JPH03123861A - ハプテンの免疫化学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原抗体反応を利用して、試料中のハプテンの
存在量を測定する方法に関する。特に医療診断の分野に
おいて、ホルモンや薬物の血中濃度を調べるための血清
検査のごと＜、臨床検査法としてのハプテンの測定法に
関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕単独
で動物に投与しても抗体産生を惹起しないが、タンパク
質等の高分子に結合させると抗原として働き、抗体産生
が可能となるような低分子物質をハプテンと呼ぶ。臨床
検査の分野でも、低分子ホルモンや血中薬物等多くの項
目で、ハプテンとして上記方法により得られた抗体を利
用した免疫化学的濃度測定が行われている。

ハプテンの免疫化学的測定技術としては、ラジオイムノ
アッセイ　（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（Ｅ
　Ｉ　Ａ）及び蛍光偏光イムノアッセイが主な技術とし
て挙げられる。こうした技術分類は反応の度合いを検知
するための標識物の違いに基づいているが、操作手順の
面からは、標識抗原乃至は抗体の反応物（Ｂｏｕｎｄ）
と未反応物（Ｆｒｅｅ）とを分離して測定する、いわゆ
るＢ／Ｆ分離法と、分離を必要としない、いわゆるホモ
ジニアス法とに分けられる。Ｂ／Ｆ分離法はＲＩＡ及び
ＥＩＡの一部で行われている方式で、感度、特異性に優
れているが、洗浄分離操作が含まれるため、操作的に繁
雑で測定所要時間が長いという欠点がある。また、分離
、洗浄等試料を扱う操作が多いと試料からの感染の危険
も無視できない。加えてＲＩＡには放射性廃棄物問題、
特殊設備の必要性など取り扱い上難点が多い。ＥＩＡに
は標識物として酵素を用いる関係上、反応時間や温度の
管理が厳しい、妨害反応の影響を受は易いといった弱点
がある。

ホモジニアス法はＥＩＡ法の一部及び蛍光偏光イムノア
ッセイ法で用いられている方式で、操作が簡便で測定所
要時間も比較的短く、専用測定装置を用いての自動化が
容易という特徴がある反面、感度が低いために測定対象
が一部の薬物に限定され、多くのホルモンやジゴキシン
のようなｎｇ／ｍルベルの物質の測定は難しい。更に蛍
光偏光測定には高価な装置が必要である。またホモジニ
アス法にあっても、酵素を使用するが故のＥＩＡ法の弱
点に変わりはなく、むしろ試料が反応系に留まるため、
妨害反応を受は易い宿命にあると言える。

ラテックス凝集法もまたホモジニアス法の１つで、定性
乃至は半定量法であるスライド法を主に、一部のハプテ
ン測定に用いられている。操作が簡単で判定までの時間
が短かくて済むというホモジニアス法の長所に加え、Ｅ
ＩＡ等に比べ試薬の保存安定性、反応系の安定性に優れ
る等の長所があるが、検出感度が低いことがやはり最大
の欠点であった。

本発明は、以上のような問題点を解決しようとするもの
で、つまり、分離洗浄等の面倒な操作や安全面の心配が
なく、操作が簡単で、所要時間も短く、かつ高感度なハ
プテン定量法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、ラテックス凝集法の長所を生がしつつ、
感度的に優れ定量に耐える測定系を確立すべく鋭意検討
を重ねた。その結果、従来のラテックス凝集法の適用、
即ちハプテン結合高分子を介して成立するラテックス粒
子同志の凝集に対するハプテンの阻害度を測定する方法
には、感度的に見て問題があることが明らかになった。

その１点は、ラテックス凝集法を成立させるためには力
価の高い抗体が必要だが、特に生体来のハプテンに対し
ては一般的に高力価抗体を得るのが容易でないこと、も
う１点は、凝集を成立させるのに必要な抗体分子はラテ
ックス表面上のごく一部であっても、凝集を阻害するた
めには抗体の大部分をハプテンで覆う必要があるという
方法論上の宿命から、阻害感度の向上が困難なことであ
る。

