KR20030065341A - 측방 유동 정량 검정 방법 및 이를 위한 스트립 및 패키지 - Google Patents

측방 유동 정량 검정 방법 및 이를 위한 스트립 및 패키지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한 종류 또는 그 이상의 분석물을 고감도로 정량할 수 있는 측방 유동 정량 검정 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 한 종류 또는 그 이상의 분석물을 동시에 고감도로 정량할 수 있는 측방 유동 정량 검정 스트립 및 이 스트립과 본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 장치가 일체로 구성된 패키지에 관한 것이다. 본 발명은 최저 검출 한계 농도가 pg/ml까지의 분석물을 정량할 수 있다. 따라서, 본 발명은 단순한 측방 유동 정량 검정 스트립을 이용하여 다수의 분석물을 동시에 정량할 수 있는 이점이 있다.

Description

측방 유동 정량 검정 방법 및 이를 위한 스트립 및 패키지{LATERAL FLOW QUANTITATIVE ASSAY METHOD AND STRIP AND PACKAGE THEREFOR}
혈액 또는 뇨와 같은 생검물에 함유된 미량의 물질을 정석 또는 정량함으로써 이루어지는 새로운 진단방법과 진단기구의 개발이 지난 30 여년간 빠르게 진행되었고, 현재도 빠른 속도로 발전하고 있다. 1950년대 방사선 동위원소를 이용한 방사능면역분석법(RIA)이 처음으로 도입된 이래 효소면역분석법(ELISA)이 70년대와 80년대에 개발되고 발전되었다. 현재 ELISA 면역분석법은 가장 많이 사용되고 있는 방법 중의 하나이며 의학이나 생명과학의 연구에서 필수적인 도구가 되었다. 최근에는 변형된 ELISA 분석법이 개발되었는데, 96-웰 내부에 다수의 항체를 고정화하여 한꺼번에 많은 수의 시료를 분석하는 방법도 이들 중의 하나이다.
RIA나 ELISA를 포함하는 전형적인 면역진단법에서는 대개 시료 당 한 종류의분석물을 복잡하고, 다단계과정을 거치며, 실험실에서만 구비된 고가의 분석기기를 사용하여 정량화할 수 있다. 따라서, 이러한 시설이나 설비가 갖추어 지지 않은 소규모의 병원, 응급실, 가정, 등에서 사용하기 용이하지 않다. 이러한 약점을 보완하기 위하여 고안된 진단제품이 면역크로마토그라피 방법을 이용한 간편용 진단 키트이다.
면역크로마토그라피 방법을 진단 키트로 전혈, 혈청, 뇨 등의 생검물을 고안된 기구에 적용하여 15 분 이내에 검사결과를 확인할 수 있다. 면역크로마토그라피 분석법의 대표적인 타입으로 측방유동분석법(lateral flow assay)을 들 수 있다. 이 측방유동분석 타입의 키트 구조를 살펴보면 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항체 항원 반응이 일어나는 전개용 막(주로, 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드(absorption pad)로 되어 있다. 탐지용 항체는 탐지를 표지하기 위하여 예를 들면 콜로이드성 금입자에 고정되어 있다. 금입자 대신 라텍스 비드(latex bead) 또는 탄소입자를 사용하기도 한다. 측방유동분석용 진단 키트는 대개 샌드위치 형태로 분석물을 탐지하도록 고안되어 있다. 액체 시료 속에 들어 있는 분석물은 샘플패드에 적용되어 이동하기 시작하면서 먼저 방출패드에 비고정적으로 코팅되어 있는 탐지용 항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속하여 전개된다. 이동하면서 전개막에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획 항체는 전개막에 고정되어 있기 때문에 항원-항체 반응이 계속하여 일어나면 복합체의 축적이 포획 항체의 고정면에서 이루어진다. 단백질은 육안으로는 투명하기 때문에 복합체의 생성 여부와 상대적인 양을 부착된 금입자의 양으로 판단한다.
이와 같은 측방 유동 분석법은 임신진단, 암진단, 미생물탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 아주 간편하게 진단할 수 있으나 판단이 육안으로 이루어지는 까닭에 정확한 양을 확인하기 어려운 점이 따른다. 특히, 판단이 컷오프 값(cut-off value) 부근에서 이루어져야 할 경우에는 정확하게 진단하기가 용이하지 않다. 예를 들어, 전립선암의 경우 컷오프 값이 4 ng/ml인데 실제 값이 3.9 ng/ml와 같이 아주 유사한 경우 정확한 판단이 매우 어렵다.
면역진단법은 빠르게 발전하고 있어 멀지 않은 미래에는 보다 단순하고 빠르게 시료를 확인하고 분석하여 질병의 상태를 진단할 수 있을 것이다. 현재까지 정량화가 가능한 RIA 방법이나 ELISA 방법은 시료에서 분석물의 정량화를 위하여 효소를 처리하고 세척하는 등의 몇 단계를 거쳐야 한다. 마찬가지로 기존의 간편용 진단 키트는 정량화에 어려움이 따른다. 따라서, 보다 빠르고, 간편하고, 그리고 고감도로 정량화가 가능한 일반적인 분석법이 더욱 더 필요한 시점이다. 이 방법은 훈련되지 않은 일반인이 장소에 구애받지 않고 진단이나 분석이 가능해야 하는 것이다.
또한, 종래의 측방 유동 정량 검정 스트립들은 문헌에 공지되어 있거나 실제로 시중에 시판되고 있는 제품 모두를 포함해서 감도가 낮아 대체로 분석물을 정량하기 보다는 단순히 정석을 위한 수단으로 이용되고 있으며 또한 분석물의 종류도 한 두 종류밖에 검정할 수밖에 없는 실정이다. 근래에는 질병을 검사하는데 보통수십 종류의 분석물을 대상으로 하며 실제로 분자생물학 및 의학의 급격한 발전으로 인해 질병 검사를 위한 분석물의 종류는 점점 더 증가하는 추세이다. 그러나, 검사해야할 분석물의 종류가 많아지는 한편 현재로서는 대체로 개개의 분석물을 별도로 검정하는 실정에 있음으로써 시간적으로나 비용적으로 많은 부담이 되고 있다. 이러한 상황하에, 신속 정확하게 많은 종류의 분석물을 동시에 정량하는 것이 경제적 측면에서는 물론 기타 여러 가지 측면에서 유리하며 이러한 제품의 개발은 많은 의료 관계자를 포함한 일반 소비자들에 의해 더욱 더 간절히 요구되고 있다.
본 발명자들은 다수 종류의 분석물을 pg/ml의 최저 검출 한계 농도까지 동시에 측정할 수 있는 새로운 측방 유동 정량 검정 방법 및 이를 위한 스트립 및 이러한 스트립과 레이저 유발 표면형광 검출 장치가 일체로 구성된 패키지를 개발하였다.
한 가지 관점으로서, 본 발명은 크로마토그래피 매질상의 한쪽 말단에 분석물이 함유된 것으로 예상되는 액체 시료를 적하하여 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 이동되도록 하고, 액체 시료중의 분석물은 액체 시료가 적하된 구획으로부터 크로마토그래피 매질을 따라 전개하는 방향으로 일정한 간격을 두고 위치한 구획에 흡착되어 있는 표지된 탐지자와 반응하여 분석물-표지된 탐지자의 결합체를 형성하며, 분석물-표지된 탐지자의 결합체는 크로마토그래피 매질을 통해 이동하면서 상기 탐지자와 동일하거나 상이하며 비표지되어 상기 크로마토그래피 매질상의중간 정도 위치에 설정된 검사창에 고정된 포획자와 반응함으로써 표지된 탐지자와 비표지된 포획자 사이에 분석물이 샌드위치로 포획되어 형성된 표지된 탐지자-분석물-비표지된 포획자의 복합체를 형성하고, 이에 따라 형성된 복합체의 양을 측정하여 시료중의 분석물을 결정하는 측방 유동 정량 검정 방법에 있어서,
(a) 상기 표지된 탐지자는 형광물질로 표지되어 액체 시료중의 분석물과 반응하여 형광물질 표지된 탐지자-분석물의 결합체를 형성하고; (b) 비표지된 포획자는 크로마토그래피 매질상의 검사창에 선으로 분주되어 크로마토그래피 매질을 따라 이동해 온 상기 결합체와 반응하여 형광물질 표지된 탐지자-분석물-비표지된 포획자의 복합체를 형성하고; (c) 상기 형광물질 표지된 탐지자가 흡착되어 있는 크로마토그래피 매질상에, 상기 탐지자와 동일한 형광물질로 표지되고 상기 탐지자 및 포획자와 상이하며 액체 시료중의 표준물과 반응하는 표준 탐지자가 함께 흡착되어 있으며, 크로마토그래피 매질상의 검사창을 기준으로 전방 또는 후방에, 상기 형광물질 표지된 표준 탐지자와 반응하는 비표지된 표준 포획자가 표준선으로서 단일 선으로 분주 고정되거나 전후방 모두에 각각 단일 선으로 분주 고정되어 있어 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 이동하면서 형광물질 표지된 표준 탐지자-표준물-비표지된 표준 포획자의 표준 복합체를 형성하며; (d) 상기 복합체 및 표준 복합체의 표면형광 매질에 레이저로부터 입사하고 여기필터에 통과한 빛을 조사하여 이로부터 반사된 빛을 적절한 크기로 타원반사경 또는 구면경의 제1초점에 집속시키고, 타원반사경의 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경에 반사하여 타원반사경의 제2초점으로 집속시키며, 이와같이 집속된 광은 다시 평행광학계에 의하여 평행광으로 변환되며, 이 평행광을 형광필터에 통과시켜 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분만 광검출기로 입사시켜 상기 복합체의 형광 양을 상기 표준 복합체가 나타내는 표준 형광 양에 대하여 상대적으로 비교하여 분석물의 양을 결정함을 특징으로 하는 측방 유동 정량 검정 방법을 제공한다.
두 번째 관점으로서, 본 발명은 지지대(backing), 지지대의 한쪽 말단 상에 접착되어 있고 액체 시료가 투입되는 시료 패드(sample pad), 지지대의 다른 쪽 말단 방향으로 시료 패드의 말단에 한쪽 말단이 겹쳐서 지지대에 접착되어 있고 시료중의 분석물과 반응하여 복합체를 형성하는 표지된 탐지자가 비고정 흡착되어 있는 결합체 방출 패드(conjugate releasing pad), 지지대의 다른 쪽 말단 방향으로 표지된 결합체 방출 패드의 말단에 한쪽 말단이 겹쳐서 지지대에 접착되어 있고 시료가 전개되며 방출 패드로부터 분리 이동하는 결합체와 샌드위치로 반응 포획하여 복합체를 형성하는 상기 탐지자와 동일하거나 상이한 포획자가 고정되어 있는 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 크로마토그래피에 의해 이동하는 시료를 흡수하고 또한 표지된 미반응 물질을 흡수 및 제거하는 흡수패드(absorption pad)를 포함하는 측방 유동 정량 검정 스트립에 있어서,
상기 결합체 방출 패드상에 비고정적으로 흡착되어 있는 탐지자는 형광물질로 표지되어 있고, 추가로 상기 결합체 방출 패드상에는 상기 탐지자의 표지 형광물질과 동일한 형광물질로 표지되어 있고 액체시료중의 표준물과 반응하는 표준 탐지자가 비고정적으로 흡착되어 있으며; 상기 포획자는 크로마토그래피 매질상의 검사창에 선으로 분주 고정되어 있으며; 상기 탐지자 및 포획자와 상이하고 비표지된표준 포획자가 상기 검사창의 전방 또는 후방에 표준선으로서 단일 선으로 분주 고정되거나 상기 검사창의 전후방 모두에 표준선으로서 각각 단일 선으로 분주 고정되어 있고; 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 이동하면서 상기 검사창에서 형성된 형광물질 표지된 탐지자-분석물-포획자의 복합체 및 상기 표준선에서 형성된 형광물질 표지된 표준 탐지자-표준물-표준 포획자의 표준 복합체의 표면형광 매질은 레이저로부터 입사하고 여기 필터를 통과한 빛으로 조사되고 이로부터 반사된 빛은 적절한 크기로 타원반사경 또는 구면경의 제1초점에 집속되며 타원반사경의 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경에 반사하여 타원반사경의 제2초점으로 집속되고 이와같이 집속된 광은 다시 평행광학계에 의하여 평행광으로 변환되며 이 평행광을 형광필터에 통과시켜 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분만 광검출기로 입사하여 상기 복합체의 형광 양을 상기 표준 복합체가 나타내는 표준 형광 양에 대하여 상대적으로 측정 비교하여 분석물의 양을 결정하기 위한 스트립을 제공한다.
세 번째 관점으로서, 본 발명은 (i) 지지대(backing), 지지대의 한쪽 말단 상에 접착되어 있고 액체 시료가 투입되는 시료 패드(sample pad), 지지대의 다른 쪽 말단 방향으로 시료 패드의 말단에 한쪽 말단이 겹쳐서 지지대에 접착되어 있고 시료중의 분석물과 반응하여 복합체를 형성하는 표지된 탐지자가 비고정 흡착되어 있는 결합체 방출 패드(conjugate releasing pad), 지지대의 다른 쪽 말단 방향으로 표지된 결합체 방출 패드의 말단에 한쪽 말단이 겹쳐서 지지대에 접착되어 있고 시료가 전개되며 방출 패드로부터 분리 이동하는 결합체와 샌드위치로 반응 포획하여 복합체를 형성하는 상기 탐지자와 동일하거나 상이한 포획자가 고정되어 있는 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 크로마토그래피에 의해 이동하는 시료를 흡수하고 또한 표지된 미반응 물질을 흡수 및 제거하는 흡수패드(absorption pad)를 포함하고; 상기 결합체 방출 패드상에 비고정적으로 흡착되어 있는 탐지자는 형광물질로 표지되어 있고, 추가로 상기 결합체 방출 패드상에는 상기 탐지자의 표지 형광물질과 동일한 형광물질로 표지되어 있고 액체시료중의 표준물과 반응하는 표준 탐지자가 비고정적으로 흡착되어 있으며; 상기 포획자는 크로마토그래피 매질상의 검사창에 선으로 분주 고정되어 있으며; 상기 탐지자 및 포획자와 상이하고 비표지된 표준 포획자가 상기 검사창의 전방 또는 후방에 표준선으로서 단일 선으로 분주 고정되거나 상기 검사창의 전후방 모두에 표준선으로서 각각 단일 선으로 분주 고정되어 있는 스트립과 (ii) 레이저, 여기필터, 타원반사경 또는 구면경, 표면형광이 발광되는 시료의 제어 수단, 평행광학계, 형광필터 및 광검출기로 구성되고, 이들 구성 요소들은 액체 시료가 상기 스트립의 크로마토그래피 매질을 따라 이동하면서 상기 검사창에서 형성된 형광물질 표지된 탐지자-분석물-포획자의 복합체 및 상기 표준선에서 형성된 형광물질 표지된 표준 탐지자-표준물-표준 포획자의 표준 복합체의 표면형광 매질이 레이저로부터 입사하고 여기 필터를 통과한 빛으로 조사되고 이로부터 반사된 빛은 적절한 크기로 타원반사경 또는 구면경의 제1초점에 집속되고, 이 집속점은 타원반사경의 제1초점에 위치하며, 이 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경에서 반사하여 타원반사경의 제2초점으로서 평행광학계로 집속되고 이를 통해 평행광으로 변형된 뒤 형광필터를 지나면서 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분만이 광검출기로 입사하도록 배치되어 있는 레이저 유발 표면형광 검출 장치가, 상기 스트립상에 형성된 상기 복합체의 형광 양 및 상기 표준 복합체의 표준 형광 양이 상기 레이저-유발 표면형광 검출 장치에 의해 측정되고 상대적으로 비교되어 액체 시료중의 분석물 양을 결정할 수 있도록, 일체로 구성된 분석물 정량 패키지를 제공한다.
도 1은 종래 측방 유동 정량 검정 스트립의 사시도이다.
도 2는 본 발명에 따른 한 양태로서의 측방 유동 정량 검정 스트립의 사시도이다.
도 3은 도 1에 도시된 종래 측방 유동 정량 검정 스트립의 평면도이다.
도 4는 도 2에 도시된 본 발명에 따른 한 양태로서의 측방 유동 정량 검정 스트립의 평면도이다.
도 5는 도 2 및 도4에 도시된 본 발명에 따른 한 양태로서의 측방 유동 정량 검정 스트립의 측면도이다.
도 6은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 정량 검정 스트립의 측면도이다.
도 7은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 정량 검정 스트립의 측면도이다.
도 8은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 정량 검정 스트립의 측면도이다.
도 9는 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 정량 검정 스트립의 측면도이다.
도 10은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 정량 검정 스트립의 측면도이다.
도 11은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 정량 검정 스트립의 측면도이다.
도 12는 본 발명에 따른 타원반사경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도이다.
도 13은 본 발명에 따른 구면경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도이다.
도 14는 본 발명에 따른 타원반사경 레이저 유발 형광 검출 장치를 이용하여 분석물의 표면항원에 대해 측정한 최저 검출 한계 농도를 보여주는 그래프이다(A: 4 ng/ml; B 400 pg/ml; C: 40 pg/ml).
도 15는 본 발명에 따른 타원반사경 레이저 유발 형광 검출 장치(A)와 종래의 형광 검출 스캐너(B)를 이용하여 측정된 PSA(전립선특이항원, prostate specific antigen) 표면형광 세기의 결과를 비교하는 그래프이다.
