JP5383671B2 - バイオセンサ - Google Patents

Description

本発明は、免疫学的測定方法を用いて液体試料中の分析対象物を分析するシート状の分析デバイスとしてのバイオセンサに関するものである。

近年では、在宅医療、および医院や診療所などの地域医療の充実、さらには早期診断、および緊急性の高い臨床検査の増加などに伴い、臨床検査の専門家でなくとも、それを用いて、簡易かつ迅速に、高精度の測定を実施可能である分析装置が要望されるようになってきている。このため、煩雑な操作を伴わず、短時間で信頼性の高い測定を行うことのできる、ＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）向けの小型分析装置が、脚光をあびている。

ＰＯＣＴとは、一般的に、開業医、専門医の診察室、病棟および外来患者向け診療所などの「患者の近いところ」で行われる検査の総称であり、検査結果を即座に医師が判断し、迅速な処置を施し、治療の過程や、予後のモニタリングまでを行うという診療の質の向上に大きく役立つものとして注目されている方法である。このような小型分析装置による検査は、中央検査室での検査に比べて、検体の運搬や、設備にかかるコストや、不要な検査にかかる費用を抑えることができ、トータルの検査費用の削減が可能になるといわれており、ＰＯＣＴ市場は、病院経営合理化の進む米国では、急速に拡大してきており、日本をはじめ世界的にみても成長市場となっていくことが予想されている。

免疫クロマトセンサに代表されるような乾式の分析素子としてのバイオセンサは、試薬の調整を必要とせず、測定対象となる血液や尿などの液体試料を、バイオセンサ上に滴下するなどの簡単な操作のみにより、該液体試料に含まれた分析対象物を分析することが可能なものであり、液体試料中の分析対象物を簡便かつ迅速に分析するのに非常に有用なため、ＰＯＣＴの代表として今日多数実用化されている。

抗原抗体反応を用いる免疫クロマトセンサ（以下、クロマトセンサと略す）は、感知反応が高度の特異性と強い結合力で行われるので、きわめて低い濃度で存在する生理活性物質の分析において、他のセンサより優れた特性を示す。今日では、この原理を用いて、妊娠診断薬や癌マーカー診断薬、心筋マーカー診断薬などの数多くの診断薬が市販されている。

クロマトセンサの構成については、特許文献１で、同一平面上に、すなわち１枚の平板形状の固形支持体において、互いに毛細管流により連絡可能である複数の部分（領域）で物質を流動させて、液体試料中の被分析体の存否を測定するアッセイ装置が開示されている。

また、特許文献２や、特許文献３では、液体中に存在する免疫学的な結合特性を有する１対の組み合わせにおける一方の成分を検出または測定する分析デバイスが開示されている。

前述した特許文献１〜３の方法は、何れも特異的反応を有する免疫学的アッセイデバイスの構成について述べられたものであり、毛細管力（毛細管現象により生じる力）によって液体試料が移動可能な材料で構成されている。例えば特許文献１では、平板形状の固形支持体に、分析対象物と特異的に反応するトレーサーが保持された領域（第１部分）と、分析対象物またはトレーサーに特異的に結合する結合体が保持された領域（第２部分）とが設けられており、これらの領域（第１部分と第２部分）は同一平面の固形支持体上に存在し、互いに毛細管流により連絡可能である構成を特徴としている。また、特許文献２と特許文献３とでは、液体試料の流れ方向に対して相前後して配置され、かつそれらの縁を介して相互に吸収可能な接触状態にある１個またはそれ以上の細片からなるシート状ゾーンと固体支持体とからなる構成が特徴とされている。

これら特許文献１〜３に代表されるクロマトセンサの一般的な構成の一例を図１４Ａ〜図１４Ｃ、図１５Ａ、図１５Ｂに示している。クロマトセンサの一般的な構成は、ＰＥＴシートなどの基板１上に、ニトロセルロースやガラス繊維濾紙などの多孔質担体からなり、分析対象物あるいはトレーサーと特異的に反応する試薬を固定化した試薬固定化部３が一部に設けられた展開流路２と、分析対象物及び固定化試薬と特異的に反応する試薬を標識した標識試薬が液体試料の浸透によって溶出しやすいよう液体透過性の材料に保持された標識試薬保持部４と、標識試薬保持部４上あるいは標識試薬保持部４よりもクロマト展開方向の上流側に配設されて液体試料を添加する試料添加領域５と、展開した液体試料をクロマト展開方向の下流領域で吸水するための吸水部６とが設けられた構成とされている。そして、基板１上において、クロマト展開方向の上流側から順番に、試料添加領域５の下流端に標識試薬保持部４の上流端が接触され、標識試薬保持部４の下流端に展開流路２の上流端が接触され、展開流路２の下流端に吸水部６の上流端が接触されている。ここで、基板１以外のセンサ構成部材（試料添加領域５、標識試薬保持部４、展開流路２および吸水部６）は、全て液体透過性の材料で構成されている。多くの場合、このクロマトセンサは、図１５Ａ、図１５Ｂに示すように、試薬固定化部３と試料添加領域５との一部が外部に露出されるよう、試料添加部５０と結果確認窓５２とが設けられた液体不透過性材料からなる中空ケーシング５１の内部に収容されて構成されている。

このクロマトセンサの液体試料などの流れおよび測定原理について説明する。まず、液体試料を中空ケーシング５１の試料添加部５０に添加する。添加された液体試料は、試料添加部５０を通して、各クロマトセンサ構成材料由来の毛細管現象によって吸水されながら展開していく。試料添加領域５から展開して標識試薬保持部４に到達した液体試料は、標識試薬を溶出しながら更に下流方向へと展開して、展開流路２内を展開する際に試薬固定化部３を通過し、さらに下流まで展開して吸水部６へと吸水されていく。ここで、液体試料中に分析対象物が含まれている場合、分析対象物は、標識試薬保持部４に達した時点で、まず、標識試薬との特異的結合反応により、「標識試薬−分析対象物の複合体」を形成する。この「標識試薬−分析対象物の複合体」は、液体試料とともに展開流路２へと展開し、更に試薬固定化部３に到達する。試薬固定化部３において「標識試薬−分析対象物の複合体」は固定化試薬とも特異的結合反応を生じ、「標識試薬−分析対象物−固定化試薬の複合体」を形成する。そして、試薬固定化部３において、分析対象物の濃度に応じた標識試薬由来の呈色反応を結果確認窓５２から確認することができる。この構成に代表される一般的なクロマトセンサは、市場では病院用や一般家庭用などとして広く流通している。なお、ここでは免疫反応の例として「標識試薬−分析対象物−固定化試薬複合体」を形成するサンドイッチ反応を例に測定原理を述べたが、競合反応もしばしば利用されている。

このクロマトセンサの構成においては、液体試料の移動を助けるためと、展開してきた液体試料を保持することとを目的として、液体をよく吸水する材料で構成された吸水部６を展開流路２に隣接して設けている。また、標識試薬は、液体試料が添加されると、できるだけ速やかにかつ、完全に標識試薬保持部４から放出され、液体の流れにのって移動することが重要であり、このため、標識試薬保持部４の構成材料としては多孔性材料や繊維材料が適していることが明らかにされている。具体例としては、標識試薬保持部４を構成する構成材料として、紙・フリース・多孔性プラスチック層またはメンブレンなどが多用されている。しかしながら、前記構成材料に保持された標識試薬は、材料深部に浸透しているため、十分量の液体試料が溶出し難い場合が多く、また、乾燥状態にある間に構成材料と標識試薬とが非特異吸着してしまうため、保持されている標識試薬が完全に溶出することが困難となり、クロマトセンサ毎に標識試薬の溶出度合が異なっていた。このため、免疫クロマトセンサを用いた定量測定を行う場合、十分な精度が得られないという問題や高感度測定が行えないという問題があった。

次に、図１５Ａ、図１５Ｂに示す従来の一般的なクロマトセンサに液体試料を添加した場合の、クロマトセンサ上を液体試料が展開していく様子を、図１６Ａ〜図１６Ｆを用いて説明する（なお、図１６Ｂ〜図１６Ｆにおいては、クロマトセンサのみを示し、中空ケーシング５１を省いて図示している）。まず、図１５Ａ、図１６Ａに示すように、ディスペンサやスポイトなどの用具（あるいは注射器５４）を用いて、試料添加部５０に液体試料（図１５Ａ、図１６Ａにおいては、血液サンプルＳ）が添加される（Ｓｔｅｐ１）と、図１６Ｂに示すように、試料添加領域５の全体に液体試料が染み込んで拡がっていく（Ｓｔｅｐ２）。次に、図１６Ｃに示すように、試料添加領域５に保持された液体試料は、標識試薬保持部４へと展開していく（Ｓｔｅｐ３）。この際、液体試料の展開先端部と接触した標識試薬から速やかに溶解し、図１６Ｄに示すように、溶出した標識試薬は液体試料の流れとともに展開していく。液体試料が展開する間に、分析対象物と標識試薬との間で複合体が形成され、流れとともに移動する。標識試薬は、液体試料に押し流されるようにして溶解・溶出し、図１６Ｅに示すように、展開流路２を展開して試薬固定化部３を通過し、Ｓｔｅｐ５で、図１６Ｆに示すように、吸水部６へと展開し吸水されていく（Ｓｔｅｐ６）。このように、標識試薬は液体試料の展開先端部ほど濃く存在し、標識試薬と接触して複合体を形成できる分析対象物は液体試料中の展開前方部が大部分であり、展開後方の液体試料には標識試薬がほとんど存在せず、未反応の分析対象物のみが展開していく状態であった。

したがって、前述したようなクロマトセンサの構成の場合、クロマトセンサで評価される結果となる液体試料は、実際には液体試料の全体ではなくて、添加された液体試料の一部における分析対象物の存在あるいは量を判断するに留まっていた。このため、液体試料中に分析対象物が高濃度に存在する場合は十分に検出可能であるが、分析対象物が低濃度の場合は、全ての標識試薬と分析対象物とが極めて良好に反応できれば検出可能であるものの、上記理由から現構成のクロマトセンサでは良好に検出することは不可能であり、分析対象物の高感度領域（ナノモル領域やピコモル領域〜更に低濃度領域）までの検出には、対応できない問題があった。

以上のように、従来の構成では、標識試薬を完全に溶出させることができないという不具合と、液体試料中に均一に拡散・展開しないという不具合とがあったため、クロマトセンサを用いた定量測定を行う場合に、十分な精度が得られないとともに、高感度測定が行えないという問題があった。

さらに、基板１以外の全てのセンサ構成部材がガラス繊維濾紙や多孔質膜などの液体透過性材料で構成されていることから、液体試料が各センサ構成部材に染み込んで保水されてしまい、下流側に流出しない液体量（デッドボリューム）が生じてしまう。そのため、従来のクロマトセンサでは、少なくとも各センサ構成部材が保水してしまうデッドボリュームを考慮に入れて、多目の液体試料を添加する必要性があり、このため、例えば液体試料が血液などの場合には、この血液などの微少検体での測定が不可能であった。

特許文献４では、毛細管現象によって流入される空間である間隙部を展開層の一部に形成した空間形成部を備えるバイオセンサが報告されている。ここでは、試料添加部の空間を液体不透過性材料により囲むことで形成されており、一定量の液体試料を保持することを可能としている。しかし、標識試薬は展開層の一部に形成されているため十分な検体量の削減にならないとともに、液体試料の展開による標識試薬の溶解及び溶出パターンは特許文献１〜３と同様であるので、特許文献１〜３が抱える標識試薬の溶出及び展開状況の改善を図るまでには至っていない。

特許公報第２８９０３８４号 特公平７−７８５０３号公報 特許公報第２５０４９２３号 特許公報第３５５３０４５号

前述したように、前記特許文献１〜４に示す方法は、免疫反応を基本とするバイオセンサにおいて、基本的に基板１以外のセンサ構成部材が、毛細管流（毛細管現象による流れ）によって互いに連絡可能な状態になる液体透過性材料にて構成されているものである。そして、これらの構成材料の構成部品および構成を用いることで、液体試料中の分析対象物を簡易迅速に分析することを実現しようと考え出された発明であり、これらの技術により今日の医療現場で多くの検査を実施可能としている。

しかしながら、図１４Ａ〜図１４Ｃ、図１６Ａ〜図１６Ｆに示す従来の一般的なクロマトセンサでは、液体試料が血液サンプルＳである場合、一般的には注射器５４を用いて採血を行い、注射器５４から直接大量の血液サンプルＳを添加する、またはディスペンサやスポイトなどの用具を用いて、全血あるいは血漿および血清を添加しなくてはならなかった。したがって、クロマトセンサへの試料添加が非常に煩雑であり、簡易迅速測定とするＰＯＣＴ検査における、作業の簡略化は大変重要な課題であった。