本発明者らは、さきにラテックス凝集法の応用として、
不溶性担体粒子及び磁性体含有粒子２通りの粒子を用い
る測定法を発明した（特願昭６３−１６８４８号公報）
。そしてかかる方法によれば、双方の不溶性担体粒子に
担持させる抗体種を変えられるので、抗ハプテン抗体を
担持させる粒子を一方に限ることにより、阻害効率を向
上させられると考えた。更に、もう一方の粒子に担持す
る高分子上のハプテンとは異なる抗原決定基に対する抗
体は、高分子として抗原性の強い物を選択することによ
り高力価抗体の適用が可能となるので、いま１点の問題
であった凝集活性の改良をも併せ実現できることを見い
だし本発明に到達した。

即ち、本発明の要旨は、 試料中のハプテンの濃度を測定する方法において、 （Ａ）該ハプテンを結合した高分子化合物（試薬Ａ） （Ｂ）該ハプテンに対する抗体を担持させた不溶性担体
粒子（試薬Ｂ） （Ｃ）試薬（Ａ）における該ハプテンとは異なる抗原決
定基に対する抗体を担持させた磁性体を含有する不溶性
担体粒子（試薬Ｃ） から成る３つの試薬と試料とを反応させて、反応後に磁
場を付与して試薬（Ａ）を介して成立した試薬（Ｂ）と
試薬（Ｃ）を含む凝集塊及び未反応の試薬（Ｃ）を分離
し、残存する試薬（Ｂ）の量を測定することにより、か
かる試薬（Ａ）を介して成立した試薬（Ｂ）と試薬（Ｃ
）との凝集反応が、試料中のハプテンと上記の試薬（Ｂ
）との反応により競合的に阻害される程度を測定するこ
とを特徴とするハプテンの免疫化学的測定法に存する。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明でいう「ハプテン」とは、分子量１万以下の低分
子のうち、単独では人或いは動物に対し抗体産生を惹起
させるのは困難だが、タンパク質等の高分子物質と結合
することにより抗体産生を惹起し得る物質を指す。さら
に、高分子に結合した状態における、構造的に該当する
部位を指す場合もある。臨床検査で「ハプテン」として
測定されるものの例を挙げると、甲状腺ホルモン、ステ
ロイド、アドレナリン等の低分子ホルモン、ガストリン
、パップレシン、アンジオテンシン等の小ペプチドホル
モン、各種合成薬剤等がある。

本発明でいう「高分子」とは、ハプテンと異なり、単独
で抗体産生を惹起できる抗原性を有する分子ｉｔｓ　ｏ
　ｏ　ｏ以上の物質で、分子内にハプテン分子を内蔵す
るか、或いは化学的にハプテン分子を結合し得る官能基
を有する必要がある。通常ウシ血清アルブミン、ウマフ
ェリチンのようなタンパク質乃至はポリリジンのような
、分子量致方から数十刃で水溶性に優れ、官能基に冨む
物質が用いられる。

「不溶性担体粒子」としては例えば赤血球などの細胞や
りポゾーム等のマイクロカプセル類や有機高分子物質、
カーボンブランク等の無機微粒子、各種金属及び金属化
合物コロイド粒子が用いられるが、スチレン、ジビニル
ベンゼン、ポリビニルトルエン等の芳香族ビニル化合物
、もしくはメタクリル酸エステル誘導体等の重合によっ
て得られる合成高分子ラテックス粒子がより好ましい。

さらに光学的に測定する都合上反応媒体中での分散性に
優れ、容易に沈降しないものが好ましい。粒径としては
０．１〜１０μｍ１好ましくは０．２〜３μｍの範囲の
ものが用いられる。

「磁性体含有粒子」で用いられる磁性体としては、鉄及
び四酸化三鉄等の磁性酸化鉄、或いはこれらと他の金属
乃至は金属酸化物との混合物及び合金であって残留磁気
のないものが好ましく、これらを５〜１００重量％、更
に好ましくは２０〜６５重量％の割合で含有し、平均粒
径（球形でないものは、長短径平均値の平均）０．０５
〜１０μｍ程度に調製された粒子が用いられる。磁性体
を含有する粒子マトリックスの成分としては、アガロー
スやデキストラン、カルボキシメチルセルロース等の多
糖類、ゼラチン、重合化アルブミン等のタンパク質及び
タンパク質誘導体も用いられるが、より好ましくはスチ
レン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニル化合物、もし
くはメタクリル酸エステル誘導体等の重合によって得ら
れる合成高分子が用いられる。

担体粒子に抗体を担持させる方法としては、物理吸着、
官能基を利用した共有結合何れでもよい。

担体粒子と担持させる物質の量比については特に制限は
ないが、担持物質に対し重量比で５〜２００倍量の担体
粒子を用いると、多くの場合良い結果が得られる。

不溶性担体粒子と磁性体含有粒子のいずれに抗ハブテン
抗体を担持させても凝集阻害によるハプテンの定量は可
能だが、抗ハプテン抗体は光学的測定に直接かかわる不
溶性担体粒子に担持させ、高分子上のハプテンとは異な
る抗原決定基に対する抗体は、凝集活性への寄与がより
大きい磁性体含有粒子に担持させた方が、はるかに良い
結果が得られる。

抗ハブテン抗体を担持させた不溶性担体粒子（試薬Ｂ）
及びハプテンが結合している高分子（試薬Ａ）上のハプ
テンとは異なる抗原決定基に対する抗体を担持させた磁
性体含有粒子（試薬Ｃ）は、該ハプテンを含むと考えら
れる試料溶液及び一定量の試薬（Ａ）と混合し、反応さ
せる。反応開始時の混合は十分に行う必要があるが、均
一に混合された後は混合を止め放置して反応させてもよ
い。反応は一般の免疫化学反応と同様にｐＨ５〜１０、
好ましくはｐＨ７〜９にて行う。温度については、２〜
５０℃の範囲で実施可能であるが、望ましくは室温乃至
は３７〜４０℃で反応させる。

反応時間は、反応直後から１昼夜まで任意であるが、感
度、操作性を考慮して、通常５〜６０分の範囲で設定さ
れる。これらの反応条件は、以降の工程についても同様
である。

目的のｐＨを維持するために、通常緩衝液が用いられる
。緩衝液としては、例えばリン酸、トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン等が用いられるが、中性から弱ア
ルカリ性で常用される殆どの緩衝液が使用可能である。

多（の場合、非特異反応を避けるために、塩化ナトリウ
ム等の塩類及び牛血清アルブミン等のタンパク質が添加
される。

一定量の試薬（Ａ）を含む溶液に、試薬（Ｂ）及び試薬
（Ｃ）を混合すると、試薬（Ｂ）表面上の抗ハプテン抗
体と試薬（Ａ）上のハプテンとの反応及び試薬（Ａ）上
のハプテンとは異なる抗原決定基と試薬（Ｃ）に担持さ
れた該抗原決定基に対する抗体とが反応し、試薬（Ａ）
を介した、試薬（Ｂ）と試薬（Ｃ）との凝集が成立する
。

ここに該ハプテンを含むと期待される試料を共存させる
と、存在する該ハプテンは試薬（Ｂ）に担持された抗ハ
プテン抗体と反応する結果、試薬（Ａ）に結合したハプ
テンと反応できる試薬（Ｂ）上の抗体が減ることにより
、結果的に試薬（Ａ）を介した試薬（Ｂ）と試薬（Ｃ）
との凝集が阻害される。即ち、凝集の反応阻害の程度を
定量することで、試料中のハプテン量を知ることが可能
である。

