KR20190059089A

KR20190059089A - 측방유동 면역 분석 기반의 항ccp 항체 및 류마티스인자를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법

Info

Publication number: KR20190059089A
Application number: KR1020170156684A
Authority: KR
Inventors: 박용범; 최의열; 주후돈; 이미숙
Original assignee: 바디텍메드(주); 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-11-22
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2019-05-30
Also published as: WO2019103324A1; KR102047978B1

Abstract

본원은 류마티스 관절염을 진단하기 위해 항CCP 항체와 류마티스 인자를 단일 키트에서 동시에 정량할 수 있는 측방유동기반의 인비트로 형광 면역분석방법이다.

Description

측방유동 면역 분석 기반의 항CCP 항체 및 류마티스인자를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법 {Method for diagnosing rheumatoid arthritis based on lateral flow assay using anti-CCP antibody and Rheumatoid Factor}

POCT (Point- of- care test) 기반의 류마티스 관절염 진단 기술이다.

류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis, RA)은 만성의 진행성 전신 (progressive systemic) 염증질환으로 주로 여러 관절의 윤활막을 침범하여 뼈와 연골을 파괴시킨다. RA는 전세계 성인의 0.5%~1%에서 나타나며, 모든 인종 및 민족들에서 비슷하게 나타나지만 여성이 남성보다 2-3배 높은 빈도를 보인다. RA가 모든 연령에서 나타날 수 있지만 특히 40-60세 사이의 연령에서 두드러지게 나타나는 질환이다.

RA의 진단에서는 누구나 인정할 수 있는 생화학적 지표나 병리소견, 영상소견 등의 소위 골드 스탠다드가 없기 때문에 여러 지표의 조합을 사용한 분류기준이라는 방법을 통하여 진단하게 된다. 류마티스 인자는 1987년 이후로 미국 류마티스학회 (American College of Rheumatology, ACR) 분류기준에 따라 류마티스 진단에서 혈청학적 검사로 사용되고 있다. 류마티스 인자는 면역글로블린 IgG의 Fc 영역에 결합하는 자가항체이며, 류마티스 관절염 환자의 약 60~80%에서 증가되어 있지만, 관절염에 대한 특이도가 높지 않으며, 다른 자가 면역 질환이나 만성 염증, 악성종양, 건강한 노인에게서도 나타나는 단점이 있다. 류마티스 관절염 환자에서 발견되는 그외의 자가 항체들로는 RA33 및 Sa, p68, calpastatin, perinuclear factor 등에 대한 자가 항체가 존재하나 이들에 대한 혈청학적 검사는 아직 개발되어 있지 않다.

미국 및 유럽 류마티스 학회는 2010년에 개정한 류마티스 관절염 진단 분류에서 혈청학적 검사로 항CCP항체 검사를 추가하였다. 항CCP (Cyclic Citrullinated Peptide) 항체는 시트룰린 잔기를 포함하는 항원결정기에 반응하는 자가항체로 항 fillagrin 항체의 한 종류이다. 최근 류마티스 인자 검사와 비슷한 민감도를 보이면서 더 우수한 특이도 (90~98%)를 가진 항CCP 항체 검사법이 개발되어 이용되고 있다.

항CCP항체 검사는 높은 진단 특이도와 더불어 환자들의 기능적 상태와도 관련이 있으며, 조기 류마티스 관절염 환자에서 관절손상과도 연관성이 있는 것으로 보고되고 있다.

류마티스 관절염 진단을 위한 기존 방법은 다음과 같다. 항CCP 항체 검사는 주로 microplate ELISA (ezyme-linked immunosorbent assay)와 자동화장비 이용한 검사법이 사용되고 있다. 측방유동 분석법으로 Euro-diagnosis사의 CCPoint 제품의 rapid kit가 상용화되어 있다. Microplate ELISA 검사법은 CCP가 코팅된 플레이트에 시료를 희석하여 반응시킨 후 효소결합 항체를 반응시킴으로써 항CCP 항체를 검사한다. 자동화장비를 이용한 검사법은 chemiluminescent microparticle immunoassay, electrochemiluminescence immunoassay 방법들이 사용된다 .

류마티스인자를 이용한 정량법은 인간 혹은 동물의 IgG가 코팅된 particles(예, latex, sheep erythrocytes)의 응집반응을 주로 사용한다. Latex 응집법은 매우 민감한 방법이나 위양성이 높게 나타날 수 있으며, 정상인에서 비특이적 응집반응 또한 나타난다. 현재는 nephelometry/turbidimetry 분석법을 이용한 정량검사법이 가능한 자동화 분석법이 가장 널리 사용되고 있다. 이 검사법들은 대부분 IgM형 류마티스 인자를 측정하는데 사용된다. 이외에 류마티스 관절염의 활동성과 상관성이 있는 것으로 알려진 IgG형 류마티스인자 검사는 주로 효소면역반응을 이용한 분석법이 사용된다.

류마티스 관절염은 그 원인이 분명하지 않으며, 유전적, 환경적 및 기회적 요인 등이 관련되어 있는 것으로 생각되며, 확실하게 진단하는 방법은 현재까지 존재하지 않는다. 최근에 류마티스인자와 mutated citrullinated vimentin (MCV)에 대한 항체를 동시 검사하는 정성분석용 POCT 제품이 개발되었으나, 특히 분자수준에서 세 가지이상의 마커 검출이 가능한 정량분석용 POCT (point of care test)기반의 검출방법은 현재까지 개발되지 않았다.