また、何れの特許文献の発明においても、標識試薬は多孔質材料などの液体透過性材料に保持されている。したがって、標識試薬は液体試料の展開とともに速やかに溶出し、展開先端部に非常に高濃度な状態で存在し展開されていくが、保持されている標識試薬は完全に溶出されることができず、保持担体に数％〜数１０％の標識試薬が残留してしまう問題がある。また、残留する標識試薬量はバイオセンサ毎に異なるため、試薬固定化部を通過する標識試薬量がバイオセンサ同士の間では一定でなくなり、分析対象物の量が同じでも呈色度合に違いが生じ、これによりバイオセンサを用いた高精度な定量測定の実現が困難であった。

さらに、展開される標識試薬は、添加される液体試料全体に拡散して分析対象物と反応するのではなく、展開先端部にあたる一部の液体試料とともに流出して、一部の分析対象物との反応に留まってしまうため、低濃度の分析対象物を検出することが困難であり、ナノモルやピコモル、更に低濃度の濃度領域の検出及び定量を必要とする高感度測定が不可能であった。

また、基板１以外のセンサ構成部材が液体透過性材料で構成されていることから、展開してきた液体試料をセンサ構成各部材が保水してしまうことで検体損失（デッドボリューム）が発生していた。したがって、液体展開がＢ／Ｆ分離（抗体と結合している抗原と、抗体と結合していない抗原との分離）の役割を果たすクロマトセンサにおいて十分な展開（Ｂ／Ｆ分離）のためには、過剰な液体試料の添加が必要不可欠であり、過剰に検体量がある尿が液体試料である場合では問題ないものの、血液中の分析対象物を検出したい場合などは、上腕採血による必要以上の採血を必要としてしまい、簡易・迅速とは言えない検査体制となっていた。

これらの課題を解決し、より微少な量の液体試料（微量検体）で正確かつ高精度・高感度な定量測定を実現するためには、デッドボリュームを小さくし、標識試薬や、その他の反応試薬を１００％溶出でき、液体試料全体の分析対象物が反応できる免疫クロマトセンサとしてのバイオセンサを提供することが重要かつ不可欠な要素であった。

また、液体試料として血液サンプルＳを添加する場合は、血液中に存在する血球成分（特に赤血球）が、結果の確認を妨げることと、展開流路を血球成分が展開できない場合があることから、従来のクロマトセンサやバイオセンサを用いる場合には、予め遠心分離などの作業により、血球成分を取り除き血清あるいは血漿成分だけを試料添加部に添加する方法、あるいは試料添加領域と展開流路との間に、血球成分の濾過が可能な血球濾過材を配設する必要性があった。

本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、ディスペンサやスポイト、注射器などを用いなくても、一定量の液体試料としての血液を良好に保持することができるだけでなく、標識試薬やその他の反応試薬を完全に溶出することができるとともに、添加する血液の量を大幅に削減、微量化することができ、しかも、標識試薬が均一な状態で溶出した血液を展開流路に良好に流入させることができるバイオセンサを提供することによって、免疫反応を基本とするバイオセンサにおいて、測定精度向上を図ることができると同時に、従来の免疫クロマトセンサに見られる利便性を損なわず、いつでもどこでも誰でも測定可能であり、しかも、微量の血液などの液体試料での測定を実現化でき、正確かつ高精度・高感度な免疫クロマトセンサとしてのバイオセンサを提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明のバイオセンサは、液体試料が添加される試料添加部と、液体試料に反応する反応試薬と、反応試薬が混在する液体試料あるいは反応試薬と反応した液体試料を展開する展開流路とを有し、液体試料中の分析対象物の存否あるいは濃度を測定するバイオセンサであって、前記試料添加部が、液体不透過性材料からなる空間形成材により添加空間を囲むことで構成され、前記試料添加部における空間形成材の添加空間に臨む箇所に、前記反応試薬が、添加空間に添加された液体試料に溶け出し可能な状態で保持され、前記展開流路は、前記試料添加部内の液体試料と前記反応試薬とが毛細管力にて移動可能な材料で構成され、展開流路の一部に測定領域が配設されていることを特徴とするものである。

この構成により、試料添加部の添加空間を形成する空間形成材が液体不透過性材料により形成されていることから、試料添加部に保持された液体試料は、試料添加部に保水されることを回避して、留まることなく展開流路をその展開方向下流領域へと展開していくことが可能となり、試料添加部に留まったままのデッドボリュームが無くなることから、測定に必要な液体試料を大きく削減することが可能となる。

なお、ここでの液体不透過性材料とは、液体がその材料内部へ浸潤しない材料を意味し、例えばＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂材料の他、金属、ガラス等が挙げられる。また、紙などの液体が材料内部へ浸潤可能な液体透過性材料であっても、その表面を樹脂やフィルムなどでコーティングしたり、撥水加工などの処理を行ったりすることで、液体の浸潤を防止しているような材料をも含む。

また、展開流路とは、毛細管力で液体が移動可能な任意の材料または構成を有するものでよく、例えば微細空間で形成された流路や、微細柱（ナノピラー）の形成された微細流路、多孔質膜やガラス繊維濾紙などの任意の液体透過性材料が挙げられるが、好ましくはその展開流路は単層であるのがよく、ニトロセルロースに代表されるメンブレンフィルタや、ガラス繊維濾紙、セルロース濾紙、液体不透過性材料などで形成される微細流路など何を用いてもよい。

また、前記構成によれば、反応試薬が、液体不透過性材料からなる空間形成材で構成された添加空間に保持されていることから、保持されている反応試薬が担持材料に留まる、あるいは吸着されることなく全て溶出することが可能となり、この結果、反応試薬の溶出度合がほぼ一定となって、従来生じていた、「反応試薬の溶出が多い場合に、感度は高い」「反応試薬の溶出が少ない場合に、感度は低い」となっていた感度差が生じなくなり、測定結果は安定する。これにより、より正確かつ高精度・高感度な測定結果を得ることができる。

なお、反応試薬は、例えば液体試料と反応する変性剤であったり、酵素反応に必要とされる任意の試薬であったり、分析対象物および固定化試薬と特異的反応の可能なトレーサーを有する標識試薬などを含んでいる。ここで言うトレーサーとは、リガンド部分及びこのリガンド部分に結合した検出可能な標識部分のことである。検出可能な標識は多種多様な検出が可能な標識の何れであってもよいが、本発明の好ましい形態においては各種の色原体、例えば蛍光性物質、吸収性色素や発光物質、不溶性粒状担体、例えば金属コロイドやラテックス粒子などを用いるとよく、酵素を用いてもなんら問題はない。「反応試薬と反応した液体試料」とは、液体試料中の分析対象物とトレーサーとが反応した状態、あるいは液体試料中の任意の成分が、反応試薬中の任意の試薬と反応した状態を示す。

また、測定領域としては、１つまたはそれ以上の任意の数の領域でよく、何れの場合も何ら問題はない。更に展開流路は、毛細管力で液体が移動可能な任意の材料または構成を有するものでよく、例えば微細空間で形成された流路や、微細柱（ナノピラー）の形成された微細流路、多孔質膜やガラス繊維濾紙などの任意の液体透過性材料が挙げられるが、好ましくはその展開流路は単層であるのがよい。

また、本発明のバイオセンサは、反応試薬が、試料添加部における展開流路の延長線上の面とは異なる箇所に配設されていることを特徴とするものである。また、本発明のバイオセンサは、展開流路が、支持体としての基板の面に沿って配置され、反応試薬が、空間形成材における前記基板の面から離れて対向する上面部裏面に保持されていることを特徴とするものである。

このように、反応試薬を、試料添加部における展開流路の延長線上の面とは異なる箇所に配設させたり、空間形成材における前記基板の面から離れて対向する上面部裏面に保持させたりすることで、反応試薬が、試料添加部における展開流路の延長線上の面に配設されている場合に比べて、試料添加部に添加された液体試料に対して反応試薬がより均一に溶け出した状態で、展開流路に導入されることとなり、より正確かつ高精度・高感度な測定結果を得ることができる。つまり、反応試薬が、試料添加部における展開流路の延長線上の面に配設されている場合には、反応試薬が保持されている箇所と展開流路とが接触したり、極めて近接したりしているので、液体試料に反応試薬が溶け出した直後の、不均一な状態の液体試料が展開流路に導入され、精度が低下したり感度が低下したりするおそれがあるが、上記構成によりこのような不具合の発生を抑えることができる。

ここで、試料添加部における展開流路との厚み方向に沿ってこの展開流路の延長線上とは異なる位置とは、例えば、試料添加部の底面部分に沿って展開流路が配設されている場合には、試料添加部を囲んで形成するカバーなどの空間形成材の底面部分よりも上方にずれた上面部裏面や底面部より上方に延びる側面など、展開流路と同一面に位置する底面部以外の任意の面を示す。

また、本発明は、基板に、添加空間の厚さを調整する補助基板が配設されていることを特徴とするものである。

この構成によれば、補助基板が設けられていることで、空間形成材によって形成された試料添加部が、血液サンプルなどの液体試料を毛細管力により良好に吸引するように保持され、液体試料を良好に吸引することができて、吸引量の不足を生じることがなくなる。

また、本発明のバイオセンサは、空間形成材に、添加空間への液体試料の吸引を促進する空気孔が形成されていることを特徴とするものである。

この構成によれば、空間形成材に、添加空間への液体試料の吸引を促進する空気孔が形成されていることによって、添加空間の毛細管力を高めることができるため、添加空間に血液等の液体試料が添えられると同時に、添加空間内へと速やかに液体試料を吸引することが可能となり、一定量の液体試料を、より確実に、かつ一瞬の間に添加空間に保持することができ、添加する液体試料が不足するような事態の発生を極小化することができる。

また、本発明のバイオセンサは、測定領域は、分析対象物あるいは反応試薬と特異的反応の可能な試薬が固定化された試薬固定化部からなることを特徴とするものである。

また、本発明のバイオセンサは、反応試薬は、分析対象物あるいは固定化試薬と特異的反応の可能な標識試薬を含んでいることを特徴とするものである。

この構成によれば、反応試薬が標識試薬を含んでいるので、液体試料が反応試薬と接すると速やかに標識試薬は溶解あるいは水和し、液体試料中の分析対象物との反応が行われることが可能となる。標識試薬と液体試料とは反応した後に展開流路を展開するため、標識試薬は確実に分析対象物と反応することができ、反応した液体試料が試薬固定化部を通過することから、試薬固定化部における反応度合も均一化することができ、反応度合によって生じていた測定ばらつきも改善され、より高精度な測定を実現することができる。

また、本発明のバイオセンサは、標識試薬は、分析対象物あるいは固定化試薬と特異的反応の可能な試薬が不溶性粒状マーカーに標識されていることを特徴とするものである。
また、本発明のバイオセンサは、不溶性粒状マーカーが、着色重合体ビーズ、金属、合金および重合染料粒子からなる群から選択されることを特徴とするものである。

また、本発明のバイオセンサは、特異的反応が、抗原抗体反応であることを特徴とするものである。

この構成により、抗原抗体反応などの特異的反応を利用したバイオセンサにおいて、試料添加部の液体試料の損失をおさえて、微量な液体試料での測定を可能とし、標識試薬などの担持された反応試薬を完全に溶解・流出できて、液体試料全体に反応試薬を良好に拡散させて反応させることができる。

また、本発明のバイオセンサは、反応試薬が、標識試薬以外の試薬であることを特徴とするものである。

この構成によれば、反応試薬は標識試薬以外の試薬であるので、トレーサーを必要としない反応系、例えばＨｂＡ１ｃの測定における、ヘモグロビンの定量なども実施可能だったり、標識試薬が酵素である場合には、通常酵素反応の為の基質試薬を、後から展開したりする必要性があるが、その必要性を回避することが可能となり、様々な反応系への対応を実現することができる。

また、本発明のバイオセンサは、展開流路の表面を覆う液体不透過性シートを有することを特徴とするものである。

この構成によれば、展開流路の表面は液体不透過性シートで覆われるので、試料添加部から展開する液体試料は、展開流路の表面から蒸発・乾燥することがなく、展開流路をクロマト下流領域まで展開することが可能となるばかりか、試薬固定化部におけるＢ／Ｆ分離（特異的結合反応により形成された複合体と、反応していない物質との分離）が確実に行われるので、より正確な測定を行うことができ、より高感度かつ高精度な測定を実現することができる。

また、本発明のバイオセンサは、液体不透過性シートは、試料添加部の添加空間の一部または近傍から、少なくとも試薬固定化部までの範囲を覆うものであることを特徴とするものである。

この構成によれば、展開流路の試薬固定化部が設けられている箇所の表面は液体不透過性シートで覆われているので、試料添加部の添加空間から展開する液体試料は、展開流路における試薬固定化部の表面から蒸発することなく良好に展開する。

また、本発明のバイオセンサは、液体不透過性シートは、展開流路の下流端部においてはこの展開流路を覆わないものであることを特徴とするものである。

この構成によれば、展開流路の下流端部、すなわち、展開流路における試薬固定化部よりも下流の、液体不透過性シートで覆われていない箇所では、展開液が蒸発して乾燥するため、液体試料のクロマト上流領域から下流領域までの展開がより促進されるばかりか、試薬固定化部におけるＢ／Ｆ分離が確実に行われて、より正確な測定を行うことができ、より高感度かつ高精度な測定を実現することができる。

