KR20100095422A - 면역학적 미소 입자의 응집 반응을 사용하는 검체의 아크롤레인 부가체의 측정 방법 및 측정용 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 검체 중의 아크롤레인 부가체를 측정하는 방법은, (a) 당해 아크롤레인 부가체를 포함하는 검체와, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린을 함유하는 용액과를 혼합하는 공정; (b) 당해 공정 (a)에서 수득된 당해 혼합액에, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자를 함유하는 용액을 첨가하여 혼합하는 공정; 및 (c) 당해 공정 (b)에서 수득된 당해 혼합액에 있어서, 당해 미소 입자의 응집 반응의 정도를 측정하는 공정으로서, 당해 응집 반응의 정도가, 당해 검체 중의 아크롤레인 부가체의 양에 따라 감소되는 공정; 을 포함한다. 본 발명에 의하면, 번잡한 조작을 필요로 하지 않고 아크롤레인 부가체를 측정할 수 있다.

Description

면역학적 미소 입자의 응집 반응을 사용하는 검체의 아크롤레인 부가체의 측정 방법 및 측정용 키트{Method and kit for measurement of acrolein adduct in sample utilizing agglutination reaction of immunological microparticle}
본 발명은, 물질을 결합한 미소 입자를 사용하는 면역학적 측정법에 관한 것이다. 특히, 주로 공업, 환경, 및 임상 검사의 분야에 있어서의, 항원 항체 반응을 이용한 아크롤레인 부가체의 면역학적 측정 방법 및 면역 측정 시약 키트에 관한 것이다.
최근, 임상 검사 등의 각종 검사에서는 자동화 및 측정 시간의 단축이 도모되고 있다. 그 검사의 방법으로서, 생체 시료 중의 물질을 측정하기 위해서 면역반응을 이용하는 측정 방법이 널리 사용되고 있다. 면역학적 측정 방법으로서는, RIA법, EIA법, 면역비탁법, 라텍스 응집법, 금 콜로이드 응집법, 면역 크로마토법 등의 많은 방법이 있다. 이 중에서도, 라텍스 응집법이나 금 콜로이드 응집법은, 반응액의 분리나 세정 조작을 필요로 하지 않는 균일계에서의 측정이 가능하기 때문에, 측정의 자동화나 단시간 측정에 적합하다. 특히, 금 콜로이드 입자는 5 내지 100nm의 크기이며, 이것은 라텍스 입자보다 작기 때문에, 보다 미량의 물질의 측정에 이용 가능하다[참조: 일본 공개특허공보 2005-283250호 및 일본 공개특허공보 2004-325192호].
이러한 측정법에 있어서의 주반응 성분은, 피측정 물질에 특이적으로 반응(예를 들면, 결합)하는 물질을 결합한 라텍스 입자나 금 콜로이드 입자 등의 미소 입자이다. 미소 입자 위에 존재하는 항체 등의 특이적 결합 물질이 피측정 물질과 결합함으로써, 미소 입자의 응집이 생긴다. 이러한 응집은, 피측정 물질의 양 의존적으로 발생하기 때문에, 그 현상을 기계적으로 측정함으로써, 피측정 물질량을 산출할 수 있다.
이러한 응집에 의한 측정용의 담체 입자로서는, 상기의 라텍스 입자나 금 콜로이드 입자 이외에, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜을 결합한 미립자 담체[참조: 일본 공개특허공보 2004-300253호], 스티렌 유도체 및 비닐계 화합물로 이루어지는 미소 담체[참조: 일본 공개특허공보 제(평)7-133232호], 표면이 이방성을 갖는 고분자 입자[참조: 일본 공개특허공보 제(평)10-87841호], 독특한 수단에 의해 조제된 리포솜[참조: 일본 공개특허공보 제(평)9-5325호 및 일본 공개특허공보 제(평)9-229937호] 등을 사용할 수 있는 것이 알려져 있다.
