CN110596380A - 一种排除hook效应的方法及其免疫层析检测卡 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种排除HOOK效应的方法及其免疫层析检测卡，属于疾病检测技术领域，本发明方法在免疫层析检测卡的检测T线和质控C线之间设置一条检测H线，所述检测H线包被待检测目标物。当样本待检测物浓度过大时，检测H线颜色变淡或呈阴性，样本待检测物浓度较小甚至浓度为零时，检测H线呈阳性，从而能很好的发现样本检测是否存在HOOK效应，如果存在HOOK效应，通过对高浓度的样本进行稀释，从而解决了因为HOOK效应测值不准的问题，检测结果直观，可靠。
Description
技术领域
本发明属于疾病检测技术领域，具体地讲，是涉及一种排除HOOK效应的方法及其免疫层析检测卡。
背景技术
免疫层析技术是以胶体金或荧光作为示踪标志物应用于抗原抗体反应的一种的免疫标记技术，将胶体金标记或荧光的免疫反应性物质——抗原(或抗体)与样本中对应的抗体(或抗原) 进行反应，并在硝酸纤维素膜上进行层析，并进而与硝酸纤维素膜上包被的另一抗原(或抗体) 结合而被固定在硝酸纤维素膜上(T线)显示信号(胶体金颗粒的颜色或荧光信号，下同)，以便对在该样本中的指定抗体或抗原进行定性或者定量分析。
有时在测定含有高浓度分析物的样品中观察到没有T线信号或仅发生轻微的T线信号。在高浓度下T线信号的消失或减少称作“钩状效应”(HOOK效应)，并且与如下事实相关：例如在检测抗原时，样品中过量的抗原导致抗原抗体复合物，而不形成抗体-抗原-抗体夹心复合物。一般而言，抗原的浓度与抗体的浓度相比越高，则观察到的信号越低。当抗原的递增浓度超过了抗体群识别和结合的相对能力时，T线信号值会衰减或消失。
当出现HOOK效应时，就会出现假阴性结果或导致检测值偏低，影响检测结果准确性，造成误诊等严重后果。
虽然有不少的专利涉及到HOOK效应，专利201380072186.5通过检测设备的传感器来鉴定HOOK效应。专利201710655896.0通过检测设备的内置标准曲线来鉴定HOOk效应从而扩充检测范围。专利CN200510026872.6通过在样品和标记抗体中加入检测微球形成检测复合物来鉴定HOOK效应。专利CN200480007328.0通过在样品中加入探针来检测HOOK效应。这些方法要么通过复杂的检测工具，要么加入试剂，虽然能一定程度减少HOOK效应，但是都比较复杂，而且反应不是那么直观，不能完全消除HOOK效应。
发明内容
本发明提供一种排除HOOK效应的方法及其免疫层析检测卡，以提高现有技术由于检测标本中待检测抗原或抗体过量导致测值结果与实际结果偏小或导致漏检，从而影响检测结果的准确性、造成误诊等严重后果的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种排除HOOK效应的方法，在免疫层析检测卡的检测T线和质控C线之间设置一条检测H线，所述检测H线包被待检测目标物。
本发明通过设置包被待检测目标物的检测H线，当样本待检测物浓度过大时，检测H线颜色变淡或呈阴性，样本待检测物浓度较小甚至浓度为零时，检测H线呈阳性，从而能很好的发现样本检测是否存在HOOK效应，如果存在HOOK效应，通过对高浓度的样本进行稀释，从而解决了因为HOOK效应测值不准的问题，检测结果直观，可靠。
其检测原理：以双抗体检测抗原为例。T线上的抗体和结合垫上的荧光微球标记的抗体都与抗原反应，形成三明治的结构。当标本存在过量的抗原时，标本中的抗原分别与结合垫上的抗体和T线上的抗体充分反应，从而导致不能形成三明治的结构从而导致HOOK效应。当在 T线和C线之间包被检测抗原时，标本中无抗原时，结合垫上的荧光微球标记抗体特异性结合 H线抗原，导致T线无信号，而H线有强信号。当样本中的抗原浓度越来越高，结合垫中与样本中的抗原结合再与T线上的抗体结合，从而导致与H线上的抗原结合的标记抗体的量越来越少，信号越来越弱。而当HOOK效应时，T线上的信号变弱，H线的信号也很弱。从而有效区分HOOK效应。其表现特征在于，如果是阴性标本，则T线无信号，而H线有最强信号。如果是阳性标本，随着检测物的浓度的升高，T线信号增强，H线的信号会降低。当开始出现比较弱的HOOK效应时，则H线没有信号，而T线信号逐渐变弱，当高浓度的标本存在强HOOK效应时，T线和H线同时无信号。而C线用来判定实验的有效性。此方法简单，直接，不仅适用于胶体金免疫层析，还适合荧光免疫层析。不仅适用于双抗原夹心法检测抗体，还适用于双抗体夹心法检测抗原。