また、本発明のバイオセンサは、展開流路の流れ方向に沿った両側面部が被覆または封止されていることを特徴とするものである。

この構成によれば、展開流路の流れ方向に沿った両側面部が被覆または封止されていることにより、両側面部からの液体試料の蒸発・乾燥を阻むことが可能となり、展開流路における両脇部分に逃れがちになる液体試料の展開を、クロマト下流領域方向へと促進することが可能となる。その結果、液体試料の展開を均一化できて、液体試料の展開の乱れによる反応度合のばらつきを極小化することが可能となり、より高精度な測定を実現することができる。

また、本発明のバイオセンサは、液体試料が血液サンプルであることを特徴とするものである。

また、本発明のバイオセンサは、反応試薬は細胞収縮剤を含むものであり、この細胞収縮剤が血液サンプル中の血球成分と反応して、血球成分が収縮された状態であるいは血球成分が収縮されながら、血液サンプルが展開流路を展開するようにされていることを特徴とするものである。

これに対して本発明の上記構成によれば、反応試薬に細胞収縮剤、または細胞収縮剤を含む混合試薬を担持したことにより、血液サンプル中の血球成分が、反応試薬である細胞収縮剤と接した際に速やかに収縮してその大きさが均一化される。その結果、不均一な大きさの血球成分により乱れていた血液サンプルの展開状態を均一化することが可能となって反応度合も均一化され、ひいては測定ばらつきも改善されて、より高精度な測定を実現することができる。

また、本発明のバイオセンサは、試料添加部の添加空間には、指先血を毛細管力にて吸引可能であることを特徴とするものである。

また、本発明のバイオセンサは、反応試薬および固定化試薬は、乾燥状態でバイオセンサに保持および固定されていて、液体試料に溶解あるいは水和するものであることを特徴とするものである。

この構成によれば、反応試薬および固定化試薬はいずれも乾燥状態にあり、バイオセンサは乾燥分析素子となることから、持ち運びや保管方法にも優れ、いつでもどこでも誰でも測定することが可能になる。

また、本発明のバイオセンサは、反応試薬は溶液状態で空間形成材の内面に塗布された後に乾燥されたものであり、固定化試薬は溶液状態で展開流路に塗布された後に乾燥されたものであることを特徴とするものである。

また、本発明のバイオセンサは、試料添加部の添加空間の吸引容積が１０μｌ以下であることを特徴とするものである。

この構成により、従来のクロマトセンサと比較して大幅な検体量の削減を実現することができ、指先血などの極めて微量な血液サンプルで良好に定性または定量することができる。

また、本発明のバイオセンサは、前記試料添加部の添加空間が、液体不透過性材料からなる空間形成材により囲まれることで構成され、前記展開流路の上流部分が添加空間の一方の端部側から添加空間に入り込んでいるが、前記展開流路の上流端部の入り込み位置が、前記添加空間における他の端部側に形成された液体試料吸引用の開口部よりも吸引方向奥側の位置であることを特徴とする。

この構成により、血液サンプルなどの液体試料を一定量添加するためのディスペンサなどの用具や、添加された血液を保持するための吸水パッドを必要とすることなく、適当量の液体試料を添加する操作のみで微少な液体試料を一定量保持することができ、かつ微量の液体試料を展開して分析することが可能である。また、展開流路の上流端部は、添加空間における液体試料吸引用の開口部よりも吸引方向奥側の位置までしか入り込んでいないため、前記開口部を通して液体試料を吸引させた際に、液体試料にまず反応試薬だけが溶出されて混在し、その後、反応試薬が既に良好に溶出して混在したあるいは反応した液体試料が、開口部よりも吸引方向奥側の位置、すなわち、流れ方向の下流側に位置する、展開流路の上流端部に流入して展開されることになる。この結果、反応試薬が均一な状態で溶出した液体試料を展開流路に良好に流入させることができて、良好な精度で、定性または定量することができる。

また、本発明のバイオセンサは、展開流路は基板上に支持されており、添加空間は、展開流路の上流端部に対応した基板の一端部とこの基板の一端部を覆う空間形成材とによって所要の吸引空間として形成されており、展開流路は所定の厚みを有し、添加空間に、この添加空間に入り込んだ展開流路の上流端部と基板との間に形成される展開流路の厚みに相当する段差を解消または軽減するように補填することで試料添加部の厚み方向の寸法を減少させて毛細管力を保持する補助基板が設けられていることを特徴とする。

この構成により、補助基板が設けられていることで、空間形成材によって形成された試料添加部が、血液サンプルなどの液体試料を毛細管力により良好に吸引するように保持され、液体試料を良好に吸引することができて、吸引量の不足を生じることがなくなる。

また、本発明のバイオセンサは、展開流路は基板上に支持されており、添加空間は、展開流路の上流端部に対応した基板の一端部からなり、試料添加部の厚さを規定するスペーサと、基板と対向して基板の一端部を覆う空間形成材とによって所要の吸引空間として形成されていることを特徴とする。

この構成によれば、添加空間内にて保持可能な体積は、添加空間の長さと幅だけでなく、スペーサの厚さにて規定することが可能となり、スペーサの厚さを変更することで、様々な体積を保持可能なバイオセンサを実現することができる。そのため、バイオセンサの構造をよりシンプルにすることが可能になると同時に、バイオセンサの構造のばらつきによる、反応度合のばらつきを極小化することが可能となり、より高精度な測定を実現することができる。

以上のように本発明によれば、試料添加部を、液体不透過性材料からなる空間形成材により添加空間を囲むことで構成したので、液体試料が試料添加部に保水されることなく展開流路を展開させることができる。したがって、従来のように、添加された液体試料が構成材料にて保水されてしまって、展開されない損失検体（デッドボリューム）が発生することを、最低限に抑えることができ、この結果、従来のクロマトセンサと比較して大幅な検体量（液体試料量）の削減を実現することができる。したがって、試料添加部の添加空間に、指先血を毛細管力にて吸引することが可能であり、この場合には、添加空間の吸引容積、すなわち、必要な血液の量を１０μｌ以下とすることも可能である。

また、反応試薬を液体不透過性の空間形成材により保持したことから、反応試薬は保持部である空間形成材に留まる、あるいは吸着されることなく、完全に溶出することが可能となり、反応試薬の溶出度合は常に一定となるばかりか、添加空間で液体試料と接触して溶解し、液体試料全体に拡がり反応した後に、展開流路を展開することが可能となり、反応試薬の残留及び反応試薬と未反応な液体試料の展開を回避することができる。

このように反応試薬の１００％の溶出を実現し、未反応な液体試料の展開を回避できる。また、液体不透過性材料からなる空間形成材により囲むことで添加空間を形成することによって、より正確かつ高精度・高感度な測定を可能とする簡易迅速測定の可能なバイオセンサを提供することができる。

また、反応試薬を、試料添加部における展開流路の延長線上の面とは異なる箇所に配設させたり、空間形成材における基板の面から離れて対向する上面部裏面に保持させたりすることで、試料添加部の添加空間に添加された液体試料に対して反応試薬がより均一に溶け出した状態で、展開流路に導入されることとなり、より正確かつ高精度・高感度な測定結果を得ることができる。

また、基板に、添加空間の厚さを調整する補助基板を配設したことにより、この添加空間に入り込んだ展開流路の上流端部と基板との間に形成される展開流路の厚みに相当する段差を解消または軽減するように補填することで添加空間の厚み方向の寸法を減少させて毛細管力を保持する補助基板を設けることで、添加空間が、液体試料を吸引する毛細管力が良好に作用して、液体試料を良好に吸引することができ、これによっても定性または定量時の精度を向上させることができる。

また、本発明のバイオセンサの空間形成材に、添加空間への液体試料の吸引を促進する空気孔を設けたことにより、添加空間に液体試料が添えられると同時に、添加空間内へと速やかに液体試料を吸引することが可能となり、一定量の液体試料を、より確実かつ一瞬の間に保持することができて、添加する液体試料が不足するような事態の発生を極小化することができる。

また、反応試薬に、分析対象物あるいは固定化試薬と特異的反応の可能な標識試薬を含ませたことにより、標識試薬と液体試料とは反応した後に展開流路を展開するため、標識試薬は確実に分析対象物と反応することができ、試薬固定化部における反応度合も均一化することができる。したがって、反応度合によって生じていた測定ばらつきも改善されて、より高精度な測定を実現することができる。

また、液体不透過性シートにより展開流路の表面を覆うことで、液体試料は、展開流路の表面から蒸発・乾燥することがなく、展開流路をクロマト下流領域まで展開することが可能となる。また、試薬固定化部におけるＢ／Ｆ分離が確実に行われるので、より正確な測定を行うことができ、より高感度かつ高精度な測定を実現することができる。

また、展開流路の流れ方向に沿った両側面を封止することにより、展開流路の両脇に逃れがちになる液体試料の展開を、クロマト下流領域方向へと促進することが可能となり、液体試料の展開を均一化できて、液体試料の展開の乱れによる反応度合のばらつきを極小化することが可能となる。

また、液体試料が血液である場合に、反応試薬に細胞収縮剤、または細胞収縮剤を含む混合試薬を含ませることにより、血液中の血球成分が、反応試薬である細胞収縮剤と接した際に速やかに収縮してその大きさが均一化され、血液の展開状態を均一化することが可能となって、より高精度な測定を実現することができる。

また、本発明によれば、液体試料を毛細管力にて吸引して保持することが可能な添加空間に、反応試薬を担持させ、展開流路を、その上流端部が、添加空間部内における血液液体試料吸引用の開口部よりも吸引方向奥側の位置までしか入り込んでいないように配設することで、添加空間に血液サンプルなどの液体試料を添加して吸引させた際に、液体試料に反応試薬が良好に溶出した後に、展開流路の上流端部に流入して展開されることになる。したがって、反応試薬が均一な状態で溶出した液体試料を展開流路に良好に流入させることができて、高精度に定性または定量することができるとともに、良好に高感度測定を行うことができる。

また、添加空間に、この添加空間に入り込んだ展開流路の上流端部と基板との間に形成される展開流路の厚みに相当する段差を解消または軽減するように補填することで添加空間の厚み方向の寸法を減少させて毛細管力を保持する補助基板を設けることで、添加空間が、液体試料を吸引する毛細管力が良好に作用して、液体試料を良好に吸引することができ、これによっても定性または定量時の精度を向上させることができる。

また、展開流路は基板上に支持されており、添加空間は、展開流路の上流端部に対応した基板の一端部からなり、添加空間の厚さを規定するスペーサと、基板と対向して基板の一端部を覆う空間形成材とによって所要の吸引空間として形成されていることにより、添加空間内にて保持可能な血液サンプルの体積を、スペーサの厚さの変更だけで容易に実現することができて、バイオセンサの構造をよりシンプルにすることが可能となると同時に、バイオセンサの構造のばらつきによる、反応度合のばらつきを極小化することが可能となって、より高精度な測定を実現できる。

本発明の第１の実施の形態に係るバイオセンサの斜視図 同バイオセンサの縦断面図 同バイオセンサの分解斜視図 同バイオセンサに液体試料が添加された場合の、バイオセンサにおける液体試料の展開状況を示す断面図 同バイオセンサに液体試料が添加された場合の、バイオセンサにおける液体試料の展開状況を示す断面図 同バイオセンサに液体試料が添加された場合の、バイオセンサにおける液体試料の展開状況を示す断面図 同バイオセンサに液体試料が添加された場合の、バイオセンサにおける液体試料の展開状況を示す断面図 同バイオセンサに液体試料が添加された場合の、バイオセンサにおける液体試料の展開状況を示す断面図 同第１の実施の形態の変形例に係るバイオセンサの斜視図 同バイオセンサの分解斜視図 同バイオセンサの縦断面図 同第１の実施の形態における他の変形例に係るバイオセンサの斜視図 同バイオセンサの分解斜視図 比較例のバイオセンサにより測定している状態を概略的に示す斜視図 本実施の形態のバイオセンサにより測定している状態を概略的に示す斜視図 本発明の第１の実施の形態の実施例１における測定結果の吸光度分布とＣＶ値を示す図 本発明の第１の実施の形態の実施例１における測定結果の吸光度分布とＣＶ値を示す図 本発明の第１の実施の形態の実施例２における測定結果の吸光度分布とＣＶ値を示す図 本発明の第１の実施の形態の実施例２における測定結果の吸光度分布とＣＶ値を示す図 本発明の第２の実施の形態に係るバイオセンサの構成を示す斜視図 同バイオセンサと分析装置とを用いた分析状態を概略的に示す斜視図 同バイオセンサの斜視図 同バイオセンサの分解斜視図 同バイオセンサを長手方向にカットした場合の断面図 同バイオセンサを幅方向にカットした場合の断面図 同バイオセンサの断面図 同バイオセンサに血液サンプルを添加した際の展開状況のイメージを示す断面図 同バイオセンサに血液サンプルを添加した際の展開状況のイメージを示す断面図 同バイオセンサに血液サンプルを添加した際の展開状況のイメージを示す断面図 同バイオセンサに血液サンプルを添加した際の展開状況のイメージを示す断面図 同バイオセンサに血液サンプルを添加した際の展開状況のイメージを示す断面図 同バイオセンサの試料添加部をなす空間形成材の分解斜視図 同バイオセンサの試料添加部をなす空間形成材の斜視図 同バイオセンサを測定する分析装置により分析する状態を簡略的に示す図 従来のバイオセンサの斜視図 従来のバイオセンサの縦断面図 従来のバイオセンサの分解斜視図 同従来のバイオセンサをケーシングに内蔵した最終状態を示す平面図 同従来のバイオセンサをケーシングに内蔵した最終状態を示す側面断面図 同従来のバイオセンサをケーシングに内蔵した最終状態の断面図 同従来のバイオセンサ上を液体試料が展開していく様子を示すバイオセンサの断面図 同従来のバイオセンサ上を液体試料が展開していく様子を示すバイオセンサの断面図 同従来のバイオセンサ上を液体試料が展開していく様子を示すバイオセンサの断面図 同従来のバイオセンサ上を液体試料が展開していく様子を示すバイオセンサの断面図 同従来のバイオセンサ上を液体試料が展開していく様子を示すバイオセンサの断面図 比較例のバイオセンサの斜視図 比較例のバイオセンサの分解斜視図 他の比較例のバイオセンサの斜視図 同他の比較例のバイオセンサの分解斜視図 同他の比較例のバイオセンサを長手方向にカットした場合の断面図