도 16은 본 발명에 따른 타원반사경 레이저 유발 형광 검출 장치로 다수 시험선 스트립에 대해 측정 정량한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 17은 본 발명에 따라 스트립상의 시험선에 바이오틴-아비딘 시스템을 이용한 것과 기존 방법을 이용한 비교 모식도입니다.
도 18은 본 발명에 따라 스트립상의 시험선에 바이오틴-아비딘 시스템을 이용하여 정량한 결과와 대조구로서 기존 방법을 이용하여 정량한 결과를 비교해 주는 그래프이다.
도 19는 본 발명의 레이저 유발 형광 장치를 이용하여 총 PSA의 형광 세기를 측정하여 정량 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20은 본 발명의 레이저 유발 형광 장치를 이용하여 유리 PSA의 형광 세기를 측정하여 정량 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 21은 본 발명에 따른 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성 요소인 시료의 제어 수단의 구성도이다.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
측방 유동 정량 검정 스트립(1)샘플 패드(2)
결합체 방출 패드(3)크로마토그래피 매질(4)
흡수 패드(5)지지대(6)
접착제(7)위킹 패드(8)
제1 표준선(9)제2 표준선(10)
시험선(11)상부 라미네이트(12)
제2 크로마토그래피 매질(13)검사창(14)
레이저 유발 형광 검출 장치(20, 30)
레이저(21, 31)시료(24, 34, 44)
광검출기(27, 37)여기필터(22, 32)
타원반사경(23)구면경(33)
공간필터(25, 35)평행광학계(26, 36)
형광필터(28, 38)컴퓨터(29, 39)
시료제어수단(40)시료받침대(41)
이송수단(42)가이드(43)
모터(45)
본원에서 용어 "감도(sensitivity)"는 포획자, 탐지자와 분석물의 복합체를 검출할 수 있는 최소 한계량을 의미한다.
본원에서 용어 "표면형광(epifluorescence)"은 크로마토그래피를 이용한 측방 유동 검정 스트립(lateral flow assay strip)의 검사창 및 표준선에 각각 고정되는 형광물질 표지된 탐지자-분석물-포획자의 복합체 및/또는 형광물질 표지된 표준 탐지자-표준물-표준 포획자의 표준 복합체로부터 발광되는 형광을 가리킨다.
본원에서 용어 "분석물(analyte)"은 액체 시료중의 분석 대상 화합물 또는 조성물을 가리킨다. 본 발명에서 사용될 수 있는 시료는 상기 분석물을 함유하는 어떠한 시료로부터도 선택될 수 있으며, 예로는 뇨, 혈청, 혈장, 혈액, 타액, 척수액, 안구액, 양수 등과 같은 생리학적 유액, 밀크 및 와인과 같은 식품, 음식물 폐수와 같은 화학적 처리 스트림 등이 포함된다. 본 발명에서 검사될 수 있는 분석물은 완전 항원과 합텐(불완전 항원)으로 구분될 수 있다. 여기서, 완전 항원은 자체로서 항체 생성을 유도할 수 있는 능력(면역원성)을 갖는 항원성 물질을 가리키며 주로 고분자량의 펩타이드 호르몬을 포함한다. 상기 합텐은 항체와 결합할 수 있으나 자체로서는 항체 생성을 유도하는 능력이 없는 물질을 가리키며 비교적 작은 분자량(약 1,000 미만의 분자량)의 펩타이드를 포함한다. 합텐은 예를 들면 소 혈청 알부민과 같은 단백질에 결합될 때 항체 생성능을 획득한다.
본 발명에 있어서, 완전 항원은 이들로 한정되는 것은 아니지만 다음 같은 것을 포함한다:
(1) 펩타이드 호르몬의 예
1) 성장 호르몬(GH), 부신피질자극 호르몬(ACTH), 멜라닌세포자극 호르몬(MSH), 프롤락틴, 갑상선-자극 호르몬(TSH), 황체형성 호르몬(LH), 여포자극 호르몬(FSH) 및 옥시토신과 같은 뇌하수체 호르몬;
2) 칼시토닌 및 부갑상선 호르몬과 같은 칼슘 대사 조절 호르몬;
3) 인슐린, 프로인슐린 및 췌장 호르몬;
4) 가스트린 및 세크레틴과 같은 소화관 호르몬;
5) 안지오텐신 및 브라디키닌과 같은 혈관에 작용하는 호르몬;
6) 사람 융모성성생식선자극 호르몬(hCG) 및 사람 태반 락토겐(hPL)과 같은 태반 호르몬;
(2) 다른 물질의 예
1) 전립선 산성 포스파타제(PAP), 전립선-특이 항원(PSA), 알카리성 포스파타제, 트랜스아미나제, 락트산 데하이드로게나제(LDH), 트랜스아미나제, 트립신 및펩시노겐과 같은 효소;
2) α-펩토프로테인(AFP) 및 암태아성 항원(CEA)과 같은 암-특이 물질;
3) 면역글로불린 G(IgG), 피브린-피브리노겐 분해 산물(FDP, D-이량체), 안티트롬빈 III(ATIII) 및 트랜스페린과 같은 혈청 단백질 성분;
4) 류마티스성 인자, 세로토닌, 우로키나제, 페리틴 및 물질 P와 같은 물질.
본 발명에 있어서, 합텐으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 다음 같은 것이 포함된다:
(1) 스테로이드성 합텐
1) 에스트론, 에스트라디올, 에스트리올, 에스테트롤, 에퀼린 및 에퀼레닌과 같은 에스트로겐;
2) 프로제스테론, 프레그나네디올, 프레그나네트리올, 19-노레티스테론 및 클로로마디논 아세테이트와 같은 천연 또는 합성 루테오호르몬(luteohormones);
3) 테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 디하이드로테스토스테론, 안드로스테론 및 에티오콜라노론과 같은 남성 호르몬;
4) 코르티솔, 코르티손, 데옥시크로티코스테론, 알도스테론 및 테트라하이드로코르티솔과 같은 부신피질 호르몬;
5) 비타민 D, 콜레스테롤, 콜린산, 데옥시콜린산 및 케노콜린산(chenocholic acid) 및 기타 스테로이드(예, 카르디오토닉 스테로이드, 사포닌 및 사포제닌).
(2) 생리학적 활성 아민
1) 에피네프린, 노레피네프린, 도파민 및 에페드린 및 이들의 대사물과 같은 카테콜아민;
2) 모르핀, 코데인, 헤로인, 모르핀 클로라이드, 코카인, 메스칼린, 파파베린, 나르코틴, 요힘빈(yohimbine), 레세르핀, 에르고타민 및 스트리키닌(strychinine)과 같은 생리학적 활성 알카로이드;
3) LSD, 암페타민, 메탄페타민 및 메프로바메이트와 같은 아미노 기-함유 향정신제.
(3) 다른 예
1) TRH 및 LH-RH와 같이 항원성이 없는 저분자량 펩타이드;
2) 디요오도티로닌, 트리요오도티로닌 및 티록신과 같은 갑상선 호르몬;
3) 프로스타글란딘 E2, 프로스타글란딘 E3 및 프로스타글란딘 F1a과 같은 프로스타글란딘;
4) 비타민 A, 비타민 B(비타민 B1, B2, B6 및 B12 등), 비타민 E 및 비타민 K와 같은 비타민;
5) 페니실린, 악티노마이신, 클로로마이세틴 및 테트라사이클린과 같은 항생물질;
6) 유기체내로 투여되는 기타 생체내 성분 및 약물 및 이들의 대사물.
본 발명에 있어서, 분석물은 단일 결합 부위(일가)(monoepitopic) 리간드 또는 복수 결합 부위(다가)(polyepitopic) 리간드로서 특정될 수 있다. 다가 리간드 분석물은 보통 폴리(아미노산), 즉 폴리펩타이드 및 단백질, 다당류, 핵산 및 이들의 조합물이다. 여기서 조합물은 세균, 바이러스, 염색체, 유전자, 미토콘드리아, 핵, 세포막 등을 포함한다. 대부분의 경우, 본 발명에서 검정되는 다가 리간드 분석물은 분자량이 보통 약 5,000 이상, 더욱 보통은 약 10,000 이상이다. 폴리(아미노산) 카테고리에서 관심의 대상인 폴리(아미노산)의 분자량은 일반적으로 약 5,000 내지 5,000,000, 더욱 보통은 약 20,000 내지 1,000,000이다. 호르몬중에서 관심의 대상인 것은 보통 분자량이 약 5,000 내지 60,000이다.
본 발명에 있어서의 분석물로서 여러 단백질은 유사한 구조 특징을 갖는 단백질 부류, 특정한 생물학적 기능을 갖는 단백질 부류, 특정 미생물, 특히 발병 미생물과 연관된 단백질 부류 등으로서 고려될 수 있다. 세포 및 바이러스의 경우, 조직적합성 항원 또는 표면 항원이 흔히 관심의 대상이다.
구조와 연관된 단백질은 프로타민, 히스톤, 알부민, 글로불린, 경단백질(scleroproteins), 인단백질(phosphoproteins), 뮤코단백질, 색소단백질(chromoproteins), 지단백질(lipoproteins), 핵단백질, 당단백질 및 프로테오글리칸로 분류될 수 있으며 기타 미분류된 단백질로 예를 들면 소마토트로핀, 프롤락틴, 인슐린, 펩신 등이 있다. 이들 모두는 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립과 레이저 유발 표면형광 검출 장치가 일체로 구성된 패키지(본원에서 본 발명 패키지로 약칭될 수 있다)로 정량될 수 있다.
사람 혈장에서 발견되는 많은 단백질이 임상학적으로 중요하며 이들 모두는본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립과 레이저 유발 표면형광 검출 장치가 일체로 구성된 패키지로 정량할 수 있다. 이러한 혈장 단백질의 예로는 프리알부민, 알부민 α1-지단백질, α1-산 당단백질, α1-안티트립신 및 α1-당단백질, 트랜스코르틴, 4,6S-포스트알부민, 트립토판-불량 α1-당단백질 및 α1X-당단백질, 티록신-결합 글로불린, 인터-α-트립신-억제제, Gc-글루불린(Gc 1-1, Gc 2-1 및 Gc 2-2), 합토글로불린(Hp 1-1, Hp 2-1 및 Hp 2-2), 세룰로플라스민, 콜린에스터라제 α2-지단백질, 마이오글로빈, C-반응성 프로테인 α2-마크로글로불린, α2-HS-당단백질, Zn-α2-당단백질 및 α2-뉴라미노-당단백질, 에리쓰로포이에틴 β-당단백질, 트랜스페린, 헤모펙신, 피브리노겐, 플라스미노겐 β2-당단백질 I 및 β2-당단백질 II, 면역글로불린 G(IgG), A(IgA), M(IgM), D(IgD), E(IgE) 등을 들 수 있다.
본 발명 패키지를 사용하여 정량할 수 있는 분석물의 또 다른 예는 보체 인자 및 혈액응고 인자이다. 보체 인자는 C'1, C'1q, C'1r, C'1s, C'2, C'3(β1A 및 α2D), C'4, C'5, C'6, C'7, C'8 및 C'9를 포함한다. 중요한 혈액응고 인자는 피브로노겐, 프로트롬빈, 트롬빈, 조직 트롬보플라스틴, 프로아셀레린, 프로아셀레린 촉진 글로불린, 항호혈액성 글로불린(AHG), 크리스트마스 인자(혈장 트롬보플라스틴 성분), 스튜아트-프로워 인자(오토프로트롬빈 III), 혈장 트롬보플라스틴 선조(plasma thromboplastin antecedent), 하지만 인자(Hagemann 인자), 피브린-안정화 인자를 포함한다.
본 발명 패키지를 사용하여 정량할 수 있는 중요한 단백질 호르몬으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 부갑상선 호르몬(파라트롬빈), 티로칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 렐락신, 에리쓰로포이에틴, 멜라노트로핀, 소마토트로핀(성장 호르몬), 코르티코트로핀, 티로트로핀, 여포자극호르몬, 황체형성호르몬, 루테오마모향성 호르몬, 고나도트로핀(융모 고나도트로핀)과 같은 펩타이드 및 단백질 호르몬; 세크레틴, 가스트린, 안지오텐신 I 및 II, 브라디키닌(Bradykinin), 사람 태반 락토겐과 같은 조직 호르몬; 옥시토신, 바소프레신, 방출인자(CRF, LRF, TRF, 소마토트로핀-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF)와 같은 뇌하수체로부터 유도된 펩타이드 호르몬이 포함된다.
본 발명 패키지를 사용하여 정량할 수 있는 분석물로서 미생물로부터 유도된 항원성 다당류는 이들로 한정되는 것은 아니지만 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes) 다당류, 디플로코커스 뉴모니아(Diplococcus pneumoniae) 다당류, 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 다당류, 나이세리아 고노르헤애(Neisseria gonorrheae) 다당류, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 다당류, 액티노바실러스 말레이(Actinobacillus mallei) 조추출물, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 지다당류 및 다당류, 파스퇴렐라 페스티스(Pasteurella pestis) 다당류, 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 캡슐 항원, 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) 조추출물, 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 다당류, 해모필루스 페르투시스(Haemophilus pertussis) 조추출물, 트레포네마 레이테리(Treponema reiteri) 다당류, 베일로넬라(Veillonella) 지다당류, 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix) 다당류, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 다당류, 크로모박테리움(Chromobacterium) 지다당류, 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 90% 페놀-추출된 균주의 염수 추출물 및 다당류 분획, 크렙시엘라 에어로게네스(Klebsiella aerogense) 다당류, 크렙시엘라 클로아캐(Klebsiella cloacae) 다당류, 살모넬라 타이포사(Salmonella typhosa) 지다당류 및 다당류, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 다당류, 쉬겔라 다이센테리애(Shigella dysenteriae) 다당류, 쉬겔라 플렉네리(Shigella flexneri) 및 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 조추출 및 다당류, 리케치아(Rickettsiae) 조추출물, 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 다당류 및 엔타모에바 히스톨라이티카(Entamoeba histolytica) 조추출물에서 발견되는 헤모센시틴(hemosensitin)을 포함한다.
본 발명 패키지를 사용하여 정량하는 미생물은 완전한 균체이거나 용해, 분쇄 또는 단편화될 수 있으며 미생물의 예로는 코리네박테리아(Corynebacteria), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diptheriae), 뉴모코씨(Pneumococci), 디플로코쿠스 뉴모니아(Diplococcus pneumoniae), 스트렙토쿠씨(Streptococci), 스트렙토코쿠스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 살리바루스(Streptococcus salivarus), 스타필로코씨(Staphylococci), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 알버스(Staphylococcusalbus), 나이쎄리아(Neisseriae), 나이쎄리아 메닌자이티디스(Neisseria meningitidis), 나이쎄리아 고노르해(Neisseria gonorrheae), 엔테로박테리아씨아(Enterobacteriaciae), 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 에어로박터 에어로게네스(Aerobacter aerogenes), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 살모넬라 타이포사(Salmonella typhosa), 살모넬라 콜레라슈스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 쉬겔라 다이센테리아(Shigella dysenteriae), 쉬겔라 슈미트지(Shigella schmitzii), 쉬겔라 아라비노타다(Shigella arabinotarda), 쉬겔라 플렉스너리(Shigella flexneri), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 소니(Shigella Sonnei), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 모가니(Proteus morgani), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 알카리제네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 해모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenzae), 해모필루스 두크레이(H. ducreyi), 해모필루스 헤모필루스(H. hemophilus), 해모필루스 애집티쿠스(H. aegypticus), 해모필루스 파라인플루엔자(H. parainfluenzae), 보디텔라 페투씨스(Bordetella pertussis), 파스퇴렐라 페스티스(Pasteurella pestis), 파스퇴렐라 툴라루시스(Pasteurella tulareusis), 브루셀라 메리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보투스(Brucella abortus), 브루셀라 슈이스(Brucella suis), 바실러스 앤쓰라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 크로스리디움 테타니(Clostridium tetani), 크로스리디움 펄프리젠스(Clostridium perfringens), 크로스리디움 노비(Clostridium novyi), 크로스리디움 셉티쿰(Clostridium septicum), 크로스리디움 히스토리티쿰(Clostridium histolyticum), 크로스리디움 터티움(Clostridium tertium), 크로스리디움 바이퍼멘탄스(Clostridium bifermentans), 크로스리디움 스포로제네스(Clostridium sporogenes), 마이코박테리움 튜버쿨로시스 호미니스(Mycobacterium tuberculosis hominis), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 레프라(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 파라튜버쿨로시스(Mycobacterium paratuberculosis), 액티노마이시스 이스랠리(Actinomyces israelii), 액티노마이시스 보비스(Actinomyces bovis), 액티노마이시스 내슬루디(Actinomyces naeslundii), 노카디아 아스티로이디스(Nocardia asteroides), 노카디아 브라질리엔시스(Nocardia brasiliensis), 스피로케츠 강(Spirochetes), 트레포네마 팰리듐 스파이릴움 미누스(Treponema pallidum Spirillum minus), 트레포네마 펄티뉴 스트렙토바질루스(Treponema pertenue Streptobacillus), 트레포네마 카라튬(Treponema carateum), 보렐리아 리큐렌티스(Borrelia recurrentis), 렙토스피라 익테로헤모하지아(Leptospira icterohemorrhagiae), 렙토스피라 캐니콜라(Leptospira canicola), 마이코프라즈마(Mycoplasmas), 마이코프라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae), 리스테이라 모노사이토제네스(Listeriamonocytogenes), 에리시펠로트릭스 류시오파시아(Erysipelothrix rhusiopathiae), 스트렙토바실루스 모닐리포미스(Streptobacillus moniliformis), 돈바니아 그래눌로마티스(Donvania granulomatis), 바토넬리아 바질리포미스(Bartonella bacilliformis), 리케차 프로와제키(Rickettsia prowazekii), 리케차 무세리(Rickettsia mooseri), 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii), 리케차 코노리(Rickettsia conori), 리케차 오스트랠리스(Rickettsia australis), 리케차 시비리쿠스(Rickettsia sibiricus), 리케차 아카리(Rickettsia 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바이러스(Semliki Forest Virus), 마요라 바이러스(Mayora Virus), 세인트 루이스 뇌염 바이러스(St. Louis Encephalitis Virus), 캘리포니아 뇌염 바이러스(California Encephalitis Virus), 콜로라도 진드기 열 바이러스(Colorado Tick Fever Virus), 황달 바이러스(Yellow Fever Virus), 뎅그열 바이러스(Dengue Virus), 1 내지 3형 레오바이러스(Reoviruses), A형 간염 바이러스(Hepatitis A Virus), B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus), 종양 바이러스(Tumor Viruses), 라우스커 백혈병 바이러스(Rauscher Leukemia Virus), 그로스 바이러스(Gross Virus), 말로니 백혈병 바이러스(Maloney Leukemia Virus), 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus), 개 심장 기생충(microfilaria), 말라리아균(Malaria), 주혈흡충증균(Schistosomiasis), 콕시디아증균(Coccidosis) 및 선모충병균(Trichinosis)을 들 수 있다.