본원은 류마티스 관절염 질환을 진단하기 위해 항CCP 항체와 류마티스 인자를 단일 키트에서 동시에 정량할 수 있는 측방유동기반의 인비트로 형광 면역분석방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 류마티스 관절염(RA) 진단이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계;

상기 시료에 검출대상(target)인 항CCP 항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 검출하기 위한 IgG 탐지자(detector)와 검출대상인 류마티스인자 IgM(RF IgM)을 검출하기 위한 IgM 탐지자를 제공하여 상기 시료내에서 검출대상과 탐지자의 제1복합체(Target-Detector complex)를 형성하는 단계;

상기 검출대상과 제1복합체를 형성하지 못한 IgG 탐지자와 비표지 IgG Fc단편을 반응시켜 상기 시료내에서 비표지 IgG Fc단편과 IgG탐지자의 복합체를 형성하는 단계;

항ccp항체 포획자(capture)인 CCP 및 류마티스인자 포획자인 IgG Fc 단편이 고정된 측방유동 스트립상에서 상기 제1복합체와 상기 포획자의 제2 복합체가 형성되는 단계;

제2 복합체에서 방출하는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 인비트로에서 측방유동기반의 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 류마티스 관절염(RA) 진단이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 검출대상(target)인 항CCP항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 검출하기 위한 IgG 탐지자, 검출대상(target)인 류마티스인자 IgM (RF IgM)을 검출하기 위한 IgM 탐지자 및 control 항체 탐지자를 제공하여 검출대상과 탐지자의 제1복합체(Target-Detector complex)를 형성하는 단계;

항ccp항체 포획자(capture)인 CCP, 류마티스인자 포획자인 IgG Fc 단편 및 control 단백질이 고정된 측방유동 스트립상에서 상기 제1복합체와 상기 포획자의 제2 복합체가 형성되는 단계; 및

제2 복합체에서 방출하는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 인비트로에서 측방유동기반의 류마티스 관절염 마커의 동시 정량 검사 방법을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 측방유동기반의 류마티스 인자인 RF IgG, RF IgM 및 항ccp항체를 검출하기 위한 방법으로서,

시료내의 항CCP항체 및 류마티스 인자인 RF IgG를 검출하기 위한 IgG 탐지자중 상기 항CCP항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)와 반응하지 않은 미반응 IgG탐지자를 비표지 IgG Fc 단편과 반응시켜, 상기 미반응 IgG탐지자와 류마티스인자 포획자로서 측방유동 스트립상에 위치하는 IgG Fc 단편과의 교차반응을 억제하고, 상기　IgG 탐지자와　상기 IgM 탐지자는 서로 다른 광학계를 통해 검출되는 것을 특징으로 하는 인비트로에서 측방유동기반의 류마티스 인자 검출방법을 제공한다.

본원은 류마티스 관절염 진단을 위한 측방유동 면역 분석 기반의 항CCP 항체 및 류마티스인자를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 IgM 류마티스 인자 (RF IgM), IgG 류마티스 인자 (RF IgG) 와 항CCP 항체의 세 가지 마커의 동시 검출이 가능하여 보다 신속하고 정확한 진단을 가능하게 한다. 특히 시료내 비결합 anti-human IgG와 RF 포획자인 IgG Fc 단편과의 교차반응을 억제하기 위해 비표지 IgG Fc 첨가제를 추가하여 검출대상인 항CCP 항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 신속하고, 정확하게 정량할 수 있다.

도1은 시료와 검출용액을 혼합한 후 시료내 human IgG와 반응하지 않고 남아있는 검출용액 내 labeled anti-human IgG 탐지자를 비표지 IgG Fc를 첨가하여 결합시키는 모식도이다. 검출용액내 4종의 컨쥬게이트된 탐지자는 각각 TRF (T) conjugated anti-human IgG (IgG-T Detector), anti-control antibody (Control-T Detector), Fluorescent (F) conjugated anti-human IgM (IgM-F Detector) 와 anti-control antibody (Control-F Detector)이다.
도2는 니트로셀룰로스 멤브레인에 콘트롤 (ex. chicken IgY, streptavidin, KLH, Rabbit IgG)과 테스트 2 라인으로 CCP 펩타이드, IgG Fc 가 각각 고정된 카트리지에 대한 모식도이다.
도3은 비표지가 포함된 시료 혼합액을 카트리지에 로딩후 형광광학계를 이용하여 IgM RF를 검출하고, time resolved fluorescence 광학계를 이용하여 IgG RF와 anti-CCP를 검출하는 모식도이다.
도4는 검출용액 내 labeled anti-human IgG와 니트로셀룰로스 멤브레인에 고정되어 있는 RF capture (IgG Fc)와의 교차반응이 비표지 IgG Fc를 시료와 검출용액 혼합액에 첨가했을 때 억제되는 효과를 나타낸 모식도이다.
도5는 T-optics를 통한 anti-CCP의 표준곡선 모식도이다.
도6은 F-optics를 통한 IgM RF의 표준곡선 모식도이다.
도7은 T-optics를 통한 IgG RF의 표준곡선 모식도이다.
도8은 triple 검출법을 통해 검출된 IgM, IgG RF와 anti-CCP 각각에 대해 3종의 상용 제품과 임상적 민감도에 대한 결과이다.
도9는 triple 검출법을 통해 류마티스 질환자 혈청 30건에 대해 single, double, triple 검출 수에 대한 것이다.
도10은 triple 검출법과 2종 상용제품 조합 (anti-CCP 제품과 RF 제품)시에 임상적 민감도 비교 및 판정법 테이블에 대한 것이며, 류마티스환자 혈청의 양상판정 기준에서 민감도 설정, 대조군 혈청의 음성판정 기준에서 특이도가 설정된 것이다.
도11은 니트로셀룰로스 멤브레인에 콘트롤 (ex. chicken IgY, streptavidin, KLH, Rabbit IgG), IgG Fc 단편 및 테스트 2 라인으로 CCP 펩타이드, IgG Fc 가 각각 고정된 카트리지에 대한 모식도이다.
도12은 도11의 카트리지를 통해 비표지가 포함된 시료 혼합액을 카트리지에 로딩후 형광광학계를 이용하여 IgM RF를 검출하고, time resolved fluorescence 광학계를 이용하여 IgG RF와 anti-CCP가 검출된 결과이다.