또한, 측정의 정밀도를 향상시키기 위해서, 담체 입자와 함께 사용하는 시약에 관해서도 다양한 검토가 실시되고 있다. 예를 들면, 고농도의 C-반응성 단백질에 대한 항체를 담지한 라텍스 입자와 함께, 포스포릴콜린기와 양이온성기를 갖는 화합물을 사용하는 측정 방법이 알려져 있다[참조: 일본 공개특허공보 2001-318099호]. 또한, 응집 면역분석법에 있어서, 포스포릴콜린기 및 비닐기를 갖는 단량체를 단독 중합한 중합체, 또는 포스포릴콜린기 및 비닐기를 갖는 단량체와 비닐기를 갖는 단량체를 공중합한 중합체를 사용하는 방법이 있다[참조: 국제공개 제02/018953호 팜플렛]. 또한, 매독 감염 진단용 시약으로서, 항원을 담지한 담체와 함께, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린에 유래하는 세그먼트 및 친수성 단량체에 유래하는 세그먼트를 갖는 공중합체를 사용하는 측정 시약이 있다[참조: 일본 공개특허공보 2007-155623호 및 일본 공개특허공보 2007-155624호].
그러나, 특히, 분자량이 작은 피측정 물질인 약제나 화학 물질 등은, 특이적 결합 물질과 피측정 물질의 결합 부위가 적고, 응집 반응이 생기기 어렵기 때문에, 응집 반응을 사용한 균일한 측정계를 조직하는 것은 곤란하였다. 이로 인해, 특별히, 피측정 물질, 또는 하프텐을 복수개 결합시킨 경합체를 반응계에 첨가하는 것 등의 연구가 필요하였다.
발명의 개시
본 발명의 목적은, 상기와 같이 응집 반응을 사용한 측정계를 조직하기 어려운 저분자 물질인 아크롤레인 부가체의 균일한 측정 방법, 및 그 측정 키트를 제공하는 것이다.
본 발명에서는, 피측정 물질인 아크롤레인 부가체를 포함하는 검체; 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린을 함유하는 용액; 및 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자 용액을 혼합함으로써, 저분자인 아크롤레인 부가체를 특별한 경합체를 첨가하지 않고, 보다 간편하게 측정하는 것을 가능하게 하였다.
본 발명은, 검체 중의 아크롤레인 결합물을 측정하는 방법을 제공하고, 당해방법은,
(a) 당해 아크롤레인 부가체를 포함하는 검체와, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린을 함유하는 용액과를 혼합하는 공정;
(b) 당해 공정 (a)에서 수득된 당해 혼합액에, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자를 함유하는 용액을 첨가하여 혼합하는 공정; 및
(c) 당해 공정 (b)에서 수득된 당해 혼합액에 있어서, 당해 미소 입자의 응집 반응의 정도를 측정하는 공정으로서, 당해 응집 반응의 정도가, 당해 검체 중의 아크롤레인 부가체의 양에 따라서 감소되는 공정;
을 포함한다.
하나의 실시 형태에서는, 상기의 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린은, 포르밀데하이드로피페리딘 구조를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체이다.
어떤 실시 형태에서는, 상기의 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질은, 당해 면역 글로불린과 특이적으로 결합하는 항체이며, 적합하게는 모노클로날 항체이다.
또 다른 실시 형태에서는, 상기의 블록킹제는, 면역 시약 조제시에 사용되는 일반적인 블록킹제이며, 적합하게는 소 혈청 알부민이다.
또 다른 실시 형태에서는, 상기의 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제를 결합시킨 미소 입자 함유 용액은, 완충제 및 단백질을 함유하고, 단백질로서는 소 혈청 알부민이 적합하다.
하나의 실시 형태에서는, 상기 미소 입자는, 라텍스 또는 금 콜로이드이다.
본 발명은 또한, 아크롤레인 부가체 측정용 시약 키트를 제공하고, 당해 키트는,
아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린을 포함하는, 제1 시약; 및
아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자를 포함하는, 제2 시약;
을 포함한다.
또 다른 실시 형태에서는, 상기의 제2 시약은, 완충제 및 단백질을 함유하고, 단백질로서는 소 혈청 알부민이 적합하다.
본 발명에 의하면, 피측정 물질인 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린, 및 당해 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제를 결합시킨 미소 입자를 사용함으로써, 아크롤레인 부가체의 균일한 계에서의 보다 간편한 측정이 가능하게 된다. 본 발명의 방법은 균일하고 간편한 측정계이기 때문에, 자동 분석 장치에서의 측정에 적용 가능하다. 이로 인해, 아크롤레인 부가체의 측정에 있어서의 시간의 단축 및 노동력의 경감으로 이어진다.