본 발명 패키지를 사용하여 정량할 수 있는 일가 리간드 분석물은 일반적으로 분자량이 약 100 내지 2,000이고, 더욱 보통은 125 내지 1,000이다. 중요한 분석물로는 약물, 대사물, 살충제, 오염물 등이 포함된다. 중요한 약물로서는 알카로이드가 포함된다. 알카로이드의 예로는 모르핀 알카로이드(예, 모르핀, 코데인, 헤로인, 덱스트로메토르판, 이들의 유도체 및 대사물), 코카인 알카로이드(예, 코카인 및 벤조일 엑고닌, 이들의 유도체 및 대사물), 맥각 알카로이드(예, 리세르그산의 디에틸아미드), 스테로이드 알카로이드, 아미나졸릴 알카로이드, 퀴나졸린 알카로이드, 이소퀴놀린 알카로이드, 퀴놀린 알카로이드(예, 퀴닌 및 퀴니딘), 디테르펜 알카로이드, 이들의 유도체 및 대사물을 들 수 있다.
본 발명 패키지로 정량할 수 있는 분석물로는 스테로이드 계통의 약물이 포함된다. 이의 예로는 에스트로겐, 안드로겐, 안드레오피질 스테로이드, 담즙산, 강심성 글리코시드 및 아글리콘(예, 디곡신 및 디곡시제닌, 사포닌 및 사포제닌, 이들의 유도체 및 대사물)을 들 수 있다. 또한, 디에틸스틸베스트롤과 같은 스테로이드 모사 물질이 포함된다. 또 다른 약물로는 5 내지 6개의 환원을 갖는 락탐이 포함되고, 이의 예로는 바르비투레이트(예, 페노바르비탈 및 세코바르비탈), 디페닐하이단토닌, 피리미돈, 에토숙시미드 및 이들의 대사물을 들 수 있다. 또 다른 약물로는 알킬의 탄소수가 2개 또는 3개인 아미노알킬벤젠이 포함되고, 이의 예로는 암페타민, 카테콜아민(예, 에페드린), L-도파, 에피네트린, 나르신, 파파베린 및 이들의 대사물을 들 수 있다. 또 다른 약물로는 헤테로사이클릭 환이 아제핀, 디아제핀 및 페노티아진인 벤즈헤테로사이클릭이 포함되고, 이의 예로는 옥사제팜, 클로르프로마진, 테그레톨, 이미프라민, 이들의 유도체 및 대사물을 들 수 있다. 또 다른 약물로는 퓨린이 포함되고 이의 예로는 테오필린, 카페인, 이들의 대사물 및 유도체를 들 수 있다. 또 다른 약물로는 마리쥬아나로부터 유도된 물질이 포함되고 이의 예로는 카나비놀 및 테트라하이드로카나비놀을 들 수 있다. 또 다른 약물로는 A, B(예, B12), C, D, E, K, 엽산 및 티아민과 같은 비타민이 포함된다. 또 다른 약물로는 하이드록실화 및 불포화의 정도 및 부위에 의해 상이하게 나타나는 프로스타글란딘이 포함된다. 또 다른 약물로는 항생물질이 포함되고, 이의 예로는페니실린, 클로로마이세틴, 안티노마이세틴, 테트라사이클린, 테라마이신, 이들의 대사물 및 유도체를 들 수 있다. 또 다른 약물로는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드가 포함되고, 이의 예로는 적절한 당과 포스페이트 치환체를 갖는 ATP, NAD, FMN, 아데노신, 구아노신, 티미딘 및 시티딘을 들 수 있다. 또 다른 약물로는 분류될 수 없는 기타 개개 약물을 들 수 있는데 예를 들면 메타돈, 메프로바메이트, 세로토닌, 메페리딘, 아미트리프틸린, 노르트리프틸린, 리도카인, 프로카인아미드, 아세틸프로카인아미드, 프로프라놀롤, 그리세오풀빈, 발프로산, 부티로페논, 항히스타민, 항콜린성 약물(예, 아트로핀), 이들의 대사물 및 유도체가 포함된다. 질병 상태로 연관된 대사물로는 스페르민, 갈락토스, 페닐피루브산 및 1형 포르피린이 포함된다. 또 다른 약물로는 아미노글리코시드이 포함되고 이의 예로는 젠타마이신, 카나마이신, 토브라마이신 및 아미키신을 들 수 있다.
본 발명에서 정량될 수 있는 분석물로서는 살충제를 들 수 있으며 이의 예로는 폴리할로겐화 바이페닐, 포스페이트 에스테르, 티오포스페이트, 카르바메이트, 폴리할로겐화 설펜아미드, 이들의 대사물 및 유도체를 들 수 있다.
본 발명 패키지를 사용하여 정량할 수 있는 분석물로는 수용체 분석물이 있다. 이의 경우 분자량은 일반적으로 10,000 내지 2 x 108이고, 더욱 보통은 10,000 내지 106이다. 면역글로불린 IgA, IgG, IgE 및 IgM의 경우, 분자량은 일반적으로 약 160,000 내지 약 106이다. 효소는 보통 분자량이 약 10,000 내지 1,000,000이다. 천연 수용체는 분자량이 아주 다양하며, 일반적으로, 약 25,000 이상이며 106이상일 수 있고, 예를 들면 아비딘, DNA, RNA, 티록신 결합 글로불린, 티록신 결합 프리알부민, 트랜스크로틴 등이 포함된다.
상기된 분석물 외에도, 본 발명 패키지는 종양 마커, 맥관형성 연관된 마커, 심장병 마커, 알쯔하이머병 연관된 마커, 암 연관된 유전자, 환경 독소, 남용 약물 등을 정량하는데 사용할 수 있다. 종양 마커로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 알파 1-애시드글리코프로테인, CEA, AFP, PSA/유리 PSA, CA 15-3, CA 19-9, CA 27-9, CA 50, CA 125, CA 72-4, 칼시토닌, 엘라스타제-1, 페리틴, 펩시노겐 I, PIVKA II, 프로콜라겐 III 펩타이드, 베타 HCG, 베타 2-마이크로블로불린, 뉴우론 특이적 에놀라제, CYFRA 21-1(사이코케라틴 19), 세크레틴, NMP(핵 매트릭스 단백질), COX-1 및 TPA(조직 폴리펩타이드 항원)이 포함된다. 맥관형성 관련된 마커는 혈관형성 인자 및 지혈인자를 포함한다. 혈관형성 인자의 예로는 aFGF(산성 섬유아세포 성장인자), bFGF(염기성 섬유아세포 성장인자), VEGF(혈관내피 성장인자), 안지오제닌, 안지오포이에틴 1, 헤파리나제, 산란 인자(scatter factor), HGF(간세포 성장인자), PDGF(혈소판 파생 성장인자), 플레이오트로핀, TGF 알파, TGF 베타, IL-8, TNF 알파 및 프로스타글란딘 E1 및 E2를 들 수 있다. 지혈 인자의 예로는 엔도스타틴, 안지오스타틴, 연골 파생 억제제, 헤파리나제, 안지오포이에틴 2, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감파, 혈소판 인자 4, 16kDa 프로락틴 단편, 프로타민, 쓰롬보스판딘, TIMP(메탈로프로테이나제의 조직 억제제), 탈리도미드(thalidomide), TNP470(푸마질린 유사체)를 들 수 있다. 심장병 마커의 예로는 크레아틴 키나제-BB, 크레아틴 키나제-MB, 크레아틴 키나제-MM, 마이오글로빈, MLC(마이오신 경쇄), 트로포닌 I, 트로포닌 C, 트로포닌 ITC, 트로포닌 T, CRP, FABP(지방산 결합 단백질)을 들 수 있다. 알쯔하이머병 연관된 마커의 예로는 글루타민 신쎄타제, 멜라노 트랜스페린, 베타-아밀로이드 단백질를 들 수 있다. 암 연관된 유전물질의 예로는 bcl-2, C-erbB-2, C-myc, CSF-1 수용체, EGF 수용체, H-ras, K-ras(p12), L-myc, mdr-1, N-myc, N-ras, p53 엑손 4, p53 엑손 5, p53 엑손 6, p53 엑손 7, p53 엑손 8, p53 엑손 9, TcR-α, TcR-β, TcR-γ, TcR-δ를 들 수 있다. 환경 독소를 예로 들면 마이크로시스틴, 다이옥신, PCB가 포함된다. 남용 약물로는 암페타민, 바르비투레이트(barbiturate), 벤조디아제핀, 카나비노이드, 코카인, 몰핀, 펜사이클리딘, TBPE 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에서 액체 시료중에 분석물의 존재 유무에 대한 지수로서 작용할 수 있는 표지(label)로는 특정적으로 형광물질이 사용된다. 형광물질은 흡수파장과 방출파장이 20 nm 이상의 차이가 나는 것을 사용할 수 있다. 대표적인 형광물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 형광 입자(fluorescence particle), 퀀텀 도트(quantum dot), 란타니드 킬레이트(lanthanide chelate)(예, 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu) 및 테르븀(Tb)) 및 플루오레슨스(fluorescence)(예, FITC, 로다민 그린, 티아디카르보시아닌, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594 및 Alexa 647)이 포함된다. DNA를 검출하는데 사용되는 바람직한 형광물질은 Cy3과 Cy5이다. 일반적으로 형광의 세기는 여기광(excitation light)의 세기에 직접 비례한다.
본 발명에 있어서 상기 표지는 링커를 통해 분석물과 특이적으로 결합하는 탐지자와 결합된다. 이러한 링커로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 N-[k-말레이미도운데카노일옥시])-설포석신아미드 에스테르(설포-KMUS), 석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카르복시[6-아미도카프로레이트](LC-SMCC), N-K-말레이미도우데칸산(KMUA), 석신이미딜-4-[p-말레이미도페닐]부티레이트(SMBP), 석신이미딜-6-[(β-말레이미도-프로피온아미도)헥사노에이트](SMPH), 석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 설포석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카르복실레이트(설포-SMCC), N-석신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트(SIAB), 설포석신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트(설포-SIAB), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]설포-석신이미드 에스테르(설포-GMBS), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]석신이미드 에스테르(GMBS), 석신이미딜-3-[브로모아세트아미도]프로피오네이트(SBAP), N-β-말레이미도프로피온산(BMPA), N-[α-말레이미도아세톡시]석신이미드 에스테르(AMAS), N-석신이미딜 S-아세틸티오프로피오네이트(SATP), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(MBS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포석신이미드 에스테르(설포-MBS), N-e-말레이미도카프린산(EMCA), N-[e-말레이미도카프로일옥시]석신이미드 에스테르(EMCS), N-석신이미딜-[4-비닐설포닐]벤조에이트(SVSB), N-[β-말레이미도프로필옥시]석신이미드 에스테르(BMPS) 및 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)가 포함된다. 상기 링커들은 예를 들면 탐지자의 티올 그룹과 반응하게 된다.
본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립은 직사각형, 원형, 난형, 삼각형, 기타 여러 모양을 취할 수 있는데 단 시험 용액이 모세관력에 의해 이동할 수 있는 적어도 하나의 방향이 존재하여야 한다. 시험 용액이 가운데서 접촉되는 난형 또는 원형과 같이 다른 이동 방향이 존재할 수 있다. 그러나, 고려되어야 하는 것은 시험 용액이 적어도 하나의 방향으로 예정된 위치로 이동되어야 한다. 본 발명에 따른 스트립의 두께는 중요하지 않지만 보통 0.1 내지 2 mm, 더욱 보통은 0.15 내지 1 mm, 바람직하게는 0.2 내지 0.7 mm이다. 일반적으로, 최소 두께는 스트립 재질의 강도 및 용이한 검출 신호의 생성 필요성에 의해 결정되는 한편 최대 두께는 시약의 취급 용이성 및 시약의 비용에 의해 결정된다. 시약을 보존하고 한정된 크기의 샘플을 제공하기 위해, 스트립의 너비는 일반적으로 비교적 좁게 만들며, 보통은 20 mm 미만, 바람직하게는 10 mm 미만이다. 일반적으로, 스트립의 너비는 약 1.0 mm 미만이어서는 안되며 보통의 범위는 약 2 mm 내지 12 mm이고, 바람직한 범위는 약 4 mm 내지 8 mm이다. 스트립의 길이는 분석물의 종류, 크로마토그래피 매질상의 시험 선 또는 점 및 표준선의 수, 패드사이의 공간, 취급의 편리성 등을 고려하여 결정된다. 보통은 1 내지 40 cm이고, 바람직하게는 약 2 내지 25 cm이며, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 20 cm이다. 그러나, 스트립은 실질적으로 어떠한 길이로도 가능할 수 있다.
분석할 액체 시료를 위한 용매는 보통 수성 매질이며, 이러한 매질은 약 40 중량% 이하의 다른 극성 용매, 특히 알코올, 에테르 등을 포함하여 탄소수 1 내지 6, 더욱 보통은 탄소수가 1 내지 4인 산화 용매를 포함할 수 있다. 보통, 공동용매가 약 20 중량% 미만으로 존재한다. 시료의 성질에 따라 일부 환경하에서 수성 매질중 일부 또는 전부가 시료 자체에 의해 제공될 수 있다.
매질에 대한 pH는 보통 4 내지 11, 더욱 보통은 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9이다. pH는 결합 요소들의 중요한 결합 친화성 부위 및 신호 생성 시스템에 의한 신호의 임의 생성을 유지하는 정도로 선택된다. 검정동안에 원하는 pH로 조절하고 그 pH를 유지하기 위해 다양한 완충액을 사용할 수 있다. 대표적인 완충액으로는 보레이트, 포스페이트, 카르보네이트, 트리스, 바르비탈(barbital)이 포함된다. 사용되는 특정 완충액이 중요하지는 않지만 개개의 검정에서 한 완충액이 다른 완충액에 비해 바람직할 수 있다. 바람직하게는 약 0.05 내지 0.5 중량%의 비이온성 세정제(detergent)가 시료에 포함된다. 약 200 내지 20,000 달톤의 여러 폴리옥시알킬렌 화합물이 사용될 수 있다.
검정을 실시하는데는 보통 온화한 온도가 사용되며 바람직하게는 실질적으로 일정한 온도가 사용된다. 검정 신호의 생성을 위한 온도는 일반적으로 약 4℃ 내지 50℃, 더욱 보통은 약 10℃ 내지 40℃이고, 흔히는 주변 온도, 즉 약 15℃ 내지 25℃이다.
피검 수용액중의 검정될 분석물의 농도는 일반적으로 약 10-4내지 약 10-15M, 더욱 보통은 약 10-6내지 10-14M이다. 다른 시약의 농도는 목적하는 분석물의 농도 및 프로토콜과 같은 것을 고려하여 결정하는 것이 보통이다.
시료 및 시약 용액중에 여러 많은 시약의 농도는 일반적으로 목적하는 분석물의 농도 범위에 의해 결정되는 한편, 각 시약의 최종 농도는 목적하는 범위에서 검정의 감도를 경험에 의해 최적화하는 정도로 결정된다. 특정 프로토콜과 함께 개개의 시약은 검정의 감도를 저하시키지 않는 한 과량으로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립과 레이저 유발 표면형광 검출 장치가 일체로 구성된 패키지에 대해 설명될 것이다.
측방 유동 검정 스트립의 지지대(backing)
지지대는 보통 수불용성, 비다공성 및 경직성이고 보통은 이의 위에서 시료를 전개하는 패드의 길이와 너비가 동일하나 보다 크거나 작을 수 있다. 아주 다양한 천연 및 합성의 유기 및 무기 재료를 사용할 수 있는데 다만 지지대는 흡수 물질의 모세 작용을 방해하거나, 분석물과 비특이적으로 결합하거나, 분석물과 탐지자의 반응을 방해해서는 안된다. 대표적인 중합체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 유리, 세라믹, 금속 등이 포함된다.