본 발명은 류마티스 관절염(RA) 진단이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계;상기 시료에 검출대상(target)인 항CCP 항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 검출하기 위한 IgG 탐지자(detector)와 검출대상인 류마티스인자 IgM(RF IgM)을 검출하기 위한 IgM 탐지자를 제공하여 상기 시료내에서 검출대상과 탐지자의 제1복합체(Target-Detector complex)를 형성하는 단계; 상기 검출대상과 제1복합체를 형성하지 못한 IgG 탐지자와 비표지 IgG Fc단편을 반응시켜 상기 시료내에서 비표지 IgG Fc단편과 IgG탐지자의 복합체를 형성하는 단계;항CCP항체 포획자(capture)인 CCP 및 류마티스인자 포획자인 IgG Fc 단편이 고정된 측방유동 스트립상에서 상기 제1복합체와 상기 포획자의 제2 복합체가 형성되는 단계;제2 복합체에서 방출하는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 인비트로에서 측방유동기반의 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법에 대한 것이다.

측방유동 분석은 시료에 포함된 목표 분석물, 예를 들면 특정 핵산 또는 단백질을 정량 또는 정성적으로 검사하는 방법으로, 예를 들면 일정한 서열의 핵산에 교잡하는 올리고뉴클레오타이드 또는 특정 항체 및/또는 항원이 특정 위치에 결합되어 있는 나이트로셀룰로스 막(전개용 매질)을 포함하는 스트립이 이용된다. 스트립은 크로마토그래피 방법으로 시료를 이동시켜 서열 특이적 교잡반응 또는 항원 항체 반응을 통해 시료 중의 특정 핵산 또는 단백질의 검출에 사용된다. 예를 들면 대한민국 공개 특허공보 제2003-0065341호, 제2011-0007699호, 제2011-0127386호, 및 등록공보 제1149357호 등에 기재된 것을 참조할 수 있다.

상기 스트립은, 프리패드, 샘플분리 패드, 전개용 매질, 및 흡수패드를 포함하며, 이들은 지지대 상에 위치할 수 있다. 상기 프리패드 및 흡수패드는 서로 겹치거나 또는 서로 겹치지 않도록 상기 지지대의 양 단부에 각 각 위치되어 있으며, 상기 전개용 매질은 상기 샘플분리 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각각 상기 흡수 패드의 한 단부 및 상기 샘플 분리 패드의 한 단부와 접해 있으며,상기 전개용 매질 (test line)에는 류마티스 관절염 마커인 항CCP 항체 및 류마티스 인자를 포획할 수 있는 포획자가 부착될 수 있다. 시료가 전개되기 전, 시료와 탐지자가 포함된 탐지버퍼용액을 반응시켜 시료 중의 항CCP 항체 및 류마토이드 인자가 탐지자와 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 포함된 시료를 전개시키고, 상기 복합체는 포획자와 특이적으로 결합하여 형광물질로 표지된 탐지항체에 의해 검출되는 것일 수 있다.

또한, 측방유동분석을 위해서는 상술한 바와 같이 시료를 전개시키고, 반응물을 검출하는 스트립과 상기 스트립이 장착되는 하우징 또는 카트리지를 포함할 수 있다.

상기 스트립에 전혈/일반패드를 사용할 수 있으며, 상기 일반패드는 컨쥬게이션 패드와 접합한 접합패드일 수 있다.

상기 컨쥬게이션 패드에는 포획자가 결합될 수 있다.

또한, 상기 컨쥬게이션 패드에는 항CCP 항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 검출하기 위한 IgG 탐지자중 상기 항 CCP 항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)와 반응하지 않은 미반응 IgG탐지자의 교차반응을 억제하기 위해, 비표지 IgG Fc 단편이 탐지자가 상기 고정될 수 있다.

본원에서 류마티스 관절염은 만성의 진행형 전신 자가면역질환으로, 노화로 인해 주로 연골손상을 특징으로 하는 비염증성 만성관절염인 퇴행성관절염과는 구분된다. 류마티스 관절염은 그 원인이 분명하지 않으며, 유전적, 환경적 및 기회적 요인 등이 관련되어 있는 것으로 생각되며, 확실하게 진단하는 방법은 현재까지 없으며, 특히 분자수준에서 마커 검출이 가능한 POCT (point of care test)기반의 검출방법은 현재까지 개발되지 않았다. 본원에서는 류마티스 관절염 마커로서 항CCP 항체 및 류마티스 인자 (IgM형, IgG형 RF) 3종을 동시에 정량 및 정성적 수준에서 검출이 가능한 방법이다.

본원에 따른 방법에 사용되는 대상체유래 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청을 포함하나. 상기 마커의 검출이 가능한 것이라면 특별히 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 구현예에서는 혈장 또는 혈청이 사용될 수 있다.

항CCP항체는 시트룰린 잔기를 포함하는 항원결정기에 반응하는 자가항체로 항fillagrin 항체의 한 종류에 해당될 수 있다.

류마티스 인자(RF)는 IgG의 Fc portion에 결합하는 자가항체이며, 대부분 IgM (RF IgM)에 속하지만, IgG(RF IgG)나 IgA(RF IgA)에 속하는 것도 포함된다.

탐지항체는 검출대상에 특이적으로 반응하는 항체이며, 탐지항체로 anti-human IgG 또는 anti-human IgM가 사용될 수 있다.