도 1은, Nε-(3-포르밀-3,4-디하이드로피페리디노)-리신(FDP-Lys)의 농도와 흡광도 변화량의 관계를 도시하는 그래프(아크롤레인 부가체 측정용 검량선)이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에 있어서의 측정 대상 물질인 아크롤레인(CH2=CH-CHO)은, 석유, 석탄, 목재, 및 플라스틱의 연소에 의해 생성될 뿐만 아니라, 담배 연기, 배기 가스, 유지의 가열 등에 의해서도 생성되는 화학 물질이며, 강한 세포 독성을 갖는 것이 알려져 있다. 최근, 아크롤레인은, 지방질의 과산화에 의해서도 생성되는 것도 밝혀져 생체 내에서의 영향이 주목받고 있다. 아크롤레인은, 임상 검사 분야에서 산화 스트레스 마커로서, 특히 뇌졸중·무증후성 뇌경색의 마커로서, 임상 검사 분야에서 측정 대상 물질이 되고 있다[참조: 일본 공개특허공보 2005-334476호].
아크롤레인은, 통상적으로 단백질 중의 리신의 ε-아미노기에 결합하고, 포르밀데하이드로피페리디노-리신 구조(FDP-Lys라고 하는 경우도 있다)를 갖는 물질로서 존재하고 있다. 본 발명에 있어서는, 당해 구조체를 아크롤레인 부가체(ACR-Lys라고 하는 경우도 있다)라고 하고, 이러한 아크롤레인 부가체를 피측정 물질로 한다.
본 발명에 있어서, 측정에 제공하는 피측정 물질인 아크롤레인 부가체를 포함하는 검체로서는, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 분변(현탁액), 수액, 복수 등의 생체 시료; 환경 중에서 수득된 샘플 또는 그 추출물 등을 들 수 있다.
피측정 물질인 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식(아크롤레인 부가체에 특이적으로 결합)하는 면역 글로불린은, 특별히 한정되지 않지만, 아크롤레인 부가체와의 결합의 특이성이 양호한 점에서, 아크롤레인 부가체에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체가 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 아크롤레인 부가체의 포르밀데하이드로피페리딘 구조를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 들 수 있다. 폴리클로날 항체로서는, 예를 들면, 일본 공개특허공보 제(평)11-80023호에 기재된 ACR-Lys에 대한 항혈청을 들 수 있다. 또한, 모노클로날 항체로서는, 예를 들면, 일본 공개특허공보 제(평)11-147899호에 기재된 모노클로날 항체를 사용할 수 있다.
상기 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질로서는, 면역 글로불린에 특이적으로 결합할 수 있는 프로테인 A, 프로테인 G, 면역 글로불린을 인식하는 항체 등을 들 수 있다. 결합의 특이성이 양호한 점에서, 면역 글로불린을 인식하는 항체가 바람직하다. 또한, 면역 글로불린을 인식하는 모노클로날 항체가 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 블록킹제는, 면역 시약 조제시에 통상적으로 사용되는 일반적인 블록킹제이면 양호하다. 예를 들면, 소 혈청 알부민이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적 결합하는 물질과 블록킹제를 결합시키기 위한 미소 입자는, 면역 측정 시약에 통상적으로 사용될 수 있는 미소 입자이면 양호하다. 예를 들면, 라텍스 및 금속 콜로이드가 바람직하다. 금속 콜로이드의 경우, 금 콜로이드가 일반적으로 이용되기 쉬운 점에서 바람직하다. 금 콜로이드 입자는, 시판되고 있는 것을 사용해도 양호하며, 또는 당업자가 통상적으로 사용하는 방법(예를 들면, 염화금산을 시트르산나트륨으로 환원하는 방법)에 의해 조제한 것을 사용해도 양호하다. 금 콜로이드 입자의 입자 직경은, 통상적으로 10 내지 100nm, 바람직하게는 30 내지 60nm의 범위이다.
본 발명의 방법에 사용되는 상기 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제를 결합시킨 미소 입자(이하, 결합 미소 입자라고 하는 경우가 있다)는, 예를 들면, 미소 입자로서 금 콜로이드 입자를 사용하는 경우, 이하와 같이 조제할 수 있다: 금 콜로이드 입자 용액(540nm에 있어서의 흡광도가 약 2.0) 1L에 대해, 통상적으로 0.1 내지 100mg, 바람직하게는 1 내지 10mg의 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린과 특이적으로 결합하는 물질(예를 들면, 항체)을 첨가하고, 냉장 또는 실온하에서 5분 내지 24시간 동안 교반한다. 다음에, 소 혈청 알부민 등으로 블록킹하고, 원심 분리를 실시함으로써, 원하는 결합 미소 입자(이 경우는, 결합 금 콜로이드 입자)를 수득할 수 있다. 수득된 미소 입자는, 측정에 필요한 농도가 되도록 완충액에 분산시킨다. 완충액의 pH는 5 내지 9가 바람직하고, 농도는 1 내지 100mM이 바람직하다. 완충액으로서는, 예를 들면, 인산 완충액, 트리스 염산 완충액, 석신산 완충액, 또는 글리실글리신, MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), HEPES(2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄설폰산), TES(N-트리스(하이드록시메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), PIPES(피페라진-1,4-비스(2-에탄설폰산)), Bis-Tris(비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스(하이드록시메틸)메탄)등의 굿 완충액이 적합하게 사용된다.
