JP3938627B2 - リジン親和性物質の測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホモジニアスな系で簡便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を検出又は定量することができる測定法に関する。
【0002】
【従来の技術】
蛋白質をはじめとする生体成分の中には、プラスミノーゲンやLp(a)等のように、必須アミノ酸の一つであるリジンに対して親和性を有する物質が存在し、これらの多くは各種疾患により生体内濃度が変動することが知られている。従って、これらリジン親和性物質を測定することは、各種疾患を診断する指標を得ることとなり重要である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
リジン親和性物質等の生体内物質を検出又は定量する方法としては、抗原と抗原に対する抗体の特異的な結合を利用するイムノアッセイ法(ラジオアイソトープ標識を利用したRIA法、酵素標識を利用したEIA法、免疫凝集法、凝集阻害法等)が考えられ、この方法は臨床検査や生化学の分野で幅広く利用されており、生体中の蛋白質をはじめとした多くの物質が、この方法を利用して測定されている。
特に、測定対象抗原に対する抗体と測定対象抗原との抗原抗体反応に基づく免疫凝集法の中で免疫比濁法と呼ばれる方法は、高感度化が可能な方法であり、また、自動分析装置への適用をはじめとした測定の自動化が可能なことから検査領域において注目されている。
【0004】
免疫比濁法は、測定対象抗原を動物に免疫することにより得られた抗体を用い、液相中において測定対象抗原とこれに対する抗体を反応させ、生じる免疫凝集体を光学的に測定する方法であり、試薬としてラテックスのような担体を用いない方法(以下「TIA法」という)と抗体が結合した担体を用いる方法(以下「LTIA法」という)が一般に知られている。
しかしながら、TIA法やLTIA法のような免疫比濁法に用いる抗体として、ポリクローナル抗体を使用する場合には、ポリクローナル抗体が測定対象物質たるリジン親和性物質以外の物質を認識することがあり、試料中の極わずかな夾雑成分や測定対象物質と構造が類似する他の成分と反応してしまうという問題があった。
【0005】
このような問題点を解決するため、抗体として1種類又は2種類以上のモノクローナル抗体を用いる免疫比濁法もあるが、1種類のモノクローナル抗体を用いる方法は、Lp(a)のように同一構造が分子中に複数存在する特殊な抗原にしか利用できず、しかも用いる抗体は、分子中に複数存在する同一構造を認識しなければならないという問題があり、用途が極めて限定される。一方、2種類以上のモノクローナル抗体を用いる方法は、認識部位の数を抗体の数に相当する数にまで増やすことで免疫凝集体を形成させるものであるが、同じ抗原に対するモノクローナル抗体ならばどの抗体の組み合わせでも使用できるわけではなく、目的に応じて反応性が高くしかも認識部位の異なる特殊な抗体の組み合わせを選択しなければならないという問題がある。
【0006】
この他の免疫比濁法として、抗原性物質を不溶性担体粒子にあらかじめ吸着もしくは結合させ、これに該抗原性物質に特異的に反応する1種の抗体もしくは抗体複合体を反応させて、凝集した不溶性担体を測定する方法(特開平7−35752号)が知られているが、この方法は不溶性担体粒子への吸着の容易性の点から、ヘモグロビンのように試料中に高濃度含まれる物質に特異な方法であり、また使用する抗体も、液相中では該抗原性物質とは反応せずに、不溶性担体粒子と結合した該抗原性物質とのみ反応する抗体を選択しなければならないという問題がある。
【0007】
従って、本発明の目的は、リジン親和性物質を上記の如き問題点がなく、簡便、迅速かつ感度良く検出又は定量することができる方法を提供することにある。
【0008】
【課題を解決するための手段】
斯かる実情に鑑み本発明者は鋭意研究を行った結果、リジン親和性物質を含む検体に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子と該リジン親和性物質に対する抗体の両方を反応させ、生成する免疫凝集体の吸光度等を直接光学的に測定すれば、感度が高く、しかも簡便かつ迅速にリジン親和性物質を検出又は定量できることを見出し本発明を完成した。
【0009】
すなわち本発明は、リジン親和性物質に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子と該リジン親和性物質に対する抗体を反応させ、生成する免疫凝集体を直接光学的に測定することを特徴とするリジン親和性物質の測定方法を提供するものである。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明は、検体中の測定対象抗原たるリジン親和性物質に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子(以下「固定化リジン」又は「固定化ポリリジン」という)とリジン親和性物質に対する抗体(抗体は1種でも2種以上でもよい)を反応させ、生じる免疫凝集体の吸光度等を直接光学的に測定することにより、該リジン親和性物質の検出又は定量を行うものである。
【0011】
本発明において用いられる不溶性担体粒子としては、平均粒径が1.6μm以下のものが好ましく、特に平均粒径が0.05〜1μm、更に0.05〜0.5μmのものが免疫凝集体を直接光学的に測定する上で好ましい。
【0012】
不溶性担体粒子の材質は特に制限されず、従来、ホモジニアス系で不溶性担体を用いて抗原又は抗体を測定する場合に使用される公知の物質であればいずれも使用することができる。このような物質としては、有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生物等が挙げられる。このうち、有機高分子物質としては、ラテックス粒子が好ましく、特に、アクリル酸重合体、スチレン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた1種又は2種以上の微粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が好ましい。また、無機物質としては、シリカ、アルミナ等の微粒子が挙げられる。
【0013】
不溶性担体粒子にリジンもしくはポリリジンを担持させる方法は特に限定されず、公知の物理吸着や化学結合法による方法等を用いることができる。但し、不溶性担体粒子にポリリジンを担持させる場合、ポリリジンの分子量が大きすぎると不溶性担体粒子同士がポリリジンを介したと考えられる凝集を生じる場合がある。それ故ポリリジンは、平均分子量10000以下のものが好ましく、特に、平均分子量が5000以下のものが好ましい。また、リジンもしくはポリリジンをキャリア蛋白質(アルブミン、カゼイン、フィブロネクチンなど)に縮合剤あるいは二架橋試薬等を用い化学的に結合させたものを、不溶性担体粒子に物理吸着や化学結合法により結合させる方法も挙げられる。
【0014】
本発明で使用する抗体は、抗原たるリジン親和性物質に高い特異性を有していれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また抗体は、遊離抗体であっても、不溶性担体粒子に担持させた抗体(以下「固定化抗体」という)であってもよいが、固定化抗体が測定感度の点で好ましい。不溶性担体粒子に抗体を固定する場合、その方法は特に限定されず、物理吸着、化学結合、免疫的結合を利用する方法のほか、あらかじめ抗体に対して結合性を有する物質を単体に担持させ、この物質を介して抗体を結合させる方法等を用いることができる。また、本発明では、1種類の抗体があればよいが、より高感度な測定を行うために2種以上の抗体を用いてもよい。
【0015】
固定化リジン等又は固定化抗体を懸濁する液は、特に限定されないが一般的にはリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝液が使用される。反応におけるpHは5〜10、特に6〜9が好ましい。
【0016】
本発明における測定対象物質としてはリジンと親和性のある物質であれば特に限定されず、プラスミノーゲン、プラスミン−プラスミンインヒビター複合体、プラスミノーゲン活性化因子、Lp(a)等の血液凝固関連物質の他、リジンを担持させたゲルを用いて精製されるDNA、RNA等の物質が挙げられる。
【0017】
本発明では、小粒径の不溶性担体粒子が使用されているので、本発明方法により得られる免疫凝集体は懸濁状態が保たれており、従ってこれを光学的に測定することができる。光学的な吸光度の測定は、汎用の分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置(日立製作所社製 日立7150、7070、7170等、東芝社製 東芝 TBA−8OR等)、近赤外を測定波長とした装置(三菱化成社製 LPIA等)、積分球濁度を測定原理とした装置(協和発酵社製 ELシステム等)、散乱光強度を測定する装置(ベーリンガー社製
BNAシステム等)等の光学的測定機器を用いて行うことができる。
【0018】
【実施例】
以下、製造例、実施例並びに比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0019】
製造例1.固定化リジン液の調製
ポリスチレンラテックス(COOHタイプ、平均粒径0.2μm、セキスイ化学社製)300μlに1.5mlの50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)を添加したのち遠心洗浄を行い、同じ1.5mlの50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)に懸濁させた。この液に1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(同人化学研究所製)を10mg/mlの濃度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液375μlを加え、25℃で2時間反応させた。次いで、N′−(tert−ブトキシカルボニル)−L−リジン(東京化成工業製)を2mg/mlの濃度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液375μlを加え、25℃で3時間反応させた。この溶液に氷冷下トリフルオロ酢酸(キシダ化学製)750μlを加え、更に氷冷下で30分静置したのち、500mMグリシン緩衝液(pH8.4)22mlを加え、遠心洗浄を行った。この後、2%グリシンを含有した50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)10mlに再懸濁させ、25℃で一夜穏やかに攪拌した後、再度遠心し、0.1%BSA、10%グリセロールを含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)10.5mlで再懸濁させ、固定化リジン液を得た。
【0020】
製造例2.固定化ポリリジン液の調製
ポリスチレンラテックス(平均粒径0.2μm、セキスイ化学社製)を2%の濃度で250mMグリシン緩衝液(pH8.4)に懸濁した液1mlにポリ−L−リジン(平均分子量3970、シグマ社製)を1.5mg/mlの濃度で上記グリシン緩衝液に溶解した溶液1mlを添加し、4℃で一夜反応させた。次いでBSAを0.5%含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)2mlを加え、4℃で3時間反応させた。その後、遠心洗浄を行い、0.005% Tween80を含んだ50mMグリシン緩衝液(pH8.4)2mlを加えて懸濁させ、4℃で一夜穏やかに攪拌した。再度遠心洗浄し、0.1%BSA、10%グリセロールを含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)14mlで再懸濁させ固定化ポリリジン液を得た。
【0021】
製造例3.抗プラスミノーゲン固定化抗体液の調製
ポリスチレンラテックス(平均粒径0.2μm、セキスイ化学社製)を2%の濃度で250mMグリシン緩衝液(pH8.4)に懸濁した液1mlに、抗プラスミノーゲンモノクローナル抗体(7PG、テクノクローン社製)を1mg/mlの濃度になるように調製した溶液1mlを添加し、4℃で5時間反応させた。次いで、BSAを0.5%含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)2mlを加え、4℃で一夜反応させた。その後、遠心洗浄を行い、0.005% Tween80を含んだ50mMグリシン緩衝液(pH8.4)2mlを加えて懸濁させ、4℃で6時間穏やかに攪拌した。再度遠心洗浄し、0.1%BSA、10%グリセロールを含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)14mlで再懸濁させ、抗プラスミノーゲン固定化抗体液を得た。
【0022】
製造例4.遊離抗プラスミノーゲン抗体液の調製
抗プラスミノーゲンモノクローナル抗体(7PG、テクノクローン社製)を1mg/mlの濃度になるように精製水で溶解した。次いで抗体濃度が0.5mg/mlとなるように、0.1%BSA、10%グリセリンを含む50mMグリシン緩衝液(pH8.4)で希釈し、遊離抗プラスミノーゲン抗体液を得た。
【0023】
実施例1.固定化リジンと抗プラスミノーゲン固定化抗体を用いたプラスミノーゲンの測定
第1試薬として10%グリセリンを含有した20mMトリス緩衝液(pH9.0)を用い、その200μlにプラスミノーゲンを含有する試料液20μlを加えて37℃で5分間加温後、第2試薬として製造例1で得た固定化リジン液1容に対して1容の製造例3で得た抗プラスミノーゲン固定化抗体液を混和した溶液100μlを加え攪拌した。その後1〜5分の波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン濃度の関係を図1に示した。
【0024】
比較例1.
0.1%BSA、10%グリセロールを含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)1容に対して、1容の製造例3で得た抗プラスミノーゲン固定化抗体液を混和した溶液を第2試薬とする以外は、実施例1と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図1に示した。
【0025】
比較例2.
0.1%BSA、10%グリセロールを含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)1容に対して、1容の製造例1の固定化リジン液を混和した溶液を第2試薬とする以外は、実施例1と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図1に示した。
【0026】
図1に示したように、比較例1及び2は共に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対して、実施例1ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光度変化を示した。
従って、固定化リジンと抗プラスミノーゲン抗体の双方が本発明の効果を奏するために必要であることが判る。
【0027】
実施例2.固定化ポリリジンと抗プラスミノーゲン固定化抗体を用いたプラスミノーゲンの測定
第1試薬として10%グリセリンを含有した20mMトリス緩衝液(pH9.0)を用い、その200μlにプラスミノーゲンを含有する試料液20μlを加えて37℃で5分間加温後、第2試薬として製造例2で得た固定化ポリリジン液1容に対して1容の製造例3の抗プラスミノーゲン固定化抗体液を混和した溶液100μlを加え攪拌した。その後1〜5分の波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン濃度の関係を図2に示した。
【0028】
比較例3.
0.1%BSA、10%グリセロールを含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)1容に対して、1容の製造例3の抗プラスミノーゲン固定化抗体液を混和した溶液を第2試薬とする以外は、実施例2と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図2に示した。
【0029】
比較例4.
0.1%BSA、10%グリセロールを含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)1容に対して、1容の製造例2の固定化ポリリジン液を混和した溶液を第2試薬とする以外は、実施例2と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図2に示した。
【0030】
図2に示したように、比較例3及び4は共に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対して、実施例2ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光度変化を示した。
【0031】
実施例3.固定化リジンと遊離抗プラスミノーゲン抗体を用いたプラスミノーゲンの測定
第1試薬として10%グリセリンを含有した20mMトリス緩衝液(pH9.0)を用い、その200μlにプラスミノーゲンを含有する試料液20μlを加えて37℃で5分間加温後、第2試薬として製造例1の固定化リジン液7容に対して3容の製造例4の遊離抗プラスミノーゲン抗体液を混和した溶液100μlを加え攪拌した。その後1〜5分の波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン濃度の関係を図3に示した。
【0032】
比較例5.
0.1%BSA、10%グリセロールを含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)7容に対して、3容の製造例4の遊離抗プラスミノーゲン抗体液を混和した溶液を第2試薬とする以外は、実施例3と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図3に示した。
【0033】
比較例6.
0.1%BSA、10%グリセロールを含有した50mMグリシン緩衝液(pH8.4)3容に対して、7容の製造例1の固定化リジン液を混和した溶液を第2試薬とする以外は、実施例3と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図3に示した。
【0034】
図3に示したように、比較例5及び6は共に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対して、実施例3ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光度変化を示した。
以上の実施例及び比較例の結果から、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子とリジン親和性物質に対する抗体の両方が本発明の効果を奏する上で必要であることが判る。
【0035】
【発明の効果】
本発明によれば、ホモジニアスな系で簡便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を感度良く検出又は定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】固定化リジンと抗プラスミノーゲン固定化抗体を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
【図2】固定化ポリリジンと抗プラスミノーゲン固定化抗体を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
【図3】固定化リジンと遊離抗プラスミノーゲン抗体を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
Claims (7)
- リジン親和性物質に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子と該リジン親和性物質に対する抗体を反応させ、生成する免疫凝集体を直接光学的に測定することを特徴とするリジン親和性物質の測定方法。
- 抗体が不溶性担体粒子に担持されていることを特徴とする請求項1記載の測定方法。
- 抗体が遊離抗体であることを特徴とする請求項1記載の測定方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項1、2又は3記載の測定方法。
- 抗体がポリクローナル抗体である請求項1、2又は3記載の測定方法。
- 不溶性担体粒子がラテックス粒子である請求項1〜5のいずれか1項記載の測定方法。
- 不溶性担体粒子が平均粒径1.6μm以下の粒子である請求項1〜6のいずれか1項記載の測定方法。
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