一种排除HOOK效应的免疫层析检测卡，包括PVC底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸从前到后依次设置在PVC底板上，所述结合垫设有偶联荧光微球的单克隆抗体，所述包被膜上设有检测T线、检测H线和质控C线，所述检测T线包被单克隆抗体，所述检测H线包被待检测目标物，所述质控C线包被多克隆抗体。H线包被的是待检测物，如检测的是抗体，则H线包被的是抗体，检测的是抗原，则包被的是抗原。检测抗体时，H线包被的相应的抗体，包被的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆的抗体，抗体可以是鼠源的和兔源的，也可以是羊抗体，而不管是单克隆的抗体还是多克隆的抗体，抗体的特异性是必须的，即只和标记抗原反应；检测抗原时，H线包被的时相应的抗原，包被抗原可以是天然抗原，也可以是重组抗原，重组抗原特异性是必须的，即只和标记抗体反应，如果存在非特异性反应，则即使是阴性标本，H线也可能无信号，因为非特异性的结合导致标记抗体不能与H线抗原反应，这样不能有效区分HOOK效应。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的技术方案加入了样本检测，根据检测结果可以直接判断是否存在 HOOK效用，可以准确测量样本的浓度，如果存在HOOK效应，可以通过稀释样本进行检测；而且通过T线和H线的信号变化，可以判断是否存在多大程度的HOOK效应；如果HOOK效应不严重，可以减少样本的稀释倍数；如果HOOK效应比较严重，如T线和H线都没有信号，则可以增加样本稀释倍数；
(2)本发明提供的技术方案在现有技术的基础上改动较小，改造成本低，但HOOK效应排除效果好，很好的避免了现有技术由于检测标本中待检测抗原或抗体过量导致测值结果与实际结果偏小或导致漏检，从而影响检测结果的准确性、造成误诊等严重后果的问题。
附图说明
图1为本发明提供的免疫层析检测卡的结构示意图；
图中标号分别为：1、PVC底板；2、吸水纸；3、包被膜；4、质控C线；5、检测T线； 6、结合垫；7、样品垫；8、检测H线。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
如图1所示，为本发明提供的免疫层析检测卡的结构示意图，包括PVC底板1、样品垫7、结合垫6、包被膜3和吸水纸2，所述样品垫7、结合垫6、包被膜3和吸水纸2从前到后依次设置在PVC底板1上，所述包被膜上设有检测T线5、检测H线8和质控C线4。
以下结合具体实施例来说明本发明方案。
实施例1
CRP，肺炎球菌细胞壁c多糖蛋白，一种急性时相(期)蛋白，亦称C反应蛋白，正常参考值≤10mg/L。当存在炎症时，CRP的浓度可升高100-1000倍。C反应蛋白(CRP)免疫层析检测线性范围一般为0.5-200mg/L。而CRP免疫层析检测试剂盒检测的标本都是需要经过稀释的，稀释倍数从100倍到300倍不等。即使样本经过稀释，不同的厂家的的试剂盒在测高值时，还是会存在HOOK效应。
制备两种CRP荧光免疫检测试剂盒。一种是正常的CRP检测装置，即T线包被CRP单克隆抗体，包被浓度为1mg/ml。C线包被羊抗鸡多克隆抗体，包被浓度为1mg/ml，而结合垫上有鸡IgY标记的时间分辨荧光微球，用于和C线反应。结合垫上还有CRP单克隆标记的时间分辨荧光微球，用于CRP的检测。如图1所示，另一种检测卡(本发明检测卡)除了T线包被1mg/ml 的CRP单克隆抗体，1mg/ml的C线包被羊抗鸡多克隆抗体外，在T线和C线之间包被了0.5mg/mL 的CRP抗原。包被的抗原是能和结合垫上的时间分辨微球上的CRP抗体反应的。
取一份浓度为500mg/L的标本，用PBST样本稀释液分别进行稀释，浓度分别为500mg/L， 400mg/L，300mg/L，200mg/L，100mg/L，50mg/L，25mg/L，10mg/L，5mg/L，2mg/L，1mg/L， 0mg/L。将稀释好的不同浓度的标本各取100ul样本分别加入两种试剂卡中，反应时间为3分钟。然后用时间分辨荧光免疫检测仪进行检测，获取荧光值，检测结果如表1。
表1 CRP检测结果