以下、本発明に係るバイオセンサの実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。なお、本実施の形態において、被検査物質とは実質的に分析対象物と同じものである。

図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃはそれぞれ本発明の第１の実施の形態に係るバイオセンサの構成を示す図であり、図１Ａはバイオセンサの斜視図、図１Ｂはバイオセンサの縦断面図、図１Ｃはバイオセンサの分解斜視図である。

図１Ａ〜図１Ｃに示すように、バイオセンサは、液体試料が添加される試料添加部１２（添加空間９）と、液体試料に反応する反応試薬１４と、反応試薬１４が混在する液体試料、あるいは反応試薬１４と反応した液体試料を展開する展開流路２と、試料添加部１２および展開流路２を支持する支持体としての基板１とを有し、免疫クロマトグラフィーを用いて、液体試料中の分析対象物の存否あるいは濃度を測定する。試料添加部１２は、液体不透過性材料からなる空間形成材８により微細な添加空間９を囲むことで構成され、試料添加部１２における微細空間形成材８の添加空間９に臨む箇所に、トレーサー（以下、標識試薬とも称す）を含む反応試薬１４が、添加空間９に添加された液体試料に溶け出し可能な状態で保持されている。なお、トレーサーとは、リガンド部分、およびこのリガンド部分に結合した検出可能な標識部分で構成される。

ここで、トレーサー（標識試薬）を含有する反応試薬１４は、試料添加部１２における展開流路２のクロマト展開方向上流領域が突入されている添加空間９の底面部に相当する基板１の上面（試料添加部１２における展開流路２の延長線上の面）とは異なる箇所に、展開流路２や基板１に接触しない状態で保持されている。この実施の形態では、反応試薬１４は、展開流路２が配設されている基板１の上面から所定距離だけ離れて対向する空間形成材８の上面部裏面に保持されている。

また、反応試薬１４は、測定対象である液体試料が、血球などの細胞成分を有しない血漿や血清などの場合には、標識試薬を含む一方で、細胞成分を収縮させる細胞収縮剤を含まない構成とされている。これに対して、測定対象である液体試料が、血球などの細胞成分を含む全血などの場合には、反応試薬１４は、標識試薬および細胞収縮剤を含む構成とされている。

展開流路２の一部には、特異的タンパク質が固定化された、測定領域としても用いられる試薬固定化部３が設けられている。また、展開流路２の表面は、クロマト展開方向の下流端領域（クロマト下流端とも称す）にある開放部１０を除いて、クロマト上流領域から少なくとも試薬固定化部３を含むクロマト下流領域まで、液体不透過性材料からなる液体不透過性シート７で覆われている。クロマト上流領域には、上記した、液体不透過性材料からなる空間形成材８により微細な添加空間９を囲むことで構成された試料添加部１２が設けられている。図１Ｂに示すように、添加空間９は液体試料を一定量吸引する（この実施の形態では毛細管現象により液体試料を一定量吸引する）ための、クロマト上流端にあたる空間であり、この添加空間９の先端は、液体試料をバイオセンサに供給するための開口部１１とされている。

また、この実施の形態では、バイオセンサのクロマト上流領域のみバイオセンサの底面部（支持体）をなす基板１の上に、スペーサとして機能する補助基板１８（材料は基板１と同様なもので、後述するように液体不透過性材料からなる）が重ねられて配設されている。展開流路２におけるクロマト上流領域の端部は、添加空間９における開口部１１よりも吸引方向奥側の位置、すなわち、クロマト展開方向の下流側の位置までしか配設されておらず、この展開流路２における上流端部から開口部１１までの領域には、展開流路２が設けられていない。前記補助基板１８は、添加空間９の底面部側の段差をなくすとともに、開口部１１に続く箇所において液体試料を良好に毛細管現象により吸引できるように添加空間９の厚み寸法（上下方向厚み）を調節する機能も有している。補助基板１８は液体不透過性材料から構成され、好ましくは展開流路２と同じ厚さによって展開流路２との段差をなくすように設定するとよいが、これに限るものではなく、展開流路２との段差を軽減させるだけの厚みでもよく、その材質も厚みも問わない。さらに、この箇所の添加空間９の厚みが小さくて、毛細管力を保持できれば、段差がそのまま存在しても、何ら差し支えない。また、補助基板１８は、必ずしも基板１とは別体にしなくてもよく、補助基板１８に相当する肉厚部分を基板１に一体形成してもよい。なお、補助基板１８に相当する肉厚部分を基板１に一体形成したり、別体の補助基板１８を基板１に精度よく接合させたりすることで、添加空間９を形成するために空間形成材８を基板１上に取り付ける際に、空間形成材８を基板１上にゆがみ無く取り付けることができて、組み付け精度が向上する利点もある。

次に、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅを用いて、バイオセンサ上の液体試料の展開状況を説明する。図２Ａ〜図２Ｅは、それぞれ、本発明の実施の形態に係るバイオセンサに液体試料が添加された場合の、バイオセンサにおける液体試料の展開状況を示す断面図である。

図２Ａに示すように、試料添加部１２の開口部１１に、血液サンプルＳなどの液体試料が点着（添加）される（Ｓｔｅｐ１）と、図２Ｂに示すように、添加空間９へ一定量の液体試料が毛細管現象により吸引され、添加空間９内は液体試料で満たされる（Ｓｔｅｐ２）。添加空間９に液体試料が吸引されると、反応試薬１４の試薬（標識試薬、または標識試薬および細胞収縮剤）が液体試料と接触し、速やかに溶解し始める。添加空間９に液体試料が満たされると、溶解した標識試薬、または標識試薬および細胞収縮剤（以下、単に標識試薬等と称す）は、液体試料と反応して添加空間９全体へ拡散していきながら、図２Ｃに示すように、液体試料は展開流路２へと展開していく（Ｓｔｅｐ３）。

展開流路２を展開する液体試料は、標識試薬等と反応した状態で展開し、図２Ｄに示すように、試薬固定化部３に到達した後、通過する（Ｓｔｅｐ４）。試薬固定化部３に到達すると、液体試料中に分析対象物が存在する場合、標識試薬および分析対象物と固定化試薬との間で特異的反応が行われ、試薬固定化部３には標識試薬由来の呈色反応が生じる。展開流路２をさらに展開した液体試料は、展開流路２における液体不透過性シート７により覆われている領域では、液体不透過性シート７の働きにより表面からの水分蒸発が阻止されており、液体不透過性シート７により覆われていない開放部１０に到達して初めて水分蒸発が始まる（図２Ｅ参照）。この乾燥過程は液体試料の移動を助け、試料添加部１２から開放部１０への液体試料の展開が促進される。試料添加部１２は、液体不透過性材料から構成された微細空間であり、微細空間内で保持されることなく、液体の展開移動によって、クロマト下流方向へと移動していく（Ｓｔｅｐ５）。これらの過程を経緯して試薬固定化部３に出現した標識試薬の反応を、目視あるいは測定装置を用いて検出することにより、液体試料中の分析対象物の存在、あるいは濃度を確認することが可能となる。

なお、ここで示す展開流路２は、液体が毛細管力（毛細管現象により生じる力）で移動可能な任意の材料で構成された、液体試料が展開可能な流路である。この展開流路２は、液体試料により湿潤され、液体試料を展開可能な流路を形成できる材料であればよく、濾紙、不織布、メンブレン、布、ガラス繊維等多孔質な任意の材料でよい。あるいは、流路を中空の毛細管で形成してもよく、このような場合の中空の毛細管材料は、樹脂材料等で構成できる。

また、標識試薬は、抗体に金コロイドなどの標識物を標識したもので、前記試薬固定化部３における結合を検出する手段として用いられるものである。前述した金コロイドはほんの標識試薬の一例に過ぎず、金属あるいは非金属コロイド粒子、酵素、タンパク質、色素、蛍光色素、発光物質、ラテックスなどの着色粒子など、必要に応じて任意に選択可能である。

更に、試薬固定化部３に使用する抗体は、標識試薬および被検査物質との複合体を形成できれば良く、従って、被検査物質に対するエピトープもしくは親和性は、同じであっても異なっていても何れでも良い。２つの抗体の親和性は異なるが、エピトープが同じでも何ら問題はない。

また、図１Ａ〜図１Ｃ及び図２Ａ〜図２Ｅに示すバイオセンサの構成では、試薬固定化部３が１箇所だけに設けられている例を示すが、これは必ずしも１箇所である必要はなく、複数箇所でもよく、１箇所以上であれば、その目的に応じて自在に選択できる。また、展開流路２上の試薬固定化部３の形状についても、ライン状である必要はなく、スポット形状、もしくは、文字形状、鍵型形状など、自由に選択でき、複数の試薬固定化部を設定した場合においては、空間的に離れているあるいは、見かけ上一本のライン状に見えるように接触させるなど、様々な位置関係を設定することも可能である。

展開流路２を覆う液体不透過性シート材７は、例えば透明ＰＥＴテープで構成される。前記液体不透過性シート材７は、試料添加部となる添加空間９に接続する部分、および前記液体試料の到達する下流端を除き、展開流路２を密着被覆する。

このように液体不透過性シート材７により展開流路２を被覆することで、試料添加部１２（添加空間９）以外への点着を防止して保護すると共に、外部からの汚染を防止する作用を持たせることができる。さらにこればかりでなく、液体試料の展開時に、液体試料が展開しながら蒸発してしまうことを防止し、展開流路２上の反応部分である試薬固定化部３を必ず液体試料が通過し、前記試薬固定化部３において液体試料中の被検査物質との反応を効率よく行うようにすることができる。ここでの外部からの汚染とは、この展開流路２上の反応部分に対して不用意に液体試料が接触することや、被験者が手などで展開流路２に直接接触することなどを指す。前記展開流路２を被覆する液体不透過性シート材７には、透明な材料を用いることが好ましく、前記試薬固定化部３を覆う部分は、シグナルを測定する部分であるから、少なくとも光が透過可能な状態を持たせることが好ましい。

また、より高精度な測定を行う場合には、展開流路２の上面部および側面部を、特に前記試薬固定化部３を含んで密着密閉し、かつ、液体試料の展開方向に対して平行な側面を、同様に密着、密閉させる構造をとることもできる。このように、展開流路２の上面部だけでなく、両側面部も液体不透過性シート材７により覆うことで、この側面部からの液体試料の蒸発・乾燥を阻むことが可能となり、展開流路２における両脇部分に逃れがちになる液体試料の展開を、クロマト下流領域方向へと促進することが可能となる。なお、液体不透過性シート材７により両側面部を覆う代わりに、図３Ａに示すように、両側面部を封止してもよく（図３Ａにおいては、展開流路２の両側部および基板１の両側面部も封止している場合を示しているがこれに限るものではない）、封止する方法としては、封止材１７を用いて塗布または充填してもよいが、これに限るものではなく、展開流路２の製造工程においてレーザーを走査し溶融するあるいはレーザーで切断することで、切断と同時に両側面部の孔部を封止することが可能である。また、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｂに示すように、添加空間９への毛細管力を促進するための空気孔１３を、添加空間９を形成する空間形成材８の一方の端部における側面部分に代えて、上面部分に開口させて形成してもよい。

なお、基板１は、ＰＥＴフィルムなどの液体不透過性シート材で構成され、透明、半透明、不透明のいずれをとってもよいが、例えば光学的検出機器を使用する場合などは、透過光を測定する場合は透明、反射光を測定する場合は不透明の材料を用いるのが好ましい。また、その材質は、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂材料の他、金属、ガラス等、液体不透過性の材料を用いることが可能である。