항CCP 항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 탐지하기 위한 탐지항체인 anti-human IgG는 RF capture인 Fc 단편과 강한 교차반응을 가진다. 그 결과 시료에 IgG RF가 존재하여 탐지항체와 결합하더라도 그 외에 결합하지 않은 나머지 anti-human IgG가 RF capture인 Fc 단편과 결합하게 된다. 또한 이 탐지항체는 시료내 anti-CCP 항체 및 IgG RF의 양에 따라서 의존적으로 비결합 anti-human IgG의 양이 변할 수 있어서 RF capture인 Fc 단편과 반응하는 양은 달라지게 되어 IgG RF의 정량화는 확인 할 수 없게 된다. 따라서 항 CCP 항체와 IgM, IgG 류마티스 인자를 동시 분석하는 카트리지를 개발하기 위해서는 anti-human IgG와 류마티스 인자 검사하기 위한 포획자 Fc 단편과의 교차반응을 없애는 것이 주요한 해결과제이다.

anti-human IgM 탐지항체는 IgM RF를 분석할 수 있을 뿐만 아니라 IgM 타입의 항CCP항체에 대해서도 반응 할 수 있다. 현재 항CCP항체의 subclass에 대한 연구는 일부 결과가 보고되고 있으나 아직 임상학적 근거는 미미한 수준이다. 본 발명을 위해 anti-CCP 분석 카트리지를 이용하여 IgM 타입의 항CCP 항체를 분석하고 IgG 타입과의 항CCP 항체 분석에 민감도 차이를 확인하였다. Aboukhamis I (2010) 보고한 바와 같이 IgG 타입의 항CCP항체가 류마티스진단에 더 높은 특이도를 나타냈으며, IgM 타입의 anti-CCP 반응성은 매우 미미한 수준으로 나타났다. 따라서 본 발명에서 두가지 탐지항체인 anti-human IgG/M을 사용하여 항CCP 항체를 분석함에 있어서 IgM 타입의 anti-CCP 감도는 고려하지 않았다.

탐지자는 탐지항체에 표지물질이 결합될 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 표지물질은 나노입자 또는 형광입자를 포함할 수 있다.

상기 나노입자는 금속 나노입자, 자성 나노입자, 실리카 나노입자 및 라텍스 나노입자로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

형광입자는 광원제공시 발광하는 입자를 의미하며, 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하지만 이에 한정된 것은 아니다.

상기 형광입자는 시분할 형광입자((time-resolved fluorescence, TRF)일 수 있다. 시분할 형광입자는 란탄(lanthanide)계열 원소의 착화합물을 포함할 수 있다. 형광 입자는 란탄족 원소 및 상기 란탄족 원소와 결합한 리간드들을 포함할 수 있다. 상기 란탄족 원소는 유로퓸(III), 테르븀(III), 사마륨(III), 디스프로슘, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는 유로퓸 (Europium) 착화합물일 수 있다.

항 CCP항체와 류마티스 인자를 동시에 검출하기 위해, 탐지자는 서로 다른 광학계를 사용하여 탐지될 수 있으며, 이를 위해 일반 형광입자와 시분할 형광입자가 동시에 사용될 수 있다.

본 발명에서 일반 형광입자는 시분할 형광입자가 아닌 형광입자를 의미할 수 있다.

본 발명에서 상기 광학계는 측정하고자 하는 시료에서 발생한 형광신호를 검출하기 위한 것이다. 광학계는 측정시료를 조명하기 위한 조명 광학계와 여기광에 의해 측정시료에 발생한 형광신호를 검출하기 위한 검출광학계를 포함할 수 있다.

상기 광학계는 일반 형광입자 또는 시분할 형광입자에서 발생한 형광신호를 검출할 수 있다.

구체적으로 탐지자는 TRF (T) conjugated anti-human IgG (IgG-T Detector), anti-control antibody (Control-T Detector), Fluorescent (F) conjugated anti-human IgM (IgM-F Detector) 또는 anti-control antibody (Control-F Detector) 일 수 있다.

탐지항체로 사용되는 anti-human IgG와 anti-human IgM은 RF capture인 IgG Fc에 모두 반응하므로, IgM RF와 IgG RF반응성을 구분할 수 없다. 따라서 각각을 검사하기 위해서 본 발명에서는 이중 광학계를 사용할 수 있다. Anti-human IgG는 Europium (Eu) bead를 conjugation에 사용하였으며, anti-human IgM는 fluorescence dye를 conjugation하였다. 란탄족 화합물인 Eu는 Fluorescence Process를 하지 못하므로 Eu3+chelate화 하였고, Eu3+chelate는 hvEX(333nm)와 hvEM(613nm)의 차이인 Stokes shift가 크기 때문에 여기 필터와 방출필터의 선정이 매우 용이할 수 있다. 그리고 약 1000us의 lifetime은 일반적인 형광체의 lifetime (1~10ns) 보다 길기 때문에 실험에 있어서 다른 형광체의 형광 방출을 효율적으로 제거할 수 있다. 본 발명은 형광광학계와 시분할 형광 광학계를 접목시킨 dual optics를 사용함으로써 anti-CCP와 IgG와 IgM RF를 각각 단일 시료내에서 동시 정량분석이 가능하게 한다.

검출대상과 탐지자의 제1복합체(Target-Detector complex)는 검출대상인 항 CCP항체와 류마티스 인자(RF)가 각각 탐지자(IgG 탐지자, IgM 탐지자)와 결합하여 생성될 수 있다.

상기 제1복합체는 항ccp항체와 IgG 탐지자가 결합한 항ccp항체-IgG 탐지자 제1복합체, RF IgG와 IgG 탐지자가 결합한 RF IgG-IgG 탐지자 제1복합체 및 RF IgM와 IgM 탐지자가 결합한 RF IgM-IgM 탐지자 제1복합체로 이루어질 수 있다.

