TWI757328B - 使用以相異方式將抗原固定化之承載抗原不溶性承載粒子之抗體測定法、抗體測定用試劑 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於擴大承載有抗原之乳膠等不溶性承載粒子於抗體測定中之可利用性的幅度,尤其在於提供一種即便承載源自微生物之溶解物等複數種物質之混合物而仍可獲得良好之測定結果之方法,且本發明提供一種抗體測定方法,其特徵在於:使含有藉由物理吸附而承載有特定之抗原之不溶性承載粒子、及藉由化學鍵結而承載有該抗原之不溶性承載粒子兩者的不溶性承載粒子之含有液,與可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本接觸,檢測因該承載粒子所承載之抗原與該樣本中之目標抗體之抗原抗體反應所引起的該承載粒子之凝集反應。
Description
本發明係一種與生物體物質之測定方法相關之發明,更具體而言,係一種與混合以相異方式將抗原固定化之承載抗原不溶性承載粒子、例如承載抗原乳膠粒子彼此而使用的抗體之測定方法相關之發明。
目前,於使用不溶性承載粒子之診斷試劑中,使用乳膠凝集法作為免疫測定方法之一的試劑尤其通用。
於乳膠凝集法中,於液相中使用承載有抗原或抗體之乳膠粒子,形成檢測抗體或抗原之測定系統。可基於因形成免疫複合體而乳膠粒子凝集之性質,藉由目測而確認凝集之程度,或者於光學上以吸光度或散射光強度之變化之形式測定濁度之增加(以下,亦稱為乳膠法:專利文獻1)。
ELISA(enzyme linked immunosorbent assay,酵素結合免疫吸附分析)等夾心免疫測定法係測定本身較為準確,可用作基準法,但於測定之過程中,包括將測定樣本中所包含之被測定物質以外之成分或測定試劑中之成分去除的清洗步驟,故而有測定需要長時間,測定操作較為繁雜之缺點。因此,不適於短時間內之多數之測定試樣之測定。
相對於此,乳膠法係操作較為簡便,容易應用於臨床檢查中廣泛使用之通用之生物化學自動分析裝置,可實現短時間內之測定及多數之受驗試樣之測定。
因此,於多數之臨床檢查項目中,使用乳膠法。
[專利文獻1]日本專利特開昭53-62826號公報
本發明之課題在於在使用承載有抗原之乳膠粒子等不溶性承載粒子之抗體測定中擴大測定範圍,以及提高感度及特異性。本發明尤其提供一種即便承載源自微生物之溶解物等複數種物質之混合物亦獲得良好之測定結果的方法。
於使用不溶性承載粒子之診斷試劑之開發時,不溶性承載粒子所承載之物質之分子量或承載方式之選擇大幅度地影響其性能。
例如,於使用物理吸附法之情形時,即,於利用不溶性承載粒子與承載蛋白質之靜電相互作用(疏水性相互作用)藉由直接接觸使不溶性承載粒子承載蛋白質等之情形時,適於相對較高之分子量之物質之承載。然而,低分子量之物質或半抗原之承載有以下困難:可能會發生不溶性載體表面之包埋、或由用於抑制非特異性凝集之阻斷劑所引起之包埋。又,於非常缺乏疏水性胺基酸殘基之蛋白質之承載中,物理吸附法亦可見困難。
於使用化學鍵結法之情形時,即,於藉由利用碳二醯亞胺等偶合試劑使不溶性承載粒子或蛋白質表面之羧基與胺基進行共價鍵結之方法、使不溶性承載粒子表面之醛基或甲苯磺醯基等與蛋白質之胺基進行鍵結之方法等而使不溶性承載粒子承載蛋白質等的情形時,對於物理吸附法而言存在困難之低分子量之蛋白質或半抗原之承載亦相對較容易。進而,於使用
化學鍵結法之情形時,藉由適當選擇不溶性載體之官能基,可控制形成共價鍵之蛋白質側之鍵結部位側,即,可選擇蛋白質側之鍵結部位(進行共價鍵結之胺基酸殘基)。然而,可見難以進行缺乏官能基之蛋白質(換言之,疏水性較高之蛋白質)之承載的問題,進而,該承載粒子之製作步驟較為繁雜,亦可見承載蛋白質之改性之問題。
尤其於承載源自微生物之溶解物等「複數種物質之混合物」之情形時,若承載方式僅為物理吸附法或化學鍵結法中之任一者,則由於每一物質之大小不同,或者於蛋白質中親水性胺基酸殘基及疏水性胺基酸殘基之含量不同,故而所承載之物質產生偏差,其結果為存在如下問題:所獲得之承載抗原不溶性承載粒子難以獲得良好之測定結果,即,所捕捉之目標抗體之種類限定於與有限之物質結合者,可能無法充分地取得與該目標抗體所來源之導致疾病等之微生物等有關的資料。
又,生物體內之對微生物之抗體並非對單一抗原之抗體,而是以對複數種抗原之複數種抗體之形式存在,故而若可一次性捕捉該等複數種抗體,則取得更確實之資料。據本發明者所知,使用承載有源自生物之抗原性物質等不特定多數種物質之混合物作為抗原的不溶性承載粒子之例係於本案之申請時不存在。
本發明者等人對上述問題進行研究,發現:藉由在抗體測定中使用含有藉由物理吸附法進行抗原物質之承載之不溶性承載粒子、及藉由化學鍵結法進行該抗原物質之承載之不溶性承載粒子兩者的不溶性承載粒子之含有液,可實現廣泛之測定範圍並且實現較高之感度及特異性,尤其於抗原為源自生物之抗原性物質等複數種物質之混合物之情形時亦可實現,從