从检测结果可以看出，正常检测试剂卡在CRP浓度100mg/L时，T线信号最强，高于100mg/L的样本检测浓度低于样本实际浓度，浓度500mg/L的标本已经完全无法检测出来，而且无法有效区分。而本发明检测试剂卡在样本浓度超过100mg/L时，虽然T值信号降低，但由于H线信号也变得很弱，通过数值可立即判断此标本属于高值标本，可进一步放大稀释倍数，就可以得到准确检测结果。
实施例2
艾滋病是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒(HIV病毒)引起。HIV是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的CD4T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。感染HIV病毒后，一般一个星期内就会产生HIV抗体，随后HIV抗体的滴度逐渐增加。HIV感染者要经过数年、甚至长达10年或更长的潜伏期后才会发展成艾滋病病人。因此，检测HIV抗体，在术前，输血等是必须的检测项目。目前检测HIV 抗体的免疫学检测方法有酶联免疫(ELISA)，免疫层析(胶体金，荧光)，化学发光等。而很多HIV病毒感染者，体内的HIV抗体滴度很高，ELISA(一步法)，免疫层析，化学发光(一步法)都可能会产生HOOK效应，尤其是免疫层析法，从而导致漏检。因此，设计好免疫层析法检测试剂，有效防止因HOOK效应产生漏检具有很重要的意义。
本实施例制备两种HIV抗体荧光免疫检测试剂盒。一种是正常的HIV抗体检测装置，即T 线包被HIV抗原，包被浓度为1mg/ml。C线包被羊抗鼠多克隆抗体，包被浓度为1mg/ml.而结合垫上有鼠IgG标记的时间分辨荧光微球，用于和C线反应。结合垫上还有HIV抗原标记的时间分辨荧光微球，用于HIV抗体的检测。如图1所示，另一种检测卡(本发明检测卡)除了T 线包被1mg/ml的HIV抗原，1mg/ml的C线包被羊抗鼠多克隆抗体外，在T线和C线之间包被了 0.5mg/mL的HIV抗体。包被的抗体是能和结合垫上的时间分辨微球上的HIV抗原反应。
取一份高浓度为HIV抗体阳性标本，用PBS样本稀释液分别进行稀释，稀释梯度分别为2 倍，4倍，8倍，16倍，32倍，64倍，128倍，256倍，512倍，1024倍。将稀释好的不同浓度的标本各取100ul样本分别加入两种试剂卡中，反应时间为10分钟。然后用时间分辨荧光免疫检测仪进行检测，获取荧光值，检测结果如表2。
表2 HIV检测结果
从测试结果可以看出，HIV标本在稀释8倍时，T值最高，说明在稀释低于8倍的高浓度都存在HOOK效应，尤其是原倍标本，直接测成了阴性。而正常检测的免疫层析试剂卡是不能说明存在HOOK效应的。本发明的检测试剂卡由于H线检测结果随着HIV抗体的浓度的升高， H线的荧光值逐步降低，因此可以有效区分标本是存在HOOK效应的。根据检测结果，原倍标本由于存在HOOK效应，且HOOK效应比较强，可以做10倍或更多比例稀释，保证检测结果的准确性。
本发明通过在T线和C线之间包被一条待检测的抗原(抗体)，从而有有效发现检测结果是否存在HOOK效应，保证检测结果的准确性。此方法简单有效直观，不需要增加大量的工作和成本。
上述实施例仅为本发明的优选实施方案之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主题设计思想和精神上做出毫无意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种排除HOOK效应的方法，其特征在于，在免疫层析检测卡的检测T线和质控C线之间设置一条检测H线，所述检测H线包被待检测目标物。
2.一种排除HOOK效应的免疫层析检测卡，其特征在于，包括PVC底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸从前到后依次设置在PVC底板上，所述接合垫设有偶联荧光微球的单克隆抗体，所述抱被膜上设有检测T线、检测H线和质控C线，所述检测T线包被单克隆抗体，所述检测H线包被待检测目标物，所述质控C线包被多克隆抗体。
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- 2019-09-20 CN CN201910891916.3A patent/CN110596380A/zh active Pending
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