CN111007267A - 一种降钙素原（pct）的检测试剂及其制备方法 - Google Patents
一种降钙素原（pct）的检测试剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111007267A CN111007267A CN201911386655.6A CN201911386655A CN111007267A CN 111007267 A CN111007267 A CN 111007267A CN 201911386655 A CN201911386655 A CN 201911386655A CN 111007267 A CN111007267 A CN 111007267A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pct
- reagent
- latex
- procalcitonin
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 84
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 title claims abstract description 69
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims abstract description 59
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims abstract description 58
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 25
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims abstract description 13
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 13
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims abstract description 13
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 13
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 claims description 11
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 claims description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 7
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 7
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 7
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 claims description 6
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 4
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 10
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 abstract description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 3
- BDOYKFSQFYNPKF-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;sodium Chemical compound [Na].[Na].OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O BDOYKFSQFYNPKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 abstract description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 abstract 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 abstract 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 9
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 5
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 201000005008 bacterial sepsis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
- G01N21/51—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid inside a container, e.g. in an ampoule
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/59—Transmissivity
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种降钙素原（PCT,Procalcitonin）的胶乳增强免疫比浊检测单试剂以及制备方法。该试剂包括PCT抗体致敏胶乳颗粒、乙二胺四乙酸二钠、精氨酸、牛血清白蛋白、聚乙烯磺酸钠、十二烷基聚乙二醇醚以及Proclin300，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。本发明还公开了合适的表面活性剂组合可提高降钙素原检测单试剂的检测灵敏度的制备方法。本发明采用单一试剂，无需混合，灵敏度高，检测速度快，能够直接测量全血、血清和血浆等各种样本，因此可广泛应用于各种透射或者散射分析仪，包括普通生化分析仪、特定蛋白分析仪等。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫诊断领域，具体涉及一种降钙素原（PCT）的胶乳增强免疫比浊检测单试剂的制备及其应用。