시료내 비결합 anti-human IgG와 RF capture인 IgG Fc 단편과의 교차반응을 억제하기 위해 비표지 IgG Fc를 추가하였다.

상기 비표지 IgG Fc는 Ig G Fc의 일부 단편일 수 있다.

상기 비표지 IgG Fc는 제1복합체를 형성하지 못한 IgG 탐지자와 반응하여 상기 시료내에서 비표지 IgG Fc단편과 IgG탐지자의 복합체를 형성할 수 있다. 비표지 IgG Fc단편과 IgG탐지자의 복합체로 인하여 제1복합체를 형성하지 못한 IgG 탐지자가 스트립내에 고정된 류마티스인자 포획자인 IgG Fc 단편와 반응하는 것을 방지하여 보다 정확한 RF IgG 측정이 가능해진다.

상기 비표지 IgG Fc는 상기 시료에 직접 제공되거나, 스트립에 고정될 수 있다. 상기 스트립에 고정된 비표지 IgG Fc는 시료에 포함된, 제1복합체를 형성하지 못한 IgG 탐지자와 반응할 수 있다. 바람직하게는 상기 제1복합체를 형성하지 못한 IgG 탐지자는 항ccp항체 및 RF를 검출하기 위한 포획자와 반응하기에 앞서 먼저 비표지 IgG Fc와 반응하게 할 수 있다.

항CCP항체를 검출하기 위해 포획자는 ccp 펩타이드일 수 있으며, 보다 구체적으로는 (특허 EP 1 456 662B1,EP 2 058 663 A1)에 사용된 펩타이드를 2종~4종을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, RF를 검출하기 위해 포획자는 IgG Fc 단편일 수 있다.

본 발명은 류마티스 관절염(RA) 진단이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 검출대상(target)인 항CCP항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 검출하기 위한 IgG 탐지자, 검출대상(target)인 류마티스인자 IgM (RF IgM)을 검출하기 위한 IgM 탐지자 및 control 항체 탐지자를 제공하여 검출대상과 탐지자의 제1복합체(Target-Detector complex)를 형성하는 단계;

항CCP항체 포획자(capture)인 CCP(Cyclic Citrullinated Peptide), 류마티스인자 포획자인 IgG Fc 단편 및 control 단백질이 고정된 측방유동 스트립상에서 상기 제1복합체와 상기 포획자의 제2 복합체가 형성되는 단계; 및

제2 복합체에서 방출하는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 인비트로에서 측방유동기반의 류마티스 관절염 마커의 동시 정량 검사 방법에 대한 것이다.

상기 control 단백질은 chicken IgY일 수 있으나, 본 발명의 목적에 위배되지 않는 한, 이에 한정되지 않는다.

류마티스 관절염(RA) 진단이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 검출대상(target)인 항CCP항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 검출하기 위한 IgG 탐지자, 검출대상(target)인 류마티스인자 IgM (RF IgM)을 검출하기 위한 IgM 탐지자 및 control 항체 탐지자를 제공하여 검출대상과 탐지자의 제1복합체(Target-Detector complex)를 형성하는 단계;

상기 정량을 위해 스트립상에서 제2복합체를 통해 방출된 신호(또는 형광량)을 측정하고 그 양을 control의 형광량으로 나누어준 ratio 값으로 분석하는 과정이 포함될 수 있다.

본 발명은 측방유동기반의 류마티스 인자인 RF IgG, RF IgM 및 항ccp항체를 검출하기 위한 방법으로서, 시료내의 항CCP항체 및 류마티스 인자인 RF IgG를 검출하기 위한 IgG 탐지자중 상기 항CCP항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)와 반응하지 않은 미반응 IgG탐지자를 비표지 IgG Fc 단편과 반응시켜, 상기 미반응 IgG탐지자와 류마티스인자 포획자로서 측방유동 스트립상에 위치하는 IgG Fc 단편과의 교차반응을 억제하고, 상기　IgG 탐지자와　상기 IgM 탐지자는 서로 다른 광학계를 통해 검출되는 것을 특징으로 하는 인비트로에서 측방유동기반의 류마티스 인자 검출방법에 대한 것이다.

상기 IgG 탐지자는 표지물질과 컨쥬게이트된 anti-IgG 항체이거나, 상기 IgM 탐지자는 표지물질과 컨쥬게이트된 anti-IgM 항체일 수 있다.

상기 표지물질은 나노입자를 포함하고,

상기 나노입자는 금속 나노입자, 자성 나노입자, 실리카 나노입자 및 라텍스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 표지물질은 형광입자를 포함하고,

상기 형광입자는 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이거나, 시분해 형광입자 (Time-resolved Fluorescence, TRF)일 수 있다.

상기 시분해 형광입자는 유로퓸(Europium) 또는 이들의 착화합물을 포함할 수 있다.

상기　IgG 탐지자를 위한 광학계 와　상기 IgM 탐지자를 위한 광학계중 어느 하나는 시분할 형광 (time resolved fluorescence) 광학계일 수 있다.

<실시예>

항CCP항체와 IgM-RF를 동시 검출 측방유동 분석

본 방법은 항CCP항체와 IgM-RF를 동시 검사하는 측방유동 형광면역분석법이다. 이 방법은 분석시료 (전혈, 혈장, 혈청)내 존재하는 자가항체가 capture line에 있는 IgG의 Fc 단편과 CCP 펩타이드와 결합하도록 설계될 수 있다. 이 방법은 추가 세척과정을 거치지 않으며, 15분내에 반응이 종료되어 레이저유발 표면형광 검출기를 이용하여 CCP 펩타이드 또는 IgG의 Fc 부분와 결합된 형광체의 형광 양을 정량화할 수 있다.