試料添加部１２における添加空間９を形成する液体不透過性材料からなる微細空間形成材８は、液体試料を一定量吸引して保持するばかりでなく、添加後のバイオセンサを取り扱う際に、液体試料の外部への汚染を保護する役割をも有する。この微細空間形成材８には、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂材料の他、金属、ガラス等、液体不透過性の材料を用いることが可能であり、また、透明もしくは半透明であることが好ましいが、透明でなくて有色であってもよく、あるいはこの不透明の材料の場合には任意の材料で構成できる。

クロマト下流端の開放部１０には、液体不透過性シート７が設けられておらず、開放されているため、液体試料が到達した後、あるいは到達しながら揮発もしくは蒸発する。さらには、開放部１０に液体試料が滲み出て、開放部１０における展開流路２の上部にのみ、液体試料が、添加空間９内の展開流路２の上部にある液体試料と同じ高さ、もしくは準じた高さまで至る。

［実施例１］
（血漿を用いたＣＲＰの定量）
（ａ）比較例のバイオセンサの作製
まず、比較例のバイオセンサ（免疫クロマトセンサ）の製造方法について説明する。ここで、予めこの比較例のバイオセンサの構造を簡略的に説明する。図１７Ａは比較例のバイオセンサの斜視図、図１７Ｂはバイオセンサの分解斜視図である。図１７Ａ、図１７Ｂに示すように、このバイオセンサは、図１４Ａ〜図１４Ｃに示す従来のバイオセンサとほぼ同様な構成とされているが、展開流路２に、抗ＣＲＰ抗体Ａを固定化した第１試薬固定化部（第１固定化抗体ラインとも称す）３Ａと抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２試薬固定化部（第２固定化抗体ラインとも称す）３Ｂと、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）を保持した標識試薬保持部４とを有している。

このバイオセンサは、次のようにして製造した。

リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ａ溶液を準備した。この抗体溶液は溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜上に塗布した。次に同様にして、試料添加部領域５から下流側に４ｍｍ離れた部分に、抗ＣＲＰ抗体Ｂ溶液を塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に試薬固定化部３である第１固定化抗体ライン３Ａおよび第２固定化抗体ライン３Ｂが得られた。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にニトロセルロース膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にて更に１０分間緩やかに振り、ニトロセルロース膜の洗浄を行った。次に、０．０５％シュクロースモノラウレートを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して１０分間緩やかに振った後に、ニトロセルロース膜を液槽から取り出して、室温で乾燥させた。これにより、展開流路２が得られた。

標識試薬の金コロイドは、還流中の０．０１％の塩化金酸１００℃溶液に１％クエン酸３ナトリウム溶液を加えることによって調製した。還流を１５分間続けた後に、室温放置にて冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ８．９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ＣＲＰ抗体Ｃを加えて数分間攪拌した後に、ｐＨ８．９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体−金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ５％スクロース・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、５２０ｎｍの吸光度が１５０となるように調製して、４℃で貯蔵した。前記標識抗体溶液を溶液吐出装置にセットして、固定化抗ＣＲＰ抗体Ａ及び固定化抗ＣＲＰ抗体Ｂが塗布された乾燥膜上の第１固定化抗体ライン３Ａおよび第２固定化抗体ライン３Ｂから離れた位置に反応試薬（標識試薬）を塗布して、液体試料の添加開始方向から順番に、標識試薬保持部４、第１固定化抗体ライン３Ａ、第２固定化抗体ライン３Ｂの位置関係になるようにした後に、ニトロセルロース膜を真空凍結乾燥させた。これによって、標識試薬保持部４および試薬固定化部３（第１固定化抗体ライン３Ａ、第２固定化抗体ライン３Ｂ）を備えた展開流路２が得られた。

次に、調製された反応試薬（標識試薬）を含む展開流路２を、厚さ０．５ｍｍの白色ＰＥＴからなる基板１上に貼り付け、標識試薬保持部４よりも展開上流側に試料添加部領域５を、展開流路末端（下流端）からさらに展開下流側へ吸水部６を、それぞれ展開流路２もしくは標識試薬保持部４へ毛細管流にて接続可能なように貼り付けた。その後、レーザーを用いて、２．０ｍｍの幅に切断した。こうして従来構造の免疫クロマトセンサとしてのバイオセンサを製造した。

（ｂ）本発明のバイオセンサの作製
本発明のバイオセンサ（免疫クロマトセンサ）の製造方法について説明する。図４Ａは本発明の他の実施の形態に係るバイオセンサの斜視図、図４Ｂはバイオセンサの分解斜視図である。図４Ａ、図４Ｂ、図１Ａ〜図１Ｃに示すように、このバイオセンサは、図１Ａ〜図１Ｃに示すバイオセンサとほぼ同様な構成とされているが、ニトロセルロース膜からなる展開流路２上に、抗ＣＲＰ抗体Ａを固定化した第１試薬固定化部（第１固定化抗体ラインとも称す）３Ａと抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２試薬固定化部（第２固定化抗体ラインとも称す）３Ｂとが設けられ、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）を保持した反応試薬１４が設けられている。

このバイオセンサは、次のようにして製造した。

リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ａ溶液を準備した。この抗体溶液は溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜上に塗布した。次に同様にして、試料添加部１２より下流側に４ｍｍ離れた部分に、抗ＣＲＰ抗体Ｂ溶液を塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に試薬固定化部３である第１固定化抗体ライン３Ａおよび第２固定化抗体ライン３Ｂが得られた。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にニトロセルロース膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にて更に１０分間緩やかに振り、ニトロセルロース膜の洗浄を行った。次に、０．０５％シュクロースモノラウレートを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して１０分間緩やかに振った後に、ニトロセルロース膜を液槽から取り出して、室温で乾燥させた。これにより、展開流路２が得られた。

反応試薬（標識試薬）１４の金コロイドは、還流中の０．０１％の塩化金酸１００℃溶液に１％クエン酸３ナトリウム溶液を加えることによって調製した。還流を１５分間続けた後に、室温放置にて冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ８．９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ＣＲＰ抗体Ｃを加えて数分間攪拌した後に、ｐＨ８．９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体−金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ５％スクロース・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、５２０ｎｍの吸光度が５０となるように調製して、４℃で貯蔵した。次に厚さ１００μｍの透明ＰＥＴを積層させて作製した空間形成材８を貼り付け、微細な添加空間（幅２．０ｍｍ×長さ７．０ｍｍ×高さ０．３ｍｍ）９を形成した。この添加空間９に、前記標識抗体溶液を３μｌ塗布し風乾することで、反応試薬１４が得られた。

次に、調製された展開流路２を、厚さ０．５ｍｍの白色ＰＥＴからなる基板１上に貼り付け、クロマト展開の上下流側をいずれも３ｍｍ程度除く展開流路２の表面に透明テープを貼り付けた。その後、レーザーを用いて、２．０ｍｍの幅に切断した。切断後、透明テープを貼り付けない始端部分（クロマト上流側）上に、反応試薬１４を保持する空間形成材８を貼り付け、添加空間９を形成した。こうして本発明の免疫クロマトセンサとしてのバイオセンサを製造した。

（ｃ）液体試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液から血漿を分離し、既知濃度のＣＲＰ溶液を加えることにより、ＣＲＰ濃度０．１ｍｇ／ｄｌ、１ｍｇ／ｄｌの血漿を調整した。

（ｄ）バイオセンサ上の呈色度合の測定
前記（ａ）および（ｂ）の作製工程で作製されたバイオセンサの試料添加部５、１２に、前記（ｃ）工程にて調整したＣＲＰを含む血漿を添加し、クロマト下流方向へと展開処理して、抗原抗体反応をさせた。これらの（ａ）工程および（ｂ）工程で作製されたバイオセンサに液体試料を添加してから５分後の試薬固定化部３Ａ、３Ｂにおける呈色状況を計測した。図５Ａは上記比較例のバイオセンサにより測定している状態を概略的に示す斜視図、図５Ｂは本実施の形態のバイオセンサにより測定している状態を概略的に示す斜視図である。ここで、図５Ａ、図５Ｂにおいて、２１は、６３５ｎｍの半導体レーザーからなる光源を照射する照射部、２２は、バイオセンサからの反射散乱光を受ける受光素子（フォトダイオード）で構成される受光部である。この装置構成において、バイオセンサを走査し、第１試薬固定化部３Ａおよび第２試薬固定化部３Ｂにおける標識抗体結合量を展開流路２からの反射散乱光を演算処理して、吸光度として結果を得る。前記（ａ）（ｂ）の各工程で作製した１０個（Ｎ＝１０）のバイオセンサ（従来のバイオセンサ（仕様（ａ））と本発明の実施の形態に係るバイオセンサ（仕様（ｂ）））に対して同時再現性の測定を行った際の測定結果を図６Ａ、図６Ｂに示す。

図６Ａおよび図６Ｂは、第１試薬固定化部３Ａおよび第２試薬固定化部３Ｂにおける吸光度の測定結果を示したものであり、ＣＲＰ濃度において０．１ｍｇ／ｄｌでは第１試薬固定化部３Ａが、１ｍｇ／ｄｌでは第２試薬固定化部３Ｂが定量演算に用いることから、０．１ｍｇ／ｄｌでは第１試薬固定化部３Ａの吸光度とＣＶ値を、１ｍｇ／ｄｌでは第２試薬固定化部３Ｂの吸光度とＣＶ値を示している。なお、ＣＶ値とは標準偏差／平均値×１００を示す。

図６Ａ、図６Ｂに示すように、いずれの濃度においても仕様（ｂ）と比較して仕様（ａ）の方が吸光度は低い。これは本発明の課題において述べたように、従来のバイオセンサでは、展開流路２に担持された標識試薬が完全に溶出していないためと、添加した液体試料中の分析対象物であるＣＲＰと標識試薬とが十分に反応していないために低い吸光度となった結果であり、仕様（ｂ）、すなわち本発明のバイオセンサの吸光度が高くなったのは、この２点を解消して標識試薬の完全な溶出と、分析対象物とＣＲＰと標識試薬との十分な反応を実現し、かつこの反応液体試料が展開流路２を十分に展開することを可能にしたからであることが良好にうかがえる。

更にＣＶ値を比較すると、両仕様によるＣＶ値に大きな相違は出ておらず、粘度が低く展開性の良好な血漿を検体として用いたことにより展開に大きなばらつきが生じていないことがわかる。この結果から、吸光度が２つの仕様で異なる要因は、標識試薬を保持した部位及び担体に起因しており、本発明を用いることで感度が向上し、高感度測定実現が可能になったことがうかがえる。また、本発明の実施例１のバイオセンサでは、液体透過性の構成部材が減ったことにより、検体量も大幅に減少させることが可能となる。

［実施例２］
（全血を用いた血中ＣＲＰの定量）
（ａ）比較例のバイオセンサの作製
ニトロセルロース膜上に、抗ＣＲＰ抗体Ａを固定化した第１試薬固定化部（第１固定化抗体ラインとも称す）３Ａ、および抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２試薬固定化部（第２固定化抗体ラインとも称す）３Ｂ、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）を保持した標識試薬保持部４を含むバイオセンサを製造した。図１７Ａは比較例のバイオセンサの斜視図、図１７Ｂはバイオセンサの分解斜視図である。

この免疫クロマトセンサは、次のようにして製造した。

リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ａ溶液を準備した。この抗体溶液は溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜上に塗布した。次に同様にして、試料添加部より下流側に４ｍｍ離れた部分に、抗ＣＲＰ抗体Ｂ溶液を塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に試薬固定化部３である第１固定化抗体ライン３Ａおよび第２固定化抗体ライン３Ｂが得られた。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にニトロセルロース膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にて更に１０分間緩やかに振り、ニトロセルロース膜の洗浄を行った。次に、０．０５％シュクロースモノラウレートを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して１０分間緩やかに振った後に、ニトロセルロース膜を液槽から取り出して、室温で乾燥させた。これにより、展開流路２が得られた。

反応試薬（標識試薬）の金コロイドは、還流中の０．０１％の塩化金酸１００℃溶液に１％クエン酸３ナトリウム溶液を加えることによって調製した。還流を１５分間続けた後に、室温放置にて冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ８．９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ＣＲＰ抗体Ｃを加えて数分間攪拌した後に、ｐＨ８．９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体−金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ５％スクロース・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、５２０ｎｍの吸光度が１５０となるように調製して、４℃で貯蔵した。前記標識抗体溶液を溶液吐出装置にセットして、固定化抗ＣＲＰ抗体Ａ及び固定化抗ＣＲＰ抗体Ｂが塗布された乾燥膜上の第１固定化抗体ライン３Ａおよび第２固定化抗体ライン３Ｂから離れた位置に反応試薬（標識試薬）を塗布して、液体試料の添加開始方向から順番に、標識試薬保持部４、第１固定化抗体ライン３Ａ、第２固定化抗体ライン３Ｂの位置関係になるようにした後に、ニトロセルロース膜を真空凍結乾燥させた。これによって、標識試薬保持部４および試薬固定化部３（第１固定化抗体ライン３Ａ、第２固定化抗体ライン３Ｂ）を備えた展開流路２が得られた。