而完成了本發明。
即,本發明提供一種抗體測定方法(以下,亦稱為本發明之測定方法),其特徵在於:使含有藉由物理吸附而承載有特定之抗原之不溶性承載粒子(以下,亦稱為物理吸附粒子)、及藉由化學鍵結而承載有該抗原之不溶性承載粒子(以下,亦稱為化學鍵結粒子)兩者的不溶性承載粒子之含有液(以下,亦稱為本發明之含有液),與可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本接觸,檢測因該承載粒子所承載之抗原與該樣本中之目標抗體之抗原抗體反應所引起的該承載粒子之凝集反應。於本發明之抗體測定方法中,較佳為除了本發明之含有液以外,還使用稀釋液。於使用稀釋液之情形時,較佳為於藉由稀釋液將可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本稀釋後,與不溶性承載粒子之含有液接觸。
又,本發明提供一種抗體之測定用試劑(以下,亦稱為本發明之測定用試劑),其特徵在於其係含有物理吸附粒子及化學鍵結粒子兩者的不溶性承載粒子之含有液(本發明之含有液)。
進而,本發明提供一種測定用套組(以下,亦稱為本發明之套組),其特徵在於包含本發明之測定用試劑(本發明之含有液)及稀釋液。
較佳為物理吸附粒子及化學鍵結粒子均係以乳膠粒子之形式提供。除此以外,亦可使用二氧化矽膠體、磁性粒子、金屬膠體等不溶性承載粒子。含有液只要含有不溶性承載粒子,則其含有狀態並無特別限定。即,含有液中包括分散液、乳化液、懸浮液、沈澱液、多層分離液等。又,含有液中之不溶性承載粒子可實施視需要之表面處理。
物理吸附粒子係如上述規定般藉由物理吸附法而承載有特定之抗原之不溶性承載粒子。物理吸附粒子之平均粒徑可於0.01μm~1.0μm之範
圍內使用,較佳為0.05μm~0.35μm,進而較佳為0.10μm~0.35μm,最佳為0.20μm~0.35μm。物理吸附粒子可藉由使吸附對象抗原與成為進行物理吸附法之對象的不溶性承載粒子之含有液接觸而製作。
化學鍵結粒子係如上述規定般藉由化學鍵結法而承載有特定之抗原之不溶性承載粒子。化學鍵結粒子之平均粒徑可於0.01μm~1.0μm之範圍內使用,較佳為0.05μm~0.35μm,進而較佳為0.10μm~0.35μm,最佳為0.20μm~0.35μm。化學鍵結粒子可藉由進行如下操作而製作:使鍵結對象抗原與成為進行化學鍵結法之對象的不溶性承載粒子之含有液進行共價鍵結。
即,本發明之含有液較佳為可藉由將上述「含有物理吸附粒子之溶液」與「含有化學鍵結粒子之溶液」混合而製備。
物理吸附粒子與化學鍵結粒子之混合比(質量比)較佳為10:1~1:10(物理吸附粒子:化學鍵結粒子),進而較佳為5:1~1:5(物理吸附粒子:化學鍵結粒子),極佳為3:1~1:3(物理吸附粒子:化學鍵結粒子),最佳為3:1~1:2(物理吸附粒子:化學鍵結粒子)。但是,若樣本中之目標抗體之測定時之測定用試劑中之物理吸附粒子的含量、或於使用稀釋液之情形時測定用試劑及稀釋液之混合液中之物理吸附粒子的含量為0.045質量%以上,則有未見與該粒子之含量增加相應之效果提昇的傾向。
所謂「特定之抗原」中之「特定」,例如可換言為「已選擇」。係「已規定」或「已選擇」為與作為測定對象而選擇之抗體結合的抗原之含義,一旦規定或者一旦選擇,則該抗原係唯一地確定。
可成為「特定之抗原」之抗原並無特別限定,只要為與測定對象之
抗體結合之物質,則可廣泛地選擇,較佳為與自生物體分離之樣本中之抗體結合之抗原。即,較佳為將對伴隨特定之疾病或體質而存在於生物體內之物質的抗體作為目標抗體,將與其結合之抗原作為「特定之抗原」。可成為「特定之抗原」之物質具代表性而言為蛋白質,亦包含糖鏈、脂質等其他物質。
又,「生物體」係廣泛指一般生物之身體,通常為人體。
藉由將該抗原設為「複數種物質之混合物」,而較佳地發揮本發明之效果。作為該混合物,可列舉源自生物之抗原性物質,較佳為可列舉源自細菌、病毒等微生物之溶解物。
又,於該抗原包含至少1種分子量為5000以上、尤佳為10000以上之物質之情形時,較佳地發揮本發明之效果。藉由對源自微生物之溶解物併用物理吸附粒子與化學鍵結粒子兩者,整體可實現多樣化之表位呈現。關於該分子量之上限,只要可實現對不溶性承載粒子之承載,則並無特別限定,較佳為大致2000000以下左右。亦存在上述「複數種物質之混合物」符合該特定分子量之條件之情形。
可使上述本發明之含有液與可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本接觸,檢測因該含有液之不溶性承載粒子所承載之抗原與該樣本中之目標抗體之抗原抗體反應所引起的該承載粒子之凝集反應之程度。