지지대는 그 위로 보통 접착제가 코팅되어 각종 패드가 부착된다. 적절한 접착제의 선택은 스트립의 성능을 개선하고 수명을 연장하는데 도움을 줄 수 있다. 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립에 사용되는 것으로는 감압성접착제(pressure-sensitive adhesives, PSA)가 대표적이다. 전형적인 측방 유동 검정 스트립에서 각종 패드의 결합은 접착제가 그들 패드의 기공내로 침투하고 이에 따라 패드가 지지대와 함께 결합함으로써 달성된다. 이와 같이 접착제가 정상적인 조건하에서 이동하는 과정을 콜드 플로우(cold flow)라고 한다. PSA를 패드에 적층하는 과정에서는 가열을 하지 않기 때문에 어느 정도의 콜드 플로우는 패드와 지지대사이의 결합이 형성되기 위해서는 필수적이다. 콜드 플로우의 정도가 너무 낮으면 초기 결합력이 낮아 패드와 지지대의 적절치 못한 결합을 초래할 수 있다. 반대로, 콜드 플로우의 정도가 너무 높으면 특히 스트립의 저장 기간 동안에 함께 결합되어 있는 패드내로 접착제가 이동하여 기공이 차단되거나 소수성 얼룩이 형성되거나 패드의 재습윤 문제가 발생할 수 있다. 이러한 접착제의 콜드 플로우와 연관된 문제는 직접-주조 막을 사용함으로써 해결될 수 있다. 예를 들면, 이러한 막들은 지지 플라스틱 시트에 의해 접착제가 막의 기공으로 들어가는 것을 차단해 주기 때문에 저장동안에 접착제의 상하 이동을 예방할 수 있다.
측방 유동 검정 스트립의 시료 패드(sample pad)
시료 패드는 기본적으로 분석물이 함유된 시료를 접수하는 역할을 한다. 이러한 기능에 더하여 시료 패드는 시료중의 불용성 입자를 여과하는 기능을 가질 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 시료 패드는 여과 기능을 부가하는 재질인 셀룰로즈 여과지 또는 유리 섬유 여과지가 바람직하다. 일반적으로, S & S사의 셀룰로즈 막(등급 903)이 사용된다.
시료 패드는 이의 재질에 시료중의 분석물이 비특이적으로 흡착되는 것을 막고, 더불어 시료의 성분들이 크로마토그래피 매질을 통해 용이하게 이동할 수 있도록 보조하며 반응의 감도를 유지하고 라벨-표지된 탐지자와 시료의 성분사이에 이루어질 수 있는 원치 않는 비특이적 반응을 최대한 방지하기 위하여 전처리하는 것이 바람직하다. 시료 패드의 전처리는 보통 불활성 단백질로 샘플 패드를 처리하거나 계면활성제로 처리하여 실시된다. 불활성 단백질로의 전처리는 예를 들면 패드를 0.1 내지 10% 소 혈청 알부민(BSA)-함유 0.1 M 트리스 완충액(pH 6-9), 0.1 M 트리스 완충액(pH 6-9)중의 0.1% 내지 10% 탈지유분의 용액 및/또는 0.1% 내지 10% 카제인 용액에 침지시키고 이 상태로 37℃에서 1시간 또는 4℃에서 24시간 방치한 후 패드를 트리스 완충액으로 세척한 다음 건조시킴으로써 수행된다. 계면활성제로의 전처리는 예를 들면 패드를 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-100 또는 트윈 20의 0.01% 내지 1%를 함유한 용액중에 침지시킨 후 건조시킴으로써 수행된다. 바람직한 전처리는 불활성 단백질로 처리하고 또한 계면활성제로 처리하는 것이다. 그러나, 이러한 전처리의 결정은 분석물 및 시료의 종류에 따라 결정될 것이다.
측방 유동 검정 스트립의 결합체 방출 패드(conjugate releasing pad)
결합체 방출 패드에는 시료중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성할 수 있는 형광물질-표지된 탐지자가 고정되지 않고 흡착되어 있다. 탐지자는 고정되지 않고 흡착되어 있음으로써 시료중의 분석물과의 반응에 의해 결합체를 형성한 후 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 전개 이동됨에 따라 함께 이동한다.
결합체 방출 패드를 위한 재질은 신속한 여과 속도와 함께 양호한 입자 보유를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 것으로는 폴리에스테르와 같은 합성소재 및 유리 섬유 필터가 사용될 수 있다. 일반적으로, S & S사의 유리 섬유 및 폴리에스테르가 사용된다. 이들은 생물학적으로 불활성이고 천연 소재보다 정교한 섬유질을 갖고 있기 때문에 수성 시약이나 시료가 투입되었을 때 뒤틀리거나 팽창하지 않는다. 바람직하게는, 결합체 방출 패드는 이에 분석물과 형광물질-표지된 탐지자가 비특이적으로 흡착되는 것을 방지하면서 결합체의 방출과 이동이 원활이 이루어질 수 있도록 계면활성제와 같은 시약으로 전처리한다.
결합체 방출 패드에 시약을 흡착시키는 방법은 특정적으로 제형된 고밀도 시약 용액에 유리 섬유와 같은 패드를 담그고 말리는 침지 방법(impregnation process)을 포함한다. 침지 방법은 단순하지만 몇 가지 문제점이 있다. 첫째는 패드를 말리는 동안에 구겨지거나 비틀릴 수 있다는 것이다. 둘째는 패드를 오븐에서 말리는 동안 패드의 위치에 따라 시약이 표면 장력 및 중력 효과로 인해 이탈되거나 재구성될 수 있다는 점이다. 셋째는 패드 침지욕에서 시간이 경과함에 따라 화학 변화가 일어나 여러 시약간에 상이한 흡착 속도를 초래할 수 있으며 이에 따라 패드상에 시약이 균일하지 않게 코팅된다는 점이다. 이러한 문제점을 최소화하기 위한 한 가지 방법으로는 패드의 건조를 40℃ 미만의 오븐에서 수 시간에 걸쳐서 행하는 것이다. 다른 방법은 오븐에서 건조시키는 대신에 동결건조시키는 것이다. 이러한 동결건조는 탐지자의 안정성을 확보할 수 있다는 점에서 오븐에서 건조하는 것보다 바람직하다.
침지 방법의 대안으로서, 분주 방법(dispensing process)이 사용된다. 이 방법은 분주기(dispenser)를 사용하여 보통 패드 cm당 12 내지 15 μl의 시약 용액을 분주한 후 말리는 것이다. 패드를 말리는 것은 침지 방법과 동일하게 실시하며 또한 패드를 동결건조시킬 수 있다.
다른 관점으로서, 결합체 방출 패드에는 안정화제 및 차단제가 사용될 수 있다. 안정화제의 예로는 수크로즈, 트레할로즈와 같은 당류를 들 수 있다. 차단제는 이들로 한정되는 것은 아니지만 BSA(소혈청알부민), 젤라틴, 카세인, 탈지유 등과 같은 단백질류가 포함된다.
측방 유동 검정 스트립의 크로마토그래피 매질
크로마토그래피 매질은 바람직하게는 액체 시료 및 결합체가 모세관력에 의해 신속하게 이동하여 그 위에 고정된 포획자에 도달될 수 있도록 하는 것이면 어느 것이든 가능할 수 있으며 균일한 특성을 갖는 것이 바람직하다. 일반적으로, 크로마토그래피 매질은 모세관력에 반응하여 수성 매질에 의해 이동하기 쉽고 기공이 0.1 μ 이상, 바람직하게는 1.0 μ 이상인 다공성 물질을 가리킨다. 이러한 물질은 일반적으로 친수성이거나 친수성으로 될 수 있으며 예로는 무기 분말(예, 실리카, 황산마그네슘 및 알루미나); 천연 중합체 물질, 특히 셀룰로즈성 물질 및 셀룰로즈로부터 유도된 물질(예, 필터지, 크로마토그래피지 등과 같은 섬유 함유 지); 합성 또는 변형된 천연 중합체(예, 니트로셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 가교된 덱스트란, 아가로즈, 폴리아크릴레이트 등)이 포함된다. 상기 예시된 물질은 단독으로 사용되거나 다른 물질과 결합시켜 사용할 수 있다. 또 다른 예로는 세라믹 물질을 들 수 있다. 크로마토그래피 매질은 지지대에 결합될 수 있다. 다른 방도로서, 크로마토그래피 매질은 그 자체가 지지체가 될 수 있다. 크로마토그래피 매질은 다작용성이거나 다작용성으로 변형시켜 포획자의 공유 결합을 가능하게 할 수 있다.
크로마토그래피 매질은, 결합체 패드로부터 이동해 온 분석물과 탐지자의 결합체와 반응하여 포획할 수 있도록 크로마토그래피 매질에 화학적으로 결합 고정되어 있는 포획자가 고농도로 사용되는 경우, 활성화된 필터지를 사용하는 것이 바람직하다. 매질의 재질로서 CNBr 활성화된 셀룰로즈가 선택 사용되는 경우에는 활성화된 셀룰로즈 필터지는 문헌[Ceska and Lundkvist, Immunochemistry, 9, 1021 (1972)] 및 [Lehtone, Viljanen et al., J. Immunol. Methods, 36, 63 (1980) 및 동일 문헌의 34, 61 (1980)]에 기술된 방법과 같은 공지 방법에 의해 쉽게 제조할 수 있다. 다른 방도로서, 재질이 DBM 활성화된 셀룰로즈가 선택 사용되는 경우에는 문헌[Alwine, Methods Enzymol., 68, 220 (1979)]에 기술된 방법과 같은 공지 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 이외에도 시판되고 있는 활성화된 나일론 필름(Pall Immunodyne, USA)을 사용할 수 있다.
크로마토그래피 매질은 포획자를 고정할 수 있는 능력(capacity)이 중요하다. 이러한 결합능(binding capacity)은 매질의 기공 구조 및 매질의 후처리에 따라 달라진다. 본 발명에 있어서 바람직하게 사용될 수 있는 크로마토그래피 매질은 니트로셀룰로즈(NC) 막이며 이의 예는 하기 표 1에 기술되어 있다.
표 1
제조사 제품명 Sec/4cm (유속(a)) IgG / cm2(b)
S & S(지지대가 결합되지 않은 것) AE 98 160-210 20~30ug
AE 99 120-160 20~30ug
AE 100 90-120 20~30ug
Millipore(지지대가 결합된 것) HF 090 80-100 >95
HF 120 107-133 >95
HF 135 120-150 >95
HF 180 160-200 >95
HF 240 214-266 >120
Sartorius(지지대가 결합된 것) CN 90 88-94 10-30
CN 140 137-153 10-30
CN 200 205-233 10-30
(a) 증류수가 매질을 타고 4cm 오르는데 걸리는 시간
(b) 결합능 - 매질제곱 센티 당 붙을 수 있는 IgG의 양.
바람직한 크로마토그래피 매질은 CN 90 막이다. CN 90 막은 위의 제품군들 중 유속 변화 폭이 +/- 3 초로서 가장 좁은 범위의 변화 폭을 가지고 있다. 결합능은 형광 표지물질의 증폭이 워낙 뛰어난 탓에 10 내지 30ug 정도로도 충분한 것이다. 무엇보다도 이 막의 가장 큰 장점은 측방 유동 속도의 재현성이 뛰어나다는 점이다.
포획자는 크로마토그래피 매질상에 화학적으로 결합하여 고정된다. 이러한 화학적 결합은 공지 방법(LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Volume 15, Edited by R. H. BURDON and P. H. Van KNIPPENBERG ELSEVIER AMSTERDAM: NEW YORK, OXFORD (1985) P. 318-322)에 따라 실시될 수 있다. 또한, 포획자는 크로마토그래피 매질상에 제2 물질(예, 항체 단백질)을 통해 결합될 수있다. 제2 물질이 항체(제2 항체)이고 고정될 포획자가 마우스로부터 유래된 모노클로날 항체인 경우 과량의 항-마우스 yG(감마 글로불린) 헤테로-동물 항체가 결합된 후 적절한 양의 포획자(모노클로날 항체)가 면역반응에 의해 결합되는 활성화된 페이퍼 시트가 사용될 수 있다. 만일 제2 물질이 단백질인 경우에는 예를 들면 과량의 프로테인 A가 결합된 후 적당량의 포획항체가 결합되는 활성화된 페이퍼 시트가 사용될 수 있다.
크로마그래피 매질상의 검사창에서 시험선을 균일하게 습윤시키기 위한 방법으로 차단(blocking) 기술을 사용하는 것이다. 크로마토그래피 매질의 재습윤을 강화하는 물질로 크로마토그래피 매질을 차단시키는 것은 신속하고 균일한 매질의 재습윤을 보장한다. 차단제로 사용되는 것은 네 종류로 나누어 볼 수 있다: 단백질(예, BSA 및 젤라틴), 계면활성제(SDS, 트윈 20 및 트리톤 X-100), 중합체(PVA, PEG 및 PVP). 차단제는 세 가지 지점에서 사용될 수 있다. 첫째는 차단제를 크로마토그래피 매질에 적용하는 것이다. 이 방식은 아주 균일한 재습윤 효과를 제공할 수 있는 반면 매질은 포획자의 적용 후 그러나 시료 패드의 부착이전에 차단되어야하고 고가의 코팅 장비를 필요로 하며 포획자를 재용해시킬 필요가 있고 차단제 자체는 포획자의 항원성 및 저장 수명을 감소시킬 수 있다. 둘째는 차단제를 시료 패드 또는 결합체 방출 패드에 혼입시키는 것이다. 이 방식은 비용이 적게 들고 실시가 용이하다는 점과 포획자를 재용해시킬 필요가 없다는 점이 있으나 차단 효과가 떨어진다는 단점이 있다. 이 방법은 비록 첫 번째 방식에 비해 차단 효율이 떨어지기는 하나 취급의 용이성 측면에서 바람직한 방법이다. 셋째는 포획자 적용 완충액에 차단제를 함유시키는 것이다. 이 방식 또한 비용이 적게 들고 실시가 용이하다는 점이 있으나 차단 효과가 좋지 않고 차단제의 함유로 인해 포획자의 항원성 및/또는 저장 수명이 저하되고 포획자가 번질 가능성이 높다.
시료 패드, 결합체 방출 패드 및 크로마토그래피 매질에서 사용되는 시약의 비특이적 결합을 방지하기 위해 두 가지 방법이 사용될 수 있다. 한 가지 방법은 포획자가 적용된 후 크로마토그래피 매질을 단백질 또는 고도의 극성 중합체(예, 폴리비닐 알코올)가 함유된 용액에 침지시키거나 이러한 용액으로 분무시켜 크로마토그래피 매질상의 비특이적 결합 부위를 차단하는 것이다. 그러나, 이 기술은 특히 포획자가 차단 단계이전에 완전한 건조에 의해 최적으로 고정되지 않은 경우 포획자를 치환시킬 수 있는 가능성이 있다. 다른 방법은 시료 패드에 차단제를 첨가하는 것이다. 차단제는 적어도 초기에는 포획자가 크로마토그래피 매질에 결합하는 것을 방해하지 않을 수 있다. 액체 시료가 시료 패드에 적하될 때 차단제는 시료 패드에서 재용해되고 시료와 함께 이동한다. 이상적으로는, 시료에 존재하는 분석물과 탐지자 모두의 비특이적 결합을 방지하기 위해 충분한 양의 차단제를 시료 패드에 첨가하는 것이다.
본 발명은 추가의 바람직한 양태로서 바이오틴-아비딘 결합체를 이용한다. 즉, 포획자(예, 항체 또는 항원 단백질)를 스트립상의 시험선에 분주하지 않고 아비딘을 분주하여 고정화한다. 대신 포획자에 바이오틴을 부착하여 바이오틴이 아비딘과 결합하면서 포획자가 스트립상의 시험선에서 자동적으로 탐지될 수 있다. 포획자에 바이오틴을 결합시킬 때에는 포획자가 단백질인 경우에 아미노산 중 리신또는 아르기닌의 아민기를 이용함으로서 단백질의 특정 부위에 특이적으로 바이오틴이 결합하게 된다. 바이오틴이 결합된 단백질은 스트립상에 분주되어 고정화된 아비딘과 특이적으로 결합하게 되고 항상 같은 방향의 방향성을 유지하게 되며, 흡착에 의한 결합이 아니므로 포획자로 사용되는 단백질의 구조나 기능에 변화가 적다. 이러한 이유로 인하여 기존의 비특이적으로 방향성 없이 스트립의 막상에 고정화되던 방법과는 다르게 바이오틴-아비딘 방법은 포획 단백질이 항상 일정한 방향으로 고정화가 되어 동일한 방향성을 갖게 되고, 그 구조나 기능에 변화가 없음으로서 보다 더 효과적으로 검체내에 존재하는 분석물과 반응을 할 수가 있다. 따라서 바이오틴-아비딘 방법은 동일한 분석물의 농도에서 더욱 높은 감도를 유지 할 수가 있다. 기존에 사용하던 고정화 물질의 농도보다 최저 10-100배의 낮은 농도를 사용하더라도 높은 감도를 유지 할 수가 있다. 그리고 아비딘이 분주된 스트립을 사용하면 비록 분석물이 상이한 경우에도 새로운 타입의 스트립을 준비하지 않아도 된다는 장점이 있다. 즉 아비딘 스트립을 공통적으로 사용할 수 있다. 다만 각기 다른 단백질-바이오틴 결합체와 탐지자인 단백질-형광 결합체만을 준비함으로서 다양한 측정 항목을 실험 할 수가 있다. 본 방법은 기존 방법과 동일하게 결합체 패드를 사용하여 제조 할 수도 있으며 또한 결합체 패드를 제조하지 않고 용액 상태로 분석물과 반응하여 결합체 패드 없이 직접 샘플패드에 분석물과 단백질-바이오틴 결합체와 단백질-형광 결합체를 혼합하여 첨가함으로서 실험을 수행할 수도 있다. 도 17은 스트립상의 시험선에 바이오틴-아비딘 시스템을 이용한 것과 기존 방법을 이용한 비교 모식도 입니다.
측방 유동 검정 스트립의 흡수 패드(absorption pad)
흡수 패드는 모세관 작용에 의한 크로마토그래피에 의해 이동해 온 시료를 물리적으로 흡수하고 또한 미반응 물질을 제거하기 위한 수단이다. 즉, 흡수 패드는 측방 유동 검정 스트립의 말단에 설정되어 크로마토그래피 매질을 따라 이동해 오는 시료 및 시약의 속도를 조절 및 촉진하고 이를 담아두는 펌프 또는 저장소로서 작용한다. 시료 및 시약의 이동 속도는 흡수 패드의 질 및 크기에 따라 다를 수 있으며 보통 사용되는 흡수 패드는 셀룰로즈 여과지, 부직물, 천 또는 셀룰로즈 아세테이트와 같은 수-흡수 재질로부터 형성된 것들이다.
측방 유동 검정 스트립의 위킹 패드(wicking pad)
혈액과 같은 시료의 확산을 촉진시킴과 동시에 스트립의 저장시 결합체 패드의 세균 오염을 방지할 목적으로 사용한다. 일반적으로, 폴 코포레이션(Pall Corporation, USA) 제품 AW14-20T4가 사용되며 이의 재질은 하이드록실화 폴리에스테르이다.
본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립은 본원에 첨부된 도면을 참고로 하여 좀더 구체적으로 예시될 것이다. 이러한 예시로부터 본 발명의 특징 및 장점은 명백할 것이다.
도 1 및 도 3은 종래의 측방 유동 검정 스트립을 보여준다. 도 1로부터 종래 측방 유동 검정 스트립(1)은 지지대(6)상의 접착층을 매개로 하여 지지대의 한쪽 말단에 분석물을 함유한 액체 시료가 투입되는 시료 패드(2)가 부착되어 있고 이어서 지지대(6)의 반대쪽 말단 방향으로 결합체 방출 패드(3), 크로마토그래피 매질(4) 및 흡수 패드(5)가 부착되어 있다. 결합체 방출 패드(3)상에는 액체 시료가 모세관 현상에 의해 크로마토그래피적으로 이동하면서 액체 시료중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성할 수 있는 표지된 탐지자가 비고정적으로 흡착되어 있다. 크로마토그래피 매질(4)상에는 탐지자와 동일하거나 상이한 포획자가 한 선(시험선)(11)으로 화학적 결합에 의해 매질(4)상에 고정되도록 분주되어 있으며, 이러한 한 선의 포획자(11)는 액체 시료 및 상기 결합체 방출 패드(3)에서 형성된 결합체가 크로마토그래피적으로 이동해 오면서 화학적으로 반응하여 그 결합체를 포획하여 표지된 탐지자-분석물-포획자의 복합체를 형성한다. 나머지 미반응된 물질 및 액체 시료는 계속해서 크로마토그래피적으로 이동하면서 지지대의 말단에 부착되어 있는 흡수 패드(5)로 흡수된다. 분석물의 양은 복합체의 양으로서 결정되며, 이러한 복합체의 양은 크로마토그래피 매질상에 포획 고정된 복합체의 발광 세기를, 사전에 탐지자와 동일하게 표지되고 탐지자 및 포획자와 상이한 표준 탐지자와 이 표준 탐지자와 상이하고 비표지된 표준 포획자가 반응하여 형성된 복합체에 대해 표준 발광 세기를 정량화하고 이를 상대적인 값으로 산정함으로써 분석물을 정량한다.
상기된 바와 같이 종래의 측방 유동 검정 스트립은 생물 시료중의 분석물에대해 단지 한 종류만을 정량 분석하기 위한 의도로 고안되어 있다.
도 2, 도 4 및 도 5는 본 발명의 한 양태로서 측방 유동 검정 스트립을 보여준다. 이 측방 유동 검정 스트립은 결합체 방출 패드(2)상에 네 종류 또는 그 이상의 탐지자를 비고정적으로 흡착시키고 크로마토그래피 매질(4)상의 검사창(14)에 상기 탐지자의 종류와 동일한 수의 포획자를 다수의 미세 시험선(11)으로 배열 분주하여 다수의 분석물을 한번에 동시 검정할 수 있는 방식이다. 포획자 각 종류는 개개의 시험선으로 분주되어 시험선의 개수는 포획자의 수와 동일하므로 그러한 수만큼 다수의 분석물을 동시에 검정할 수 있다. 시험선의 개수는 측방 유동 검정 스트립의 크기, 스트립에 사용되는 시약(탐지자 및 포획자)의 종류 및 양, 감도 등에 의해 제약을 받을 수 있다. 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립에서 사용되는 시험선의 개수는 일반적으로 2 내지 20개이며, 바람직하게는 5 내지 15개이다.
도 6은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 검정 스트립을 보여준다. 도 6에 도시된 본 발명의 측방 유동 검정 스트립은 크로마토그래피 매질(4) 위에 시료 패드(2)가 위치하고, 이어서 시료 패드 위에 결합체 방출 패드(3)가 위치하며, 이어서, 결합체 방출 패드 위에 위킹 패드(8)가 위치한다. 결합체 방출 패드(3) 위에 설정되는 위킹 패드는 액체 시료의 분산을 용이하게 해 주고 결합체 방출 패드의 용해도를 높여 주며 또한 결합체 방출 패드위에 비고정적으로 흡착되어 있는 탐지자와 표준 탐지자를 스트립의 저장시 세균 오염 등에 의해 변형되거나 손상되지 않도록 보호하는 작용을 한다.
본 발명에서 사용된 위킹 패드는 이들로 한정되는 것은 아니지만 대표적인것으로서 하이드록실화 폴리에스테르를 들 수 있다. 이러한 하이드록실화 폴리에스테르의 예로는 폴 코포레이션(Pall Corporation, USA)의 제품 AW14-20T4가 포함된다.
액체 시료는 위킹 패드(8)에 적하되면 위킹 패드를 통과하면서 분산되고 결합체 방출 패드(3)로 확산이 이루어지면서 액체 시료에 의해서 결합체 방출 패드상에 비고정적으로 흡착되어 있는 탐지자 및 표준 탐지자가 용해되어 액체 시료중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성하면서 액체 시료와 함께 시료 패드(2)로 이동한다. 결합체 방출 패드아래에 위치한 시료 패드(2)는 액체 시료 및 형성된 결합체가 결합체 방출 패드에서 반응되지 않은 미반응 시약과 분석물이 충분히 이루어질 수 있도록 하는 보조 수단으로서 작용하면서 더불어 액체 시료 및 결합체가 크로마토그래피 매질(4)로 원만하게 이동할 수 있도록 하는 완충 작용을 한다. 형성된 결합체는 액체 시료가 모세관 현상에 의해 크로마토그래피 매질로 이동함에 따라 함께 이동하면서 크로마토그래피 매질 상에 고정된 시약(포획자 및 표준 포획자)과 반응하여 포획된다.
도 7은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 검정 스트립을 도시한 것이다. 이 측방 유도 검정 스트립은 시료 패드(2)만이 크로마토그래피 매질상에 위치해 있다. 시료 패드는 그 위에 형광물질-표지된 탐지자 및 표준 탐지자가 비고정적으로 흡착되어 있어 결합체 방출 패드의 역할을 겸할 수 있다. 결합체 방출 패드위에서 형성된 결합체는 액체 시료가 모세관 현상에 의해 크로마토그래피 매질로 이동함에 따라 함께 이동하면서 크로마그래피 매질 상에 고정된 시약(포획자 및 표준 포획자)과 반응하여 포획된다.
다른 방도로서, 시료 패드에는 탐지자 및 표준 탐지자가 흡착되어 있지 않을 수 있다. 이 경우는 소위 두 단계 방식(two-step way)으로 지칭되는 것으로 액체 시료를 시료 패드에 적하하기 전에 형광물질-표지된 탐지자 및 표준 탐지자를 투입하여 혼합하고 이 혼합물을 시료 패드에 적하하는 것이다. 이 두 단계 방식은 감도가 형광물질-표지된 탐지자 및 표준 탐지자가 시료 패드에 흡착되어 있는 경우에 비해 2배 이상을 증대시키는 효과를 제공한다. 그러나, 탐지자는 사용전에 냉장 보관되어야 하기 때문에 휴대가 불편하다는 단점이 있다. 액체 시료중에 분석물이 존재하는 경우 결합체가 형성되고 형성된 결합체는 액체 시료가 모세관 현상에 의해 크로마토그래피 매질로 이동함에 따라 함께 이동하면서 크로마그래피 매질 상에 고정된 시약(포획자 및 표준 포획자)과 반응하여 포획된다.
도 8은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 검정 스트립의 측면도이다. 이 측방 유동 검정 스트립은 크로마토그래피 매질상에 결합체 방출 패드를 위치시킨 후 시료 패드를 결합체 방출 패드 위에 정위치시킨 것이다. 시료 패드에 액체 시료가 첨가된 후 액체 시료는 확산에 의해서 결합체 방출 패드로 이동하게 되며, 만약 피검 액체 시료에 분석물이 존재한다면 형광물질-표지된 탐지자는 분석물과 반응하여 결합체를 형성하게 된다. 형성된 결합체는 액체 시료가 모세관 현상에 의해 크로마토그래피 매질로 이동함에 따라 함께 이동하면서 크로마그래피 매질 상에 고정된 시약(포획자 및 표준 포획자)과 반응하여 포획된다.
도 9는 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 검정 스트립의 측면도이다. 이 측방 유동 검정 스트립은 도 6에 도시된 측방 유동 검정 스트립과 두 장의 크로마토그래피 매질이 적층되어 있다는 점만을 제외하고 동일하다. 제2 크로마토그래피 매질(13)은 지지대(6)상의 접착제(7)에 부착되고, 제1 크로마토그래피 매질(4)은 제2 크로마토그래피 매질보다 양끝으로 약간 길게 연장되어 제2 크로마토그래피 매질위에 정위치하고 연장된 양끝이 지지대(6)상의 접착제에 부착된다. 제1 크로마토그래피 매질위에는 한쪽 말단에 시료 패드(2)가 위치하고 다른 쪽 말단에 흡수 패드(5)가 위치한다.
포획자(11)와 표준 포획자(9,10)는 제1 크로마토그래피 매질(4)와 제2 크로마토그래피 매질(13) 접면 사이에서 각각 아래위로 고정된다. 이때, 제1 크로마그래피 매질 아래면에 고정된 포획자는 제2 크로마그래피 매질 상면에 고정된 표준 포획자와 동일하거나 상이할 수 있다. 만일 동일한 표준 포획자가 두 겹의 크로마토그래피 매질사이에 고정된 경우는 표준 포획자가 하나의 크로마그래피 매질상에 고정된 경우 보다 감도가 적어도 2배는 증가된다. 만일 상이한 표준 포획자가 두 겹의 크로마토그래피 매질사이에 고정된 경우에는 동일한 표준 포획자가 두 겹의 크로마그래피 매질사이에 고정된 경우나 표준 포획자가 하나의 크로마그래피 매질상에 고정된 경우에 비해 두 배 더 많은 분석물을 검정할 수 있는 이점이 있다.
또한, 이러한 유형의 측방 유동 검정 스트립은 반응 시약이 외부로 노출되지 않음으로써 장기간 저장이 가능하고 일정한 감도를 유지할 수 있는 이점을 제공한다.
도 10은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 검정 스트립의 측면도이다. 이 측방 유동 검정 스트립은 도 6에 도시된 측방 유동 검정 스트립의 상부에 얇고 투명한 재질의 폴리에스테르 필름을 적층한 것이다. 이와 같이 스트립의 상부에 폴리에스테르 필름을 적층함으로서 시험 시간 동안 발생하는 수분 증발로 인한 표지에 의한 배경 신호(background signal)의 증가를 억제시켜 줌으로서 보다 높은 감도를 유지할 수 있다. 또한, 스트립이 시험 중에 혹은 보관 중에 외부 환경에 노출되어 있음으로서 스트립의 상부에 적층된 폴리에스테르 필름에 의해 스트립의 상부는 공기중의 수분 및 오염 물질로부터 보호될 수가 있어 항상 일정한 질을 유지할 수 있다. 또한, 감도에 전혀 영향을 미치지 않는 아크릴 접착 테이프를 스트립의 상부에 접착시킬 수 있는데 이는 폴리에스테르 필름에 의해 얻을 수 있는 상기 효과에 추가하여 스트립의 지지대에 접착하고 있는 각 패드를 보다 견고하게 일체화하여 준다.
도 11은 본 발명에 따른 또 다른 양태로서의 측방 유동 검정 스트립의 측면도이다. 이 측방 유동 검정 스트립은 도 9에 도시된 측방 유동 검정 스트립의 상부에 얇고 투명한 재질의 폴리에스테르 필름을 적층하거나 아크릴 접착 테이프를 부착한 것으로서 도 9 및 도 10에 도시된 측방 유동 검정 스트립의 장점을 모두 제공할 수 있는 매우 바람직한 유형이다.
본 발명은, 표면형광의 세기를 측정하여 분석물을 정량하기 위하여, 레이저, 여기필터(exciter filter), 타원반사경 또는 구면경, 표면형광이 발광되는 시료 제어 수단, 공간필터, 평행광학계, 형광필터 및 광검출기로 구성되고, 이들 구성 요소들은 레이저로부터 조사된 빛이 여기필터를 통하여 시료 면에 적절한 크기로 집속되고, 이 집속점은 타원반사경의 제1초점에 위치하며, 이 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경에 반사하여 타원반사경의 제2초점으로서 공간필터로 집속되고, 공간필터를 통과한 빛은 평행광학계에 의해 평행광으로 변형된 뒤 형광필터를 지나면서 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분만이 광검출기로 입사하도록 배치되어 있음을 특징으로 하는 표면형광을 검출하기 위한 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 사용한다.
본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 사용되는 레이저는 대표적으로 He-Ne 레이저 및 다이오드 레이저가 포함된다. He-Ne 레이저의 예로는 National Research Laboratory of Metrology(NRLM), agency of Industrial Science and Technology(AIST), ministry of International Trade and Industry(MITI)에서 개발한 소형의 휴대용 정밀 요도드-안정화 He-Ne 레이저(Model NEO-92SI) 및 모델 05 LYR 173(캘리포니아 어어빈 소재 Melles Griot 제품)을 들 수 있다. 다이오드 레이저는 He-Ne 레이저보다 컴팩트하고 보다 정밀하며 적외선 또는 적색광 다이오드 레이저가 있다.
본 발명에서 사용되는 레이저 유발 표면형광 검출 장치는 상기한 바와 같이 레이저, 여기필터, 타원반사경 또는 구면경, 표면형광이 발광되는 시료 제어 수단, 공간필터, 평행광학계, 형광필터 및 광검출기로 구성되며 이러한 구성에 의한 표면형광의 포집 원리는 도 12 및 도 13을 참고로 하여 이하에서 구체적으로 설명될 것이다.
도 12는 본 발명에 따라 타원반사경의 제1초점에 집속된 입사광선과 시료를 배치하고 제2초점에 집속된 후 발산하는 형광을 평행광으로 가공하여 표면형광을 검출하는 장치를 보여준다. 레이저는 특정 형광단의 여기 밴드 최대치와 일치하는 파장을 방출한다. 한 가지 양태로서, 레이저(21)은 형광물질 표지 Alexa의 흡수 최대치에 근접하는 파장 594 nm에서 방출하는 2 mW He-Ne 레이저이다. 예를 들면, He-Ne 레이저 모델 05 LYR 173(캘리포니아 어어빈 소재 Melles Griot 제품)을 레이저로 사용할 수 있다. 레이저(21)의 빛은 입사필터(22)를 통과하고 입사필터와 시료제어 수단(24)사이에 배치되어 있는 타원반사경(23)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 이때 레이저의 빛이 입사필터(22)를 지나 타원반사경(23)의 구멍을 적절히 통과할 수 있도록 레이저, 입사필터와 타원반사경은 일렬로 나란히 배치되는 것이 바람직하다. 타원반사경을 통과한 빛은 시료 제어수단(24)에 고정되어 있는 시료 면에 적절한 크기로 집속된다. 시료는 빛이 최적으로 집속될 수 있도록 제어 수단에 의하여 위아래 혹은 전후(지면에 수직한 방향)로 이동하여 위치를 변경할 수 있다. 이 집속점은 타원반사경(23)의 제1초점에 위치하고 있다. 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경(23)에 의해 반사되어 타원거울의 제2초점으로서 공간필터(25)로 집속된다. 공간필터는 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈(noise)를 제거하는 작용을 한다. 공간필터를 통과한 빛은 평행광학계(collimator)(26)에 의하여 평행광으로 변형되고, 형성된 평행광은 형광필터(28)를 지나면서 산란광은 걸러지고 순수한 형광성분만이 광검출기(27)로 입사한다. 광검출기(27)로 입사된 형광은 이의 세기(fluorescence intensity)를 표시하는 신호(signals)로 컴퓨터(29)로 전송되어 분석 처리된다.