RF를 검사하기 위해 NC (HF90, HF135 & HF180) 막에 control line과 test line 1에 항CCP항체에 대한 capture (CCP 펩타이드), test line 2에 RF에 대한 capture (IgG Fc 단편)를 제타 분주기를 이용하여 라인분주하고 37도에서 건조하여 카트리지를 제조하였다. 항CCP항체를 검사하기 위해 포획자는 (특허 EP 1 456 662B1,EP 2 058 663 A1)에 사용된 펩타이드를 2종~4종을 혼합하여 사용하였으며, 탐지항체는 항인간항체의 면역글로블린 G를 사용하였다.

Anti-CCP와 IgG RF를 검출하기 위한 탐지항체인 anti-human IgG는 시분해 형광 (Time-resolved Fluorescence, TRF) 입자와 컨쥬게이션하였다. IgM RF를 검출하기 위한 탐지항체인 anti-human IgM는 형광분자와 컨쥬게이션하였다. 이중 광학계를 이용하여 labeled 탐지항체의 신호를 검출할 때 대조군으로서 시분해 형광 입자 (T)와 형광분자 (F)가 각각 컨쥬게이션 된 항 control 항체를 사용하였다.

검출용액 내 탐지항체와 더불어 detergent (ex. Tween-20, TritonX-100, CA630), 중성 pH의 전개용매와 bovine serum albumin이 사용될 수 있다.

카트리지의 시료 도입구에 RA 환자의 혈청, 혈장 혹은 전혈을 도입한 직후에 탐지항체를 포함한 검출용액(버퍼용액)을 도입구에 도입하거나 혹은 RA 환자의 시료와 탐지항체가 포함된 검출용액을 미리 혼합한 후에 측방유동 면역반응을 진행할 수 있다. 이어 레이저 유발 표면형광 검출기를 이용하여 형광 양을 정량화할 수 있다.

보다 구체적으로, 시료와 검출용액의 혼합비율은 1:2 ~ 1:100 (v:v)으로 적용할 수 있으며, 시료의 최대 부피는 10ul 이내로 적용될 수 있다. 시료와 검출용액의 혼합액에 비표지 IgG Fc 단편을 첨가하여 검출용액 내 labeled anti-human IgG와 니트로셀룰로스 멤브레인에 고정되어 있는 RF capture (IgG Fc)와의 교차반응을 상쇄시킨다(도면 1, 3).

Labeled anti-human IgG 농도와 비표지 IgG Fc 단편 첨가량과는 서로 상보적으로 반응하여 탐지항체 농도 증가에 따라 비표지 IgG Fc 단편 첨가량도 증가하게 된다.

비표지 IgG Fc 단편을 첨가된 시료와 검출용액의 혼합액을 카트리지에 로딩한 후 15분 이내로 반응시킨 후 dual 광학계가 장착된 리더기를 이용하여 형광값을 측정한다(도면 2). 총 4종의 탐지항체에 대한 형광신호를 검출하고 anti-CCP와 RF 검출을 위한 2종의 테스트 항체에 대한 2종의 대조군 항체 (T/F 광학계에서 검출이 가능하도록 컨쥬게이션 된 단일항체)의 형광신호로서 보정함으로써 (test 탐지항체 형광신호/control 탐지항체 형광신호 = ratio) 그 ratio 값을 사용하여 anti-CCP와 RF 농도에 따른 표준 정량곡선을 작성한다(도면 4-6). 시료에서 triple 마커의 검출결과를 바탕으로 최소 1개 이상의 마커에서 양성일 때 양성으로 판정하며, anti-CCP 가 음성일 때만 음성으로 판정한다.

1. 비표지 Fc 단편 첨가에 따른 교차반응 억제 효과

도면 2와 같이 control line과 test line 1에 항CCP항체에 대한 capture(CCP 펩타이드), test line 2에 RF에 대한 capture (IgG Fc 단편)를 제타 분주기를 이용하여 라인분주하여 37도에서 건조 후 카트리지를 제작하였다.

형광 나노입자를 탐지항체인 anti-human IgG에 컨쥬게이션하여 탐지자를 제조하였으며 0.025%를 사용하였다. 형광 정량기인 ichroma 리더 (boditech med.)를 이용하여 카트리지에서 각 라인에 포획된 탐지 형광량을 측정하고 그 양을 control의 형광량으로 나누어준 ratio 값으로 분석하였다. 첨가물(비표지 Fc)이 없을 때 탐지항체인 anti-human IgG만 카트리지에 100ul를 로딩하였을 때 IgG Fc capture와의 교차반응은 7.56으로 매우 높게 나타났으나, 비표지 Fc를 첨가 후 카트리지에 로딩하였을 때 농도의존적으로 교차반응이 감소하는 것을 확인하였다. 시료와 탐지항체 anti-human IgG를 포함한 검출용액에 비표지 Fc 단편을 첨가하여 비결합 anti-human IgG를 masking시킴으로서 교차반응을 억제하였다(도1, 도2참조). 탐지항체의 양에 따라 첨가물의 양은 달라질 수 있으며, 탐지항체의 농도가 증가할수록 교차반응을 억제하기 위해 첨가물의 양은 증가할 수 있는 것으로 나타났다(도3참조).

2. singe detection과 상용검사법의 임상적 민감도 비교 in Triple assay

도면 2에서와 같이 control line과 test line 1에 항CCP항체에 대한 capture (CCP 펩타이드), test line 2에 RF에 대한 capture (IgG Fc 단편)를 제타 분주기를 이용하여 라인분주하여 37도에서 건조 후 카트리지를 제작하였다. 형광 나노입자 (Europium chelator)를 탐지항체인 anti-human IgG에 컨쥬게이션하여 탐지자를 제조하였으며 이를 0.025%를 사용하였다. 형광 정량기인 ichroma 리더기 (boditech med.)를 이용하여 카트리지에서 각 라인에 포획된 탐지 형광량을 측정하고 그 양을 control의 형광량으로 나누어준 ratio 값으로 분석하였다.