「可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本」只要可能含有被測定抗體,則並無特別限定,例如可列舉:血液、血清、血漿、尿、淋巴液、穿刺液、腦脊液、汗、唾液、胃液、肺清洗液、糞便等。於該等中,較佳為血液、血清、血漿。
作為「因抗原抗體反應所引起的承載有特定之抗原之不溶性承載粒
子之反應」,主要為凝集反應,可藉由使用滑動凝集法、光學測定法、微量滴定法、過濾器分離法等檢測不溶性承載粒子之凝集,而進行所需之抗體之測定。
本發明之測定方法較佳為使用生物化學自動分析裝置進行。生物化學自動分析裝置係以光學測定方法作為測定原理者,通常成為如下規格:於使用時,以稀釋液將血清等樣本稀釋並進行加溫後,加入試劑(若為本發明之情形,則為本發明之含有液)進行測定。作為目前提供之生物化學自動分析裝置,例如可列舉:日立7180型、LABOSPECT 008、LABOSPECT 006等(Hitachi High-Technologies股份有限公司製造);JCA-BM6010、JCA-BM6050、JCA-BM9130等(日本電子股份有限公司製造);TBA-c16000、TBA-2000FR、TBA-120FR等(Toshiba Medical Systems股份有限公司製造);AU680、AU5800等(Beckman Coulter股份有限公司製造)等,但並不限定於該等。
藉由本發明,提供一種以廣泛之測定範圍與較高之感度及特異性測定抗體之方法。
圖1係研究粒徑0.145μm之化學鍵結乳膠粒子與粒徑0.235μm之物理吸附乳膠粒子之混合之反應性之效果的圖式。
圖2係研究因使粒徑0.300μm之化學鍵結乳膠粒子相對於粒徑0.235μm之物理吸附乳膠粒子之混合量變化所致的反應性之效果的圖式。
1.本發明之含有液
如上所述,本發明之含有液係含有物理吸附粒子及化學鍵結粒子兩者之含有液。
(1)不溶性承載粒子之供給
如上所述,較佳為物理吸附粒子及化學鍵結粒子均係以乳膠粒子之形式提供。乳膠係聚合物之微粒子(乳膠粒子)穩定地分散於水性溶劑中而成之乳液。
乳膠之製作方法可使用乳化聚合法、無皂乳化聚合法、種子聚合法、階段進料乳化聚合法、動力進料聚合法、懸浮聚合法等常規方法進行。粒徑之調節亦可使用該等乳膠之製備方法各者之常規方法進行。例如,若為乳化聚合法,則藉由調節單體、乳化劑、起始劑之種類及量、聚合溫度等,可進行乳膠之粒徑之調節。當然亦可使用乳膠之市售品。
關於乳膠之種類,只要可應用物理吸附粒子之製作中所使用之物理吸附法或化學鍵結粒子之製作中所使用之化學鍵結法,則並無特別限定,較佳為選擇適於物理吸附法及化學鍵結法各者之種類。
作為適於物理吸附法之乳膠,可列舉聚苯乙烯乳膠、極低羧酸乳膠、親水基定域乳膠等。
作為適於化學鍵結法之乳膠,可列舉含有於表面具有羧基、羥基、胺基、醛基或甲苯磺醯基等之乳膠粒子之乳膠。
不論是適於物理吸附法之乳膠還是適於化學鍵結法之乳膠,均可使用實施著色所得之著色乳膠、或實施螢光物質所得之螢光乳膠。
如上所述,進行物理吸附之乳膠粒子及進行化學鍵結之乳膠粒子之粒徑均無特別限定,可於0.01μm~1.0μm之範圍內使用,較佳為0.05μm~0.35μm,進而較佳為0.10μm~0.35μm,最佳為0.20μm~0.35
μm。
對於該等兩種承載方式之乳膠粒子各者而言,為了獲得與承載抗原及測定抗體之性質相應的適當之感度、特異性及測定範圍,可決定測定中使用之乳膠粒子之粒徑。具體而言,於欲提高因免疫反應所引起之乳膠之凝集性之情形時,較佳為選擇中等程度至較大之粒徑(0.20~0.35μm),但於測定對象(抗體)之濃度非常高之情形時,亦存在較佳為選擇較小之粒徑(0.10μm以下)之情形。
如上所述,作為乳膠粒子以外之不溶性承載粒子,可列舉二氧化矽膠體粒子、磁性粒子、金屬膠體粒子等。藉由對該等不溶性承載粒子進行加成適於物理吸附或化學鍵結之官能基的粒子表面之改質,可獲得可用於本發明中之不溶性承載粒子。
(2)對不溶性承載粒子之承載步驟
(a)承載抗原
對不溶性承載粒子承載之抗原只要可與所測定之目標抗體結合,則毫無限定,如上所述,藉由採用「複數種物質之混合物」或「含有較大分子量物質之物」,而較佳地發揮本發明之效果。作為該混合物,可列舉源自生物之抗原性物質,較佳為可列舉源自細菌、病毒等微生物之溶解物。例如,於下述實施例中所使用之幽門螺旋桿菌之溶解物中,含有脲酶B(UreaseB)、脲酶A(UreaseA)、細胞毒素相關基因A(CagA)、鞭毛蛋白(Flagellin)、熱休克蛋白(Heat Shock Protein)、其他物質。該等幽門螺旋桿菌之溶解物中所包含之物質之分子量大部分為10000~200000左右。
為了確定該幽門螺旋桿菌般之體內之感染微生物,可使用該感染微生物所特有之物質作為承載抗原。作為微生物,除了該幽門螺旋桿菌以