この場合、試薬（Ｂ）上の抗ハブテン抗体に対して、試
料中の該ハプテンと試薬（Ａ）上のハプテンが競合する
度合いを測定するのであるから、試薬（Ｂ）上の抗ハプ
テン抗体と試薬（Ａ）上のハプテンとの反応が、試料中
の該ハプテンとの反応に先行しないような添加順序をと
る必要があるが、試薬（Ｂ）と試薬（Ｃ）間の試薬（Ａ
）を介した結合に関しては、試薬（Ｂ）或いは試薬（Ｃ
）いずれの結合が先行しても良い。従って実際の操作手
順上は、試薬（Ｂ）上の抗ハブテン抗体と、試料中の該
ハプテン並びに試薬（Ａ）上のハプテンを先ず反応させ
た後に、試薬（Ｃ）を作用させても良いし、その逆の順
序で作用させても良く、或は全部を同時に混合、反応さ
せても良い。

磁場のかけ方に関しては、試薬（Ｃ）及び試薬（Ａ）を
介して成立した試薬（Ｂ）と試薬（Ｃ）との凝集物を５
〜２０分で分離できるような磁場の強度及び反応系の形
状が好ましい。分離に要する時間が短すぎると、一般に
感度、再現性の低下を招き、長すぎると操作性を悪化さ
せる。こうした理由から反応系の大きさは比較的小さい
方が扱い易い。９６六マイクロプレートなどは個々のウ
ェルのサイズは小さく、ウェル間の隙間に小磁石を置け
ば、マイクロプレートを利用したＥＩＡと同様にマイク
ロプレートリーダを用いて容易に定量できるので本発明
の実施に適した材料である。

磁場により試薬（Ｃ）を分離すると、試薬（Ｃ）と凝集
を起こした試薬（Ｂ）も−緒に分離されるので、分離後
に試薬（Ｂ）を含む反応溶液の濁度乃至は担体粒子量を
測定すれば、該ハプテンと反応した結果凝集に与らなか
った粒子の量を容易に知ることが出来る。即ち試料中の
該ハプテン量が多い程、濁度（吸光度）は大きくなる。

この際、試薬（Ｃ）の一部が分離し切れずに残り、未凝
集の試薬（Ｂ）と共に測定に掛かる場合があるが、実用
上問題のない程度であれば構わない。

光学的に検知する方法としては、最も単純には、照明上
黒色背景上で、試薬（Ｂ）残存量に応じた濁度の違いを
直接肉眼で観測しても良いが、各種比色計や濁度計を用
いれば定量が可能である。測定光波長としては可視光ま
たは近赤外光相当の波長が、好ましくは６００〜１ｌ１
００ｎが用いられる。さらにはレーザー光を用いたフロ
ーサイトメトリー法等を適用して残存粒子数を直接計測
しても良い。

定量を行う場合は、予め該ハブテン濃度既知品を試料と
して測定を行い、得られた定量値を試料のハプテン濃度
に対して図示すれば該ハプテンの検量線が得られるので
、濃度未知試料の反応定量値から該ハプテンの濃度が求
められる。

〔実施例〕

以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明するが、そ
の要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるもの
ではない。

〔実施例１〕 チロキシンの測定 チログロブリンは１分子中にチロキシン残基を数分子含
む天然のチロキシン結合高分子であるが、高分子上のハ
プテンとは異なる抗原決定基と、該抗原決定基に対する
抗体との反応の特異性を上げかつ増強する目的で、抗原
性の強いテオフィリンを結合させ、高分子上の抗原決定
基として使用した。