도 13은 본 발명에 따라 타원반사경 대신에 구면경을 사용하여 입사광이 집속된 시료의 형광을 구면경의 영상점에 집속시키고 이를 평행광으로 가공하여 표면형광을 검출하는 장치를 보여준다. 따라서, 도 13의 장치에 의해 시료의 표면형광을 검출하는 과정은 상기된 도 12의 장치와 동일하다. 레이저의 빛은 입사필터(32)를 통과하고 입사필터와 시료제어 수단(34)사이에 배치되어 있는 구면경(33)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 이때 레이저의 빛이 입사필터(32)를 지나 구면경(33)의 구멍을 적절히 통과할 수 있도록 레이저, 입사필터와 타원반사경은 일렬로 나란히 배치되는 것이 바람직하다. 타원반사경을 통과한 빛은 시료 제어수단(34)에 고정되어 있는 시료 면에 적절한 크기로 집속된다. 시료는 빛이 최적으로 집속될 수 있도록 제어 수단에 의하여 위아래 혹은 전후(지면에 수직한 방향)로 이동하여 위치를 변경할 수 있다. 이 집속점은 구면경(33)의 제1초점에 위치하고 있다. 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 구면경(33)에 의해 반사되어 타원거울의 제2초점으로서 공간필터(35)로 집속된다. 공간필터는 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈를 제거하는 작용을 한다. 공간필터를 통과한 빛은 평행광학계(36)에 의하여 평행광으로 변형되고, 형성된 평행광은 형광필터(38)를 지나면서 산란광은 걸러지고 순수한 형광성분만이 광검출기(37)로 입사한다. 광검출기(37)로 입사된 형광은 이의 세기를 표시하는 신호로 컴퓨터(39)로 전송되어 분석 처리된다.
본 발명에 따른 형광 검출 장치는 시료(24, 34) 면이 타원반사경(23) 또는구면경(33)의 오목 부분내에 위치함으로써 형광이 거의 전부 대기로 발산되지 않고 타원반사경(23) 또는 구면경(33)에 반사되므로 소실될 확률이 극히 낮다. 또한, 본 발명에 따른 형광 검출 장치는 평행광학계(26, 36)를 사용하기 때문에 타원반사경(23) 또는 구면경(33)을 통해 반사되는 형광이 평형광학계(26, 36)를 통해 평행광으로 변형되기 때문에 형광이 광검출기(27, 37)로 입사하는 과정에서 소실될 가능성은 매우 적다.
요컨대, 본 발명에 따른 레이저 유발 표면형광 검출 장치는 표면형광 포집시 렌즈 대신에 시료의 전방 표면을 완전히 덮는 반사경계를 사용하기 때문에 방출된 형광의 97% 이상이 반사경에서 검출기 쪽으로 반사된다(입사광이 들어오는 구멍에 의한 손실 제외). 이중 시료 및 시료 제어수단이 일부 반사광을 차폐하기 때문에 이로 인한 손실을 제외한 나머지는 모두 검출광학계에 도달한다. 반사경의 직경이 10cm, 시료 제어수단의 크기가 2 x 10cm인 경우 제어수단에 의한 손실율은 20% 수준이다(이 손실에는 입사광 인입구에 의한 반사형광 손실분도 포함된다). 따라서, 본 발명에서는 기존 렌즈식 형광 포집 장치가 가진 10% 미만의 형광 포집 효율을 80% 이상으로 향상시키는 효과를 기대할 수 있다. 당업자는 본 발명으로부터 시료 제어수단이 작을수록 형광 포집 효율이 높아질 수 있음을 이해할 것이다.
도 21은 본 발명의 한 양태로서의 시료 제어수단의 구성도를 도시한 것이다. 시료 받침대(41)(holder)는 이의 상부에서 시료(44)(스트립상에 마운팅된 상태)의 한쪽 면을 삽입하여 고정할 수 있도록 되어 있고 하부에는 톱니바퀴가 구비되어 이송수단(42)과 맞물려 있어 이송수단(42)이 모터의 구동에 의해 회전함에 따라 이송수단과 나란히 설치되어 있는 가이드를 따라 전후로 이동할 수 있다.
일반적으로 측정하고자 하는 물질의 혈액 중(마이크로시스틴은 환경물질이므로 혈액이 아니라 수질 내에 존재함) 컷오프는 다음의 표 2에 수록된 바와 같다.
표 2
마커 단위 컷오프
CEA ng/ml 〈5
AFP ng/ml 〈15
PSA ng/ml 〈4
B2M ng/ml 〈2
NSE ng/ml 〈15
CYFRA21-1 ng/ml 〈3.5
마이오글로빈 ng/ml 〈70
CK-MB ng/ml 〈3
cTnI ng/ml 〈1
cTnT pg/ml 〈60
BNP pg/ml 〈100
마이크로시스틴 pg/ml 〈300
본 발명에 따른 추가의 양태로서 pg/ml까지 측정가능한 분석물로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하기 표 3에 수록된 바와 같다.
표 3
분석물 단위 컷오프
ACTH pg/ml 200-250
아드레노메듈린 pg/ml 480±135pg/ml
ANP pg/ml 73pg/ml
안지오텐신 II pg/ml 21±4pg/ml
칼시토닌 pg/ml 10pg/ml
CNP pg/ml 7.36±3.0pg/ml
엔돌핀 pg/ml 30±5pg/ml
가스트린 pg/ml 26.4±8.4pg/ml
그렐린 pg/ml 87.79±10.27pg/ml
NPY pg/ml 70.7±5.9pg/ml
췌장 폴리펩타이드 pg/ml 218±23pg/ml
우로텐신 II pg/ml 7.70±0.97pg/ml
본 발명에 따른 레이저 유발 표면형광 검출 장치는 분석물의 최저 검출 한계 농도가 pg/ml까지 측정되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 이하 실시예를 통해 좀더 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 단지 예시하는 것으로 이해되어야 하며 본 발명을 이들 실시예로 한정되어서는 안된다.
실시예 1
탐지자 및 포획자로 사용하기 위한 모노클로날 항체의 제조 방법
(1) 배양액의 준비
둘베코 변형 이글 배지(Dulecco's modified Eagle's media, DMEM) 분말을 900ml의 DDW에 녹이고 형성된 용액에 3.7g의 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)을 가한 다음 pH를 6.9로 조정하였다. 이 배양액을 0.45㎛ 크기의 필터를 사용하여 무균화시키고 이 용액을 불완전(incomplete) DMEM이라 하며 450ml의 불완전 DMEM에 10%가 되도록 송아지 혈청(Bovine Calf Serum)과 항생제 페니실린과 스트렙토마이신(penicillin - streptomycin)을 첨가하여 완전(complete) DMEM으로 만들었다. 이 완전 DMEM에 5ml의 100X HT을 첨가하여 HT(하이포크산틴+티미딘) 배양액, 5ml의 100X HAT(하이포크산틴+아미노프테린+티미딘)을 첨가하여 HAT 배양액을 준비하였다.
(2) 항원 준비와 주사
처음 주사할 경우 정제된 효소 단백질 용액(50㎍)에 같은 부피(주로 0.3ml)의 완전 프로인드 보조제(Complete Freund's Adjuvant)를 넣고 30초 동안 음파처리(sonication)한 후 이 용액을 BALB/c 생쥐에 각각 0.4ml씩 주사하였다. 첫 번째 주사 후 3주 경과하여 단백질 용액을 불완전 프로인드 보조제(Incomplete Freund's Adjuvant)와 섞은 후 주사하는 데 이 추가접종(booster injection)을 2 또는 3차례 반복하고 최종 면역시에는 세포 융합 실험 3 내지 4일 전에 보조제 없이 단백질만 주사하였다. 실험에 사용되는 생쥐는 암수 구별 없이 모두 생후 6 내지 8주정도 되는 BALB/c를 사용한다.
(3) 지지세포(Feeder Cell)의 준비
지지세포는 융합 실험하기 하루나 이틀 전에 준비하는 데 생후 10주 이상 된 생쥐를 치사시킨 후 복부 껍질을 아주 조심스럽게 벗기고 5ml의 11.6% 설탕용액을 복강 속으로 주사하였다. 1 내지 2분 후 주사기를 사용하여 복강 내의 주사된 설탕용액 3ml이상을 회수하여 원심분리(2,000rpm, 3분)한 후 지지세포를 30ml의 HAT 배양액에 녹인 다음 5개의 96웰 평판에 한 방울씩 분주하였다. 만약 생쥐가 작으면 두 마리로부터 복강 세포를 채취하였고, 만약 적혈구가 들어있을 경우 다시 준비하였다.
(4) 지라세포의 준비
항원을 면역시킨 쥐를 치사시킨 후 지라를 무균 상태에서 취한 다음 10ml의불완전 DMEM이 들어있는 배양접시에 옮긴 후 가는 핀셋을 사용하여 조직을 파쇄하고 지라 세포를 배양액내로 방출시켰다. 이 세포들을 15ml 튜브로 옮겨 큰 조직이나 파쇄되지 않은 세포들을 2분 동안 가라앉힌 후 윗부분에서 5ml을 다시 채취하였다. 이를 원심 분리하여 모은 다음 상등액을 제거하고 준비된 골수종 세포(myeloma)와 합치기 위해 3ml의 불완전 DMEM에 녹여 놓았다. 한번 세포융합 실험을 하기 위해 3×107개의 지라세포를 준비하였다.
(5) 골수종 세포의 준비
세포융합 실험 5일전 질소탱크에 얼려져 있던 SP2/O Ag14 세포를 꺼내어 녹인 후 완전 DMEM을 매우 천천히 첨가하여 회복시켰다. 이를 원심분리하여 가라앉은 세포를 다시 10ml의 완전 DMEM에 녹여 37℃ CO2배양기에서 이틀 간격으로 계대 배양하였다. 세포융합 실험 때까지 5×107개의 골수종 세포를 준비하여 이를 사용하였다.
(6) 세포융합
준비된 지라세포와 골수종 세포를 섞고 원심분리(2,000rpm, 3분)하여 얻은 세포에 20ml의 불완전 DMEM을 첨가하여 한번 씻고 상등액을 완전히 제거하였다. 이후의 세포융합 반응은 손으로 감싸 37℃를 유지해주면서 실시하는데 밑부분에 가라앉은 세포들은 손가락으로 튜브를 치면서 완전히 부수고 1ml의 50% PEG용액을 한 방울씩 천천히 1분동안 가하고 90초 동안 흔들어 세포융합 과정을 실시하였다. 정확하게 첫 PEG(폴리에틸렌글리콜)용액 방울을 넣기 시작한 후 2분30초 후에 불완전DMEM을 첨가하면서 정지시키는데 PEG용액에 의해 세포막이 입을 수 있는 삼투압 충격을 막기 위해서 처음 1ml의 불완전 DMEM은 1분 동안에, 다음 2ml을 1분 그리고 다음 3ml을 1분 등의 방법으로 전체 20ml의 불완전 DMEM을 서서히 튜브에 첨가하였다. 이런 방식으로 융합된 세포들을 원심분리시키고 20ml의 HAT 배양액을 가해 남아있는 PEG를 씻어준 후 얻은 세포들을 65ml의 HAT배양액에 녹여 한 방울씩 지지세포가 들어있는 96웰 평판에 두 방울씩 분주하여 37℃, CO2배양기에서 배양하였다. 세포융합 후 3일째에 세 방울의 HT 배양액을 각 웰에 새로 첨가하고 다시 3일 간격으로 새로운 HT 배양액으로 갈아주면서 세포의 성장을 현미경으로 확인하였다. 대개 융합 4일 후면 하이브로도마 콜로니가 보이기 시작하고 7일경부터 하이브리도마 스크리닝을 시작하였다. 배양 상등액 200㎕를 400㎕의 PBS가 담긴 24웰 평판으로 옮긴 다음 ELISA 방법에서 양성 반응을 보이는 웰의 세포를 1ml의 HT 배양액이 들어있는 새로운 24웰 평판으로 옮겨 3 내지 4일 더 배양하였다. 이 배양액 500㎕를 2ml의 PBS가 들어 있는 15ml 튜브에 넣어 웨스턴 블롯 분석(western blot)을 통해 다시 양성 반응을 보이는 세포를 5ml의 HT배양액이 담긴 6웰 평판으로 옮겨 성장시킨 후 신속하게 얼리고 하이브리도마 세포주를 클로닝하는 방법으로 제한 희석(limiting dilution)을 실시하였다.
(7) 하이브리도마 세포의 동결 방법
10ml의 배양 플라스크에서 단층으로(confluent) 자란 세포를 원심분리하여 얻은 후 가라앉은 세포들을 1ml의 동결 배지(Freezing Media)(90% 송아지 혈청, 10% DMSO)에 녹인 후 동결 바이알에 넣고 스티로폼(styrofoam) 상자에 담아 -70℃에서 서서히 온도가 떨어지게 하였다. 2시간이 지난 후 빠르게 액체질소 탱크로 옮겨 보관하는데 이곳에서 거의 영구적으로 보관할 수 있다.
(8) 하이브리도마 세포의 제한 희석
하나의 에피토프에 반응하는 항체를 만들어 내는 세포를 골라내기 위해 제한 희석 방법을 수행하였다. 먼저, 로그 단계(log phase)에서 자라고 있는 하이브리도마 세포의 숫자를 너이바우어 세포 계수기(Neubauer Cell Counter)로 계산한 다음 연속 희석으로 1ml당 15개 세포가 포함될 수 있게, 즉 한 방울에 하나의 세포가 들어가게 한 다음 하루나 이틀 전에 준비된 지지세포가 담긴 96웰 평판에 한 방울씩 옮겼다. 3일 마다 배양액을 계속 갈아주고 5일째 역상 현미경(inverted microscope)으로 관찰하여 단일 콜로니가 보이는 웰을 표시하였다. 이후, 14일째 24웰로 옮겨 계속 배양한 다음 ELISA를 통해 탐색한 후 원하는 항체를 만들어내는 하이브리도마 세포를 취해 얼려 보관하였다.
(9) 복수액(Ascites fluid)의 생성
다량의 단일 클론항체가 필요할 경우 500㎕의 프리스탄(pristane)을 미리 주사한 BALB/c 생쥐에 9일이 경과한 후 원하는 항체를 만들어내는 하이브리도마 세포를 1×107개정도 주사하였다. 이후 10 내지 15일 후 적당하게 복부가 비대해진 생쥐를 마취시키거나 치사시킨 후 주사기를 사용하여 복수를 채취하고 원심분리(4℃, 15,000rpm, 10분)하여 세포와 조직을 제거하고 이 상등액을 나누어 -70℃에서 얼려 보관하고 이후 프로테인 A 컬럼(Protein A column)을 이용하여 복수에 포함되어 있는 IgG를 분리하였다.
(10) 각 분석물에 대한 모노클로날 항체의 비교
PSA Free PSA AFP CEA
항원원 정액(a) 정액(a) 양수(b) 사람 체액(c)
포획항체 32c5(IgG2a) 83c1(IgG1) 15c3(IgG2a) 34(IgG1)
탐지항체 1c1(IgG2a) 1c1(IgG2a) 20c4(IgG1) 17(IgG2a)
피복완충액 인산염 완충액(0.1M, pH 7.4) 트리스 완충액(0.15M, pH8.0) 보락스(Borax) 완충액(0.2M. pH 8.3) 탄산염 완충액(0.5M, pH 9.5)
표지완충액 PBS PBS PBS PBS
(a) Scripps로부터 입수
(b) RDI로부터 입수
(c) Biodesign으로부터 입수
실시예 2
단백질-형광물질 결합체 제조
측정하고자 하는 분석물에 대한 마우스 단일클론 항체에 신호 발생원인 형광물질을 다음과 같은 방법으로 중합하여 시험에 사용하였다. 형광물질 결합에 사용될 단백질은 95% 이상의 고순도로 정제된 것을 사용하였으며, 농도는 1mg/ml 이상의 농도가 좋은 결합비율을 보여 주었다. 형광물질과의 반응을 용이하게 하기 위하여 정제된 단백질을 암모니아와 아민이온이 들어 있지 않은 완충용액(0.1M 중탄산나트륨, pH 8.5)으로 4℃ 냉장실에서 12-24시간 동안 투석하였다. 투석된 단백질은사용하기 전까지 -20℃이하 냉동고에 보관하였다. 완충용액에서 투석된 단백질에 분말로 된 Alexa 647 형광물질(Molecular Probes, USA)을 직접 첨가하여 천천히 섞어 준 후 4℃ 냉장고에서 1-2시간 동안 교반기를 사용하여 반응시켰다.
실시예 3
단백질-형광물질 결합체의 정제
세파덱스(Sephadex) G-25를 충전한 분배 컬럼을 사용하여 단백질-형광물질 중합체와 반응하지 않고 남아있는 여분의 형광물질을 제거하였으며, 정제 완충용액은 0.1M 중탄산나트륨(pH 8.5)를 사용하였다. 정제된 단백질-형광물질 중합체는 사용하기 전까지 냉장 또는 -20℃이하 냉동고에 보관하였다.