次に、調製された標識試薬を含む反応層担体を、厚さ０．５ｍｍの白色ＰＥＴからなる基板１上に貼り付け、標識試薬保持部４から終端部分にかけて、透明テープを貼り付けた。その後、レーザーを用いて、２．０ｍｍの幅に切断した。切断後、透明テープを貼り付けない始端部分上に、厚さ１００μｍの透明ＰＥＴを積層させて作製した空間形成材８を貼り付け、微細な添加空間（幅２．０ｍｍ×長さ７．０ｍｍ×高さ０．３ｍｍ）９を形成した。

前記空間形成材８はあらかじめ１０％塩化カリウム水溶液を点着した後に、液体窒素にて直ちに凍結し、凍結乾燥を行い、これによって、塩化カリウムが乾燥状態で保持された細胞収縮剤を保持する空間形成材８を有するバイオセンサを作製したものである。こうして比較例の免疫クロマトセンサを製造した。すなわち、この比較例としてのバイオセンサでは、図１７Ａ、図１７Ｂには図示していないが、図４Ａ、図４Ｂに示すものと同様な空間形成材８を有している。しかし、空間形成材８には、細胞収縮剤のみ保持され、標識試薬保持部４は反応層担体（展開流路２）の上流側領域に配設されている。

ｂ）本発明の免疫クロマトセンサの作製
ニトロセルロース膜上に第１試薬固定化部（第１固定化抗体ラインとも称す）３Ａ、および抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２試薬固定化部（第２固定化抗体ラインとも称す）３Ｂ、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）および細胞収縮剤を保持した反応試薬１４を含む本発明のバイオセンサを製造した。図４Ａは、このバイオセンサの斜視図を、図４Ｂは分解斜視図を示す。

このバイオセンサは、次のようにして製造した。

リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ａ溶液を準備した。この抗体溶液は溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜上に塗布した。次に同様にして、試料添加部１２より下流側に４ｍｍ離れた部分に、抗ＣＲＰ抗体Ｂ溶液を塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に試薬固定化部３である第１固定化抗体ライン３Ａ、および抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２固定化抗体ライン３Ｂが得られた。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にニトロセルロース膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にて更に１０分間緩やかに振り、膜の洗浄を行った。次に、０．０５％シュクロースモノラウレートを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して１０分間緩やかに振った後に、膜を液槽から取り出して、室温で乾燥させた。これにより、展開流路２が得られた。

標識試薬の金コロイドは、還流中の０．０１％の塩化金酸１００℃溶液に１％クエン酸３ナトリウム溶液を加えることによって調製した。還流を１５分間続けた後に、室温放置にて冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ８．９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ＣＲＰ抗体Ｃを加えて数分間攪拌した後に、ｐＨ８．９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体−金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ５％スクロース・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、５２０ｎｍの吸光度が５０となるように調製した。さらに前記標識抗体溶液に塩化カリウムが最終濃度１０％になるよう加えた、標識抗体−細胞収縮剤混合溶液を調整したのち４℃で貯蔵した。次に厚さ１００μｍの透明ＰＥＴを積層させて作製した空間形成材８を貼り付け、添加空間（幅２．０ｍｍ×長さ７．０ｍｍ×高さ０．３ｍｍ）９を形成した。この添加空間９に、前記標識抗体−細胞収縮剤混合溶液を３μｌ塗布して風乾することで、反応試薬１４が得られた。

次に、調製された展開流路を、厚さ０．５ｍｍの白色ＰＥＴからなる基板１上に貼り付け、クロマト展開の上下流側をいずれも３ｍｍ程度除く展開流路２の表面に透明テープを貼り付けた。その後、レーザーを用いて、２．０ｍｍの幅に切断した。切断後、透明テープを貼り付けない始端部分（クロマト上流側）上に、反応試薬１４を保持する空間形成材８を貼り付け、添加空間９を形成した。こうして本発明のバイオセンサを製造した。

ｃ）液体試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液に、既知濃度のＣＲＰ溶液を加えることにより、ＣＲＰ濃度０．１ｍｇ／ｄｌ、１ｍｇ／ｄｌの血液（全血）を調整した。

ｄ）バイオセンサ上の呈色度合の測定
前記（ａ）および（ｂ）の作製工程で作製されたバイオセンサの試料添加部５、１２に、前記（ｃ）工程にて調整したＣＲＰを含む全血を添加し、クロマト下流方向へと展開処理して、抗原抗体反応をさせた。これらの（ａ）工程および（ｂ）工程で作製されたバイオセンサに液体試料を添加してから５分後の試薬固定化部３Ａ、３Ｂにおける呈色状況を計測した。図５Ａは上記従来のバイオセンサにより測定している状態を概略的に示す斜視図、図５Ｂは本実施の形態のバイオセンサにより測定している状態を概略的に示す斜視図である。ここで、図５Ａ、図５Ｂにおいて、２１は、６３５ｎｍの半導体レーザーからなる光源を照射する照射部、２２は、バイオセンサからの反射散乱光を受ける受光素子（フォトダイオード）で構成される受光部である。この装置構成において、バイオセンサを走査し、第１試薬固定化部３Ａおよび第２試薬固定化部３Ｂにおける標識抗体結合量を展開流路２からの反射散乱光を演算処理して、吸光度として結果を得る。前記（ａ）（ｂ）の各工程で作製した１０個（Ｎ＝１０）のバイオセンサ（従来のバイオセンサ（仕様（ａ））と本発明の実施の形態に係るバイオセンサ（仕様（ｂ）））に対して同時再現性の測定を行った際の測定結果を図７Ａ、図７Ｂに示す。

図７Ａおよび図７Ｂは、第１試薬固定化部３Ａおよび第２試薬固定化部３Ｂにおける吸光度の測定結果を示したものであり、ＣＲＰ濃度において０．１ｍｇ／ｄｌでは第１試薬固定化部３Ａが、１ｍｇ／ｄｌでは第２試薬固定化部３Ｂが定量演算に用いられることから、０．１ｍｇ／ｄｌでは第１試薬固定化部３Ａの吸光度とＣＶ値を、１ｍｇ／ｄｌでは第２試薬固定化部３Ｂの吸光度とＣＶ値を示している。

図７Ａ、図７Ｂに示すように、いずれの濃度においても仕様（ｂ）と比較して仕様（ａ）の方が吸光度は低い。これは本発明の課題において述べたように、従来のバイオセンサでは、展開流路２に担持された標識試薬が完全に溶出していないためと、添加した液体試料中の分析対象物であるＣＲＰと標識試薬とが十分に反応していないために低い吸光度となった結果であり、仕様（ｂ）、すなわち本発明のバイオセンサの吸光度が高くなったのは、この２点を解消して標識試薬の完全な溶出と、分析対象物とＣＲＰと標識試薬との十分な反応を実現し、かつこの反応した液体試料が展開流路２を十分に展開することを可能にしたからであることが良好にうかがえる。

更にＣＶ値を比較すると、仕様（ｂ）、すなわち本発明のバイオセンサの方がＣＶ値が良好な結果が得られている。本実施例では、全血を展開するために、展開流路２における溶液の展開は不均一な状態となっているが、仕様（ｂ）の吸光度ばらつきは非常に小さく、その結果は血漿を展開した実施例１のものと遜色ないものである。これは、添加空間９内で標識試薬および細胞収縮剤と全血とが均一に反応したことによるもので、両試薬と同時に反応することが可能になったことから、より均一な反応状態となって、溶液の展開性を改善した効果であるといえる。

以上のように、実施例１および実施例２の結果から、本発明により正確かつ高精度・高感度な測定を可能とする簡易迅速測定の可能な免疫クロマトセンサとしてのバイオセンサを提供することができることが確認できた。

なお、前記実施例１、２においては、ニトロセルロース膜上に試薬固定化部３、３Ａ、３Ｂなどを設けたバイオセンサを用いたが、展開経路２としては、ニトロセルロース膜に限らず、液体試料により湿潤かつ該液体試料を展開可能な流路を形成できる材料であればよく、濾紙、不織布、メンブレン、布、ガラス繊維等多孔質な任意の材料でよい。あるいは、流路を中空の毛細管で形成してもよく、このような場合、材料は、樹脂材料などで構成できる。

また、標識試薬を構成する標識物としては、金コロイドを用いて例を示したが、着色物質、蛍光物質、燐光物質、発光物質、酸化還元物質、酵素、核酸、小胞体でもよく、反応の前後において何らかの変化が生じるものであれば何を用いてもよく、必要に応じて任意に選択可能であり、反応系に応じて変性剤または基質などの試薬を含んでも良い。

また、前記試第１試薬固定化部３Ａおよび第２試薬固定化部３Ｂに使用する抗体は、標識試薬、及び、分析対象物との複合体を形成できれば良く、従って、分析対象物に対するエピトープもしくは親和性は、同じであっても異なっていてもいずれでも良い。２つの抗体の親和性は異なるが、エピトープが同じでも何ら問題はない。

また、呈色度合を読み取る方法としては、照射部２１、および受光部２２を用いて光学的変化により、液体試料の展開状況を検知する方法による結果を示したが、この他にも電気的変化や、電磁的変化を読み取るものであったり、画像としてとらえるものであったり、任意の手段を用いてよい。

また、細胞収縮剤として塩化カリウムを用いた試薬構成を示したが、この細胞収縮剤は前記液体試料中に細胞成分を含む場合に設置すべき試薬であり、細胞成分を含まない液体試料を用いる場合には、特に必要ではない。また、細胞収縮剤は、細胞を収縮する効果のある塩化カリウムや塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム塩等を含む無機化合物や、グリシン、グルタミン酸、等のアミノ酸、プロリン等のイミノ酸、グルコース、スクロース、トレハロースなどの糖類、グルシトール等の糖アルコール等を用いても、同様に実施可能である。このような細胞収縮剤を含む系は、特に液体試料として全血を用いる場合に有効である。本実施の形態では、微細空間に標識試薬を担持、あるいは標識試薬に細胞収縮剤を混合した溶液を担持した場合を例に挙げて説明したが、それ以外の任意の試薬が単独で、または混合された混合試薬の状態で担持しても何ら問題はない。

また、上記実施の形態においては、トレーサーを含む反応試薬１４が、展開流路２が配設されている基板１の上面から所定距離だけ離れて対向する空間形成材８の上面部裏面に保持されている場合を述べ、この場合は、トレーサー（標識試薬）が、基板１の上面（添加空間の底面部）に配設されている場合に比べて、より均一に液体試料に溶け出した状態で、展開流路２に導入されることとなり、この結果、一層、正確かつ高精度・高感度な測定結果を得ることができる。つまり、反応試薬１４が、試料添加部１２における底面部分、基板１の上面に配設されている場合には、反応試薬１４と展開流路２のクロマト上流端領域とが接触したり、極めて近接したりするので、液体試料に標識試薬が溶け出した直後の、不均一な状態の液体試料が展開流路２に導入され、精度が低下したり感度が低下したりするおそれがあるが、上記構成によりこのような不具合の発生を抑えることができる。
なお、上記構成に限るものではなく、トレーサーを含む反応試薬１４を、空間形成材８の側面部内面などに配設することも可能であるが、この場合でも、展開流路２から接触せず、離間していることが望ましい。

なお、添加空間における標識試薬については、試薬を一定量塗布した後に乾燥させる方法を例に述べたが、上面部裏面や底面部より上方に延びる側面全体に配置する方法あるいは、いずれかの面の一部に配置する方法など、上面部裏面や底面部より上方に延びる側面の任意の位置に配置するので何ら問題はなく、塗布に限らず噴霧し付着させる方法など添加空間に添加された液体試料に溶け出し可能な状態で保持される任意の手段を用いてよい。

また、測定される液体試料としては、例えば、水や水溶液、尿、血漿、血清、唾液などの体液、固体および粉末や気体を溶かした溶液などがあり、その用途としては、例えば、血液検査や尿検査、水質検査、便検査、土壌分析、食品分析などがある。また、被検査物質としてｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を例として実施例を述べたが、抗体、免疫グロブリン、ホルモン、酵素及びペプチドなどのタンパク質及びタンパク質誘導体や、細菌、ウイルス、真菌類、マイコプラズマ、寄生虫ならびにそれらの産物及び成分などの感染性物質、治療薬及び乱用薬物などの薬物及び腫瘍マーカーが挙げられる。具体的には、例えば、絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン、濾胞形成ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン、副腎脂質刺激ホルモン、エストラジオール、前立腺特異抗原、Ｂ型肝炎表面抗体、ミオグロビン、ＣＲＰ、心筋トロポニン、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン等でも何ら問題はない。また、水質検査や土壌分析などの環境分析、食品分析などにも実施可能である。簡便かつ迅速で、高感度・高性能な測定が実現でき、また、いつでもどこでも誰でも測定が可能であるため、ＰＯＣＴ向けの分析装置としても利用できる。