완충액은, 필요에 따라서, 당 및 당알콜, 아지드화나트륨, 알부민, 염화나트륨 등의 염류, 방부제 등의 첨가물을 함유해도 양호하다. 당 및 당알콜로서는, 글루코스, 만노스, 사카로스, 락토스, 말토스, 만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있고, 그 농도는, 0.01 내지 10w/v%가 바람직하다. 알부민으로서는, 소 혈청 알부민(BSA)이 바람직하고, 그 농도는 0.001 내지 1w/v%가 바람직하다. 방부제로서는 아지드화나트륨이 바람직하고, 그 농도는, 0.01 내지 0.5w/v%가 바람직하다. 그 밖의 첨가물로서는, Tween20, 폴리에틸렌글리콜라우릴에테르, 5-브로모살리실산, 살리실산나트륨, 벤조산나트륨, 벤젠설폰산나트륨, 페놀, 티몰 등을 들 수 있다.
피측정 물질인 아크롤레인 부가체와 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린과의 결합 반응, 및 수득된 반응액과 당해 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제를 결합시킨 미소 입자의 응집 반응에 있어서, 반응 온도, pH, 완충액의 종류, 공존하는 염의 종류나 농도, 그 밖의 공존 물질 등의 반응 조건은, 종래의 면역학적 반응과 동일하다. 예를 들면, 일반적으로 실시되고 있는 바와 같이, 반응 촉진의 목적으로, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 덱스트란, 콘드로이틴황산나트륨 등의 수용성 고분자를 반응계에 첨가해도 양호하다.
본 발명에 있어서, 검체 중의 피측정 물질인 아크롤레인 부가체를 측정하는 방법은,
(a) 당해 아크롤레인 부가체를 포함하는 검체와, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린을 함유하는 용액과를 혼합하는 공정;
(b) 당해 공정 (a)에서 수득된 당해 혼합액에, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자(즉, 결합 미소 입자)을 함유하는 용액을 첨가하여 혼합하는 공정; 및
(c) 당해 공정 (b)에서 수득된 당해 혼합액에 있어서, 당해 미소 입자의 응집 반응의 정도를 측정하는 공정으로서, 당해 응집 반응의 정도가, 당해 검체 중의 아크롤레인 부가체의 양에 따라서 감소되는, 공정;
을 포함한다.
이 방법에 있어서, 피측정 물질인 아크롤레인 부가체의 농도 의존적으로, 라텍스나 금 콜로이드 등의 결합 미소 입자의 응집 반응을 발생시키고, 그 정도를 기계적으로 측정한다. 본 발명의 방법에 있어서는, 응집 반응의 정도는, 검체 중의 아크롤레인 부가체의 양에 따라서 감소된다.
본 발명의 방법은, 예를 들면, 이하와 같이 실시된다: 피측정 물질인 아크롤레인 부가체를 포함하는 검체 또는 당해 검체를 완충액 등으로 적절하게 희석한 것 등과, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린 함유 용액을 혼합하여 복합체를 형성시킨다. 다음에, 당해 복합체를 포함하는 반응액에, 상기와 같이 수득된 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자(결합 미소 입자) 용액을 첨가하여 혼합함으로써, 피측정 물질의 농도 의존적으로 응집 반응을 발생시킨다. 미소 입자로서 금 콜로이드를 사용하는 경우는, 당해 응집 반응에 기인하는 소정의 파장에 있어서의 흡광도 변화를 측정한다. 측정 결과를, 미리 작성해 둔 금 콜로이드 응집 반응의 흡광도 변화와 피측정 물질의 양의 관계를 나타내는 검량선에 적용시킴으로써, 용이하게 검체 중의 피측정 물질의 양을 구할 수 있다. 또한, 흡광도 변화가 일정 값보다도 이상인지 이하인지에 따라 판정함으로써, 정성(定性) 및 반정량을 하는 것도 가능하다.