（試薬の調製法） ■）抗チロキシン抗体Ｆ（ａｂ’）２担持ラテツクスの
調製法 Ｈ，Ｇｈａｒｉｂらの方法（Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏＭｅｔａｂ、、３主＋　　５０９（１９
７１））に準じて調製したチロキシン結合ウシ血清アル
ブミンを家兎に免疫し、得られた抗血清をウシ血清アル
ブミンにより吸収し、得られたチロキシン特異的抗血清
から常法によりＩｇＧ抗体画分を取り、ペプシンにて消
化後、分子ふるいカラムクロマトグラフィーにてＦ（ａ
ｂ’）ｚを得る。このＦ（ａｂ’）、４ｍｇを０．１　
Ｍ　）リス緩衝液（ｐＨ８）（以下、「トリス緩衝液」
と呼ぶ）ｌＯＩＩｌｌに溶解し、同様にトリス緩衝液に
て調製した粒径２．０２μｍのポリビニルトルエンラテ
ックス（セラジエン社製）２％懸濁液と３０分撹拌混合
してラテックス表面に抗チロキシン抗体Ｆ（ａｂ’）ｚ
を担持させる。遠心分離（１０゜０００ｒｐｍ、１０分
）後上清を除き、０．３％ウシ血清アルブミン含有トリ
ス緩衝液２０ｍｊ’を加え、撹拌３０分にて再分散し、
更に超音波処理し分散度を高めラテックスを安定化させ
る。引き続いて遠心分離の後、０．０５％アジ化ナトリ
ウムを含むトリス緩衝液２０１Ｉ！１に分散、懸濁して
４〜１０℃にて保存する。

２）マウス抗テオフィリンモノクローナル抗体担持磁性
体含有ラテックス試薬の調製性 磁性体含有ラテックス（エスタポールＳＭＬ　２６６、
粒径０．７μｍ、１０％；ローヌプーラン社製）１ｍｌ
を精製水１９ｍ！！と充分に混合の後、遠心分離（１０
０００ｒｐｍ、１０分）して上清を除き、洗浄ラテック
スベレットとする。そこヘトリス緩衝液１０ｍｊ！にマ
ウス抗テオフィリンモノクローナル抗体（ケンブリッジ
・メディカル・ダイアグノスティック社製）４ｍｇを溶
解した抗体溶液を加え再分散し、更に１時間撹拌して磁
性体含有ラテックス表面上に抗体を担持させる。再度遠
心して上清を除き、０．３％ウシ血清アルブミンを含む
トリス緩衝液１ＯＩ１１１にて再分散、懸濁し安定化さ
せた後、もう−度遠心して０．０５％アジ化ナトリウム
を含むトリス緩衝液１０ｍ１中に懸濁し、４〜１０℃で
保存する。

３）テオフィリン結合ウシチログロブリンの調製法 Ｃ，Ｅ、Ｃｏｏｋらの方法（Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｐａｔｈ、Ｐｈａｒｍ、、　　１３，４９７
（１９７６））に従ってテオフィリン誘導体を合成し、
その５ｍｇとウシチログロブリン１００ｍｇを反応の後
、分子ふるいゲルクロマトグラフィーによって未反応テ
オフィリン誘導体を除去し、テオフィリン結合ウシチロ
グロブリンを得た。

（操作方法） チロキシン３３．３μｇ／ｄｚ溶液を０．１％ウシ血清
アルブミン及び０．９％食塩を含む０．１　Ｍ　）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）　　（以下ｒＴＢｓ緩衝液」
と呼ぶ）にて３倍ずつ段階的に希釈し、０．１３７μｇ
　／　ｄｔまで希釈系列を用意する。９６六マイクロプ
レートのウェルに各希釈系列試料及び対照としてＴＢＳ
ＩＩ街液それぞれ５０μｌを各２ウエルずつ分注する。

次いでテオフィリン結合チログロブリンＬＯｎｇ／ｍｇ
及び０．０６％８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン
酸アンモニウムを含むＴＢＳ緩衝液１００μ！を先に試
料、を入れた各ウェルに分注する。そこへ抗チロキシン
抗体Ｆ　（ａｂ′）２担持ラテツクスをトリス緩衝液に
て４倍希釈したものを２５μβずつ分注後、ただちにマ
イクロプレート側方を軽く１０秒はど叩いて内容物を混
合し、室温にて６０分間放置、反応させる。

続いて抗テオフィリン抗体担持磁性体含有ラテックスを
トリス緩衝液にて５倍に希釈したものを、それぞれ２５
μβずつ分注し、同様に軽く叩いて混合して２０分間室
温放置、反応させた後、３ｍｍφの小型棒磁石をマイク
ロプレート各ウェル外側面４方向から１０分間作用させ
て磁性体含有ラテックスを側方に集める。そして各ウェ
ル内に磁性体含有ラテックスと凝集せずに残った抗チロ
キシン抗体Ｆ（ａｂ’）２担持ラテツクスの濁度を、マ
イクロプレートリーグ（日本インターメッド社製、ＮＪ
−２０００）を用いて波長６２０ｎｍにて定量した。

結果を第１図に各試料のチロキシン濃度と濁度との関係
（検量線）として示した。チロキシンの血中濃度の正常
下限である６μｇ　／　ｄＪをはるかに上回る感度を持
つことが分かる。

〔実施例２〕 ジゴキシンの測定 ジゴキシンは強力な強心剤であるが、有効血中濃度が低
いこと、治療域と中毒域の濃度差が少ないことから高感
度で正確な測定が要求される薬物の代表例に挙げられる
。

（試薬の調製法） １）マウス抗ジゴキシンモノクローナル抗体担持ラテッ
クス試薬の調製法 マウス抗ジゴキシンモノクローナル抗体（ケンブリッジ
・メディカル・ダイアグツステイク社製）４ｍｇを０．
１　Ｍ　）リス緩衝液（ｐＨ８）　　（以下、「トリス
緩衝液」と呼ぶ）１０ｍｌに溶解し、同様にトリス緩衝
液にて調製した粒径２．０２μｍのポリビニルトルエン
ラテックス（セラジエン社製）２％懸濁液と３０分撹拌
混合してラテックス表面にマウス抗ジゴキシンモノクロ
ーナル抗体を担持させる。遠心分離（１００００ｒｐｍ
　、１０分）後上清を除き、０．３％ウシ血清アルブミ
ン含有トリス緩衝液２０ｍｊ！を加え、撹拌３０分にて
再分散し、更に超音波処理し分散度を高めラテックスを
安定化させる。引き続いて遠心分離の後、０．０５％ア
ジ化ナトリウムを含むトリス緩衝液２０ｍ１に分散、懸
濁して４〜１０℃にて保存する。

２）抗ウマフェリチン抗体Ｆ（ａｂ′）ｚ担持磁性体含
有ラテックスの調製法 ウサギ抗ウマフェリチン抗体（ダコ社製）から常法によ
りＩｇＧ抗体画分を取り、ペプシンにて消化後、分子ふ
るいカラムクロマトグラフィーにてＦ（ａｂ’）ｚを得
る。一方ローヌプーラン社製磁性体含有ラテックス（エ
スタポールＳＭＬ　２６６、粒径０．７μｍ１１０％；
ローヌプーラン社製）　　１　ｍｌ！を精製水１９ｍ１
と充分に混合の後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０
分）して上清を除き、洗浄ラテックスペレットとする。

そこヘトリス緩衝液１０ｍｊｉ！に、先に調製した抗ウ
マフェリチン抗体Ｆ　（ａｂ’）ｚ　４ｍｇを溶解した
抗体溶液を加え再分散し、更に１時間撹拌して磁性体含
有ラテックス表面上にＦ（ａｂ’）ｚを担持させる。再
度遠心して上清を除き、０．３％ウシ血清アルブミンを
含むトリス緩衝液１０ｍ／にて再分散、懸濁し安定化さ
せた後、もう−度遠心して０．０５％アジ化ナトリウム
を含むトリス緩衝液１０ｍｊ！中に懸濁し、４〜１０℃
で保存する。

３）ジゴキシン結合ウマフェリチンの調製法Ｔ、Ｗ、Ｓ
ｍｉ　ｔ　ｈらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、主
、３３１　　（１９７０））に準じて、ジゴキシンを過
ヨウ素酸酸化法にて糖鎖端をアルデヒド化し、ウマフェ
リチンと反応、還元後、透析により未反応物を除き、ジ
ゴキシン結合ウマフェリチンを得た。

（操作方法） ジゴキシン３２８ｎｇ／　ｍｌ溶液を０．１％ウシ血清
アルブミン及び０．９％食塩を含むＯ，ｌ　Ｍ　）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）　　（以下、ｒＴＢＳ緩衝液
」と呼ぶ）にて３倍ずつ段階的に希釈し、１．３５ｎｇ
／ｍｌまで希釈系列を用意する。９６穴マイクロプレー
トのウェルに各希釈系列試料及び対照としてＴＢＳ緩衝
液をそれぞれ１００μｌを各２ウエルずつ分注する。次
いでジゴキシン結合ウマフェリチンＬｏｎｇ／ｍｊ２を
含むＴ　Ｂ　Ｓ　緩衝液１００μｌを先に試料を入れた
各ウェルに分注する。そこへ抗ジゴキシン抗体担持ラテ
ックスをトリス緩衝液にて４倍希釈したものを２５μｌ
ずっ分注後、ただちにマイクロプレート側方を軽＜１０
秒はど叩いて内容物を混合し、室温にて６０分間放置、
反応させる。続いて抗ウマフェリチン抗体担持磁性体含
有ラテックスをトリス緩衝液にて５倍に希釈したのちを
、それぞれ２５μβずつ分注し、同様に軽く叩いて混合
して２０分間室温放置、反応させた後、３ｍｍφの小型
棒磁石をマイクロプレート各ウェル外側面４方向から１
０分間作用させて磁性体含有ラテックスを側方に集める
。そして各ウェル内に磁性体含有ラテックスと凝集せず
に残った抗ジゴキシン抗体担持ラテックスの濁度を、マ
イクロプレートリーダ（日本インターメソド社製、ＮＪ
−２０００）を用いて波長６２０ｒ＋ｍにて定量した。

結果を第２図に示す。ジゴキシン治療域上限である２、
２ｎｇ／ｍ７！をカバーしている。

〔発明の効果〕

以上実施例に示したように、本発明における方法によれ
ば、分離洗浄等の面倒な操作や安全面の心配がな（、操
作が簡単で所要時間も短く、かつ高感度に、試料中のハ
プテンの濃度を測定できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各試料中のチロキシン濃度と、６２０ｎｍに
おける濁度測定結果との関係を示したものである。 第２図は、同様に各試料中のジゴキシン濃度と、６２０
ｎｍにおける濁度測定結果との関係を示したものである
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 試料中のハプテンの濃度を測定する方法において、 （Ａ）該ハプテンを結合した高分子化合物（試薬Ａ） （Ｂ）該ハプテンに対する抗体を担持させた不溶性担体
   粒子（試薬Ｂ） （Ｃ）試薬（Ａ）における該ハプテンとは異なる抗原決
   定基に対する抗体を担持させた磁性体を含有する不溶性
   担体粒子（試薬Ｃ） から成る３つの試薬と試料とを反応させて、反応後に磁
   場を付与して試薬（Ａ）を介して成立した試薬（Ｂ）と
   試薬（Ｃ）との凝集塊及び未反応の試薬（Ｃ）を分離し
   、残存する試薬（Ｂ）の量を測定することにより、かか
   る試薬（Ａ）を介して成立した試薬（Ｂ）と試薬（Ｃ）
   との凝集反応が、試料中のハプテンと上記の試薬（Ｂ）
   との反応により競合的に阻害される程度を測定すること
   を特徴とするハプテンの免疫化学的測定法。