以下、本発明に係るバイオセンサの第２の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。

図８は、本実施の形態に係るバイオセンサの構成を示す斜視図であり、図９は同バイオセンサおよび分析装置を用いた分析状態を概略的に示す斜視図である。また、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄは、図８に示すバイオセンサの構成を示す図であり、図１０Ａはバイオセンサの斜視図、図１０Ｂはバイオセンサの分解斜視図、図１０Ｃはバイオセンサの縦断面図、図１０Ｄはバイオセンサの横断面図である。

図１０Ａ〜図１０Ｄに示すように、バイオセンサ（試験片）２０は、添加された液体試料としての血液サンプルＳを毛細管力にて吸引して保持する添加空間（キャピラリチャンバ）９と、血液サンプルＳと血液サンプルＳ中の分析対象物に対して特異的反応が可能な反応試薬とを展開させる展開流路２と、添加空間９の底面部をなすとともに展開流路２を支持する支持体としての基板１などを有し、クロマトグラフィーを用いて血液サンプルＳ中の分析対象物の存否あるいは濃度を測定する。添加空間９は、基板１の一端部（後述するクロマト流れ方向の上流端部）上に、微細な空間である添加空間９を上方ならびに両側方から囲むように空間形成材８が載せられて、この空間形成材８の両側部下面が接合されて形成されている。そして、添加空間９には、一方の端部に形成された孔部を通して、展開流路２の上流部分が突入され、また、添加空間９の他方の端部には、血液サンプルを添加する開口部１１が形成されている。さらに、添加空間９を形成する空間形成材８の一方の端部における上面部分に開口して、毛細管力を促進するための空気孔１３が形成されている。

また、添加空間９には、標識試薬を含む反応試薬１４が、添加空間９に添加された血液サンプルに溶け出して混在・反応可能な状態で保持されている。なお、標識試薬は、リガンド部分と、このリガンド部分に結合して検出可能な標識部分とで構成されている。また、反応試薬１４には、標識試薬に加えて、血液サンプル中の血球成分と反応して、血球成分を収縮させる血球収縮剤が含まれている。

ここで、標識試薬を含有する反応試薬１４は、添加空間９において、展開流路２との厚み方向に沿ってこの展開流路の延長線上とは異なる位置に、展開流路２や基板１に接触しない状態で、担持されている。この実施の形態では、反応試薬１４は、展開流路２が配設されている基板１の上面から添加空間９を介して、その厚み方向に所定距離だけ離れて対向する空間形成材８の上面部裏面に保持されている。

展開流路２の一部には、特異的タンパク質が固定化された、測定領域としても用いられる試薬固定化部３が設けられている。また、展開流路２の表面は、添加空間９に入り込んでいる展開流路２の上流端箇所（クロマト流れ方向の上流端領域）と、クロマト流れ方向の下流端領域（クロマト下流端とも称す）にある開放部１０とを除いて、添加空間９外のクロマト上流領域から少なくとも試薬固定化部３を含むクロマト下流領域まで、液体不透過性材料からなる液体不透過性シート７で覆われている。展開流路２のクロマト上流領域は、空間形成材８から添加空間９内に入り込んでいる。図１０Ｃに示すように、添加空間９は、毛細管現象により血液サンプルを一定量吸引するための、クロマト上流端にあたる空間であり、この添加空間９の先端（他の端部）は、血液サンプルをバイオセンサに吸引するための開口部１１とされている。

図１０Ｂ、図１０Ｃに示すように、基板１と添加空間９とは、それぞれの端部（クロマト上流領域の端部）の位置が合わせられた状態で接合されて、前記開口部１１が形成されている。一方、展開流路２における上流端部、すなわち、展開流路２におけるクロマト上流領域の端部は、添加空間９における血液サンプル吸引用の開口部１１よりも吸引方向奥側の位置、すなわち、クロマト流れ方向の下流側の位置までしか配設されておらず、この展開流路２における上流端部から開口部１１までの領域には、展開流路２が設けられていない。

この添加空間９における基板１上の、前記展開流路２が設けられていない領域、すなわち、添加空間９内に入り込んだ展開流路２の上流端部と基板２における開口部１１までの間の領域には、何も配設しないと段差が発生するため、この段差を解消または軽減するように補填することで添加空間９の厚み方向の寸法を減少させて毛細管力を保持する補助基板（毛細管力保持用補填部）１８が設けられている。この補助基板１８は、添加空間９の底面部側の段差をなくすとともに、開口部１１に続く箇所において血液サンプルを良好に毛細管現象により吸引できるように添加空間９の厚み寸法（上下方向厚み）を調節する機能も有している。補助基板１８は液体不透過性材料から構成され、好ましくは展開流路と同じ厚さによって展開流路２との段差をなくすように設定するとよいが、これに限るものではなく、展開流路２との段差を軽減させるだけの厚みでもよく、その材質も厚みも問わない。さらに、この箇所の添加空間９の厚みが小さくて、毛細管力を保持できれば、段差がそのまま存在しても、何ら差し支えない。また、補助基板１８は、必ずしも基板１とは別体にしなくてもよく、補助基板１８に相当する肉厚部分を基板１に一体形成してもよい。なお、補助基板１８に相当する肉厚部分を基板１に一体形成したり、別体の補助基板１８を基板１に精度よく接合させたりすることで、添加空間９を形成するために空間形成材８を基板１上に取り付ける際に、空間形成材８を基板１上にゆがみ無く取り付けることができて、組み付け精度が向上する利点もある。

さらにこのバイオセンサ２０のクロマト展開方向の両側面（詳しくは、基板１、展開流路２、および液体不透過性シート７の各両側面部）は封止部１７により封止されている。したがって、添加空間９に添加された血液サンプルは、添加空間９より出て展開流路２において開放部１０に至るまでの領域では、空気の逃げ場がないため蒸発することなく、開放部１０の方向へと展開が促進されながら良好に流れる。封止部１７は封止材を両側面に充填したり接合させたりしてもよいが、これに限るものではなく、例えば、レーザ光などを照射して、孔などが潰れて、液体サンプルなどが通過しないように熱溶融してもよい。また、図８、図１０Ａ〜１０Ｃなどにおいては、バイオセンサ２０の両側面箇所を封止した場合を述べたが、これに限るものではなく、バイオセンサ２０の両側面より所定幅内側となるように、クロマト展開方向に沿って延びるレーザ光を照射するなどして、熱溶融による溝部を左右に形成し、この熱溶融溝部間の部分のみ血液サンプルが展開するよう構成してもよい。

次に、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆを用いて、バイオセンサ２０上における血液サンプルの展開状況を説明する。図１１Ａは本発明の実施の形態に係るバイオセンサの断面図、図１１Ｂ〜図１１Ｆは、それぞれ、本発明の実施の形態に係るバイオセンサに血液サンプルが添加された場合の、バイオセンサにおける血液サンプルの展開状況を示す断面図である。

図１１Ｂに示すように、添加空間９の開口部１１に、血液サンプルＳが点着（添加）される（Ｓｔｅｐ１）と、開口部１１を通して添加空間９へ一定量の血液サンプルＳが毛細管現象により吸引され、添加空間９は血液サンプルＳで満たされる（図１１Ｃ：Ｓｔｅｐ２）。添加空間９に血液サンプルＳが吸引されると、反応試薬１４の試薬（標識試薬および血球収縮剤）が血液サンプルＳと接触し、速やかに溶解し始める。添加空間９に血液サンプルＳが満たされると、溶解した反応試薬は血液サンプルＳと反応して添加空間９全体へ拡散していきながら、血液サンプルＳは展開流路２へと展開していく（図１１Ｄ：Ｓｔｅｐ３）。

展開流路２を展開する血液サンプルＳは、反応試薬と反応した状態で展開し、試薬固定化部３に到達した後、通過する（図１１Ｅ：Ｓｔｅｐ４）。試薬固定化部３に到達すると、血液サンプルＳ中に分析対象物が存在する場合、反応試薬および分析対象物と固定化試薬との間で特異的反応が行われ、試薬固定化部３には反応試薬由来の呈色反応が生じる。展開流路２をさらに展開した血液サンプルＳは、展開流路２における液体不透過性シート７により覆われている領域では、液体不透過性シート７の働きにより表面からの水分蒸発が阻止されており、液体不透過性シート７により覆われていない開放部１０に到達して初めて水分蒸発が始まる。この乾燥過程は血液サンプルの移動を助け、添加空間９から開放部１０への血液サンプルＳの展開が促進される。添加空間９は、液体不透過性材料から構成された微細空間であり、血液サンプルＳは微細空間内で保持されることなく、血液の展開移動によって、クロマト下流方向へと移動していく（図１１Ｆ：Ｓｔｅｐ５）。これらの過程を経緯して試薬固定化部３に出現した反応試薬の反応を、目視あるいは測定装置を用いて検出することにより、血液サンプルＳ中の分析対象物の存在、あるいは濃度を確認することが可能となる。

なお、ここで示す展開流路２は、血液が毛細管力（毛細管現象により生じる力）で移動可能な任意の材料で構成された、血液サンプルＳが展開可能な流路である。この展開流路２は、血液サンプルＳにより湿潤され、血液サンプルＳを展開可能な流路を形成できる材料であればよく、濾紙、不織布、メンブレン、布、ガラス繊維等多孔質な任意の材料でよい。あるいは、流路を中空の毛細管で形成してもよく、このような場合の中空の毛細管材料は、樹脂材料等で構成できる。

また、反応試薬は血球収縮剤以外の成分としては主に標識試薬で構成されており、標識試薬は抗体に金コロイドなどの標識物を標識したもので、前記試薬固定化部３における結合を検出する手段として用いられるものである。前述した金コロイドはほんの一例に過ぎず、金属あるいは非金属コロイド粒子、酵素、タンパク質、色素、蛍光色素、発光物質、ラテックスなどの着色粒子など、必要に応じて任意に選択可能である。

更に、試薬固定化部３に使用する抗体は、標識試薬および分析対象物との複合体を形成できれば良く、従って、分析対象物に対するエピトープもしくは親和性は、同じであっても異なっていても何れでも良い。２つの抗体の親和性は異なるが、エピトープが同じでも何ら問題はない。

また、図１０Ａ〜図１０Ｃに示すバイオセンサの構成では、試薬固定化部３が１箇所だけに設けられている例を示すが、これは必ずしも１箇所である必要はなく、複数箇所でもよく（図８においては、２箇所の試薬固定化部３、３’が設けられている場合を示す）、１箇所以上であれば、その目的に応じて自在に選択できる。また、展開流路２上の試薬固定化部３の形状についても、ライン状である必要はなく、スポット形状、もしくは、文字形状、鍵型形状など、自由に選択でき、複数の試薬固定化部３、３’を設定した場合においては、空間的に離れているあるいは、見かけ上、一本のライン状に見えるように接触させるなど、様々な位置関係を設定することも可能である。

展開流路２を覆う液体不透過性シート７は、例えば透明ＰＥＴテープで構成される。液体不透過性シート７は、試料添加部となる添加空間９に接続する部分、および前記血液サンプルの到達する下流端を除き、展開流路２を密着した状態で被覆する。

このように液体不透過性シート７により展開流路２を被覆することと、封止部１７で展開流路の両脇（両側面）を封止したことで、添加空間９以外への点着を防止して保護すると共に、外部からの汚染を防止する作用を持たせることができる。さらにこればかりでなく、血液サンプルの展開時に、血液サンプルが展開しながら蒸発してしまうことを防止し、展開流路２上の反応部分である試薬固定化部３を必ず血液サンプルが通過し、前記試薬固定化部３において血液サンプル中の分析対象物との反応を効率よく行うようにすることができる。ここでの外部からの汚染とは、この展開流路２上の反応部分に対して不用意に血液サンプルが接触することや、被験者が手などで展開流路２に直接接触することなどを指す。前記展開流路２を被覆する液体不透過性シート７は、前記試薬固定化部３を覆っており、この試薬固定化部３は、分析対象物のシグナルを測定する部分であるから、透明な材料を用いて、少なくとも光が透過可能な状態を持たせることが好ましい。

なお、基板１は、ＰＥＴフィルムなどの液体不透過性シート材で構成され、透明、半透明、不透明のいずれをとってもよいが、例えば、測定装置として光学的検出機器を使用する場合などは、透過光を測定する場合は透明、反射光を測定する場合は不透明の材料を用いることが好ましい。また、基板１の材質は、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂材料の他、金属、ガラス等、液体不透過性の材料を用いることが可能である。

添加空間９を形成する空間形成材８は、血液サンプルを一定量吸引して保持するばかりでなく、添加後のバイオセンサを取り扱う際に、血液サンプルの外部への汚染を保護する役割をも有する。この空間形成材８としては、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂材料の他、金属、ガラス等、液体不透過性の材料を用いることが可能であり、また、透明もしくは半透明であることが好ましいが、透明でなくて有色であってもよく、あるいはこの不透明の材料の場合には任意の材料で構成できる。