미소 입자로서 금 콜로이드를 사용하는 경우, 반응 개시후의 흡광도 변화는, 1파장 측정이라도 2파장 측정이라도 양호하다. 2파장 측정의 경우는, 측정 파장은, 제1 파장 610 내지 800nm, 바람직하게는 630 내지 750nm와, 제2 파장 360 내지 580nm, 바람직하게는 500 내지 550nm이다. 1파장 측정의 경우는, 상기 2파장 측정의 경우의 제1 파장 또는 제2 파장 중 어느 한쪽의 파장 영역의 파장으로 측정할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서 흡광도 변화란, 이하의 2가지 측정에 의해 수득된 값이며, 어느 것이라도 양호하다:
(1) 반응 개시후에 반응액의 흡광도를 적당한 간격으로 2회 측정하고, 그 차이를 흡광도 변화라고 한다; 또는
(2) 반응 개시후에 반응액의 흡광도를 연속적으로 측정하고, 시간당 흡광도 변화율(그 최대 변화율을 사용하는 경우도 있다)을 흡광도 변화라고 한다.
상기 측정에는, 분광 광도계, 마이크로 플레이트 리더, 생화학 자동 분석 장치 등을 이용할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법을 생화학 자동 분석 장치에서의 측정에 적용함으로써, 다수의 검체를 단시간에 측정하는 것이 가능하다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 아크롤레인 부가체 측정용 시약 키트가 제공된다. 이 키트는, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린을 포함하는 제1 시약; 및 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자를 포함하는 제2 시약;을 포함한다.
상기 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제를 결합시킨 미소 입자를 포함하는 제2 시약에는, 추가로 완충제와 단백질을 포함하는 것이 바람직하다. 단백질로서는 소 혈청 알부민이 적합하게 사용된다.
상기의 시약은, 어떤 형태로 제공되어도 양호하며, 각각 개별적으로 밀봉 포장되어 제공되는 것이 바람직하다. 상기 키트는, 검량선 작성용의 피측정 물질의 표준품, 사용시에 각 물질을 용해하여 적절한 농도의 용액을 조제하기 위한 완충액, 사용 설명서 등을 포함하고 있어도 양호하다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것이 아니다.
(실시예 1: 금 콜로이드액의 조제)
95℃의 증류수 1L에 10w/v% 염화금산 용액 2mL을 교반하면서 가하고, 1분후에 2w/v% 시트르산나트륨 용액 10mL을 첨가하고, 또한 20분 동안 교반한 후, 30℃로 냉각시켰다. 냉각후, 0.1w/v% 탄산칼륨으로 pH 7.1로 조절하였다.
(실시예 2: 항마우스 IgG 래트 모노클로날 항체 및 소 혈청 알부민 결합 금 콜로이드 시약의 조제)
항마우스 IgG 래트 모노클로날 항체(Production of Antibodies, Reagents for Immunology and Services사 제조)를, 0.05w/v% 아지드화나트륨을 포함하는 10mM HEPES(pH 7.1)로 희석하여 20㎍/mL의 농도로 하였다. 당해 액 50mL을 상기 실시예 1에서 조제한 약 1L의 금 콜로이드액에 가하고, 냉장 하에서 2시간 동안 교반하였다. 0.5w/v% 소 혈청 알부민을 함유하는 5.46w/v% 만니톨, 및 0.05w/v% 아지드화나트륨을 포함하는 10mM HEPES(pH 7.1)을 110mL 첨가하고, 37℃에서 90분 동안 교반함으로써 블록킹 처리를 실시하였다. 8000회전으로 40분간 원심 분리하여, 상청을 제거하였다. 다음에, 3w/v% 만니톨, 0.1w/v% BSA, 및 0.05w/v% 아지드화나트륨을 포함하는 5mM HEPES(pH 7.5)(A 용액)을 약 1L 가하고, 항체 결합 금 콜로이드를 분산시킨 후, 8000회전으로 40분 동안 원심 분리하여 상청을 제거하고, A 용액을 가하여 항체 결합 금 콜로이드를 분산시켜 전량을 70mL로 하여 항마우스 IgG 래트 모노클로날 항체 결합 금 콜로이드 용액을 조제하였다.
다음에, 항마우스 IgG 래트 모노클로날 항체 및 소 혈청 알부민 결합 금 콜로이드 용액 70mL에, A 용액을 280mL 첨가하고, 항마우스 IgG 래트 모노클로날 항체 결합 금 콜로이드 시약을 조제하였다.