총 69 혈청을 사용하였으며, 류마티스환자 혈청 (n=30)과 non-RA 환자혈청과 건강인 혈청을 포함한 대조군 혈청 (n=39)을 사용하여 3종의 상용제품과 동시분석용 triple 검출법에서의 임상적 민감도/특이도 (항CCP 항체와 류마티스인자)를 각각 분석하였다(도면 7). 상용제품에서의 민감도, 특이도는 각 제품의 임계값 (cut-off)를 적용하였으며, 본 발명의 항CCP 항체와 류마티스인자의 임계값은 형광 ratio 값을 바탕으로 ROC 분석을 통하여 설정하였다.

<임상검체리스트>

<본 발명에서 사용한 상용제품 3종>

상용제품에서의 분석 결과는 이미 보고된 바와 유사한 결과를 나타냈으나 (Abbas S, 2011), triple 검출법내에서의 각각의 마커에 대한 임상적 민감도는 anti-CCP는 유사한 정도를 나타냈으나 IgM, IgG RF의 경우는 각각을 분석하였을 때 상용제품보다 낮은 감도를 나타내는 것으로 나타났다. 그러나 이는 상용제품이 latex 응집법으로서 주로 IgM 타입의 RF를 검출하나 IgG타입의 RF나 IgA 타입의 RF 역시 검출할 수 있는 것을 감안할 때 IgM과 IgG를 분리하여 검출한 본 발명과의 직접적인 비교는 어려울 수 있다. 추가로 IgM RF와 IgG RF를 같이 분석한 경우에서는 분리검색결과보다 높은 수준의 감도로 나타나는 결과를 확인하였다(도8참조).

3. Triple detection과 2종의 상용검사법과의 임상적 민감도 비교

도면 2에서와 같이 control line과 test line 1에 항CCP항체에 대한 capture (CCP 펩타이드), test line 2에 RF에 대한 capture (IgG Fc 단편)를 제타 분주기를 이용하여 라인분주하여 37도에서 건조 후 카트리지를 제작하였다. 탐지항체는 형광 나노입자 (Europium chelator)를 anti-human IgG에 컨쥬게이션하였으며 0.025%를 사용하였다. 형광 정량기인 ichroma 리더기 (boditech med.)를 이용하여 카트리지에서 각 라인에 포획된 탐지 형광량을 측정하고 그 양을 control의 형광량으로 나누어준 ratio 값으로 분석하였다.

총 69개의 혈청을 사용하였으며, 류마티스환자 혈청 (n=30)과 non-RA 환자혈청과 건강인 혈청을 포함한 대조군 혈청 (n=39)을 사용하여 각 상용제품과 동시분석용 triple 검출법에서의 임상적 민감도/특이도 (항CCP 항체와 류마티스인자)를 각각 분석하였다.

제품에서의 민감도, 특이도는 각 제품의 임계값 (cut-off)를 적용하였으며, 본 발명의 항CCP 항체와 류마티스인자의 임계값은 형광 ratio 값을 바탕으로 ROC 분석을 통하여 설정하였다.

각 단일 마커, 이중 마커, 삼중마커에서의 양성 결과들을 개수화(도9참조)로 anti-CCP와 RF를 dual, triple 검출했을 때와 2종의 상용제품을 사용했을 때의 민감도 결과를 비교하였다. 2종의 상용제품을 사용하여 류마티스 환자 (n=30)의 민감도를 분석하였을 때 anti-CCP와 RF 마커 중 하나이상 양성인 경우는 83%로 나타나서 단일 검사법일 때보다 최대 16% 감도 상승효과를 보였다. 본 발명 카트리지에서 anti-CCP/IgM RF 혹은 anti-CCP/IgG RF 검출감도와 anti-CCP/IgM RF/IgG RF의 검출감도는 모두 83%로서 2종 상용제품을 사용했을 때와 동일한 감도를 나타냈으며, 단일 검사때 보다 최대 26% 상승효과를 나타냈다(도10참조).

한편 류마티스 관절염 음성혈청의 경우 판정기준을 특이도가 낮은 RF 결과를 배제한 특이도가 >95%으로 높은 anti-CCP 검사결과만을 기준으로 하였으며, 비록 anti-CCP의 2종 상용제품 모두에서 100%의 결과를 나타냈으나, 본 발명 카트리지에서는 총 39검체 중 1검체에서 위양성 반응을 나타내 97%의 특이도를 나타냈다. 이는 기존에 보고되고 있는 anti-CCP 의 특이도에 만족할 만한 수준으로 볼 수 있다.

