 바람직하다.

침지 방법의 대안으로서, 분주 방법(dispensing process)이 사용된다. 이 방법은 분주기(dispenser)를 사용하여 보통 패드 cm당 12 내지 15 μl의 시약 용액을 분주한 후 말리는 것이다. 패드를 말리는 것은 침지 방법과 동일하게 실시하며 또한 패드를 동결건조시킬 수 있다.

다른 관점으로서, 결합체 방출 패드에는 안정화제 및 차단제가 사용될 수 있다. 안정화제의 예로는 수크로즈, 트레할로즈와 같은 당류를 들 수 있다. 차단제는 이들로 한정되는 것은 아니지만 BSA(소혈청알부민), 젤라틴, 카세인, 탈지유 등과 같은 단백질류가 포함된다.

본 발명에서 사용되는 측방유동검정스트립의 크로마토그래피 매질은 바람직하게는 액체 시료 및 결합체가 모세관력에 의해 신속하게 이동하여 그 위에 고정된 포획자에 도달될 수 있도록 하는 것이면 어느 것이든 가능할 수 있으며 균일한 특성을 갖는 것이 바람직하다. 일반적으로, 크로마토그래피 매질은 모세관력에 반응하여 수성 매질에 의해 이동하기 쉽고 기공이 0.1 μ 이상, 바람직하게는 1.0 μ 이상인 다공성 물질을 가리킨다. 이러한 물질은 일반적으로 친수성이거나 친수성으로 될 수 있으며 예로는 무기 분말(예, 실리카, 황산마그네슘 및 알루미나); 천연 중합체 물질, 특히 셀룰로즈성 물질 및 셀룰로즈로부터 유도된 물질(예, 필터지, 크로마토그래피지 등과 같은 섬유 함유 지); 합성 또는 변형된 천연 중합체(예, 니트로셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 가교된 덱스트란, 아가로즈, 폴리아크릴레이트 등)이 포함된다. 상기 예시된 물질은 단독으로 사용되거나 다른 물질과 결합시켜 사용할 수 있다. 또 다른 예로는 세라믹 물질을 들 수 있다. 크로마토그래피 매질은 지지대에 결합될 수 있다. 다른 방도로서, 크로마토그래피 매질은 그 자체가 지지체가 될 수 있다. 크로마토그래피 매질은 다작용성이거나 다작용성으로 변형시켜 포획자의 공유 결합을 가능하게 할 수 있다.

크로마토그래피 매질은, 결합체 패드로부터 이동해 온 분석물과 탐지자의 결합체와 반응하여 포획할 수 있도록 크로마토그래피 매질에 화학적으로 결합 고정되어 있는 포획자가 고농도로 사용되는 경우, 활성화된 필터지를 사용하는 것이 바람직하다. 매질의 재질로서 CNBr 활성화된 셀룰로즈가 선택 사용되는 경우에는 활성화된 셀룰로즈 필터지는 문헌[Ceska and Lundkvist, Immunochemistry, 9, 1021 (1972)] 및 [Lehtone, Viljanen et al., J. Immunol. Methods, 36, 63 (1980) 및 동일 문헌의 34, 61 (1980)]에 기술된 방법과 같은 공지 방법에 의해 쉽게 제조할 수 있다. 다른 방도로서, 재질이 DBM 활성화된 셀룰로즈가 선택 사용되는 경우에는 문헌[Alwine, Methods Enzymol., 68, 220 (1979)]에 기술된 방법과 같은 공지 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 이외에도 시판되고 있는 활성화된 나일론 필름(Pall Immunodyne, USA)을 사용할 수 있다.

크로마토그래피 매질은 포획자를 고정할 수 있는 능력(capacity)이 중요하다. 이러한 결합능(binding capacity)은 매질의 기공 구조 및 매질의 후처리에 따라 달라진다. 본 발명에 있어서 바람직하게 사용될 수 있는 크로마토그래피 매질은 니트로셀룰로즈(NC) 막이며 이의 예는 하기 표 1에 기술되어 있다.

표 1

제조사	제품명	Sec/4cm (유속^(a))	IgG / cm² ^(b)
S & S (지지대가 결합되지 않은 것)	AE 98	160-210	20~30ug
	AE 99	120-160	20~30ug
	AE 100	90-120	20~30ug
Millipore (지지대가 결합된 것)	HF 090	80-100	>95
	HF 120	107-133	>95
	HF 135	120-150	>95
	HF 180	160-200	>95
	HF 240	214-266	>120
Sartorius (지지대가 결합된 것)	CN 90	88-94	10-30
	CN 140	137-153	10-30
	CN 200	205-233	10-30

(a) 증류수가 매질을 타고 4cm 오르는데 걸리는 시간

(b) 결합능 - 매질제곱 센티 당 붙을 수 있는 IgG의 양.

바람직한 크로마토그래피 매질은 CN 90 막이다. CN 90 막은 위의 제품군들 중 유속 변화 폭이 +/- 3 초로서 가장 좁은 범위의 변화 폭을 가지고 있다. 결합능은 형광 표지물질의 증폭이 워낙 뛰어난 탓에 10 내지 30ug 정도로도 충분한 것이다. 무엇보다도 이 막의 가장 큰 장점은 측방 유동 속도의 재현성이 뛰어나다는 점이다.

검출 표지자는 시료 내에서 분석하고자 하는 분석물을 말한다. 이들 분석물은 형광이 결합되어 있는 항체 단백질과 반응하여 검출 표지자-형광 표지 항체 단백질의 결합체를 형성한다.

본 발명의 형광이 결합되어 있는 항체 단백질은 형광을 나타내는 공지된 다양한 물질이 사용할 수 있으나, 본 발명의 구체적 실시에서는 Eu³ ⁺ 형광물질을 사용 한다. 상기 Eu³ ⁺ 형광물질(유러피엄 화합물)은 일반적인 형광물질과 비교하여 다음과 같은 장점을 가지고 있다.

첫 번째는 내부전환, 계간전이 및 내부분자 에너지 전이로부터 에너지의 손실이 크기 때문에 유러피엄 화합물에서 방출되는 형광과 흡수된 광자와의 에너지는 큰 차이를 보이고, 그것은 150 내지 300nm의 넓은 스톡스 이동(Stoke’s shift)을 갖는다. 일반적인 형광물질에서와 같이 여기파장과 방출파장의 겹쳐짐(overlap)으로 인해 방출된 형광이 형광체에 재흡수되는 내부 필터 효과(inner filter effect)를 제거할 수 있다.

두 번째는 좁은 방출 파장(line-like bands)이다. 좁은 방출 파장은 일반적인 형광체에 비해 형광 효율은 낮지만 방출 파장이 좁기 때문에 중심 파장의 세기(intensity)는 강하다.

세 번째는 긴 형광 수명이다. f-f 전자적 전이는 금지되어 있기 때문에 500 내지 2000us의 긴 여기상태를 유지시킨다. 또한 형광 수명은 배위자의 환경에 매우 민감하다. 일반적인 형광의 수명이 1 내지 10ns이기 때문에 같은 여기광에 의해 형광을 방출하여도 유러피엄 화합물의 형광을 구별하는 것은 매우 쉽다. 그러나 금지된 전이로 인해 형광효율은 매우 낮게 나타난다. 일반적인 형광이 10⁸내지 10⁹ photons /s/ molecule인 반면에 유러피엄 화합물은 1000photons /s/ molecule이다.

단점으로는 형광 면역 분석을 통하여 작은 양의 면역 반응을 측정하려면 표지물로 사용되는 형광물질 또한 그 양이 매우 작기 때문에 형광물질의 형광효율이 높아야 하지만, 유러피엄 화합물은 형광 효율이 매우 낮다. 이점을 보완하기위해 유러피엄 화합물이 약 3,000개가 들어 있는 Eu³ ⁺나노마이크로입자를 사용하여 이러한 단점을 보완하였다.

포획자는 크로마토그래피 매질상에 화학적으로 결합하여 고정된다. 이러한 화학적 결합은 공지 방법(LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Volume 15, Edited by R. H. BURDON and P. H. Van KNIPPENBERG ELSEVIER AMSTERDAM: NEW YORK, OXFORD (1985) P. 318-322)에 따라 실시될 수 있다. 또한, 포획자는 크로마토그래피 매질상에 제2 물질(예, 항체 단백질)을 통해 결합될 수 있다. 제2 물질이 항체(제2 항체)이고 고정될 포획자가 마우스로부터 유래된 모노클로날 항체인 경우 과량의 항-마우스 yG(감마 글로불린) 헤테로-동물 항체가 결합된 후 적절한 양의 포획자(모노클로날 항체)가 면역반응에 의해 결합되는 활성화된 페이퍼 시트가 사용될 수 있다. 만일 제2 물질이 단백질인 경우에는 예를 들면 과량의 프로테인 A가 결합된 후 적당량의 포획항체가 결합되는 활성화된 페이퍼 시트가 사용될 수 있다. 본 명세서에서는 포획 항체 단백질을 상기 포획자의 일 형태로서 사용한다.

상기 검출 표지자는 형광표지 항체 단백질 및 포획자와 샌드위치 형태로 결합함으로써 포획될 수 있으며, 또한 검출 표지자와 동일하거나 유사한 검출 표지자에 형광이 결합되어 있는 항체 단백질과 결합시키고 이를 시료 내의 실제 검출 표지자와 상호 경쟁시킨 후 포획항체 단백질과 반응시키는 형태로 검출할 수 있다.

상기 형광이 결합되어 있는 항체 단백질 또는 포획자(또는 포획 항체 단백질)은 1종 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, hsCRP, HbA1c, Homocystein 및 BNP 등 성인병 관련 검출 표지자를 포함할 수 있으며, PSA, AFP, CEA, CA15-3, CA19-9 및 CA125 등 암 관련 검출 표지자를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 측방유동검정스트립을 일정 거리만큼 이동시키는 이동 장치는 본 발명의 시분할 분석 및 면역 반응 정량 분석을 위하여 필요한 장치이다. 상기 이동 장치는 측방유동기를 일정 방향으로 일정 거리만큼 이동시키는데, 구체적 실시에서 측방유동기를 한쪽(오른쪽 또는 왼쪽) 방향으로 매 0.1mm 씩 이동시키거나 한쪽(오른쪽 또는 왼쪽) 방향으로 매 5mm 씩 이동하면서 측방유동기 내의 시료와 결합된 형광물질의 양을 시분할적으로 측정하여 형광분포를 나타내고 정량 분석을 하게 된다.

본 발명에서 사용되는 레이저 유발 표면형광 검출 장치는 상기한 바와 같이 레이저, 여기필터, 타원반사경 또는 구면경, 표면형광이 발광되는 시료 제어 수단, 공간필터, 평행광학계, 형광필터 및 광검출기로 구성되어 있다.

본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 사용되는 레이저는 대표적으로는 He-Ne 레이저 및 다이오드 레이저 등의 당해 분야에서 공지된 레이저를 사용할 수 있다. 본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 사용되는 레이저는 대표적으로 He-Ne 레이저 및 다이오드 레이저가 포함된다. He-Ne 레이저의 예로는 National Research Laboratory of Metrology(NRLM), agency of Industrial Science and Technology(AIST), ministry of International Trade and Industry(MITI)에서 개발한 소형의 휴대용 정밀 요도드-안정화 He-Ne 레이저(Model NEO-92SI) 및 모델 05 LYR 173(캘리포니아 어어빈 소재 Melles Griot 제품)을 들 수 있다. 다이오드 레이저는 He-Ne 레이저보다 컴팩트하고 보다 정밀하며 적외선 또는 적색광 다이오드 레이저가 있다.

본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 이용한 레이저 유발 형광 검출법은 정상 상태 형광 분석법의 한 종류로서 형광의 여기광으로 레이저를 사용하는 것으로 감도와 선택성이 높기 때문에 복잡한 생체 혼합물 내에 미량 존재 하는 생화합물 또는 면역학적 분석법 등을 분석하는데 유용하다. 그러나 레이저 유발형광 검출법은 다음과 같은 문제점을 가지고 있다.

빛의 흡수에 의해 여기된 분자의 형광 효율이 1 이라 하더라도 여기된 분자의 형광 수명을 고려하면 한 분자가 1초 동안에 방출할 수 있는 형광 광자는 10⁸개 정도일 것이다. 그러나 분자는 원자와는 달리 광자를 무한정 흡수할 수 없고, 어느 정도 흡수하면 화학적 성질이 바뀌어 버려 정지된 시료의 형광세기는 시간에 따라 지수 함수적으로 감소하게 된다. 이러한 광표백에 기인한 형광분자의 광화학 수명은 흡광 속도와 광표백 양자효율의 곱의 역수와 같다. 광표백 효율의 값은 염료분자와 용매에 따라 달라지는데, 일반적으로 10^-5 ~ 10^-7이다. 그러므로 광화학 수명은 10ms 정도 밖에 되지 않는다. 단일 분자에서 나오는 형광은 모든 방향에 대해 같은 확률로 방출되기 때문에 실제로 검출 집광장치로 모을 수 있는 것은 전체의 10∼20%이다. 그리고 여기에 필터의 투과율(50% 정도)과 검출기의 양자효율(10∼50%)을 고려하면 전체적인 광 검출 효율은 0.5∼5%밖에 되지 않는다. 그러므로 단일 분자가 광표백될 때까지 형광을 방출한다 하더라도 기껏해야 몇 천개의 형광 광자만이 검출 가능하다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 면역반응 정량분석 장치를 이용하여 면역 반응을 시분할 측정 및 분석하거나 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 정량분석 장치는 도 3에 예시적으로 도시되어 있으며, 이들 도 3에 도시된 장치를 이용하여 시료 내의 면역 반응을 시분할적으로 측정 및 분석할 수 있으며, 또한 이들 면역 반응을 정량적으로 분석할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 상기 장치에 의하여 측정되어 나타낸 형광 소멸곡선은 형광체의 매우 중요한 특성 중 하나로서 각각의 형광체에 대해 특정한 형광소멸곡선을 갖는다. 이들 형광 측정법은 펄스 형광측정(pulse fluorometry) 및 상-조정 형광측정(phase-modulation fluorometry)으로 구분할 수 있다. 시분할 분석법에서 펄스 형광측정(pulse flurometry)은 수학적으로 δ-함수에 준하는 에너지를 분자에 인가한 후에 방출되는 형광의 개수를 시간의 함수로 측정하는 것으로 분자의 여기와 방출을 반복하여 형광 수집을 함으로서 형광 소멸 곡선을 얻을 수 있다. 이와 관련하여 도 2는 펄스 형광측정(pulse fluorometry)의 일반적인 측정 데이터를 도식화하여 나타낸 것으로서, 펄스(pulse) 형태의 여기광에 의해 방출되는 형광이 I(t)=I(0)e ^-t/τf 에 의해 시간에 대한 지수 함수 모양을 갖는다.

분자의 여기와 방출을 반복하는 반복률을 증가시키면 극소량의 형광분자의 존재를 확인할 수 있다. 또한 도 2와 같이 t에서 Δt+t까지의 모든 광자를 합하여 형광분포를 비교하면 높은 분해능으로 형광분자를 측정할 수 있다.

본 발명은 이하 실시예를 통해 좀더 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 단지 예시하는 것으로 이해되어야 하며 본 발명을 이들 실시예로 한정되어서는 안된다.

실시예 1 : Eu ³ ⁺ 나노입자의 면역 반응

Eu³ ⁺나노입자의 면역 반응은 도 4와 같다. 항체와 결합된 Eu³ ⁺나노입자(a)가 면역반응을 통해 항원과 결합되고(b), 시료가 샘플패드에 적용되면 전개용 막을 지나며 도 1의 항체가 붙어있는 부분(capture line)에서 시료의 항원이 면역반응으로 샌드위치형태로 결합을 하게 된다(c). 이러한 방법은 측방유동검정스트립에서의 nanoparticle-based 면역법이다.

샌드위치형태로 측방유동검정스트립에 결합되는 Eu³ ⁺나노입자의 개수는 시료 내의 항원의 양과 비례한다. 시분할 분석을 통해 Eu³ ⁺나노입자의 형광을 측정함으로서 그에 비례하는 항원의 정량 분석할 수 있다. 특정 단백질(PSA)의 항원에 Eu³ ⁺나노입지를 표지하고, 측방유동검정스트립에 면역 반응을 시킨 후에 측방유동기를 이동하면서 시분할 형광 측정하여 특정 단백질을 정량 분석하였다.

실시예 2 : 면역 반응의 시분할 측정 및 정량 분석

본 발명의 면역반응 정량분석 장치를 이용하여 면역 반응의 시분할 측정 및 정량 분석하는 방법은 다음과 같다.

(1) 측방유동검정스트립을 이동장치인 측방유동기(moving stage)에 고정하고, 도 5에서와 같이 전개용 막에서의 시작점(start point)에 광원을 일치시킨 후 분자의 여기와 방출을 75번 반복하여 시분할 형광 측정을 하였다.

(2) 측방유동검정스트립에서의 형광분포를 측정하기 위해서 시작점(start point)에서의 형광 수집이 종료되면 이동 장치인 측방유동기(moving stage)를 0.1mm 씩 흡수패드 쪽으로 움직여서 (1)의 과정을 반복한다.

(3) 이동 장치인 측방유동기(Moving stage)를 5mm 씩 총 50번 이동하면서 시분할 형광 측정을 한다.

측방유동검정스트립 내의 각 위치에서 측정된 형광 소멸곡선에서 400~800us 동안 방출된 형광의 개수를 모두 합한 형광의 분포는 도 6과 같다.

도 6으로부터의 특이 사항은 음성(negative) 면역 반응이다. 음성(Negative)이란 PSA를 첨가하지 않은 시료로서 면역 반응이 일어날 수 없는 반응으로서, 이러한 현상을 비동종 반응(none-specific binding)이라 하며 면역학적인 일반적인 현상이다.

또한 검사선(capture line)이 아닌 곳에서의 검출된 형광으로서, 대략 1400여개 내외의 형광이 검출되었는데(그래프의 좌우 편평한 부분), 반복률이 75회이므로 1회당 약 20개의 형광이 검출되었다. 이는 전개용 막에서 전개가 모두 이루어지고 정지된 Eu³ ⁺나노입자와 PMT의 암전류에 의한 것이다. 이러한 것을 배경 노이즈(noise)라 한다.

상기 음성(Negative) 면역 반응 현상과 배경 노이즈(noise) 현상을 제거할 수 있다면 더욱 낮은 농도의 형광분자를 시분할 측정을 통한 정량분석이 가능할 것이다.

면적 맞춤(fitting)을 통해서 각 농도 별로 측방유동검정스트립의 형광의 분포를 구하여 농도 대 형광의 개수 그래프를 로그스케일로 그리면 도 7과 같고, 농도에 대한 형광의 분포가 선형임을 알 수 있었다.

본 발명은 가정 및 소규모 병의원의 검사 현장에서 바로 진단결과를 정량적 으로 확인할 수 있고 특정 질환과 관련된 면역크로마토그래피 바이오칩을 최적화함으로써 목표로 하는 표지인자의 검출에 특화된 성능을 발휘하며, 더욱 정확한 분석물의 정량화를 가능하게 하고, 한번의 시료 분석을 통하여 여러 질병 표지 인자들을 동시에 분석할 수 있도록 하며, 극미량 분석물의 농도를 정확하게 측정할 수 있는 시분할 정량 검출 방법 및 이를 위한 장치를 제공하는 효과가 있다.

Claims

크로마토그래피 매질 상의 한쪽 말단에 시료를 적하하여 매질을 통해 이동되도록 하고, 분석물인 검출 표지자는 형광이 결합되어 있는 항체 단백질과 반응하여 검출 표지자-형광표지 항체 단백질의 결합체를 형성하며, 이 결합체는 크로마토그래피 매질을 통해 이동하면서 검사선에 고정된 포획 항체 단백질과 반응함으로써 표지된 검출항체 단백질과 비표지된 포획항체 단백질 사이에 검출 표지자가 샌드위치 형태로 포획되어 형성된 복합체의 양을 측정하여 시료 중의 분석물을 검사하는 측방유동검정스트립, 상기 측방유동검정스트립을 일정 거리만큼 이동시키는 이동 장치인 측방유동기 및 레이저 유발 표면형광 검출장치를 포함하는 면역반응 정량 분석 장치.
제1항에 있어서, 상기 측방유동검정스트립 내에서 검출 표지자가 샌드위치 형태로 포획되는 것이 아닌 검출표지자와 동일하거나 유사한 검출표지자에 형광이 결합되어 있는 항체 단백질을 결합시키고, 이를 시료 내의 실제 검출 표지자와 상호 경쟁시킨 후 포획항체 단백질과 반응시키는 경쟁반응(competition assay) 형태인 것인 면역반응 정량 분석 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 측방유동검정스트립 내의 형광이 Eu³ ⁺인 면역반응 정량 분석 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 측방유동검정스트립 내의 형광표지 단백질 또는 포획 항체 단백질이 1종 이상의 항체 단백질을 포함하는 것인 면역반응 정량 분석 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 레이저 유발 표면형광 검출장치의 레이저가 He-Ne 레이저 또는 다이오드 레이저인 면역반응 정량 분석 장치.
제1항 또는 제2항의 장치를 이용하여 면역반응을 시분할 분석 및/또는 면역반응 정량 분석을 하는 방법.