실시예 4
니트로셀룰로스 막의 단백질 고정화
주사기 펌프에 연결된 미세 분주기(Biodot Dispenser)를 이용하여 단백질을 가는 선의 형태로 농도와 분주량을 달리하여 니트로셀룰로스 막위에 분주하였다. 분주한 이후에 온도는 25℃, 습도는 35~50%로 유지되는 제습 장치 안에서 2시간 동안 분주된 단백질을 고정화하였다. 이어 단백질의 안정화와 반응물 사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 1% 수크로즈,0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다. 위의 안정액 성분중에서 BSA는 젤라틴으로 트윈 20은 트리톤 X-100으로 수크로즈는 트레할로즈(trehalose)로 PVA(폴리비닐알코올)는 PEG 또는 PVP(폴리비닐피롤리돈)로 각각 대체하여 사용할 수도 있다. 처리된 막 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 건조된 막은 마찬가지로 25℃, RH 35 내지 50%가 유지되는 보관용기 안에서 사용 전까지 보관하였다.
실시예 5
샘플패드의 전처리
니트로셀룰로스 막을 통한 용액 성분들의 이동을 용이하게 하며, 또한 반응의 감도를 유지하고 단백질-형광물질 중합체와 시료 사이의 비특이적 반응에 의한 시험결과의 오류를 막기 위하여 샘플패드를 전처리 하였다.
샘플패드(2.5 X 30 cm)를 전처리 용액(20mM 트리스-Cl, 0.1% 트리톤 X-100, 0.05% NaN3,pH 8.5)에 1mL씩 충분히 적셔 10분간 평형화시켰다. 전혈을 시료로 사용할 경우에는 다른 전처리 용액(PBS, 10mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.05% NaN3, pH 7.4)을 사용하여 적혈구 용혈현상을 방지하였다. 이어 샘플패드의 과도한 용액을 제거하고 열에 의한 샘플패드의 변형을 막기 위해 50℃ 내지 60℃의 온도에서 1시간 동안 진공 건조하였다. 단백질-형광물질 결합체의 변성을 최소화하기 위하여 동결건조방법을 택하였다. 준비된 패드는 위의 막과 동일한 조건의 보관용기에서 사용하기 전까지 보관하였다.
실시예 6
결합체 방출 패드 제조
검출하고자 하는 물질의 탐지자인 단백질-형광물질 결합체를 유리섬유질의 패드에 고정화하여 검출과정을 원스텝으로 단순화하였다.
단백질-형광물질 결합체를 희석용 완충용액(PBS, 0.1% 젤라틴, 0.1% 트윈 20, pH 7.4)에 1/1000, 1/500, 1/100의 비율로 각각 희석하였다. 위의 혼합물은 유리섬유에 충분히 적셔 5분 동안 상온에서 평형화시킨 후 건조하는 것이 일반적인 방법이지만, 혼합물이 유리섬유의 표면에서 불균등하게 재분배되는 현상을 막고 소요되는 혼합물의 양을 줄이기 위해, 적시는 방법 대신 미세 분주기를 사용하여 10, 15, 20ul/cm의 양으로 각각 분주하였다. 결합체 방출 패드(단백질-형광물질 결합체 패드)는 세 가지 방법으로 건조하였다. 첫째, 단백질 성분의 안정성을 고려하여 40℃ 이하의 온도로 6시간 동안 진공 건조 시켰고, 둘째, 제습 장치안에서 16시간 동안 실온 건조하였다. 세 번째는 첫번째 방법보다는 다소 시간이 걸리지만, 단백질 성분의 불활성 가능성을 더욱 줄이고자 동결건조방법을 택하였다. 준비된 결합체 패드는 위의 막과 동일한 조건의 보관용기에서 사용하기 전까지 보관하였다.
실시예 7
NC(니트로셀룰로즈) 막 위에 단백질 분주
고정하고자 하는 각각의 단백질을 PBS 완충액에 1, 2mg/ml로 희석하고 분주기(Bio Dot dispenser)를 사용하여 0.88uL/cm의 양으로 선의 폭을 0.8mm가 되도록 NC 막 위에 분주한 후, RH 35~50%에서 2시간 동안 고정화하였다. 이어 단백질의 안정화와 반응물 사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다(위의 안정액 성분 중 BSA는 젤라틴으로, 트윈 20은 트리톤 X-100으로, 수크로즈는 트레할로즈로, PVA는 PEG 나 PVP로 각각 대체하여 사용할 수도 있다). 처리된 막은 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 시험에 사용할 막은 샘플패드와 흡수패드 등을 포개어 붙인 후 절단기를 사용하여 4mm 폭으로 잘라 최종 스트립의 크기가 4×60mm이 되도록 하였다.
실시예 8
분석물의 정량(단일 시험선)
NC막의 시험선 구역에는 분석하고자 하는 PSA(전립선 특이 항원)에 대한 포획 항체(1 mg/ml)를, 표준선에는 토끼 IgG(1 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.01 mg/ml)를 각각 0.88 ㎕/cm의 양으로 분주하였다. 분주된 막은 RH 35~50%에서 2시간동안 고정화하였다. 이어 단백질의 안정화와 반응물 사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다. 처리된 막은 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 분석하고자 하는 단백질과 항원-항체 반응을 통해 반응하는 물질을 Alexa 647로 형광 표지하였다. 또한 표준선에 분주된 단백질과 항원-항체반응을 통해 결합하는 항체를 Alexa 647로 형광표지하였다. 단백질-형광물질 결합체를 희석용 완충용액(PBS, 0.1% 젤라틴, 0.1% 트윈 20, pH 7.4)에 1/100의 비율로 희석하였다. 이 혼합액에 안정화물질인 5% 트레할로즈를 첨가하고 분주기를 사용하여 유리질 섬유표면에 20 ㎕/cm의 양으로 분주한 후, 단백질-형광물질 결합체 패드는 동결 건조하였다. 준비된 NC막과 결합체 방출 패드는 샘플패드 및 흡수패드와 함께 지지대 위에 고정되어 플라스틱 하우징에 조립되었다. PSA 표준용액은 희석 완충액(PBST, 10 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 0.3% 트윈 20, pH 7.4)으로 희석하여 0, 4, 8, 16, 32 ng/ml이 되게 준비하였다. 제조된 표준용액은 PSA ELISA 키트를 사용하여 농도를 재확인하였다. 표준선에 분주된 단백질의 경우, 위에서 준비된 각각의 표준용액을 검정키트의 검체투입구에 적하하고 10분 뒤에 본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치의 투입구에 주입하였다. 이 장치는 주입된 검정키트의 시험선과 표준선 위에 적층된 탐지자-분석물-포획자 결합체의 형광양의 피크로 표시하고 그 양을 모니터 상에 출력하도록 설계되었다. 분석물의 8 ng/ml PSA와 유사한 피크를 갖는 토끼 IgG의 양(0.1 mg/ml)을 표준선에 분주할 양으로 결정하였다. 위의 표준선 농도결정이 끝나면, 동일한 방법으로 각각의 PSA 표준물질을 검정키트에 적하하였다. 10분 후, 시험선과 표준선위에 적층된 형광양의 비율은 다항회귀법을 통하여 유추된 식에 대입되고 결과적으로 분석물의 형광양은 수치값으로 전환되어 검출 장치의 화면상에 출력되었다.
실시예 9
총/유리 PSA의 정량
총 PSA와 유리 PSA에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체(1 mg/ml)를 NC 막 위에 0.88 ㎕/cm의 양이 되도록 분주하여 고정시켰다. 고정화된 포획항체와는 다른 항원결정기를 갖는 모노클로날 항체를 Alexa 647 형광 물질과 결합시켜, 탐지자로 사용될 항체-형광물질 결합체를 준비하였다. 이를 안정화 물질인 트레할로즈 5%, 젤라틴 1%가 포함된 PBS 완충액과 혼합하여 1/100으로 희석시켜, 50 ㎕/cm2의 양으로 유리질 섬유에 적신 후 동결 건조하여 항체-형광물질 결합체 패드를 제조하였다. PSA 표준용액은 희석 완충액(PBST, 10mM 포스페이트, 150mM NaCl, 0.3% 트윈 20, pH 7.4)으로 희석하여 0, 4, 8, 16, 32 ng/ml이 되게 준비하였다. 제조된 표준용액은 PSA ELISA 키트를 사용하여 농도를 재확인하였다. 각 농도의 표준용액을 검사 스트립의 샘플 투입부에 첨가하고, 15분 후에 본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치를 사용하여 각 시험 구역(test zone; 총 PSA, 유리 PSA의 두 구역)의 형광의 세기를 측정하여 정량 분석하였다. 표준용액이 아닌 실검체인 혈청 혹은 전혈의 경우, 먼저 PSA ELISA 키트로 농도를 확인한 후, 검체를 검사 스트립에 첨가하여 레이저 유발 형광 검출 장치로 총 PSA 및 유리 PSA의 양을 정량 분석하였다. 이의 결과는 각각 도 19 및 도 20에 나타나 있다.
실시예 10
AFP, CEA, PSA, CRP의 정량 (다수 시험선)
α-펩토프로테인(Alpha Feto Protein, AFP, 간암의 지표 물질), 암태아성 항원(Carcinoembryonic Antigen, CEA, 많은 종류의 암 표지자이나 주로 대장암에 사용), 대사물질 조절 단백질(Catabolite Regulatory Protein, CRP), PSA와 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 한 쌍씩 제작하였다. 고정화될 항체는 NC 막 위에 0.88 ㎕/cm씩 크로마토그래피 매질의 한쪽 말단으로부터 2mm 간격을 두고 차례로 분주하였다. 표준선에는 시험선의 상단과 하단 끝으로부터 2mm 간격을 두고 100 ug/ml의 농도로 분주하였다. 분주된 막은 RH 35~50%에서 2시간 동안 고정화하였다. 이어 단백질의 안정화와 반응물사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다. 처리된 막은 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 위의 고정화된 항체와는 다른 항원 결정기를 갖는 모노클로날 항체는 형광물질과 결합시켜 탐지자로 사용하였다. 총/유리 전립선 특이 항원의 정량 방법과 동일하게 각각의 중합체를 완충액(트레할로즈 5%, 젤라틴 1%가 포함된 PBS, pH 7.4)으로 희석하여(PSA: 1/100, AFP: 1/200, CEA: 1/150, CRP: 1/100) 50㎕/cm2의 양으로 유리질 섬유에 적신 후 동결 건조하여 항체-형광물질 결합체 패드를 제조하였다. 각각의 항목에 대하여 ELISA 키트로 농도가 확인된 검체를 희석 완충액(10mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 0.3% 트윈 20, pH 7.4)과 혼합하여 검사 스트립에 적용한 다음, 10분 후에 본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치로 각각의 테스터 구역에서의 형광의 세기를 측정하여 정량 분석하였다. 이의 결과는 도 16에 나타나 있다.
실시예 11
형광물질 표지된 항원 또는 항체의 제조
여러 종류의 형광물질을 항원과 항체에 결합하여 비교 분석하였다. FITC(fluorescein-isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 그리고 Alexa, Cy3, Cy5 (Molecular Probes, Inc)등을 항원과 항체에 결합시켜 시험을 수행한 결과, Alexa시리즈와 Cy3 & 5 형광물질이 안정성과 재현성 면에서 좋은 결과를 보였다. 차후의 실험은 Alexa 647을 기본형광물질로 하여 진행되었다. 결합된 형광-항원/항체 결합체는 안정적인 반응성을 보였으며 상당 기간이 지나도 표백효과 없이 사용할 수 있었다.
실시예 12
단백질-형광물질 결합체의 농도 및 니트로셀룰로스 막 위의 고정 단백질의 농도 결정
측정하고자 하는 물질을 검출하는데 필요한 탐지자 및 포획단백질의 적정 농도를 결정하기 위해 연속 희석 실험을 수행하였다. 단백질의 농도를 달리해서 포획단백질을 NC 막 위에 고착한 후, 단백질-형광물질 결합체의 농도를 연속 희석하여 준비하였다. 각 검출물질의 표준용액을 단백질-형광물질 결합체와 혼합하여 섞은 후 검사 스트립에 적용하여 본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치로 분석하였다. 고정된 단백질의 농도는 각각의 측정항목에 따라서 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2 mg/ml로 하였으며, 분주량은 0.88 ul/cm로 하였다. 포획단백질의 농도가 일정한 상태에서 단백질-형광물질 결합체의 농도를 감소 또는 증가시켰을 경우에는 동일 농도의 측정물질에 대한 형광 신호의 세기가 감소 또는 증가하였다. 반대로, 단백질 형광물질 결합체의 농도를 일정하게 하고 포획단백질의 농도를 변화시켰을 때에도 동일한 결과를 보였다. 두 실험 모두에서 농도가 어느 한계를 넘어 증가될 경우에는 비특이적 반응이 증가하였다. 위의 결과를 종합하여 측정하고자 하는 물질의 검출한계를 최저로 낮추면서도 시료물질과 포획 및 탐지자 사이의 비특이적 반응을 최소화시키는 조건의 농도를 결정하였다.
실시예 13
분석물의 최저 검출 한계 및 직선성
실시예 12에서 결정된 적정농도의 PSA 단일클론 항체를 0.88 ㎕/cm의 양으로 NC 막에 분주하고 위의 방법에 따라 제조된 스트립에 실시예 12에서 결정된 값으로희석된 항체-형광물질 결합체를 완충액(트레할로즈 5%, 젤라틴 1%가 포함된 PBS, pH 7.4)에 혼합한 후 20 ㎕/cm의 양으로 유리질 섬유에 분주한 후 동결 건조하여 항체-형광물질 결합체 패드를 제조하였다. 이어 1 mg/ml 내지 1 pg/ml까지 농도를 달리한 PSA 표준물질을 첨가하여 분석물의 최저검출한계 및 검정키트의 직선성 범위를 형광분석기를 사용하여 결정하였다. 도 14에서 보는 바와 같이 PSA의 경우 최저검출한계는 10 pg/ml이었고 PSA 검정키트의 직선성은 10 pg/ml 내지 1 ug/ml까지의 상당히 넓은 범위를 보였다. 실시예 10의 AFP, CEA, CRP의 최저 검출한계 역시 진단에서 필요로 하는 컷오프 값보다 훨씬 낮은 값을 측정할 수 있었다.
실시예 14
본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치와 대조를 위해 종래의 레이저 유발 형광 검출 스캐너 Scan Life(GSI 제품)를 사용하여 형광을 측정하고 형광 세기를 서로 비교하였다.
분석물 PSA를 각각의 농도 별로 준비하여 단백질 형광물질과 혼합하여 섞은 후 실시예 7에서와 같이 스트립에 적용하여 상기 종래의 스캐너로 이미지화하였다. 동일한 방법 및 조건으로 제조된 측방 유동 검정 스트립을 본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치로 이미지화하였다. 이미지화된 데이터는 관련된 프로그램을 사용하여 수치화 하였다. 이의 결과는 도 15에 기록되어 있다. 도 15의 기록으로부터, 본 발명에 따른 레이저 유발 형광 검출 장치와 종래의 형광 검출 스캐너 모두 분석물의 농도에 따라서 증가된 형광 세기를 보였으나, 같은 분석물에 대해 본 발명에 따른 레이저 유발 형광 검출 장치를 이용하여 측정된 형광 세기는 종래의 형광 검출 스캐너를 이용하여 측정된 형광 세기에 비하여 현저히 높음을 알 수 있다.
실시예 15
표준선(internal standard)의 위치에 따른 시험
스트립상에서 표준선의 위치를 결정하기 위하여 시험선의 전방과 후방 또한 전후방에 위치하도록 스트립을 제조하였다. 표준선의 위치에 따라서 제조된 스트립을 농도 별로 각각의 스트립에 10회 반복하여 실험을 수행하였다. 실험 방법은 각각의 농도 별로 제조된 검출 물질의 표준 용액을 단백질-형광 물질 결합체와 혼합하여 섞은 후 검사 스트립에 적용하여 본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치로 분석하였다. 분석된 실험 결과를 아래의 표 3으로 작성하였으며 각각의 스트립의 차이는 분석 값에 대한 오차범위로 비교하였다. 각각 스트립의 오차 범위는 허용 오차 범위를 벗어나지는 않았지만 표준선의 위치가 전방에 위치하거나 또는 전후방에 위치하였을 때 보다 더 정확한 값을 재현 할 수 있는 것으로 나타났다.
이와 같은 결과로 표준선의 위치는 시험선의 전방 또는 후방 그리고 전후방에 어느 부위에 위치하더라도 허용 오차범위를 벗어나지는 않으나 보다 더 정확하고 재현성 있는 실험 결과를 위해서는 전방이나 전후방에 위치하는 것이 바람직한 것으로 결정하였다.
표 3.
40 pg/ml 400 pg/ml 4 ng/ml
전 방 40.2±4 403.6±12 4.01±0.2
후 방 41.3±6 405.2±35 4.09±0.4
전후방 40.2±3 403.6±11 4.01±0.1
실시예 16
NC(니트로셀룰로즈) 막 위에 아비딘 분주
고정하고자 하는 아비딘을 PBS 완충액에 1 또는 2 mg/ml로 희석하고 분주기(Bio Dot Dispenser)를 사용하여 0.88 uL/cm의 양으로 선의 폭을 0.8mm가 되도록 NC 막 위에 분주한 후, RH 35~50%에서 2시간 동안 고정화하였다. 이어서, 단백질의 안정화와 반응물 사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다(위의 안정액 성분 중 BSA는 젤라틴으로, 트윈 20은 트리톤 X-100으로, 수크로즈는 트레할로즈로, PVA는 PEG 나 PVP로 각각 대체하여 사용할 수도 있다). 처리된 막은 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 시험에 사용할 막은 샘플패드와 흡수패드 등을 포개어 붙인 후 절단기를 사용하여 4mm 폭으로 잘라 최종 스트립의 크기가 4×60mm이 되도록 하였다.
실시예 17
아비딘-바이오틴을 이용한 분석물의 정량(단일 시험선)
NC막의 시험선 구역에는 아비딘(1 mg/ml)을, 표준선에는 토끼 IgG(0.1 mg/ml)를 각각 0.88 ㎕/cm의 양으로 분주하였다. 분주된 막은 RH 35~50%에서 2시간 동안 고정화하였다. 이어서, 단백질의 안정화와 반응물사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다. 처리된 막은 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 분석하고자 하는 단백질과 항원-항체 반응을 통해 반응하는 물질을 Alexa 647로 형광 표지하였고, 기존에 분석하고자 하는 물질을 포획하던 단백질에는 바이오틴을 결합시켰다. 또한, 표준선에 분주된 단백질과 항원-항체반응을 통해 결합하는 항체를 Alexa 647로 형광표지하였다. 단백질-형광물질 결합체와 단백질-바이오틴 결합체를 희석용 완충용액(PBS, 0.1% 젤라틴, 0.1% 트윈 20, pH 7.4)에 1/100의 비율로 희석하였다. 준비된 NC막과 샘플패드는 흡수패드와 함께 지지대 위에 고정되어 최종 스트립의 크기가 4×60mm가 되도록 잘라서 플라스틱 하우징에 조립하였다. PSA 표준용액은 희석 완충액(PBST, 10 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 0.3% 트윈 20, pH 7.4)으로 희석하여 0, 4, 8, 20, 40 ng/ml이 되게 준비하였다. 제조된 표준용액은 PSA ELISA 키트를 사용하여 농도를 재확인하였다. 위에서 준비된 각각의 표준용액과 단백질-형광 결합체 및 단백질-바이오틴 결합체, 표준선의 물질을 인식하는 단백질-형광 결합체를 본 발명의 패키지에 포함된 스트립에 적하하고 10분 뒤에 레이저 유발 형광 검출 장치의 투입구로 스트립이 전달되도록 하였다. 이 장치는 스트립의 시험선위에 적층된 탐지자-분석물-포획자 결합체의 형광양과 표준선 위에 적층된 단백질-형광 결합체의 형광양의 피크로 표시하고, 시험선과 표준선에 적층된 형광양의 비율은 다항회귀법을 통하여 유추된 식에 대입되고 결과적으로 분석물의 형광양은 수치값으로 전환되어 검출 장치의 화면상에 출력되었다. 이의 결과는 도 17에 나타나 있다. 선 A는 상기와 같이 아비딘-바이오틴을 이용하여 정량한 결과이고 선 B는 대조구로서 동일한 조건으로 하고 단지 아비딘-바이오틴을 사용하지 않고 기존 방법에 따라 정량한 결과이다. 도 17의 결과로부터 아비딘-바이오틴을 이용하는 경우 보다 더 높은 감도를 얻을 수 있고 또한 재현성도 우수하다는 것을 알 수 있다.
본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립은 다수 종류의 분석물을 동시에 고감도로 정량할 수 있으므로 산업적으로, 특히 의학적으로 매우 유용할 것으로 기대된다.

Claims (27)

  1. 크로마토그래피 매질상의 한쪽 말단에 분석물이 함유된 것으로 예상되는 액체 시료를 적하하여 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 이동되도록 하고, 액체 시료중의 분석물은 액체 시료가 적하된 구획으로부터 크로마토그래피 매질을 따라 전개하는 방향으로 일정한 간격을 두고 위치한 구획에 흡착되어 있는 표지된 탐지자와 반응하여 분석물-표지된 탐지자의 결합체를 형성하며, 분석물-표지된 탐지자의 결합체는 크로마토그래피 매질을 통해 이동하면서 상기 탐지자와 동일하거나 상이하며 비표지되어 상기 크로마토그래피 매질상의 중간 정도 위치에 설정된 검사창에 고정된 포획자와 반응함으로써 표지된 탐지자와 비표지된 포획자 사이에 분석물이 샌드위치로 포획되어 형성된 표지된 탐지자-분석물-비표지된 포획자의 복합체를 형성하고, 이에 따라 형성된 복합체의 양을 측정하여 시료중의 분석물을 결정하는 측방 유동 정량 검정 방법에 있어서,
    (a) 상기 표지된 탐지자는 형광물질로 표지되어 액체 시료중의 분석물과 반응하여 형광물질 표지된 탐지자-분석물의 결합체를 형성하고; (b) 비표지된 포획자는 크로마토그래피 매질상의 검사창에 선으로 분주되어 크로마토그래피 매질을 따라 이동해 온 상기 결합체와 반응하여 형광물질 표지된 탐지자-분석물-비표지된 포획자의 복합체를 형성하고; (c) 상기 형광물질 표지된 탐지자가 흡착되어 있는 크로마토그래피 매질상에, 상기 탐지자와 동일한 형광물질로 표지되고 상기 탐지자 및 포획자와 상이하며 액체 시료중의 표준물과 반응하는 표준 탐지자가 함께 흡착되어 있으며, 크로마토그래피 매질상의 검사창을 기준으로 전방 또는 후방에, 상기 형광물질 표지된 표준 탐지자와 반응하는 비표지된 표준 포획자가 표준선으로서 단일 선으로 분주 고정되거나 전후방 모두에 각각 단일 선으로 분주 고정되어 있어 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 이동하면서 형광물질 표지된 표준 탐지자-표준물-비표지된 표준 포획자의 표준 복합체를 형성하며; (d) 상기 복합체 및 표준 복합체의 표면형광 매질에 레이저로부터 입사하고 여기필터에 통과한 빛을 조사하여 이로부터 반사된 빛을 적절한 크기로 타원반사경 또는 구면경의 제1초점에 집속시키고, 타원반사경의 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경에 반사하여 타원반사경의 제2초점으로 집속시키며, 이와같이 집속된 광은 다시 평행광학계에 의하여 평행광으로 변환되며, 이 평행광을 형광필터에 통과시켜 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분만 광검출기로 입사시켜 상기 복합체의 형광 양을 상기 표준 복합체가 나타내는 표준 형광 양에 대하여 상대적으로 비교하여 분석물의 양을 결정함을 특징으로 하는 측방 유동 정량 검정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분석물의 컷오프 값이 pg/ml임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 분석물이 CEA, PSA, B2M, CYFRA21-1, CK-MB, cTnI, cTNT, BNP, ACTH, 아드레노메듈린, ANP, 안지오텐신 II, 칼시토닌, CNP, 엔돌핀, 가스트린, NPY, 췌장 폴리펩타이드, 우로텐신 II 및 마이크로시스틴으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  4. 제1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지자가 4 종류 이상이고 이에 따라 탐지자의 종류와 동일한 수의 포획자가 동일한 수의 선으로 검사창에 분주 고정되어 4 종류 이상의 분석물을 동시에 정량할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 비표지된 표준 포획자가 고정된 표준선이 검사창의 전방에 단일 선으로 위치하거나 전후방 모두에 각각 단 일선으로 위치하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 형광물질이 알렉사 시리즈, Cy3 및 Cy5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 포획자로 사용되는 항체 또는 항원 단백질을 검사창의 시험선에 분주하지 않고 아비딘을 분주하여 고정화하고, 대신 포획자 단백질에 바이오틴을 부착하여 바이오틴이 아비딘과 결합하면서 포획자 단백질이 검사창의 시험선에서 자동적으로 탐지되는 방법.
  8. 지지대(backing), 지지대의 한쪽 말단 상에 접착되어 있고 액체 시료가 투입되는 시료 패드(sample pad), 지지대의 다른 쪽 말단 방향으로 시료 패드의 말단에 한쪽 말단이 겹쳐서 지지대에 접착되어 있고 시료중의 분석물과 반응하여 복합체를 형성하는 표지된 탐지자가 비고정 흡착되어 있는 결합체 방출 패드(conjugatereleasing pad), 지지대의 다른 쪽 말단 방향으로 표지된 결합체 방출 패드의 말단에 한쪽 말단이 겹쳐서 지지대에 접착되어 있고 시료가 전개되며 방출 패드로부터 분리 이동하는 결합체와 샌드위치로 반응 포획하여 복합체를 형성하는 상기 탐지자와 동일하거나 상이한 포획자가 고정되어 있는 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 크로마토그래피에 의해 이동하는 시료를 흡수하고 또한 표지된 미반응 물질을 흡수 및 제거하는 흡수패드(absorption pad)를 포함하는 측방 유동 정량 검정 스트립에 있어서,
    상기 결합체 방출 패드상에 비고정적으로 흡착되어 있는 탐지자는 형광물질로 표지되어 있고, 추가로 상기 결합체 방출 패드상에는 상기 탐지자의 표지 형광물질과 동일한 형광물질로 표지되어 있고 액체시료중의 표준물과 반응하는 표준 탐지자가 비고정적으로 흡착되어 있으며; 상기 포획자는 크로마토그래피 매질상의 검사창에 선으로 분주 고정되어 있으며; 상기 탐지자 및 포획자와 상이하고 비표지된 표준 포획자가 상기 검사창의 전방 또는 후방에 표준선으로서 단일 선으로 분주 고정되거나 상기 검사창의 전후방 모두에 표준선으로서 각각 단일 선으로 분주 고정되어 있고; 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 이동하면서 상기 검사창에서 형성된 형광물질 표지된 탐지자-분석물-포획자의 복합체 및 상기 표준선에서 형성된 형광물질 표지된 표준 탐지자-표준물-표준 포획자의 표준 복합체의 표면형광 매질은 레이저로부터 입사하고 여기 필터를 통과한 빛으로 조사되고 이로부터 반사된 빛은 적절한 크기로 타원반사경 또는 구면경의 제1초점에 집속되며 타원반사경의 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경에 반사하여 타원반사경의 제2초점으로 집속되고 이와같이 집속된 광은 다시 평행광학계에 의하여 평행광으로 변환되며 이 평행광을 형광필터에 통과시켜 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분만 광검출기로 입사하여 상기 복합체의 형광 양을 상기 표준 복합체가 나타내는 표준 형광 양에 대하여 상대적으로 측정 비교하여 분석물의 양을 결정하기 위한 스트립.
  9. 제8항에 있어서, 상기 탐지자 및 포획자가 분석물의 컷오프 값이 pg/ml인 분석물과 반응하는 것임을 특징으로 하는 스트립.
  10. 제9항에 있어서, 분석물이 CEA, PSA, B2M, CYFRA21-1, CK-MB, cTnI, cTNT, BNP, ACTH, 아드레노메듈린, ANP, 안지오텐신 II, 칼시토닌, CNP, 엔돌핀, 가스트린, NPY, 췌장 폴리펩타이드, 우로텐신 II 및 마이크로시스틴으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 스트립.
  11. 제8항 내지 10항중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지자가 4 종류 이상이고 이에 따라 탐지자의 종류와 동일한 수의 포획자가 동일한 수의 선으로 검사창에 분주 고정되어 4 종류 이상의 분석물을 동시에 정량할 수 있음을 특징으로 하는 스트립.
  12. 제8항에 있어서, 비표지된 표준 포획자가 고정된 표준선이 검사창의 전방에 단일 선으로 위치하거나 전후방 모두에 각각 단 일선으로 위치하는 스트립.
  13. 제8항에 있어서, 형광물질이 알렉사 시리즈, Cy3 및 Cy5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 스트립.
  14. 제8항에 있어서, 두 장의 크로마토그래피 매질이 적층되어 있고 적층된 양면사이에 포획자 및 표준 포획자가 고정되어 있는 스트립.
  15. 제8항에 있어서, 결합체 방출 패드상에 위킹 패드가 위치하는 스트립.
  16. 제8항 또는 15항에 있어서, 시료 패드, 결합체 방출 패드, 크로마그래피 매질 및 흡수 패드상에 폴리에스테르 필름 또는 아크릴 접착 테이프가 일체로 적층되어 있는 스트립.
  17. 제8항에 있어서, 포획자로 사용되는 항체 또는 항원 단백질을 검사창의 시험선에 분주하지 않고 아비딘을 분주하여 고정화하고, 대신 포획자 단백질에 바이오틴을 부착하여 바이오틴이 아비딘과 결합하면서 포획자 단백질이 검사창의 시험선에서 자동적으로 탐지되는 스트립.
  18. (i) 지지대(backing), 지지대의 한쪽 말단 상에 접착되어 있고 액체 시료가 투입되는 시료 패드(sample pad), 지지대의 다른 쪽 말단 방향으로 시료 패드의 말단에 한쪽 말단이 겹쳐서 지지대에 접착되어 있고 시료중의 분석물과 반응하여 복합체를 형성하는 표지된 탐지자가 비고정 흡착되어 있는 결합체 방출 패드(conjugate releasing pad), 지지대의 다른 쪽 말단 방향으로 표지된 결합체 방출 패드의 말단에 한쪽 말단이 겹쳐서 지지대에 접착되어 있고 시료가 전개되며 방출 패드로부터 분리 이동하는 결합체와 샌드위치로 반응 포획하여 복합체를 형성하는 상기 탐지자와 동일하거나 상이한 포획자가 고정되어 있는 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 크로마토그래피에 의해 이동하는 시료를 흡수하고 또한 표지된 미반응 물질을 흡수 및 제거하는 흡수패드(absorption pad)를 포함하고; 상기 결합체 방출 패드상에 비고정적으로 흡착되어 있는 탐지자는 형광물질로 표지되어 있고, 추가로 상기 결합체 방출 패드상에는 상기 탐지자의 표지 형광물질과 동일한 형광물질로 표지되어 있고 액체시료중의 표준물과 반응하는 표준 탐지자가 비고정적으로 흡착되어 있으며; 상기 포획자는 크로마토그래피 매질상의 검사창에 선으로 분주 고정되어 있으며; 상기 탐지자 및 포획자와 상이하고 비표지된 표준 포획자가 상기 검사창의 전방 또는 후방에 표준선으로서 단일 선으로 분주 고정되거나 상기 검사창의 전후방 모두에 표준선으로서 각각 단일 선으로 분주 고정되어 있는 스트립과 (ii) 레이저, 여기필터, 타원반사경 또는 구면경, 표면형광이 발광되는 시료의 제어 수단, 평행광학계, 형광필터 및 광검출기로 구성되고, 이들 구성 요소들은 액체 시료가 상기 스트립의 크로마토그래피 매질을 따라 이동하면서 상기 검사창에서 형성된 형광물질 표지된 탐지자-분석물-포획자의 복합체 및 상기 표준선에서 형성된 형광물질 표지된 표준 탐지자-표준물-표준 포획자의 표준 복합체의 표면형광 매질이 레이저로부터 입사하고 여기 필터를 통과한 빛으로 조사되고 이로부터 반사된 빛은 적절한 크기로 타원반사경 또는 구면경의 제1초점에 집속되고, 이 집속점은 타원반사경의 제1초점에 위치하며, 이 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경에서 반사하여 타원반사경의 제2초점으로서 평행광학계로 집속되고 이를 통해 평행광으로 변형된 뒤 형광필터를 지나면서 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분만이 광검출기로 입사하도록 배치되어 있는 레이저 유발 표면형광 검출 장치가, 상기 스트립상에 형성된 상기 복합체의 형광 양 및 상기 표준 복합체의 표준 형광 양이 상기 레이저-유발 표면형광 검출 장치에 의해 측정되고 상대적으로 비교되어 액체 시료중의 분석물 양을 결정할 수 있도록, 일체로 구성된 분석물 정량 패키지.
  19. 제18항에 있어서, 상기 탐지자 및 포획자가 분석물의 컷오프 값이 pg/ml인 분석물과 반응하는 것임을 특징으로 하는 패키지.
  20. 제18항에 있어서, 분석물이 CEA, PSA, B2M, CYFRA21-1, CK-MB, cTnI, cTNT, BNP, ACTH, 아드레노메듈린, ANP, 안지오텐신 II, 칼시토닌, CNP, 엔돌핀, 가스트린, NPY, 췌장 폴리펩타이드, 우로텐신 II 및 마이크로시스틴으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 패키지.
  21. 제18항 내지 20항중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지자가 4 종류 이상이고이에 따라 탐지자의 종류와 동일한 수의 포획자가 동일한 수의 선으로 검사창에 분주 고정되어 4 종류 이상의 분석물을 동시에 정량할 수 있음을 특징으로 하는 패키지.
  22. 제18항에 있어서, 비표지된 표준 포획자가 고정된 표준선이 검사창의 전방에 단일 선으로 위치하거나 전후방 모두에 각각 단 일선으로 위치하는 패키지.
  23. 제18항에 있어서, 형광물질이 알렉사 시리즈, Cy3 및 Cy5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 패키지.
  24. 제18항에 있어서, 두 장의 크로마토그래피 매질이 적층되어 있고 적층된 양면사이에 포획자 및 표준 포획자가 고정되어 있는 패키지.
  25. 제18항에 있어서, 결합체 방출 패드상에 위킹 패드가 위치하는 패키지.
  26. 제18항 또는 25항에 있어서, 시료 패드, 결합체 방출 패드, 크로마그래피 매질 및 흡수 패드상에 폴리에스테르 필름 또는 아크릴 접착 테이프가 일체로 적층되어 있는 패키지.
  27. 제18항에 있어서, 포획자로 사용되는 항체 또는 항원 단백질을 검사창의 시험선에 분주하지 않고 아비딘을 분주하여 고정화하고, 대신 포획자 단백질에 바이오틴을 부착하여 바이오틴이 아비딘과 결합하면서 포획자 단백질이 검사창의 시험선에서 자동적으로 탐지되는 패키지.
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