背景技术
降钙素原（ procalcitonin -简称PCT）是降钙素的前体激素，正常情况下由甲状腺C细胞分泌，经细胞内蛋白水解酶水解后形成的活性成分，其多肽链有114或116个氨基酸组成。严重全身性细菌、真菌和寄生虫感染时，PCT异位生成、水平异常升高，且升高程度与感染严重度及预后相关。PCT在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值，与目前所应用的诊断指标相比，PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息。近年来发现，在全身细菌感染和脓毒症的辅助和鉴别诊断方面降钙素原是一个具有高特异性和敏感性的新指标。
鉴别诊断细菌性与非细菌性炎性反应
在细菌引起的全身性炎性反应时，血清PCT浓度会出现明显增高，但在病毒感染、自身免疫性疾病、器官移植排斥反应等炎性反应时，血清PCT浓度仅维持低水平，提示血清PCT浓度可以鉴别诊断细菌性或非细菌性炎症。
判断脓毒症和全身炎性反应的严重程度
脓毒症是重症监护室最常见的严重疾病之一，是引起全身炎性反应综合征、多器官功能障碍综合征的常见原因，也是致残、致死率非常高的疾病之一，所以对脓毒症及早确诊，让患者及时得到治疗是重症监护室医生的主要任务。研究发现，脓毒症患者血清PCT值明显高于非脓毒症患者，认为PCT优于目前临床上应用的炎性反应指标，可作为早期鉴别全身感染，尤其是细菌感染的快捷、敏感、准确的检测手段。
PCT的常见检测方法有酶联免疫法（一种降钙素原检测试剂盒；CN201410110849.4）、化学发光法（一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法；CN201410143487.9）、胶乳增强免疫比浊法（一种定量检测降钙素原PCT的胶乳增强免疫比浊试剂盒：CN201210273085.1）以及荧光层析检测。这些方法中罗氏化学发光检测法为金标准，但设备为全封闭且昂贵，标本测试时间从9-27min不等，报告结果的时间长。
现在市场上已有的PCT胶乳增强免疫比浊试剂采用的是稀释液和胶乳溶液的双试剂形式。在测试时，测试样品必须先在稀释液中稀释，再和胶乳溶液进行混合反应。三甲医院常用仪器平台上，稀释和混合的操作可由稍大型全自动生化分析仪完成，但是在小型半自动平台上尤其是POCT类的便携式平台（三级以下医院以及县乡一级医疗服务单位常用）上进行的测试则需要操作人员手动实施，带来了额外的操作步骤，也引入了更多的操作误差，影响了测试的精密度。
荧光层析检测方法，是将抗体以及部分检测液喷涂于NC膜上，属于干式POCT，其优点是检测速度快，但是不同厂家制作水平差异，其灵敏度在0.5-2ng/mL之间。按罗氏化学发光法归纳的参考标准，0.5ng/mL水平处提示有炎症可能来判断，荧光层析检测在0.5ng/mL处的重复性低可能会导致检测结果出现假阴或假阳情况。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种单一试剂，无需混合试剂，灵敏度高，检测速度快的降钙素原（PCT）的胶乳增强免疫比浊检测试剂。该试剂既可以在大型自动生化分析仪上进行测试，也可以在特定蛋白仪等小型POCT设备上进行测试。
在背景技术的介绍中提到，市场上已有的PCT胶乳增强免疫检测试剂采用的是双试剂的检测形式。其中稀释液常被称为R1,胶乳溶液常被称为R2。纯粹的抗体或者抗原包被的微球的胶乳溶液是热力学不稳定体系，如果没有特殊的处理，胶乳会自发地凝集。因此，一般地，检测试剂中的胶乳溶液（R2）需要通过优化溶液的组成来保证胶乳溶液的稳定，阻止胶乳在储存时发生自发凝集。常见的优化手段包括选用不同的缓冲体系、改变微球表面电荷、改变溶液离子强度、添加稳定剂等手段（J.A. Molina Bolivar et al, Journal of Macromolecular Science Part C - Polymer Reviews, 2005, 45:59-98）。然而当胶乳溶液用于测试时，由抗原抗体的特异性结合导致的胶乳凝集就不应该被阻止，这就要求稀释液（R1）能够在一定程度上有益于胶乳凝集的形成。所以一般稀释液（R1）和胶乳储存液（R2）在配方上有很大的区别。直接将R1和R2混合，一般会导致胶乳不稳定。这也是市场上胶乳试剂一般都采用双试剂形式的主要原因。
在本发明中，除了常规的稳定胶乳试剂的方法以外，我们还引入了表面活性剂来优化试剂配方稳定胶乳溶液。表面活性剂可以提供空间位阻，离子型的表面活性剂还可以提供额外的静电斥力，从而阻止胶乳的凝聚，在储存时稳定胶乳试剂。 同时，通过优化试剂配方，当含有PCT的样本接触胶乳试剂时，合适的表面活性剂能够促进PCT抗原和PCT抗体的相互作用，有利于形成特异性的胶乳凝集。这样我们就制备了一种单试剂形式的PCT胶乳试剂。在储存时，该试剂可以稳定存放，在接触样品时，该试剂可以迅速发生凝集反应， 不再需要混合其他的稀释液来促进凝集反应。 而且优选的表面活性剂种类和浓度可以有效溶解血液中血细胞，从而使得本发明中的检测试剂可以直接测量全血的样本，具备了同时检测全血、血清和血浆的能力。
本发明所述的降钙素原（PCT）检测试剂包括PCT抗体致敏胶乳颗粒、乙二胺四乙酸二钠、精氨酸、牛血清白蛋白、聚乙烯磺酸钠、十二烷基聚乙二醇醚以及Proclin300，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。
所述的PCT抗体致敏胶乳颗粒的浓度为0.15mg/mL。
所述的乙二胺四乙酸二钠浓度为10mM。
所述的精氨酸浓度为10g/L。
所述的牛血清白蛋白浓度为3g/L。
所述的聚乙烯磺酸钠浓度为5-10g/L。
所述的十二烷基聚乙二醇醚浓度为1-2g/L。
所述的Proclin300浓度为1g/L。
优选的，PCT抗体致敏胶乳颗粒是按照如下方法制备的：
（1）制备活化胶乳颗粒：取粒径309nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀。
（2）制备致敏胶乳颗粒：1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的PCT多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液。将（1）中的活化胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h。12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊试剂。封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5-10g/L聚乙烯磺酸钠、1-2g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/LProclin300，pH=6.5，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。