Claims

류마티스 관절염(RA) 진단이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계;
상기 시료에 검출대상(target)인 항CCP항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 검출하기 위한 IgG 탐지자(detector)와 검출대상인 류마티스인자 IgM(RF IgM)을 검출하기 위한 IgM 탐지자를 제공하여 상기 시료내에서 검출대상과 탐지자의 제1복합체(Target-Detector complex)를 형성하는 단계;
상기 검출대상과 제1복합체를 형성하지 못한 IgG 탐지자와 비표지 IgG Fc단편을 반응시켜 상기 시료내에서 비표지 IgG Fc단편과 IgG 탐지자의 복합체를 형성하는 단계;
항CCP항체 포획자(capture)인 CCP(Cyclic Citrullinated Peptide) 및 류마티스인자 포획자인 IgG Fc 단편이 고정된 측방유동 스트립상에서 상기 제1복합체와 상기 포획자의 제2 복합체가 형성되는 단계;
제2 복합체에서 방출하는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 인비트로에서 측방유동기반의 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1복합체는
항CCP항체와 IgG 탐지자가 결합한 항ccp항체-IgG 탐지자 제1복합체,
RF IgG와 IgG 탐지자가 결합한 RF IgG-IgG 탐지자 제1복합체,
IgM와 IgM 탐지자가 결합한 RF IgM-IgM 탐지자 제1복합체 또는
이들의 조합인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2복합체는 CCP와 항CCP항체-IgG 탐지자 제1복합체가 결합한 CCP-항CCP항체-IgG 탐지자 제2복합체,
IgG FC단편와 RF IgG-IgG 탐지자 제1복합체가 결합한 IgG FC단편-RF IgG-IgG 탐지자 제2복합체,
IgG FC단편와 RF IgM-IgM 탐지자 제1복합체가 결합한 IgG FC단편-RF IgM-IgM 탐지자 제2복합체 또는
이들의 조합인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제1항에 있어서 상기 IgG 탐지자는 표지물질이 컨쥬게이트된 anti-IgG 항체이거나, 상기 IgM 탐지자는 표지물질이 컨쥬게이트된 anti-IgM 항체인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제4항에 있어서, 상기 표지물질은 나노입자를 포함하고,
상기 나노입자는 금속 나노입자, 자성 나노입자, 실리카 나노입자 및 라텍스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제4항에 있어서, 상기 표지물질은 형광입자를 포함하고,
상기 형광입자는 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이거나, 시분해 형광입자 (Time-resolved Fluorescence, TRF)인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제6항에 있어서, 상기 형광입자는 유로퓸(Europium) 또는 이들의 착화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 검출 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료는 1~10μL 인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제1항에 있어서, 류마티스인자 또는 항CCP항체중 적어도 1개 이상이 검출되는 경우 대상체를 류마티스 고위험군으로 판정하는 단계를 더 포함하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
류마티스 관절염(RA) 진단이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 검출대상(target)인 항CCP항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)를 검출하기 위한 IgG 탐지자, 검출대상(target)인 류마티스인자 IgM (RF IgM)을 검출하기 위한 IgM 탐지자 및 control 항체 탐지자를 제공하여 검출대상과 탐지자의 제1복합체(Target-Detector complex)를 형성하는 단계;
상기 검출대상과 제1복합체를 형성하지 못한 IgG 탐지자와 비표지 IgG Fc단편을 반응시켜 상기 시료내에서 비표지 IgG Fc단편과 IgG탐지자의 복합체를 형성하는 단계;
항CCP항체 포획자(capture)인 CCP(Cyclic Citrullinated Peptide), 류마티스인자 포획자인 IgG Fc 단편 및 control 단백질이 고정된 측방유동 스트립상에서 상기 제1복합체와 상기 포획자의 제2 복합체가 형성되는 단계; 및
제2 복합체에서 방출하는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 인비트로에서 측방유동기반의 류마티스 관절염 마커의 동시 정량 검사 방법.
제 10항에 있어서, 상기 제1복합체는 항ccp항체와 IgG 탐지자가 결합한 항CCP항체-IgG 탐지자제1복합체,
RF IgG와 IgG 탐지자가 결합한 RF IgG-IgG 탐지자 제1복합체,
IgM와IgM 탐지자가 결합한 RF IgM-IgM 탐지자 제1복합체 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 정량 검사 방법.
제 10항에 있어서, 상기 제2복합체는 CCP와 항ccp항체-IgG 탐지자 제1복합체가 결합한 CCP-항ccp항체-IgG 탐지자 제2복합체,
IgG FC단편와 RF IgG-IgG 탐지자 제1복합체가 결합한 IgG FC단편-RF IgG-IgG 탐지자 제2복합체,
IgG FC단편와 RF IgM-IgM 탐지자 제1복합체가 결합한 IgG FC단편-RF IgM-IgM 탐지자 제2복합체,
contol 펩타이드-control 항체 탐지자가 결합한 contol 단백질-control 항체 탐지자 복합체 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 정량 검사 방법.
측방유동기반의 류마티스 인자인 RF IgG, RF IgM 및 항ccp항체를 검출하기 위한 방법으로서,
시료내의 항CCP항체 및 류마티스 인자인 RF IgG를 검출하기 위한 IgG 탐지자중 상기 항CCP항체 및 류마티스 인자 IgG(RF IgG)와 반응하지 않은 미반응 IgG탐지자를 비표지 IgG Fc 단편과 반응시켜, 상기 미반응 IgG탐지자와 류마티스인자 포획자로서 측방유동 스트립상에 위치하는 IgG Fc 단편과의 교차반응을 억제하고, 상기　IgG 탐지자와　상기 IgM 탐지자는 서로 다른 광학계를 통해 검출되는 것을 특징으로 하는 인비트로에서 측방유동기반의 류마티스 인자 검출방법.
제13항에 있어서 상기 IgG 탐지자는 표지물질과 컨쥬게이트된 anti-IgG 항체이거나, 상기 IgM 탐지자는 표지물질과 컨쥬게이트된 anti-IgM 항체인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제14항에 있어서, 상기 표지물질은 나노입자를 포함하고,
상기 나노입자는 금속 나노입자, 자성 나노입자, 실리카 나노입자 및 라텍스 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제14항에 있어서, 상기 표지물질은 형광입자를 포함하고,
상기 형광입자는 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이거나, 시분해 형광입자 (Time-resolved Fluorescence, TRF)인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 동시 검출 방법.
제16항에 있어서, 상기 시분해 형광입자는 유로퓸(Europium) 또는 이들의 착화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마커의 검출 분석 방법.
제13항에 있어서, 상기　IgG 탐지자를 위한 광학계 와　상기 IgM 탐지자를 위한 광학계중 어느 하나는 시분할 형광 (time resolved fluorescence) 광학계인 것을 특징으로 하는 하는 류마티스 관절염 마커의 검출 분석 방법.