(실시예 3: 아크롤레인 부가체 측정용 제1 시약의 조제)
1.0w/v% 염화나트륨, 0.5w/v% EDTA, 및 0.35w/v% 폴리옥시에틸렌라우릴에테르를 포함하는 0.2M PIPES(pH 6.5)의 용액에, 항아크롤레인 모노클로날 항체[참조: 니치유 가부시키가이샤 제조]를 1.25㎍/mL, 및 반응 촉진제로서 폴리에틸렌글리콜을 1.0 내지 2.5w/v% 정도 첨가하고, 아크롤레인 부가체 측정용 제1 시약으로 하였다.
(실시예 4: 아크롤레인 부가체의 측정)
본 실시예에서는, 제1 시약으로서, 실시예 3에서 조제한 아크롤레인 부가체 측정용 제1 시약을, 그리고 제2 시약으로서, 실시예 2에서 조제한 항마우스 IgG 래트 모노클로날 항체 및 소 혈청 알부민 결합 금 콜로이드 시약을 사용하였다. 아크롤레인 부가체로서, 아크롤레인과 리신의 ε의 아미노기와의 반응 결합물인 Nε-(3-포르밀-3,4-디하이드로피페리디노)-리신[참조: 니치유 가부시키가이샤 제조](FDP-Lys라고 한다)을, 각각 0, 250, 500, 1000, 2000, 및 4000nmol/mL이 되도록, 1.0% NaCl 용액에 용해한 시료를 조제하였다. FDP-Lys 함유 시료 6μL에, 제1 시약을 170μL 첨가하고, 37℃에서 약 5분 동안 가온한 후, 제2 시약을 85μL 가하고 37℃에서 반응시켜 히타치 7070 자동 분석 장치에 의해, 파장 546nm 및 660nm에서의 측광 포인트로서 18에서 31포인트에 있어서의 흡광도 변화량을 측정하였다. 도 1에 FDP-Lys 농도와 흡광도 변화량의 관계를 도시한다.
도 1에 도시하는 바와 같이, 피측정 물질인 FDP-Lys의 농도 의존적으로, 응집 반응에 의한 흡광도 변화량이 변화(감소)되었다. 즉, 검체 중의 피측정 물질인 아크롤레인 부가체량을, 응집 반응의 흡광도 변화량으로서 측정하고, 검량선과 비교함으로써 정량할 수 있는 것을 알 수 있다.
[산업상의 이용가능성]
본 발명의 방법은, B/F 분리를 필요로 하지 않는 균일한 계에서의 아크롤레인 부가체의 측정 방법이기 때문에, 자동화에도 매우 적합하다. 예를 들면, 임상 검사 분야에서 보급되고 있는 자동 분석 장치를 이용할 수 있다. 따라서, 공업, 환경, 임상 검사 등의 분야에 있어서의, 항원 항체 반응을 이용한 아크롤레인 부가체의 면역학적 측정 방법에 적합하다.

Claims (11)

  1. 검체 중의 아크롤레인 부가체를 측정하는 방법으로서,
    (a) 당해 아크롤레인 부가체를 포함하는 검체와, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린을 함유하는 용액과를 혼합하는 공정;
    (b) 당해 공정 (a)에서 수득된 당해 혼합액에, 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자를 함유하는 용액을 첨가하여 혼합하는 공정; 및
    (c) 당해 공정 (b)에서 수득된 당해 혼합액에 있어서, 당해 미소 입자의 응집 반응의 정도를 측정하는 공정으로서, 당해 응집 반응의 정도가, 당해 검체 중의 아크롤레인 부가체의 양에 따라 감소되는, 공정;
    을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 글로불린이, 상기 아크롤레인 부가체의 포르밀데하이드로피페리딘 구조를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질이, 당해 면역 글로불린에 대한 항체인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 블록킹제가, 소 혈청 알부민인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미소 입자를 함유하는 용액이, 완충제 및 단백질을 함유하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단백질이 소 혈청 알부민인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미소 입자가, 라텍스 또는 금 콜로이드인, 방법.
  9. 아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린을 포함하는 제1 시약; 및
    아크롤레인 부가체를 특이적으로 인식하는 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자를 포함하는 제2 시약;
    을 포함하는, 아크롤레인 부가체 측정용 시약 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 면역 글로불린에 특이적 결합하는 물질과 블록킹제와를 결합시킨 미소 입자를 포함하는 제2 시약이, 완충제 및 단백질을 포함하는, 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단백질이 소 혈청 알부민인, 키트.
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