図１２Ａ、図１２Ｂは、本実施の形態に係る添加空間９の空間形成材８の構成を示す図であり、図１２Ａは空間形成材８の分解斜視図、図１２Ｂは空間形成材８の斜視図を示す。図１２Ａ、図１２Ｂに示すように、基板１におけるクロマト展開方向の下流側部分上に載せられる添加空間９の空間形成材８は、例えば、添加空間９の上面部を覆うシート材１９と、添加空間９の両側面部と一端面部（クロマト展開方向の下流側面部）とを覆って微細空間である添加空間９の厚さ寸法を規定するスペーサ１６とから構成してもよい。この場合、シート材１９とスペーサ１６とは、任意の方法によって接着される。また、シート材１９には空気孔１３が設けられており、この空気孔１３により、血液サンプルを吸引する毛細管流を促進させる。更に、添加空間９内に保持可能な血液サンプルの体積を、添加空間９の縦横寸法のみならず、スペーサ１６の厚みを調節することによって良好に規定することができる。また、シート材１９には毛細管力を促進するために任意の処理を施してもよい。

展開流路２におけるクロマト下流端の開放部１０には、液体不透過性シート７が設けられておらず、開放されているため、血液サンプルが到達した後、あるいは到達しながら揮発もしくは蒸発する。さらには、開放部１０に液体試料が滲み出て、開放部１０における展開流路２の上部にのみ、血液サンプルが、添加空間９の展開流路２の上部にある液体試料と同じ高さ、もしくは準じた高さまで至る。これにより、展開流路２において開放部１０に到達した血液サンプルの蒸発・乾燥を促進し、展開流路２に吸水部を設けなくても、クロマト展開が上流側から下流側へと促進される。

上記構成によれば、血液サンプルを毛細管力にて吸引して保持することが可能な添加空間９に、反応試薬を担持させ、展開流路２を、その上流端部が、添加空間９内における血液サンプル吸引用の開口部１１よりも吸引方向奥側の位置までしか入り込んでいないように配設することで、添加空間９に血液サンプルを添加して吸引させた際に、血液サンプルに反応試薬が良好に溶出した後に、展開流路２の上流端部に流入して展開されることになる。したがって、反応試薬が均一な状態で溶出した血液サンプルを展開流路２に良好に流入させることができて、高精度に定性または定量することができるとともに、良好に高感度測定を行うことができる。

つまり、図１８Ａ〜図１８Ｃに比較例を示すが、この比較例のバイオセンサのように、展開流路２として、基板１と同じ長さで、展開流路２の上流端部が、キャピラリチャンバ１２の流路長さ方向の全領域にわたって入り込んだ配置とした場合には、キャピラリチャンバ１２の入口部分である開口部１１およびその近傍箇所に、反応試薬１４だけでなく、展開流路２の上流端部も配設されることとなる。したがって、キャピラリチャンバ１２に添加した液体試料の一部が、直接に、すなわち、標識試薬が溶出していない状態で展開流路２に流れ込んでしまい、その結果、標識試薬が不均一な状態で溶出した液体試料が展開流路２を流れることとなって、定量測定を行う場合に十分な精度が得られないおそれがある。これに対して、本実施の形態のバイオセンサによれば、上述したように、このような不具合を生じない。

また、添加空間９の底面部分に、この添加空間９に入り込んだ展開流路２の上流端部と基板１との間に形成される展開流路２の厚みに相当する段差を解消または軽減するように補填することで添加空間９の厚み方向の寸法を減少させて毛細管力を保持する補助基板１８を設けたので、添加空間９において、常に血液サンプルを吸引する毛細管力が良好かつ確実に作用し、これにより、定性または定量時の精度を向上させることができる。

また、反応試薬を、添加空間９において、展開流路２との厚み方向に沿ってこの展開流路２の延長線上とは異なる位置に担持させたことで、添加空間９に添加された血液サンプルに対して反応試薬がより均一に溶け出した状態で、展開流路２に導入されることとなり、より正確かつ高精度・高感度な測定結果を得ることができる。

また、上記構成によれば、反応試薬１４に血球収縮剤を含ませたことにより、血液サンプル中の血球成分が、反応試薬である血球収縮剤と接した際に速やかに収縮してその大きさが均一化される。その結果、様々な大きさの血球成分により乱れていた血液サンプルの展開状態を均一化することが可能となって反応度合も均一化され、ひいては測定ばらつきも改善されて、より高精度な測定を実現することができる。

また、添加空間９における基板１の一端部を覆う空間形成材８を、基板１と対向するシート材１９と、添加空間９の厚さを規定するスペーサ１６とで構成したことにより、添加空間９内にて保持可能な血液サンプルの体積を、スペーサ１６の厚さの変更だけで容易に実現することができて、バイオセンサ２０の構造をよりシンプルにすることが可能となると同時に、バイオセンサ２０の構造のばらつきによる、反応度合のばらつきを極小化することが可能となって、より高精度な測定を実現できる。

また、上記構成によれば、血液サンプルを毛細管力にて吸引して保持することが可能な添加空間９を設けたことにより、一定量の血液サンプルを確実に吸引することができ、しかも、添加空間９における少なくとも添加空間９に臨む箇所を液体不透過性材料で構成することで、添加空間９自体には血液サンプルが保持されず、１０μｌ以下の血液サンプルを保持可能な添加空間９を実現することができる。

つまり、本発明によれば、従来のように、添加された液体試料が構成材料にて保水されることによる、展開されない損失検体（デッドボリューム）が発生することを、最小限に抑えることができ、この結果、従来のクロマトセンサと比較して大幅な検体（血液サンプル）量の削減を実現することができる。

また、ディスペンサやスポイト、注射器などを用いなくても、一定量の液体試料としての血液を良好に保持することができるだけでなく、標識試薬やその他の反応試薬を完全に溶出することができるとともに、添加する血液の量を大幅に削減、微量化することができ、しかも、標識試薬が均一な状態で溶出した血液を展開流路に良好に流入させることができるバイオセンサを提供することによって、免疫反応を基本とするバイオセンサにおいて、測定精度向上を図ることができると同時に、従来の免疫クロマトセンサに見られる利便性を損なわず、いつでもどこでも誰でも測定可能であり、しかも、微量の血液などの液体試料での測定を実現化でき、正確かつ高精度・高感度な免疫クロマトセンサとしてのバイオセンサを提供することが可能となる。

また、反応試薬１４を添加空間９内に保持したことから、反応試薬１４が添加空間９に留まる、あるいは吸着されることなく、完全に溶出することが可能となり、反応試薬１４の溶出度合は常に一定となるばかりか、添加空間９内で血液サンプルと接触し溶解あるいは水和し、血液サンプル全体に拡がり反応した後に、展開流路２を展開することが可能となり、反応試薬１４の残留及び反応試薬との未反応血液サンプルの展開を回避することができる。

このように反応試薬１４の１００％の溶出を実現し、未反応血液サンプルの展開を回避することで、より正確かつ高感度な測定が可能である。

次に、図９、図１３を用いて、分析装置１０４について簡略的に説明する。図９に示すように、分析装置１０４は、バイオセンサ２０の一部（図示しないが、添加空間９の開口部１１）が外部に露出した状態で装着自在に構成されている。そして、バイオセンサ２０を分析装置１０４に装着した状態で、指先血などの血液サンプルＳを添加すると、毛細管流によって添加空間９へ血液サンプルが吸引される。

図１３に示すように、分析装置１０４は、バイオセンサ２０における展開流路２の状況及び試薬固定化部３の反応度合を測定するためにイメージセンサ１０２と照射光出射手段（ＬＥＤなど）１０３と、表示部１０６などを備えており、イメージセンサ１０２でとらえた任意の情報は、分析装置１０４に設けられたデータ収集部１０５によって収集され、これらの情報に基づいた演算処理によって、血液サンプル中の分析対象物の存否あるいは濃度を、表示部１６に測定結果として表示するようになっている。

なお、前記分析装置１０４の分析方法は、ほんの一例であり前記以外の任意の手段（例えばイメージセンサと照射光や、フォトダイオードと照射光）であって何ら問題はない。

このように、分析装置１０４に装着されたバイオセンサ２０に血液サンプルを添加する操作のみで、分析対象物を定性あるいは定量測定することが可能となっている。

本発明のバイオセンサは、抗原抗体反応のような反応に基づいて、液体試料中の分析対象物を検出し、定量あるいは半定量測定する際に、簡便かつ迅速で、高感度・高精度な測定を実現することが可能なＰＯＣＴ向けの分析装置のバイオセンサとして有用である。

Claims (23)

1. 液体試料が添加される試料添加部と、液体試料に反応する反応試薬と、反応試薬が混在する液体試料あるいは反応試薬と反応した液体試料を展開する展開流路とを有し、液体試料中の分析対象物の存否あるいは濃度を測定するバイオセンサであって、
   前記試料添加部が、液体不透過性材料からなる空間形成材により添加空間を囲むことで構成され、
   前記試料添加部における空間形成材の添加空間に臨む箇所に、前記反応試薬が、添加空間に添加された液体試料に溶け出し可能な状態で保持され、
   前記展開流路は、支持体としての基板の面に沿って配置され、前記試料添加部内の液体試料と前記反応試薬とが毛細管力にて移動可能な材料で構成され、
   展開流路の一部に測定領域が配設され、
   前記基板に、前記添加空間の厚さを調整する補助基板が配設されていることを特徴とするバイオセンサ。
2. 反応試薬が、試料添加部における展開流路の延長線上の面とは異なる箇所に配設されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
3. 反応試薬が、空間形成材における前記基板の面から離れて対向する上面部裏面に保持されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
4. 空間形成材に、添加空間への液体試料の吸引を促進する空気孔が形成されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
5. 測定領域は、分析対象物あるいは反応試薬と特異的反応の可能な試薬が固定化された試薬固定化部からなることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
6. 反応試薬は、分析対象物あるいは固定化試薬と特異的反応の可能な標識試薬を含んでいることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
7. 標識試薬は、分析対象物あるいは固定化試薬と特異的反応の可能な試薬が不溶性粒状マーカーに標識されていることを特徴とする請求項６に記載のバイオセンサ。
8. 不溶性粒状マーカーが、着色重合体ビーズ、金属、合金および重合染料粒子からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載のバイオセンサ。
9. 特異的反応が、抗原抗体反応であることを特徴とする請求項５に記載のバイオセンサ。
10. 反応試薬は、標識試薬以外の試薬であることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
11. 展開流路の表面を覆う液体不透過性シートを有することを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
12. 液体不透過性シートは、試料添加部の添加空間の一部または近傍から、少なくとも試薬固定化部までの範囲を覆うものであることを特徴とする請求項１１に記載のバイオセンサ。
13. 液体不透過性シートは、展開流路の下流端部においてはこの展開流路を覆わないものであることを特徴とする請求項１１に記載のバイオセンサ。
14. 展開流路の流れ方向に沿った両側面が被覆または封止されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
15. 液体試料が血液であることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
16. 反応試薬は細胞収縮剤、または細胞収縮剤を含む混合試薬であり、この細胞収縮剤が血液中の血球成分と反応して、血球成分が収縮された状態であるいは血球成分が収縮されながら、血液が展開流路を展開するようにされていることを特徴とする請求項１５に記載のバイオセンサ。
17. 試料添加部の添加空間には、指先血を毛細管力にて吸引可能であることを特徴とする請求項１５に記載のバイオセンサ。
18. 反応試薬および固定化試薬は、乾燥状態でバイオセンサに保持および固定されていて、液体試料に溶解あるいは水和するものであることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
19. 反応試薬は溶液状態で空間形成材の内面に塗布された後に乾燥されたものであり、固定化試薬は溶液状態で展開流路に塗布された後に乾燥されたものであることを特徴とする請求項１８に記載のバイオセンサ。
20. 試料添加部の添加空間の吸引容積が１０μｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
21. 前記添加空間が、液体不透過性材料からなる空間形成材により囲まれることで構成され、前記展開流路の上流部分が添加空間の一方の端部側から添加空間に入り込んでいるが、前記展開流路の上流端部の入り込み位置が、前記添加空間における他の端部側に形成された液体試料吸引用の開口部よりも吸引方向奥側の位置であることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
22. 展開流路は基板上に支持されており、添加空間は、展開流路の上流端部に対応した基板の一端部とこの基板の一端部を覆う空間形成材とによって所要の吸引空間として形成されており、展開流路は所定の厚みを有し、添加空間に、この添加空間に入り込んだ展開流路の上流端部と基板との間に形成される展開流路の厚みに相当する段差を解消または軽減するように補填することで添加空間の厚み方向の寸法を減少させて毛細管力を保持する補助基板が設けられていることを特徴とする請求項２１に記載のバイオセンサ。
23. 展開流路は基板上に支持されており、添加空間部は、展開流路の上流端部に対応した基板の一端部からなり、添加空間の厚さを規定するスペーサと、基板と対向して基板の一端部を覆う空間形成材とによって所要の吸引空間として形成されていることを特徴とする請求項２１に記載のバイオセンサ。

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