外,亦可列舉:A群溶菌鏈球菌、B群溶菌鏈球菌、肺炎球菌尿中抗原、大腸桿菌O157、難養芽胞梭菌、嗜肺性退伍軍人桿菌、霍亂弧菌、引起腦膜炎之細菌等細菌類;流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、輪狀病毒、諾如病毒、日本腦炎病毒、狂犬病病毒、脊髓灰白質炎病毒、人類腸道細胞致病性病毒、柯薩奇病毒A群、柯薩奇病毒B群、腮腺炎病毒、單純疱疹病毒、水痘‧帶狀疱疹病毒、麻疹病毒、風疹病毒、EB(epstein-barr)病毒、乳突病毒、傳染性軟疣病毒、手足口病病毒、急性出血性結膜炎病毒、HAV(Hepatitis A virus,肝炎A型病毒)、HBV(Hepatitis B virus,肝炎B型病毒)、HCV(Hepatitis C virus,肝炎C型病毒)、流行性角結膜炎病毒、漢坦病毒、人類嗜T淋巴細胞病毒、HIV(human immunodeficiency virus,人類免疫缺乏病毒)、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、RS(respiratory syncytial,呼吸道融合性)病毒、腺病毒、里奧病毒、鼻病毒、冠狀病毒等病毒類;引起念珠菌症、麴菌病、隱球菌病、接合菌病、肺囊蟲肺炎、毛孢子菌病等深部真菌症之真菌;引起恙蟲病、斑疹熱、斑疹傷寒等之立克次體;衣原體、原蟲、寄生蟲等。
作為除了源自微生物之抗原以外可用於本發明中之承載抗原,可列舉:對抗TSH(thyroid stimulating hormone,促甲狀腺激素)受體抗體、抗乙醯膽鹼受體抗體、抗胰島素受體抗體等抗受體抗體之抗原;對抗甲狀腺球蛋白抗體、抗微粒體抗體等抗甲狀腺抗體之抗原;對抗胰島細胞抗體、抗GAD(glutamate decarboxylase,麩胺酸去羧酶)抗體、抗胰島素抗體等抗胰島抗體之抗原;對抗腎上腺皮質抗體、抗平滑肌抗體、抗LKM(liver-kidney microsome,肝腎微粒體)抗體、抗胃壁細胞抗體、抗內因子抗體、抗橫紋肌抗體、抗心肌抗體、抗皮膚橋粒芯糖蛋白抗體、抗
嗜中性球細胞質抗體、抗磷脂質抗體等器官特異性自體抗體之抗原等。
進而,作為可用於本發明中之承載抗原,可列舉:分佈於DNA(deoxyribonucleic acid,去氧核糖核酸)、核小體、組織蛋白、聚ADP(adenosine diphosphate,腺苷二磷酸)核糖、著絲粒、Scl-70、Ku等染色質之自體抗原;分佈於U1RNP、Sm、SS-B/LA、SS-A/Ro、PCNA、Ki等核質之自體抗原;分佈於U3RNP、Th/To、PM-Sci、RNA聚合酶等核小體之自體抗原;分佈於AA-A/Ro、Jo-1、核糖體P、線粒體M2、訊號識別粒子等細胞質之自體抗原等對器官非特異性自體抗體之抗原。
以上之記載為例示列舉,亦可使用除此以外之目前可應用之抗原,進而亦可使用將來提供之抗原。
(b)抗原之承載步驟
抗原對不溶性承載粒子之承載可按照物理吸附法、化學鍵結法進行,分別按照常規方法進行。
物理吸附法例如可將於蒸餾水或PBS(phosphate buffered saline,磷酸鹽緩衝液)中以0.1~1質量%左右含有不溶性承載粒子之含有液與欲承載之抗原進行混合,使不溶性承載粒子承載該抗原。進而,使用離心分離將未吸附之抗原與承載抗原承載粒子分開,再分散於水性溶劑(通常為緩衝液)中,藉此可製作含有物理吸附粒子之溶液。作為緩衝液,例如可列舉:HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid,4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)緩衝液等古德緩衝液、TRIS(tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羥甲基)胺基甲烷)緩衝液、甘胺酸緩衝液、硼酸緩衝液等。
化學鍵結法係利用不溶性承載粒子表面之官能基,藉由共價鍵使特定之抗原進行鍵結。例如,於不溶性承載粒子表面之官能基為羧基、羥基、胺基之情形時,分別利用碳二醯亞胺、溴化氰、戊二醛作為活性劑,藉此可使抗原與不溶性承載粒子表面進行共價鍵結。亦可藉由活化劑預先使不溶性承載粒子表面之官能基活化後與抗原接觸,亦可使活化劑及抗原同時與不溶性承載粒子接觸。於不溶性承載粒子表面之官能基為醛基、甲苯磺醯基之情形時,無須使用活性劑。進而,亦可於不溶性承載粒子與抗原之間導入寡胺基酸或胺基羧酸等間隔分子而進行共價鍵結。
上述化學鍵結反應係於水性溶劑(通常為緩衝液)中進行,藉由使所獲得之化學鍵結粒子再分散於水性溶劑(通常為緩衝液)中,可製作含有化學鍵結粒子之溶液。作為緩衝液,例如可列舉:HEPES緩衝液等古德緩衝液、TRIS緩衝液、甘胺酸緩衝液、硼酸緩衝液等。
如此,可製作物理吸附粒子及化學鍵結粒子。物理吸附粒子及化學鍵結粒子係於水性溶劑中以不溶性承載粒子之含有液之形式保存。
(3)本發明之含有液
本發明之含有液係含有物理吸附粒子及化學鍵結粒子兩者之含有液,其溶劑通常為緩衝液。作為緩衝液,例如可列舉:HEPES緩衝液等古德緩衝液、TRIS緩衝液、甘胺酸緩衝液、硼酸緩衝液等。例如,本發明之含有液可藉由將上述以含有物理吸附粒子之溶液之形式製作之物理吸附粒子、與以含有化學鍵結粒子之溶液之形式製作之化學鍵結粒子於水性溶劑(通常為緩衝液)中混合而製作。只要可獲得含有物理吸附粒子及化學鍵結粒子兩者之含有液,則本發明之含有液之製作方法並不限定於此。
於本發明之含有液中,視需要例如亦可含有各種電解質、穩定劑、
界面活性劑、增感劑等。
本發明之含有液中之各承載抗原承載粒子之含有比亦根據所需之測定範圍及感度而不同,較佳為以質量比計為10:1~1:10(物理吸附粒子:化學鍵結粒子),進而較佳為5:1~1:5(物理吸附粒子:化學鍵結粒子),極佳為3:1~1:3(物理吸附粒子:化學鍵結粒子),最佳為3:1~1:2(物理吸附粒子:化學鍵結粒子)。但是,若測定樣本中之目標抗體時之含有液中之物理吸附粒子的含量、或於使用稀釋液之情形時含有液及稀釋液之混合液中之物理吸附粒子的含量為0.045質量%以上,則有未見與該粒子之含量增加相應之效果提昇的傾向。
2.抗體之測定
於本發明之測定方法中,使用上述本發明之含有液進行抗體之測定。即,可使本發明之含有液與可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本接觸,檢測因該含有液之不溶性承載粒子所承載之抗原與該樣本中之目標抗體之抗原抗體反應所引起的該微粒子之反應。亦可不使用稀釋液而進行本發明之測定方法,但較佳為使用稀釋液進行。
於使用稀釋液進行測定之情形時,亦可使混合稀釋液而經稀釋之本發明之含有液與該樣本接觸,較佳為使於該樣本中加入稀釋液而經稀釋之該樣本與本發明之含有液接觸。相對於本發明之含有液,較佳為使用以體積比計為9倍以下之稀釋液,尤佳為使用1~5倍之稀釋液。
「可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本」只要可能含有被測定抗體,則並無特別限定,如上所述,例如可列舉:血液、血清、血漿、尿、淋巴液、穿刺液、腦脊液、汗、唾液、胃液、肺清洗液、糞便等,於該等中,較佳為血液、血清、血漿。血清等樣本視需要可利用生理鹽水等
進行稀釋。經生理鹽水等稀釋之樣本亦包括於「可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本」中。再者,此處之稀釋係與利用稀釋液之稀釋不同。
3.本發明之套組
本發明之套組係用以進行本發明之測定方法之測定用套組,包含本發明之含有液及下述稀釋液作為構成要素。
作為本發明之含有液以外之本發明之套組中之構成要素,例如可列舉:成為測定對象之目標抗體之標準品、精度管理用試樣、稀釋液等。
稀釋液較佳為用以於使「可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本」與本發明之含有液接觸之前進行稀釋的液體,只要實質上不妨礙目標抗體之測定,則並無特別限定。與本發明之含有液同樣地,稀釋液典型而言為緩衝液。作為緩衝液,例如可列舉:HEPES緩衝液等古德緩衝液、TRIS緩衝液、甘胺酸緩衝液、硼酸緩衝液等。於該稀釋液中,視需要例如亦可含有各種電解質、穩定劑、界面活性劑、增感劑等。該稀釋液較佳為與本發明之含有液之溶劑相同或類似。
又,於使用本發明之套組進行本發明之測定方法之情形時,亦可不使用稀釋液進行測定,於使用稀釋液之情形時,相對於本發明之含有液,使用以體積比計較佳為9倍以下、尤佳為1~5倍之稀釋液。
於下述實施例中,作為使用時稀釋液之第1試劑為上述稀釋液,作為乳膠粒子分散液之第2試劑為本發明之含有液。包含該等第1試劑及第2試劑作為構成要素者係本發明之套組之一個具體例。
以下,記載本發明之實施例。%只要無特別說明則為質量%。
1.乳膠
本實施例中所使用之乳膠如下所述。
(1)進行物理吸附法之乳膠
‧0.235μm聚苯乙烯乳膠粒子(以下,稱為物理乳膠1)
‧0.223μm聚苯乙烯乳膠粒子(以下,稱為物理乳膠2)
‧0.310μm聚苯乙烯乳膠粒子(以下,稱為物理乳膠3)
(2)進行化學鍵結法之乳膠
‧0.145μm羧基乳膠粒子(以下,稱為化學乳膠1)
‧0.245μm羧基乳膠粒子(以下,稱為化學乳膠2)
‧0.300μm羧基乳膠粒子(以下,稱為化學乳膠3)
2.承載抗原之製備
作為本實施例之源自細菌之承載抗原,使用幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)之製備抗原。該源自細菌之抗原之製備係按照下述順序進行。
(1)預培養
使用幽門螺旋桿菌選擇分離用Pourmedia(註冊商標)HP分離培養基(榮研化學股份有限公司),藉由AnaeroPack(三菱瓦斯化學股份有限公司)設為微好氧環境,於37℃下對原始菌株進行培養。
(2)正式培養
正式培養之培養液係使用於Pearlcore(註冊商標)腦心浸液肉湯培養基「榮研」(榮研化學股份有限公司)中加入5%馬血清而成之培養液200mL。於該正式培養液中對上述預培養基之單菌落進行釣菌後,接種經調整為McFarland No.1.0之接種菌液,於微好氧氣體下,於37℃下進行振盪
培養。
(3)溶菌
上述正式培養完成後,藉由離心進行集菌,進而藉由生理鹽水進行離心清洗,於沈澱中添加溶菌液(包含0.15M之NaCl、0.1%聚氧乙烯辛基苯基醚、5mM之EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid,四乙酸乙二胺)、0.1%之NaN3的50mM之HEPES緩衝液,pH值7.4),將其藉由冷凍融解而進行溶菌。
(4)抗原製備
使上述幽門螺旋桿菌之溶解物對包含0.15M之NaCl、0.1%之NaN3的HEPES緩衝液(pH值7.4)進行透析後,獲得離心上清液,對其實施孔徑0.45μm之薄膜過濾器過濾。將該過濾物作為抗原,完成抗原製備,將其作為「幽門螺旋桿菌溶解物」,供於以下之步驟。幽門螺旋桿菌溶解物之抗原蛋白濃度係藉由BCA(bicinchoninic acid,二喹啉甲酸)法進行測定。
3.對乳膠粒子之承載步驟
(1)利用物理吸附法之承載
於含有0.09%聚苯乙烯乳膠粒子之溶液21.1mL中添加0.5M之CHES(2-(cyclohexylamino)ethanesulfonic acid,2-(環己胺基)乙磺酸)緩衝液(pH值8.8)0.48mL後,混合8mg/mL之幽門螺旋桿菌溶解物0.25mL。將混合液於室溫下攪拌30分鐘後,添加10%BSA(Bovine Serum Albumin,牛血清白蛋白)溶液1.04mL,藉由純化水將總量調整為24.0mL。進而,於56℃下加熱處理4小時後,藉由離心分離而去除未吸附抗原。使藉由離心分離而去除未吸附抗原後之乳膠粒子再分散於0.01M之HEPES緩衝液(pH值7.4)4.0mL中,添加10%BSA溶液0.04mL後,將其
於56℃下加熱處理2小時。將加熱後之含有抗原吸附乳膠粒子之溶液進行過濾,製作乳膠粒子濃度0.48%之物理吸附乳膠。
適當變更藉由離心分離而去除未吸附抗原後用於乳膠粒子之再分散之0.01M之HEPES緩衝液(pH值7.4)的體積,藉此可適當調整所製作之物理吸附乳膠之乳膠粒子濃度(關於化學鍵結,亦相同)。
(2)利用化學鍵結法之承載
於含有0.3%羧基乳膠粒子之溶液6.4mL中添加羧基之2莫耳當量之1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽,攪拌15分鐘使其反應而使羧基活化。於使羧基活化後之含有乳膠粒子之溶液中添加純化水63.2mL及0.5M之HEPES緩衝液(pH值7.0)1.28mL後,混合8mg/mL之幽門螺旋桿菌溶解物0.340mL,反應3小時。於反應混合液中添加10%BSA溶液0.776mL,反應4小時後,藉由離心分離而去除未吸附抗原。使藉由離心分離而去除未鍵結抗原後之乳膠粒子再分散於0.01M之HEPES緩衝液(pH值7.4)4.0mL中,添加10%BSA溶液0.04mL,於56℃下加熱處理4小時。將加熱後之含有抗原鍵結乳膠粒子之溶液進行過濾,製作乳膠粒子濃度0.48%之化學鍵結乳膠。
(3)乳膠粒子分散液之製備
於包含0.3M之NaCl、0.8M之L-精胺酸鹽酸鹽及0.2%之NaN3的HEPES緩衝液(pH值7.4)2.5mL中,添加上述(1)中所製備之物理吸附乳膠1.563mL及上述(2)中所製備之化學鍵結乳膠0.521mL,藉由純化水調整為總量5.0mL,製備包含0.15%之物理吸附乳膠粒子及0.05%之化學鍵結乳膠粒子之乳膠粒子分散液。
適當選擇物理吸附乳膠及化學鍵結乳膠之添加量,藉此可設為各種
混合比率。
4.測定系統
本實施例之測定係使用濁度法進行。
第1試劑為稀釋液(使用時稀釋液),為0.05M之HEPES、0.15M之NaCl、0.5%之軟骨素硫酸Na、0.1%之BSA、0.1%之PBC-34、0.1%之NaN3、pH值7.4,剩餘量為純化水。
第2試劑為乳膠粒子分散液(本發明之含有液),為0.05M之HEPES、0.15M之NaCl、0.4M之L-Arg‧HCl、0.1%之NaN3,乳膠粒子pH值7.4,剩餘量為純化水。
測定係使用生物化學自動分析裝置JCA-BM2250(日本電子股份有限公司)進行。
具體而言,利用該裝置,於經生理鹽水稀釋至5倍之樣本(血清樣本)6.0μL中混合第1試劑60μL並於37℃下培養5分鐘後,於該混合液中混合第2試劑20μL並於37℃下進行反應,測定混合第2試劑後約3分鐘之主波長658nm及副波長805nm兩種波長下之吸光度變化。即,於本實施例中,相對於第2試劑,使用以體積比計為3倍之第1試劑(稀釋倍率:4倍)。
作為基準法,利用藉由ELISA法(E板「榮研」幽門螺旋桿菌II:榮研化學股份有限公司)之測定。
[實施例1]兩種乳膠粒子之混合效果之研究
如上所述,使用以相異方式承載有幽門螺旋桿菌溶解物之粒徑0.235μm之物理吸附乳膠粒子(物理乳膠1)、與粒徑0.145μm之化學鍵結乳膠粒子(化學乳膠1),使用混合血清之稀釋系列,確認僅使用物理吸附乳膠粒子之情形時、僅使用化學鍵結乳膠之情形時、及使用該等之混合物之情形
時之反應性(表1、圖1)。關於研究中所使用之第2試劑之乳膠粒子濃度,於僅使用物理吸附乳膠粒子之情形時設為0.15%,於僅使用化學鍵結乳膠粒子之情形時設為0.30%,於使用混合物之情形時,物理吸附乳膠粒子、化學鍵結乳膠粒子分別設為0.15%、0.30%。繼而,測定血清樣本,研究各情形時之特異性(表2)。再者,「表1之反應性之單位」及「圖1之縱軸之單位」係吸光度變化量(△OD/min)之10000倍。
又,表1所示之物理吸附乳膠粒子及化學鍵結乳膠粒子之濃度係如上所述般為第2試劑中之濃度,測定時之該乳膠濃度係因利用第1試劑之稀釋而分別為該顯示之1/4。例如,若為「物理乳膠1 0.15%」之顯示,則測定時之物理乳膠1之濃度為「0.15×1/4=0.0375%」。
藉由在物理吸附乳膠粒子中混合化學鍵結乳膠粒子,於維持較高之陰性一致率之狀態下陽性一致率提昇而特異性提昇,於將物理吸附乳膠粒子、化學鍵結乳膠粒子之第2試劑中之濃度分別設為0.15%、0.30%(1:2)之情形時,整體之一致率可見較佳之結果(表2)。
[實施例2]兩種乳膠粒子之混合比率之研究
如上所述,將以相異方式承載有幽門螺旋桿菌溶解物的粒徑0.223μm之物理吸附乳膠粒子(物理乳膠2)之第2試劑中的濃度設為0.20%,將粒徑0.145μm之化學鍵結乳膠粒子(化學乳膠1)以成為0~0.20%之方式添加至其中,測定血清樣本而研究特異性(表3)。
又,表3中之物理吸附乳膠粒子及化學鍵結乳膠粒子之濃度之顯示、與因利用第1試劑稀釋4倍所致的測定時之該等之濃度的關係係如實施例1所記載。
於混合有化學鍵結乳膠粒子之情形時,藉由化學鍵結乳膠粒子之混合量增加而一致率提昇。尤其可知隨著化學鍵結乳膠粒子之第2試劑中之濃度增加至0%、0.05%、0.10%、0.20%,陽性一致率明顯提昇至53%、67%、73%、80%,可避免假陰性(遺漏)。但是,物理吸附乳膠粒子之混合量為0.20%,超過下述0.18%(測定時:0.045%),故而一致率之提高受到抑制(表3)。
[實施例3]兩種乳膠粒子之混合比率之研究(1)
如上所述,將以相異方式承載有幽門螺旋桿菌溶解物的粒徑0.235μm之物理吸附乳膠粒子(物理乳膠1)之第2試劑中的濃度設為0.12%,將粒徑0.300μm之化學鍵結乳膠粒子(化學乳膠3)以成為0~0.10%之方式添加
至其中,使用LZ-幽門螺旋桿菌抗體校準物「榮研」(榮研化學股份有限公司)研究該情形時之反應性(表4、圖2),繼而,測定血清樣本而研究特異性(表5)。再者,「表4之反應性之單位」及「圖2之縱軸之單位」係吸光度變化量(△OD/min)之10000倍。
又,表4及表5中之物理吸附乳膠粒子及化學鍵結乳膠粒子之濃度之顯示、與因利用第1試劑稀釋4倍所致的測定時之該等之濃度的關係係如實施例1所記載。
根據該結果,隨著化學鍵結乳膠粒子相對於物理吸附乳膠粒子之混合量增加,陽性一致率提昇,可避免假陰性(遺漏)。進而,隨著化學鍵結乳膠粒子之混合量增加,反應性提昇,於物理吸附乳膠粒子與化學鍵結乳膠粒子之第2試劑中之濃度比為12:5~12:10(3:1-1:3以內)之情況下,整體之一致率較佳(表5)。
[實施例4]兩種乳膠粒子之混合比率之研究(2)
進一步擴大測定範圍而進行與實施例3相同之主旨之研究。所使用之乳膠粒子係與實施例3同樣地為物理乳膠1及化學乳膠3。
(1)測定血清樣本,對將物理乳膠1之第2試劑中之濃度固定為0.12%,且將化學乳膠3之濃度設為0%(物理吸附:化學鍵結=7.5:0)、0.016%(7.5:1)、0.048%(7.5:3)、0.08%(7.5:5)、0.12%(7.5:7.5)、0.16%(7.5:10)之情形時之特異性進行研究(表6)。幽門螺旋桿菌抗體值係根據使用LZ-幽門螺旋桿菌抗體校準物「榮研」(榮研化學股份有限公司)所製作之校準曲線求出。
又,表6中之物理吸附乳膠粒子及化學鍵結乳膠粒子之濃度之顯示、與因利用第1試劑稀釋4倍所致的測定時之該等之濃度的關係係如實施例1所記載。
(2)測定血清樣本,對將化學乳膠3之第2試劑中之濃度固定為0.08%,且將物理乳膠1之濃度設為0%(物理吸附:化學鍵結=0:5)、0.024%(1.5:5)、0.072%(4.5:5)、0.12%(7.5:5)、0.18%(11.3:5)、0.24%(15:5)之情形時之特異性進行研究(表7)。幽門螺旋桿菌抗體值係根據使用LZ-幽門螺旋桿菌抗體校準物「榮研」(榮研化學股份有限公司)所製作之校準曲線求出。
又,表7中之物理吸附乳膠粒子及化學鍵結乳膠粒子之濃度之顯示、
與因利用第1試劑稀釋4倍所致的測定時之該等之濃度的關係係如實施例1所記載。
於上述(1)(2)中,確認到較上述實施例3更廣之範圍內的物理吸附乳膠粒子與化學鍵結乳膠粒子之混合之效果。
即,於物理吸附乳膠粒子與化學鍵結乳膠粒子之第2試劑中之濃度比為7.5:1-7.5:10之範圍內進行研究,結果於7.5:1之例中,可見該等兩種乳膠粒子之混合效果,於其他7.5:3~7.5:10(3:1~1:3以內)之情況下,整體之一致率較佳(表6)。
又,於上述濃度比為1.5:5~15:5之範圍內進行研究,結果於1.5:5(5:1~1:5以內)及4.5:5及7.5:5(3:1-1:3以內)之情況下,整體之一致率較佳,但關於物理吸附乳膠粒子之第2試劑中之濃度為0.18%(測定時:0.045%)以上之2例(11.3:5及15:5之例),雖調配比本身為3:1~1:3之範圍,但由混合所得之特異性之提昇效果受到妨礙(表7)。
再者,於使用物理吸附乳膠粒子及化學鍵結乳膠粒子中之任一者之情形時,陽性一致率與陰性一致率之差更極端,認為其主要原因在於樣本數較少。
[實施例5]與乳膠粒子之粒徑有關之研究
如上所述,將以相異方式承載有幽門螺旋桿菌溶解物的粒徑0.235μm之物理吸附乳膠粒子(物理乳膠1)之第2試劑中的濃度設為0.15%,將粒徑0.245μm或0.300μm之化學鍵結乳膠粒子(分別為化學乳膠2(中粒徑)、化學乳膠3(大粒徑))0.05%混合至其中,測定血清樣本而研究各者之特異性。幽門螺旋桿菌抗體值係根據使用LZ-幽門螺旋桿菌抗體校準物「榮研」(榮研化學股份有限公司)所製作之校準曲線求出。其結果為,整體之一致率(將陽性一致率與陰性一致率合併)分別為92%及88%,兩者未見實質之差異。
進而,為了確認對物理吸附乳膠粒子間之粒徑之測定值造成之影響,將物理乳膠2(粒徑:0.223μm(中粒徑))及物理乳膠3(粒徑:0.310μm(大粒徑))分別於第2試劑中設為0.10%之濃度,藉由與上述相同之方法測定各者之特異性,但陽性一致率、陰性一致率及整體之一致率未見實質之差異。
再者,於本實施例5中,物理吸附乳膠粒子及化學鍵結乳膠粒子之濃度之顯示、與因利用第1試劑稀釋4倍所致的測定時之該等之濃度的關係亦如實施例1所記載。
根據該結果,確認到化學鍵結乳膠粒子之粒徑及物理吸附乳膠粒子之粒徑係至少於中或大粒徑之情況下,均不會對自生物體分離之樣本之測定之特異性實質上造成影響。
Claims (12)
- 一種抗體測定方法,其特徵在於:使含有藉由物理吸附而承載有特定之抗原之不溶性承載粒子、及藉由化學鍵結而承載有該抗原之不溶性承載粒子兩者的不溶性承載粒子之含有液,與可能含有目標抗體之自生物體分離之樣本接觸,檢測因該承載粒子所承載之抗原與該樣本中之目標抗體之抗原抗體反應所引起的該承載粒子之凝集反應。
- 如請求項1之抗體測定方法,其中特定之抗原為複數種物質之混合物。
- 如請求項2之抗體測定方法,其中複數種物質之混合物為源自微生物之溶解物。
- 如請求項1之抗體測定方法,其中特定之抗原包含至少1種分子量為5000以上之物質。
- 如請求項1至4中任一項之抗體測定方法,其中不溶性承載粒子為乳膠粒子。
- 一種抗體之測定用試劑,其特徵在於:其係用以檢測因與自生物體分離之樣本中之目標抗體之抗原抗體反應所引起的承載抗原承載粒子之反應者,該抗體之測定用試劑係含有藉由物理吸附而承載有特定之抗原之不 溶性承載粒子、及藉由化學鍵結而承載有該抗原之不溶性承載粒子兩者的不溶性承載粒子之含有液。
- 如請求項6之測定用試劑,其中特定之抗原為複數種物質之混合物。
- 如請求項7之測定用試劑,其中複數種物質之混合物為源自微生物之溶解物。
- 如請求項6之測定用試劑,其中特定之抗原包含至少1種分子量為5000以上之物質。
- 如請求項6至9中任一項之測定用試劑,其中不溶性承載粒子為乳膠粒子。
- 一種測定用套組,其特徵在於包含如請求項6至9中任一項之測定用試劑及稀釋液。
- 如請求項11之測定用套組,其中不溶性承載粒子為乳膠粒子。
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