本发明所述的试剂检测方法如下：
检测样品时，本发明提供的试剂中胶乳颗粒上的PCT抗体与样品中的PCT抗原发生抗体抗原反应，从而使得胶乳逐渐凝聚，改变了测试液的浊度。浊度的变化可以通过透射仪或者散射仪来测定。 透射的吸光度或者散射光强度与样品中的PCT浓度在一定浓度范围内成线性关系。 通过参考PCT校准品建立的定标曲线，可以定量地计算出被测样品中PCT的浓度。
本发明的有益效果包括：
1.检测试剂的组成简单，只有单一试剂，不需要像市场现有试剂那样在测试时进行R1、R2的混合操作，简化了操作程序。尤其是在使用半自动POCT设备的时候，为操作人员带来极大的便利，同时也更好地保障了测试的精确性。
2.试剂同时具有溶血和检测的功能，可以直接测试全血样品，不需要进行血清、血浆提取的工作，简化了操作，大大缩短了包括样品准备在内的整个测试时间。
3.该试剂反应快速，反应时间只需要2到3分钟。相比现有双试剂胶乳试剂10到12分钟的检测时间，速度提高接近4倍，从而大大提升了检测效率,尤其有利于门诊的快速检测。
4.该试剂线性灵敏度高，灵敏度为0.17ng/mL。
5.试剂适用性好，可以在透射或者散射仪上使用。既可以在全自动大型生化仪上使用，也可以在小型POCT设备上使用。可以同时满足大型医院检验科、住院部、小型医院门诊、以及急诊科室的检测需要。
附图说明
图1为实施例1在POCT设备上的定标曲线
图2为实施例1与市场上主流厂家九强试剂检测结果的相关性
图3为实施例1与市场上主流厂家罗氏试剂检测结果的相关性
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细阐述。下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
实施例1
1）胶乳试剂的制备
羧基化聚苯乙烯微球购自日本JSR Life Sciences。
PCT抗体购自芬兰Hytest生物。
EDC购自sigma。
制备方法1与2在表面活性剂的组合上存在差异。
制备方法1：制备活化胶乳颗粒：取粒径309nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀。
制备致敏胶乳颗粒：1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的PCT多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液。将（1）中的活化胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h。12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊试剂。封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5g/L聚乙烯磺酸钠、1g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/LProclin300，pH=6.5，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。
制备方法2：制备活化胶乳颗粒：取粒径309nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀。
制备致敏胶乳颗粒：1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的PCT多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液。将（1）中的活化胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h。12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊试剂。封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5g/L Triton X-100以及1g/L Proclin300，pH=6.5。
2）校准品的制备
将市售的PCT抗原用校准品稀释液配制成一系列校准品，浓度分别为0ng/mL，0.5ng/mL，2ng/mL，10ng/mL，40ng/mL，80ng/mL。
3）质控品的制备
将高浓度的PCT样品（50ng/mL）用校准品稀释液分别稀释两倍和二十倍成25ng/mL和2.5ng/mL，分别作为高值质控品和低值质控品。
4）在POCT设备上建立定标曲线。
将6个PCT校准品，浓度从0到80ng/mL，分别与配制的PCT胶乳单试剂在反应杯中反应，用POCT设备（本例中使用劳拉电子半自动特定蛋白分析仪EZ-400）进行检测，记录反应度。检测波长为650nm，检测散射光强度，采用两点速率法，反应时间120s，计算两点反应度差值。根据浓度和反应度差值可以建立定标曲线。图1是实施例1中按制备方法1和2得到的胶乳单试剂建立的定标曲线。
实施例2
试剂的分析灵敏度（空白限）
使用实施例1中的试剂， 选用零值校准品作为空白样本测试，在POCT设备上测试浓度。重复测试20次，根据实施例1中建立的标准曲线计算20次测试结果的平均值（X）和标准差（SD）， 计算X+2SD作为试剂的分析灵敏度。测试结果如表1所示，显示制备方法1的分析灵敏度为0.17ng/mL，制备方法2的分析灵敏度为0.31ng/mL，说明表面活性剂的组合优化后，能明显的提升试剂检测的灵敏度。降钙素原（PCT）的检测临床参考值在0.5ng/mL左右，本发明中制备方法1中制备的PCT胶乳增强免疫比浊单试剂的分析灵敏度比参考值要小3倍，完全符合使用的需要。
表1. 实施例1的试剂分析灵敏度测试结果
实施例3
试剂的重复性
用实施例1中制备的单试剂测试PCT浓度为0.3ng/mL左右的正常值水平的控制物质和PCT浓度为7ng/mL左右的异常值水平的控制物质，各重复测试10次，计算测量值的平均值（X）和标准差（SD）。按式（1）计算变异系数（CV）。测试结果见表2。根据测量结果，计算出变异系数CV= 7.11%和4.95%， 符合试剂CV<10%的技术要求。
CV =（SD/X）×100%…………………………(1)
式中：
CV ——变异系数；
SD ——标准差；
X ——测量值的平均值。
表2. 实施例1的重复性测量结果
实施例4
与九强试剂的相关性分析
在本实施例中，我们收集了120个临床血清样本，采用实施例1制备方法1中的单试剂和设备进行检测， 检测结果与九强的试剂检测结果进行了相关性分析。分析结果如图2所示。相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y=1.0047x+0.2194，相关系数R=0.9817。这个结果表明本发明中的单试剂和九强的试剂相关性很好，准确性非常一致。
实施例5
与罗氏试剂的相关性分析
在本实施例中，我们收集了120个临床血清样本（罗氏试剂检测后，选择在本发明单试剂的线性范围0.3-80ng/ml以内），采用实施例1制备方法1中的单试剂和设备进行检测， 检测结果与罗氏检测结果进行了相关性分析。分析结果如图3所示。相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y=1.0336x+0.0581，相关系数R=0.9808。这个结果表明本发明中的单试剂和罗氏的试剂相关性很好，准确性非常一致。
实施例6
与市场上其他试剂的性能参数对比
本发明单试剂与市场上其他PCT试剂盒性能参数对比情况如表3所列。从表中可以看出，本发明的单试剂主要在检测样本类型、需要的试剂数量和种类、试剂的灵敏度和试剂的检测速度等方面明显优于市场上的对比试剂。
表3. PCT试剂性能参数对比
| 生产厂家 | 实施例1 | 国产上市试剂 |
| 测试方法 | 散射比浊法 | 透射比浊法 |
| 样本类型 | 新鲜血清、血浆和全血 | 新鲜血清和血浆 |
| 试剂类型 | 液体，聚苯乙烯颗粒 | 液体，聚苯乙烯颗粒 |
| 试剂数量 | 1 | 2 |
| 试剂种类 | 单试剂胶乳 | 胶乳和辅助试剂 |
| 线性范围 | 0.17-80ng/mL | 0.3-60ng/mL |
| 检测耗时 | 2-3min | 约10min |
| 精密度 | ≤10% | ≤10% |
| 准确度 | ≤15% | 未标明 |
| 批间差 | ≤10% | ≤10% |
| 是否需要配备稀释液 | 否 | 是 |
| 有效期 | 12个月 | 12个月 |
Claims (1)
1.一种降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊检测单试剂，其特征在于所述单试剂包括0.15mg/mL的PCT抗体致敏胶乳颗粒、10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5-10g/L聚乙烯磺酸钠、1-2g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/L Proclin300，pH=6.5，其中聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1；
其中所述的PCT抗体致敏胶乳颗粒是按照如下方法制备的：
（1）制备活化胶乳颗粒：取粒径309nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀；
（2）制备致敏胶乳颗粒：1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的PCT多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液；将（1）中的活化胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h；12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊试剂；封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5-10g/L聚乙烯磺酸钠、1-2g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/LProclin300，pH=6.5，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911386655.6A CN111007267A (zh) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | 一种降钙素原（pct）的检测试剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911386655.6A CN111007267A (zh) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | 一种降钙素原（pct）的检测试剂及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111007267A true CN111007267A (zh) | 2020-04-14 |
Family
ID=70119590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911386655.6A Pending CN111007267A (zh) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | 一种降钙素原（pct）的检测试剂及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111007267A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020182752A1 (en) * | 2000-05-30 | 2002-12-05 | Atsushi Miyamoto | Immunological latex turbidimetry method and reagent therefor |
| US20090123955A1 (en) * | 2004-12-13 | 2009-05-14 | Bayer Healthcare Llc | Size Self-Limiting Compositions and Test Devices for Measuring Analytes in Biological Fluids |
| CN102056997A (zh) * | 2008-05-06 | 2011-05-11 | 马拉德克里科聚合物公司 | 作为活性成分载体的阴离子胶乳及其制造和使用方法 |
| CN102759631A (zh) * | 2012-08-02 | 2012-10-31 | 南京诺尔曼生物技术有限公司 | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 |
| CN107860929A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-03-30 | 苏州康和顺医疗技术有限公司 | 一种血清淀粉样蛋白a的免疫比浊检测试剂和方法 |
| CN110441515A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-12 | 柏荣诊断产品（上海）有限公司 | 一种便隐血检测试剂盒 |
-
2019
- 2019-12-30 CN CN201911386655.6A patent/CN111007267A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020182752A1 (en) * | 2000-05-30 | 2002-12-05 | Atsushi Miyamoto | Immunological latex turbidimetry method and reagent therefor |
| US20090123955A1 (en) * | 2004-12-13 | 2009-05-14 | Bayer Healthcare Llc | Size Self-Limiting Compositions and Test Devices for Measuring Analytes in Biological Fluids |
| CN102056997A (zh) * | 2008-05-06 | 2011-05-11 | 马拉德克里科聚合物公司 | 作为活性成分载体的阴离子胶乳及其制造和使用方法 |
| CN102759631A (zh) * | 2012-08-02 | 2012-10-31 | 南京诺尔曼生物技术有限公司 | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 |
| CN107860929A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-03-30 | 苏州康和顺医疗技术有限公司 | 一种血清淀粉样蛋白a的免疫比浊检测试剂和方法 |
| CN110441515A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-12 | 柏荣诊断产品（上海）有限公司 | 一种便隐血检测试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101377492A (zh) | 胱抑素c测定试剂盒 | |
| CN107860929A (zh) | 一种血清淀粉样蛋白a的免疫比浊检测试剂和方法 | |
| CN101699287B (zh) | 匀相溶胶颗粒型胱抑素c测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN108152512A (zh) | 肝素结合蛋白检测试剂盒及其制备方法 | |
| US20220113322A1 (en) | Rapid measurement of total vitamin d in blood | |
| CN108051439A (zh) | 一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN110988363A (zh) | 一种抗病毒蛋白MxA的检测试剂及其制备方法 | |
| CN110988348A (zh) | 游离前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN111007264A (zh) | 一种涎液化糖链抗原kl-6的检测试剂及其制备方法 | |
| CN108362892B (zh) | 一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂 | |
| CN111239404B (zh) | 一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒 | |
| KR20100095422A (ko) | 면역학적 미소 입자의 응집 반응을 사용하는 검체의 아크롤레인 부가체의 측정 방법 및 측정용 키트 | |
| CN114137204B (zh) | 一种kl-6测定试剂盒及其制备与检测方法 | |
| CN108089008A (zh) | 一种ngal的免疫比浊检测试剂和方法 | |
| Shin et al. | Hook effect detection and detection-range-controllable one-step immunosensor for inflammation monitoring | |
| CN111007267A (zh) | 一种降钙素原（pct）的检测试剂及其制备方法 | |
| JPH06213891A (ja) | 金コロイド粒子を用いた免疫分析法 | |
| CN115236325A (zh) | 一种胶乳增强免疫比浊法测定ctx的试剂盒及其制备检测方法 | |
| CN107860930A (zh) | 一种心型脂肪酸结合蛋白的免疫比浊检测试剂和方法 | |
| CN111175515B (zh) | 一种血清淀粉样蛋白a和c反应蛋白的二合一质控物及其制备方法 | |
| CN114965986A (zh) | 用于检测血液中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)的试剂盒 | |
| CN117890578A (zh) | 一种胰蛋白酶原2（Try-2）的检测用单试剂及其制备方法 | |
| CN113063947B (zh) | 一种检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒、系统及方法 | |
| CN118150845A (zh) | 一种基于彩色胶乳颗粒的检测降钙素原试剂及其制备方法 | |
| US20230375559A1 (en) | Ferritin measuring reagent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200414 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |