JPH11258240A - リジン親和性物質の測定方法 - Google Patents
リジン親和性物質の測定方法Info
- Publication number
- JPH11258240A JPH11258240A JP6295798A JP6295798A JPH11258240A JP H11258240 A JPH11258240 A JP H11258240A JP 6295798 A JP6295798 A JP 6295798A JP 6295798 A JP6295798 A JP 6295798A JP H11258240 A JPH11258240 A JP H11258240A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lysine
- antibody
- substance
- plasminogen
- insoluble carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 リジン親和性物質に、リジン又はポリリ
ジンを担持させた不溶性担体粒子と該物質に対する抗体
を反応させ、生成する免疫凝集体を直接光学的に測定す
ることを特徴とするリジン親和性物質の測定方法。 【効果】 簡便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を
測定することができる。
ジンを担持させた不溶性担体粒子と該物質に対する抗体
を反応させ、生成する免疫凝集体を直接光学的に測定す
ることを特徴とするリジン親和性物質の測定方法。 【効果】 簡便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を
測定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ホモジニアスな系
で簡便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を検出又は
定量することができる測定法に関する。
で簡便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を検出又は
定量することができる測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質をはじめとする生体成分の中に
は、プラスミノーゲンやＬｐ（ａ）等のように、必須ア
ミノ酸の一つであるリジンに対して親和性を有する物質
が存在し、これらの多くは各種疾患により生体内濃度が
変動することが知られている。従って、これらリジン親
和性物質を測定することは、各種疾患を診断する指標を
得ることとなり重要である。
は、プラスミノーゲンやＬｐ（ａ）等のように、必須ア
ミノ酸の一つであるリジンに対して親和性を有する物質
が存在し、これらの多くは各種疾患により生体内濃度が
変動することが知られている。従って、これらリジン親
和性物質を測定することは、各種疾患を診断する指標を
得ることとなり重要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】リジン親和性物質等の
生体内物質を検出又は定量する方法としては、抗原と抗
原に対する抗体の特異的な結合を利用するイムノアッセ
イ法（ラジオアイソトープ標識を利用したＲＩＡ法、酵
素標識を利用したＥＩＡ法、免疫凝集法、凝集阻害法
等）が考えられ、この方法は臨床検査や生化学の分野で
幅広く利用されており、生体中の蛋白質をはじめとした
多くの物質が、この方法を利用して測定されている。特
に、測定対象抗原に対する抗体と測定対象抗原との抗原
抗体反応に基づく免疫凝集法の中で免疫比濁法と呼ばれ
る方法は、高感度化が可能な方法であり、また、自動分
析装置への適用をはじめとした測定の自動化が可能なこ
とから検査領域において注目されている。
生体内物質を検出又は定量する方法としては、抗原と抗
原に対する抗体の特異的な結合を利用するイムノアッセ
イ法（ラジオアイソトープ標識を利用したＲＩＡ法、酵
素標識を利用したＥＩＡ法、免疫凝集法、凝集阻害法
等）が考えられ、この方法は臨床検査や生化学の分野で
幅広く利用されており、生体中の蛋白質をはじめとした
多くの物質が、この方法を利用して測定されている。特
に、測定対象抗原に対する抗体と測定対象抗原との抗原
抗体反応に基づく免疫凝集法の中で免疫比濁法と呼ばれ
る方法は、高感度化が可能な方法であり、また、自動分
析装置への適用をはじめとした測定の自動化が可能なこ
とから検査領域において注目されている。
【０００４】免疫比濁法は、測定対象抗原を動物に免疫
することにより得られた抗体を用い、液相中において測
定対象抗原とこれに対する抗体を反応させ、生じる免疫
凝集体を光学的に測定する方法であり、試薬としてラテ
ックスのような担体を用いない方法（以下「ＴＩＡ法」
という）と抗体が結合した担体を用いる方法（以下「Ｌ
ＴＩＡ法」という）が一般に知られている。しかしなが
ら、ＴＩＡ法やＬＴＩＡ法のような免疫比濁法に用いる
抗体として、ポリクローナル抗体を使用する場合には、
ポリクローナル抗体が測定対象物質たるリジン親和性物
質以外の物質を認識することがあり、試料中の極わずか
な夾雑成分や測定対象物質と構造が類似する他の成分と
反応してしまうという問題があった。
することにより得られた抗体を用い、液相中において測
定対象抗原とこれに対する抗体を反応させ、生じる免疫
凝集体を光学的に測定する方法であり、試薬としてラテ
ックスのような担体を用いない方法（以下「ＴＩＡ法」
という）と抗体が結合した担体を用いる方法（以下「Ｌ
ＴＩＡ法」という）が一般に知られている。しかしなが
ら、ＴＩＡ法やＬＴＩＡ法のような免疫比濁法に用いる
抗体として、ポリクローナル抗体を使用する場合には、
ポリクローナル抗体が測定対象物質たるリジン親和性物
質以外の物質を認識することがあり、試料中の極わずか
な夾雑成分や測定対象物質と構造が類似する他の成分と
反応してしまうという問題があった。
【０００５】このような問題点を解決するため、抗体と
して１種類又は２種類以上のモノクローナル抗体を用い
る免疫比濁法もあるが、１種類のモノクローナル抗体を
用いる方法は、Ｌｐ（ａ）のように同一構造が分子中に
複数存在する特殊な抗原にしか利用できず、しかも用い
る抗体は、分子中に複数存在する同一構造を認識しなけ
ればならないという問題があり、用途が極めて限定され
る。一方、２種類以上のモノクローナル抗体を用いる方
法は、認識部位の数を抗体の数に相当する数にまで増や
すことで免疫凝集体を形成させるものであるが、同じ抗
原に対するモノクローナル抗体ならばどの抗体の組み合
わせでも使用できるわけではなく、目的に応じて反応性
が高くしかも認識部位の異なる特殊な抗体の組み合わせ
を選択しなければならないという問題がある。
して１種類又は２種類以上のモノクローナル抗体を用い
る免疫比濁法もあるが、１種類のモノクローナル抗体を
用いる方法は、Ｌｐ（ａ）のように同一構造が分子中に
複数存在する特殊な抗原にしか利用できず、しかも用い
る抗体は、分子中に複数存在する同一構造を認識しなけ
ればならないという問題があり、用途が極めて限定され
る。一方、２種類以上のモノクローナル抗体を用いる方
法は、認識部位の数を抗体の数に相当する数にまで増や
すことで免疫凝集体を形成させるものであるが、同じ抗
原に対するモノクローナル抗体ならばどの抗体の組み合
わせでも使用できるわけではなく、目的に応じて反応性
が高くしかも認識部位の異なる特殊な抗体の組み合わせ
を選択しなければならないという問題がある。
【０００６】この他の免疫比濁法として、抗原性物質を
不溶性担体粒子にあらかじめ吸着もしくは結合させ、こ
れに該抗原性物質に特異的に反応する１種の抗体もしく
は抗体複合体を反応させて、凝集した不溶性担体を測定
する方法（特開平７−３５７５２号）が知られている
が、この方法は不溶性担体粒子への吸着の容易性の点か
ら、ヘモグロビンのように試料中に高濃度含まれる物質
に特異な方法であり、また使用する抗体も、液相中では
該抗原性物質とは反応せずに、不溶性担体粒子と結合し
た該抗原性物質とのみ反応する抗体を選択しなければな
らないという問題がある。
不溶性担体粒子にあらかじめ吸着もしくは結合させ、こ
れに該抗原性物質に特異的に反応する１種の抗体もしく
は抗体複合体を反応させて、凝集した不溶性担体を測定
する方法（特開平７−３５７５２号）が知られている
が、この方法は不溶性担体粒子への吸着の容易性の点か
ら、ヘモグロビンのように試料中に高濃度含まれる物質
に特異な方法であり、また使用する抗体も、液相中では
該抗原性物質とは反応せずに、不溶性担体粒子と結合し
た該抗原性物質とのみ反応する抗体を選択しなければな
らないという問題がある。
【０００７】従って、本発明の目的は、リジン親和性物
質を上記の如き問題点がなく、簡便、迅速かつ感度良く
検出又は定量することができる方法を提供することにあ
る。
質を上記の如き問題点がなく、簡便、迅速かつ感度良く
検出又は定量することができる方法を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み本発明
者は鋭意研究を行った結果、リジン親和性物質を含む検
体に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒
子と該リジン親和性物質に対する抗体の両方を反応さ
せ、生成する免疫凝集体の吸光度等を直接光学的に測定
すれば、感度が高く、しかも簡便かつ迅速にリジン親和
性物質を検出又は定量できることを見出し本発明を完成
した。
者は鋭意研究を行った結果、リジン親和性物質を含む検
体に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒
子と該リジン親和性物質に対する抗体の両方を反応さ
せ、生成する免疫凝集体の吸光度等を直接光学的に測定
すれば、感度が高く、しかも簡便かつ迅速にリジン親和
性物質を検出又は定量できることを見出し本発明を完成
した。
【０００９】すなわち本発明は、リジン親和性物質に、
リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子と該
リジン親和性物質に対する抗体を反応させ、生成する免
疫凝集体を直接光学的に測定することを特徴とするリジ
ン親和性物質の測定方法を提供するものである。
リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子と該
リジン親和性物質に対する抗体を反応させ、生成する免
疫凝集体を直接光学的に測定することを特徴とするリジ
ン親和性物質の測定方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、検体中の測定対象抗原
たるリジン親和性物質に、リジン又はポリリジンを担持
させた不溶性担体粒子（以下「固定化リジン」又は「固
定化ポリリジン」という）とリジン親和性物質に対する
抗体（抗体は１種でも２種以上でもよい）を反応させ、
生じる免疫凝集体の吸光度等を直接光学的に測定するこ
とにより、該リジン親和性物質の検出又は定量を行うも
のである。
たるリジン親和性物質に、リジン又はポリリジンを担持
させた不溶性担体粒子（以下「固定化リジン」又は「固
定化ポリリジン」という）とリジン親和性物質に対する
抗体（抗体は１種でも２種以上でもよい）を反応させ、
生じる免疫凝集体の吸光度等を直接光学的に測定するこ
とにより、該リジン親和性物質の検出又は定量を行うも
のである。
【００１１】本発明において用いられる不溶性担体粒子
としては、平均粒径が１．６μｍ以下のものが好まし
く、特に平均粒径が０．０５〜１μｍ、更に０．０５〜
０．５μｍのものが免疫凝集体を直接光学的に測定する
上で好ましい。
としては、平均粒径が１．６μｍ以下のものが好まし
く、特に平均粒径が０．０５〜１μｍ、更に０．０５〜
０．５μｍのものが免疫凝集体を直接光学的に測定する
上で好ましい。
【００１２】不溶性担体粒子の材質は特に制限されず、
従来、ホモジニアス系で不溶性担体を用いて抗原又は抗
体を測定する場合に使用される公知の物質であればいず
れも使用することができる。このような物質としては、
有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生物等が
挙げられる。このうち、有機高分子物質としては、ラテ
ックス粒子が好ましく、特に、アクリル酸重合体、スチ
レン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた
１種又は２種以上の微粉末を均一に懸濁させたラテック
ス粒子が好ましい。また、無機物質としては、シリカ、
アルミナ等の微粒子が挙げられる。
従来、ホモジニアス系で不溶性担体を用いて抗原又は抗
体を測定する場合に使用される公知の物質であればいず
れも使用することができる。このような物質としては、
有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生物等が
挙げられる。このうち、有機高分子物質としては、ラテ
ックス粒子が好ましく、特に、アクリル酸重合体、スチ
レン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた
１種又は２種以上の微粉末を均一に懸濁させたラテック
ス粒子が好ましい。また、無機物質としては、シリカ、
アルミナ等の微粒子が挙げられる。
【００１３】不溶性担体粒子にリジンもしくはポリリジ
ンを担持させる方法は特に限定されず、公知の物理吸着
や化学結合法による方法等を用いることができる。但
し、不溶性担体粒子にポリリジンを担持させる場合、ポ
リリジンの分子量が大きすぎると不溶性担体粒子同士が
ポリリジンを介したと考えられる凝集を生じる場合があ
る。それ故ポリリジンは、平均分子量１００００以下の
ものが好ましく、特に、平均分子量が５０００以下のも
のが好ましい。また、リジンもしくはポリリジンをキャ
リア蛋白質（アルブミン、カゼイン、フィブロネクチン
など）に縮合剤あるいは二架橋試薬等を用い化学的に結
合させたものを、不溶性担体粒子に物理吸着や化学結合
法により結合させる方法も挙げられる。
ンを担持させる方法は特に限定されず、公知の物理吸着
や化学結合法による方法等を用いることができる。但
し、不溶性担体粒子にポリリジンを担持させる場合、ポ
リリジンの分子量が大きすぎると不溶性担体粒子同士が
ポリリジンを介したと考えられる凝集を生じる場合があ
る。それ故ポリリジンは、平均分子量１００００以下の
ものが好ましく、特に、平均分子量が５０００以下のも
のが好ましい。また、リジンもしくはポリリジンをキャ
リア蛋白質（アルブミン、カゼイン、フィブロネクチン
など）に縮合剤あるいは二架橋試薬等を用い化学的に結
合させたものを、不溶性担体粒子に物理吸着や化学結合
法により結合させる方法も挙げられる。
【００１４】本発明で使用する抗体は、抗原たるリジン
親和性物質に高い特異性を有していれば、モノクローナ
ル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
また抗体は、遊離抗体であっても、不溶性担体粒子に担
持させた抗体（以下「固定化抗体」という）であっても
よいが、固定化抗体が測定感度の点で好ましい。不溶性
担体粒子に抗体を固定する場合、その方法は特に限定さ
れず、物理吸着、化学結合、免疫的結合を利用する方法
のほか、あらかじめ抗体に対して結合性を有する物質を
単体に担持させ、この物質を介して抗体を結合させる方
法等を用いることができる。また、本発明では、１種類
の抗体があればよいが、より高感度な測定を行うために
２種以上の抗体を用いてもよい。
親和性物質に高い特異性を有していれば、モノクローナ
ル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
また抗体は、遊離抗体であっても、不溶性担体粒子に担
持させた抗体（以下「固定化抗体」という）であっても
よいが、固定化抗体が測定感度の点で好ましい。不溶性
担体粒子に抗体を固定する場合、その方法は特に限定さ
れず、物理吸着、化学結合、免疫的結合を利用する方法
のほか、あらかじめ抗体に対して結合性を有する物質を
単体に担持させ、この物質を介して抗体を結合させる方
法等を用いることができる。また、本発明では、１種類
の抗体があればよいが、より高感度な測定を行うために
２種以上の抗体を用いてもよい。
【００１５】固定化リジン等又は固定化抗体を懸濁する
液は、特に限定されないが一般的にはリン酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、トリス緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝
液が使用される。反応におけるpHは５〜１０、特に６〜
９が好ましい。
液は、特に限定されないが一般的にはリン酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、トリス緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝
液が使用される。反応におけるpHは５〜１０、特に６〜
９が好ましい。
【００１６】本発明における測定対象物質としてはリジ
ンと親和性のある物質であれば特に限定されず、プラス
ミノーゲン、プラスミン−プラスミンインヒビター複合
体、プラスミノーゲン活性化因子、Ｌｐ（ａ）等の血液
凝固関連物質の他、リジンを担持させたゲルを用いて精
製されるＤＮＡ、ＲＮＡ等の物質が挙げられる。
ンと親和性のある物質であれば特に限定されず、プラス
ミノーゲン、プラスミン−プラスミンインヒビター複合
体、プラスミノーゲン活性化因子、Ｌｐ（ａ）等の血液
凝固関連物質の他、リジンを担持させたゲルを用いて精
製されるＤＮＡ、ＲＮＡ等の物質が挙げられる。
【００１７】本発明では、小粒径の不溶性担体粒子が使
用されているので、本発明方法により得られる免疫凝集
体は懸濁状態が保たれており、従ってこれを光学的に測
定することができる。光学的な吸光度の測定は、汎用の
分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自
動分析装置（日立製作所社製 日立７１５０、７０７
０、７１７０等、東芝社製 東芝 ＴＢＡ−８ＯＲ
等）、近赤外を測定波長とした装置（三菱化成社製 Ｌ
ＰＩＡ等）、積分球濁度を測定原理とした装置（協和発
酵社製 ＥＬシステム等）、散乱光強度を測定する装置
（ベーリンガー社製ＢＮＡシステム等）等の光学的測定
機器を用いて行うことができる。
用されているので、本発明方法により得られる免疫凝集
体は懸濁状態が保たれており、従ってこれを光学的に測
定することができる。光学的な吸光度の測定は、汎用の
分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自
動分析装置（日立製作所社製 日立７１５０、７０７
０、７１７０等、東芝社製 東芝 ＴＢＡ−８ＯＲ
等）、近赤外を測定波長とした装置（三菱化成社製 Ｌ
ＰＩＡ等）、積分球濁度を測定原理とした装置（協和発
酵社製 ＥＬシステム等）、散乱光強度を測定する装置
（ベーリンガー社製ＢＮＡシステム等）等の光学的測定
機器を用いて行うことができる。
【００１８】
【実施例】以下、製造例、実施例並びに比較例を挙げて
本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定
されるものではない。
本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定
されるものではない。
【００１９】製造例１．固定化リジン液の調製 ポリスチレンラテックス（ＣＯＯＨタイプ、平均粒径
０．２μｍ、セキスイ化学社製）３００μｌに１．５ml
の５０mMホウ酸緩衝液（pH７．５）を添加したのち遠心
洗浄を行い、同じ１．５mlの５０mMホウ酸緩衝液（pH
７．５）に懸濁させた。この液に１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同
人化学研究所製）を１０mg／mlの濃度で上記ホウ酸緩衝
液に溶解した溶液３７５μｌを加え、２５℃で２時間反
応させた。次いで、Ｎ′−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボ
ニル）−Ｌ−リジン（東京化成工業製）を２mg／mlの濃
度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液３７５μｌを加
え、２５℃で３時間反応させた。この溶液に氷冷下トリ
フルオロ酢酸（キシダ化学製）７５０μｌを加え、更に
氷冷下で３０分静置したのち、５００mMグリシン緩衝液
（pH８．４）２２mlを加え、遠心洗浄を行った。この
後、２％グリシンを含有した５０mMホウ酸緩衝液（pH
７．５）１０mlに再懸濁させ、２５℃で一夜穏やかに攪
拌した後、再度遠心し、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセ
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
０．５mlで再懸濁させ、固定化リジン液を得た。
０．２μｍ、セキスイ化学社製）３００μｌに１．５ml
の５０mMホウ酸緩衝液（pH７．５）を添加したのち遠心
洗浄を行い、同じ１．５mlの５０mMホウ酸緩衝液（pH
７．５）に懸濁させた。この液に１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同
人化学研究所製）を１０mg／mlの濃度で上記ホウ酸緩衝
液に溶解した溶液３７５μｌを加え、２５℃で２時間反
応させた。次いで、Ｎ′−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボ
ニル）−Ｌ−リジン（東京化成工業製）を２mg／mlの濃
度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液３７５μｌを加
え、２５℃で３時間反応させた。この溶液に氷冷下トリ
フルオロ酢酸（キシダ化学製）７５０μｌを加え、更に
氷冷下で３０分静置したのち、５００mMグリシン緩衝液
（pH８．４）２２mlを加え、遠心洗浄を行った。この
後、２％グリシンを含有した５０mMホウ酸緩衝液（pH
７．５）１０mlに再懸濁させ、２５℃で一夜穏やかに攪
拌した後、再度遠心し、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセ
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
０．５mlで再懸濁させ、固定化リジン液を得た。
【００２０】製造例２．固定化ポリリジン液の調製 ポリスチレンラテックス（平均粒径０．２μｍ、セキス
イ化学社製）を２％の濃度で２５０mMグリシン緩衝液
（pH８．４）に懸濁した液１mlにポリ−Ｌ−リジン（平
均分子量３９７０、シグマ社製）を１．５mg／mlの濃度
で上記グリシン緩衝液に溶解した溶液１mlを添加し、４
℃で一夜反応させた。次いでＢＳＡを０．５％含有した
５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）２mlを加え、４℃で
３時間反応させた。その後、遠心洗浄を行い、０．００
５％ Tween８０を含んだ５０mMグリシン緩衝液（pH８．
４）２mlを加えて懸濁させ、４℃で一夜穏やかに攪拌し
た。再度遠心洗浄し、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロ
ールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１４
mlで再懸濁させ固定化ポリリジン液を得た。
イ化学社製）を２％の濃度で２５０mMグリシン緩衝液
（pH８．４）に懸濁した液１mlにポリ−Ｌ−リジン（平
均分子量３９７０、シグマ社製）を１．５mg／mlの濃度
で上記グリシン緩衝液に溶解した溶液１mlを添加し、４
℃で一夜反応させた。次いでＢＳＡを０．５％含有した
５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）２mlを加え、４℃で
３時間反応させた。その後、遠心洗浄を行い、０．００
５％ Tween８０を含んだ５０mMグリシン緩衝液（pH８．
４）２mlを加えて懸濁させ、４℃で一夜穏やかに攪拌し
た。再度遠心洗浄し、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロ
ールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１４
mlで再懸濁させ固定化ポリリジン液を得た。
【００２１】製造例３．抗プラスミノーゲン固定化抗体
液の調製 ポリスチレンラテックス（平均粒径０．２μｍ、セキス
イ化学社製）を２％の濃度で２５０mMグリシン緩衝液
（pH８．４）に懸濁した液１mlに、抗プラスミノーゲン
モノクローナル抗体（７ＰＧ、テクノクローン社製）を
１mg／mlの濃度になるように調製した溶液１mlを添加
し、４℃で５時間反応させた。次いで、ＢＳＡを０．５
％含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）２mlを加
え、４℃で一夜反応させた。その後、遠心洗浄を行い、
０．００５％ Tween８０を含んだ５０mMグリシン緩衝液
（pH８．４）２mlを加えて懸濁させ、４℃で６時間穏や
かに攪拌した。再度遠心洗浄し、０．１％ＢＳＡ、１０
％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH
８．４）１４mlで再懸濁させ、抗プラスミノーゲン固定
化抗体液を得た。
液の調製 ポリスチレンラテックス（平均粒径０．２μｍ、セキス
イ化学社製）を２％の濃度で２５０mMグリシン緩衝液
（pH８．４）に懸濁した液１mlに、抗プラスミノーゲン
モノクローナル抗体（７ＰＧ、テクノクローン社製）を
１mg／mlの濃度になるように調製した溶液１mlを添加
し、４℃で５時間反応させた。次いで、ＢＳＡを０．５
％含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）２mlを加
え、４℃で一夜反応させた。その後、遠心洗浄を行い、
０．００５％ Tween８０を含んだ５０mMグリシン緩衝液
（pH８．４）２mlを加えて懸濁させ、４℃で６時間穏や
かに攪拌した。再度遠心洗浄し、０．１％ＢＳＡ、１０
％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH
８．４）１４mlで再懸濁させ、抗プラスミノーゲン固定
化抗体液を得た。
【００２２】製造例４．遊離抗プラスミノーゲン抗体液
の調製 抗プラスミノーゲンモノクローナル抗体（７ＰＧ、テク
ノクローン社製）を１mg／mlの濃度になるように精製水
で溶解した。次いで抗体濃度が０．５mg／mlとなるよう
に、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセリンを含む５０mMグ
リシン緩衝液（pH８．４）で希釈し、遊離抗プラスミノ
ーゲン抗体液を得た。
の調製 抗プラスミノーゲンモノクローナル抗体（７ＰＧ、テク
ノクローン社製）を１mg／mlの濃度になるように精製水
で溶解した。次いで抗体濃度が０．５mg／mlとなるよう
に、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセリンを含む５０mMグ
リシン緩衝液（pH８．４）で希釈し、遊離抗プラスミノ
ーゲン抗体液を得た。
【００２３】実施例１．固定化リジンと抗プラスミノー
ゲン固定化抗体を用いたプラスミノーゲンの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した２０mMトリ
ス緩衝液（pH９．０）を用い、その２００μｌにプラス
ミノーゲンを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で
５分間加温後、第２試薬として製造例１で得た固定化リ
ジン液１容に対して１容の製造例３で得た抗プラスミノ
ーゲン固定化抗体液を混和した溶液１００μｌを加え攪
拌した。その後１〜５分の波長６００nmにおける吸光度
変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン
濃度の関係を図１に示した。
ゲン固定化抗体を用いたプラスミノーゲンの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した２０mMトリ
ス緩衝液（pH９．０）を用い、その２００μｌにプラス
ミノーゲンを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で
５分間加温後、第２試薬として製造例１で得た固定化リ
ジン液１容に対して１容の製造例３で得た抗プラスミノ
ーゲン固定化抗体液を混和した溶液１００μｌを加え攪
拌した。その後１〜５分の波長６００nmにおける吸光度
変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン
濃度の関係を図１に示した。
【００２４】比較例１．０．１％ＢＳＡ、１０％グリセ
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
容に対して、１容の製造例３で得た抗プラスミノーゲン
固定化抗体液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、
実施例１と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実
施した。得られた吸光度変化量を図１に示した。
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
容に対して、１容の製造例３で得た抗プラスミノーゲン
固定化抗体液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、
実施例１と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実
施した。得られた吸光度変化量を図１に示した。
【００２５】比較例２．０．１％ＢＳＡ、１０％グリセ
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
容に対して、１容の製造例１の固定化リジン液を混和し
た溶液を第２試薬とする以外は、実施例１と同様に操作
してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光
度変化量を図１に示した。
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
容に対して、１容の製造例１の固定化リジン液を混和し
た溶液を第２試薬とする以外は、実施例１と同様に操作
してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光
度変化量を図１に示した。
【００２６】図１に示したように、比較例１及び２は共
に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対し
て、実施例１ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光
度変化を示した。従って、固定化リジンと抗プラスミノ
ーゲン抗体の双方が本発明の効果を奏するために必要で
あることが判る。
に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対し
て、実施例１ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光
度変化を示した。従って、固定化リジンと抗プラスミノ
ーゲン抗体の双方が本発明の効果を奏するために必要で
あることが判る。
【００２７】実施例２．固定化ポリリジンと抗プラスミ
ノーゲン固定化抗体を用いたプラスミノーゲンの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した２０mMトリ
ス緩衝液（pH９．０）を用い、その２００μｌにプラス
ミノーゲンを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で
５分間加温後、第２試薬として製造例２で得た固定化ポ
リリジン液１容に対して１容の製造例３の抗プラスミノ
ーゲン固定化抗体液を混和した溶液１００μｌを加え攪
拌した。その後１〜５分の波長６００nmにおける吸光度
変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン
濃度の関係を図２に示した。
ノーゲン固定化抗体を用いたプラスミノーゲンの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した２０mMトリ
ス緩衝液（pH９．０）を用い、その２００μｌにプラス
ミノーゲンを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で
５分間加温後、第２試薬として製造例２で得た固定化ポ
リリジン液１容に対して１容の製造例３の抗プラスミノ
ーゲン固定化抗体液を混和した溶液１００μｌを加え攪
拌した。その後１〜５分の波長６００nmにおける吸光度
変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン
濃度の関係を図２に示した。
【００２８】比較例３．０．１％ＢＳＡ、１０％グリセ
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
容に対して、１容の製造例３の抗プラスミノーゲン固定
化抗体液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施
例２と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施し
た。得られた吸光度変化量を図２に示した。
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
容に対して、１容の製造例３の抗プラスミノーゲン固定
化抗体液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施
例２と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施し
た。得られた吸光度変化量を図２に示した。
【００２９】比較例４．０．１％ＢＳＡ、１０％グリセ
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
容に対して、１容の製造例２の固定化ポリリジン液を混
和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例２と同様に
操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた
吸光度変化量を図２に示した。
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１
容に対して、１容の製造例２の固定化ポリリジン液を混
和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例２と同様に
操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた
吸光度変化量を図２に示した。
【００３０】図２に示したように、比較例３及び４は共
に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対し
て、実施例２ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光
度変化を示した。
に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対し
て、実施例２ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光
度変化を示した。
【００３１】実施例３．固定化リジンと遊離抗プラスミ
ノーゲン抗体を用いたプラスミノーゲンの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した２０mMトリ
ス緩衝液（pH９．０）を用い、その２００μｌにプラス
ミノーゲンを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で
５分間加温後、第２試薬として製造例１の固定化リジン
液７容に対して３容の製造例４の遊離抗プラスミノーゲ
ン抗体液を混和した溶液１００μｌを加え攪拌した。そ
の後１〜５分の波長６００nmにおける吸光度変化量を測
定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン濃度の関係
を図３に示した。
ノーゲン抗体を用いたプラスミノーゲンの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した２０mMトリ
ス緩衝液（pH９．０）を用い、その２００μｌにプラス
ミノーゲンを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で
５分間加温後、第２試薬として製造例１の固定化リジン
液７容に対して３容の製造例４の遊離抗プラスミノーゲ
ン抗体液を混和した溶液１００μｌを加え攪拌した。そ
の後１〜５分の波長６００nmにおける吸光度変化量を測
定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン濃度の関係
を図３に示した。
【００３２】比較例５．０．１％ＢＳＡ、１０％グリセ
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）７
容に対して、３容の製造例４の遊離抗プラスミノーゲン
抗体液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例
３と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施し
た。得られた吸光度変化量を図３に示した。
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）７
容に対して、３容の製造例４の遊離抗プラスミノーゲン
抗体液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例
３と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施し
た。得られた吸光度変化量を図３に示した。
【００３３】比較例６．０．１％ＢＳＡ、１０％グリセ
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）３
容に対して、７容の製造例１の固定化リジン液を混和し
た溶液を第２試薬とする以外は、実施例３と同様に操作
してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光
度変化量を図３に示した。
ロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）３
容に対して、７容の製造例１の固定化リジン液を混和し
た溶液を第２試薬とする以外は、実施例３と同様に操作
してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光
度変化量を図３に示した。
【００３４】図３に示したように、比較例５及び６は共
に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対し
て、実施例３ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光
度変化を示した。以上の実施例及び比較例の結果から、
リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子とリ
ジン親和性物質に対する抗体の両方が本発明の効果を奏
する上で必要であることが判る。
に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対し
て、実施例３ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光
度変化を示した。以上の実施例及び比較例の結果から、
リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子とリ
ジン親和性物質に対する抗体の両方が本発明の効果を奏
する上で必要であることが判る。
【００３５】
【発明の効果】本発明によれば、ホモジニアスな系で簡
便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を感度良く検出
又は定量することができる。
便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を感度良く検出
又は定量することができる。
【図１】固定化リジンと抗プラスミノーゲン固定化抗体
を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プ
ラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プ
ラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
【図２】固定化ポリリジンと抗プラスミノーゲン固定化
抗体を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合
の、プラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図であ
る。
抗体を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合
の、プラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図であ
る。
【図３】固定化リジンと遊離抗プラスミノーゲン抗体を
組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プラ
スミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プラ
スミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
Claims (7)
- 【請求項１】 リジン親和性物質に、リジン又はポリリ
ジンを担持させた不溶性担体粒子と該リジン親和性物質
に対する抗体を反応させ、生成する免疫凝集体を直接光
学的に測定することを特徴とするリジン親和性物質の測
定方法。 - 【請求項２】 抗体が不溶性担体粒子に担持されている
ことを特徴とする請求項１記載の測定方法。 - 【請求項３】 抗体が遊離抗体であることを特徴とする
請求項１記載の測定方法。 - 【請求項４】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
１、２又は３記載の測定方法。 - 【請求項５】 抗体がポリクローナル抗体である請求項
１、２又は３記載の測定方法。 - 【請求項６】 不溶性担体粒子がラテックス粒子である
請求項１〜５のいずれか１項記載の測定方法。 - 【請求項７】 不溶性担体粒子が平均粒径１．６μｍ以
下の粒子である請求項１〜６のいずれか１項記載の測定
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06295798A JP3938627B2 (ja) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | リジン親和性物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06295798A JP3938627B2 (ja) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | リジン親和性物質の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11258240A true JPH11258240A (ja) | 1999-09-24 |
| JP3938627B2 JP3938627B2 (ja) | 2007-06-27 |
Family
ID=13215321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06295798A Expired - Fee Related JP3938627B2 (ja) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | リジン親和性物質の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3938627B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006105910A (ja) * | 2004-10-08 | 2006-04-20 | Fujikura Kasei Co Ltd | 標的物質の測定方法および測定試薬 |
-
1998
- 1998-03-13 JP JP06295798A patent/JP3938627B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006105910A (ja) * | 2004-10-08 | 2006-04-20 | Fujikura Kasei Co Ltd | 標的物質の測定方法および測定試薬 |
| JP4556605B2 (ja) * | 2004-10-08 | 2010-10-06 | 藤倉化成株式会社 | 標的物質の測定方法および測定試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3938627B2 (ja) | 2007-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102735833B (zh) | 甲状腺过氧化物酶抗体均相发光免疫分析试剂盒及其检测方法 | |
| AU614109B2 (en) | Test method and reagent kit therefor | |
| JPH087215B2 (ja) | 抗原および／又は抗体の検出方法および検出用の試験キット | |
| JPS6367661B2 (ja) | ||
| JPS60259964A (ja) | 分析試料中の免疫学的に活性な物質の定量法 | |
| JP2019191187A (ja) | 標的物質の検出用試薬、検出方法および標的物質を検出するために用いられる担体ならびにその製造方法 | |
| CN108603880A (zh) | 受试物质的检测方法及受试物质的检测用试剂盒 | |
| EP0070527B1 (en) | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor | |
| Gella et al. | Latex agglutination procedures in immunodiagnosis | |
| JP2004527760A (ja) | 着色粒子を用いる非計装的定量イムノアッセイ及び装置 | |
| JP4197393B2 (ja) | ＩｇＡ腎症の検査法 | |
| FI111194B (fi) | Kaksikohtainen immuunitesti vasta-aineelle käyttäen kemiluminisoivaa leimaa ja biotiiniin sidottua ligandia | |
| KR101548284B1 (ko) | 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법 및 그를 이용한 검출키트 | |
| TWI757328B (zh) | 使用以相異方式將抗原固定化之承載抗原不溶性承載粒子之抗體測定法、抗體測定用試劑 | |
| AU751938B2 (en) | Immunoassay reagents and immunoassay method | |
| US4760030A (en) | Quantitative opaque particle agglutination assay | |
| JPH0580052A (ja) | 生体内物質の測定装置及び測定方法 | |
| US4792527A (en) | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor | |
| JP3938627B2 (ja) | リジン親和性物質の測定方法 | |
| JP2004144687A (ja) | 物質の測定方法 | |
| JP4556605B2 (ja) | 標的物質の測定方法および測定試薬 | |
| US20020127741A1 (en) | Free Analyte detection system | |
| JP3618797B2 (ja) | 免疫測定法 | |
| JPS60252265A (ja) | 発光試薬およびそれを用いる生物学的に活性な物質の測定法 | |
| JP5137880B2 (ja) | 結合性物質を固定化した乾燥粒子の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050302 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20050302 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20070315 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070320 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070323 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100406 Year of fee payment: 3 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110406 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120406 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130406 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140406 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |