CN112485443A - 一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒 - Google Patents

一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒,涉及临床体外检测试剂技术领域。所述检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:所述试剂R1的成分如下:缓冲液、聚乙二醇、氯化钠、防腐剂、催化剂、螯合剂;试剂R2的成分和含量如下:缓冲液、包被Ro52抗原的胶乳、复合稳定剂、防腐剂。本发明能够有效增强分析灵敏度、稳定性。

Description

一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及临床体外检测技术领域,具体涉及一种灵敏度高的抗 Ro52抗体检测试剂盒。
背景技术
SS-A抗原是由一个RNA分子和两种不同的蛋白质(分子量分别为 52和60kDa)组成的小核糖核蛋白,抗-SS-A60kDa蛋白的抗体对于干 燥综合症和系统性红斑狼疮的特异性更高,而单独抗SS-A52kDa的抗体 不具有疾病的特异性,并且容易与其它抗体发生交叉反应。
在鉴别诊断中,抗SSA/Ro抗体对干燥综合症和SLE具有极高的特 异性,尤其是抗Ro抗体与60KDRo蛋白(Ro60)和52KDRo蛋白 (Ro52)的免疫反应,分别用于辨别SLE和原发性干燥综合症。SS-A/Ro抗 体见于85%-95%的干燥综合症病人。因此,此抗体是鉴别此病的主要指 标。抗Ro52抗体与抗Ro60抗体相比,对原发性干燥综合症具有更高 的特异性。在超过60%的原发性干燥综合症病人中可单独检测到Ro52 自身抗体,而只有5%的SLE病人可单独检测到此抗体。
目前实验室常用的检测抗Ro52抗体的方法主要有酶联免疫吸附剂 试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)、间接免疫荧光法(indirectimmunoflurescence,IFF)、免疫印迹法(immunoblottingtest,IBT)、线性免 疫分析法(Lineimmunoassay,LIA)等。
免疫印迹法虽综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异 性和敏感性,但操作相对复杂,且试剂具有较强的毒性和污染性。
间接免疫荧光法可作半定量测定,但需通过荧光显微镜观察结果,结 果判定的客观性不足,标准化困难,技术程序比较复杂,也不适合高通量 标本的检测。
线性免疫分析法主要用于疾病大类的筛查,针对性相对较差,同时也 不适合高通量样本的检测。
ELISA法检测可用于高通量标本测定,灵敏度也较高,目前被广泛认 可,但操作比较繁琐,需多次加样和洗涤,且易受温度和孵育条件的影响, 需在专业实验室里进行操作。
目前市场上商品化的抗Ro52抗体检测试剂盒的检测方法主要为酶 联免疫吸附法,经过多次加样和洗涤步骤,完成整个实验过程需三小时左 右,需酶标仪,亦需要专业免疫学技术人员在实验室进行操作,易受人员 和场地的限制,同时易受各种温度和孵育时间等环境条件因素的影响,给 实验带来诸多不便。
发明内容
本发明提供了一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒。该试剂盒与 市场上广泛使用的酶联免疫吸附法试剂盒相比,使用常规生化仪即可实现 检测,操作简便,可进行批量样本全自动化检测,分析灵敏度高,稳定性 好,有利于试剂在临床上的推广应用。
本发明的试剂盒在具有双试剂功能的自动生化分析仪上进行,其具体 技术方案如下:
本发明提供一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒,由试剂R1和 试剂R2组成,其中:
所述试剂R1的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000021
所述试剂R2的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000022
Figure BDA0002775539180000031
进一步的,所述缓冲液为MES缓冲液、PBS缓冲液中的一种或两种 组合,所述试剂缓冲液的PH值为4-6。
进一步的,所述试剂R1和试剂R2的体积比为试剂R1:试剂R2=3:1。
进一步的,所述试剂R1的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000032
试剂R2的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000033
进一步的,所述试剂R1的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000034
试剂R2的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000041
进一步的,所述试剂R1的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000042
试剂R2的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000043
所述的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒使用全自动生化分析仪, 利用两点终点法对抗Ro52抗体进行测定,检测主波长为570nm。
所述的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂,试剂R1和试剂R2在使用 时的比例为试剂R1:试剂R2=225:75。
本发明所使用的校准品为英国朗道公司生产的校准品。
本发明所使用的质控品为英国朗道公司生产的质控品。
加入生理盐水、样本或校准品15μL,再加入225μL的R1试剂预孵 育5min后读取吸光度A1,之后再加入75μL的R2试剂反应5min后,读 取吸光度A2,并计算ΔA。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒通过两点终点法进行测 定,分别在试剂R1中添加适宜浓度的氯化钠和聚乙二醇,在试剂R2中 添加适宜浓度的甘油和BSA组合的稳定剂,增强了试剂的稳定性;添加 适宜浓度的叠氮钠作为防腐剂,不会对试剂的准确度产生影响。本发明的 试剂盒通过试剂R1中加入乙二胺四乙酸二钠作为催化剂,柠檬酸作为螯 合剂,提高了试剂盒的灵敏度。
附图说明
图1为本发明的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒中实施例1与对 照组的相关性曲线图;
图2为本发明的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒中实施例2与对 照组的相关性曲线图;
图3本发明的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒中实施例3与对照 组的相关性曲线图;
图4为本发明的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒中试剂R1的开 瓶稳定性曲线图;
图5为本发明的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒中试剂R2的开 瓶稳定性曲线图;
图6为本发明的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒在具有双试剂功 能的自动生化分析仪上具体使用方法示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结 合具体实施例和附图进行详细描述。
实施例1:
市场上获得认可的一种抗Ro52抗体检测试剂盒为对照试剂,按照说 明书进行严格操作,筛选阳性样本,检测阈值为18IU/mL,大于18IU/mL 的为阳性。
本实施例的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒包括试剂R1和试剂 R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000061
试剂R2的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000062
本实施例的检测方法:采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪(如 日立7180全自动分析仪、OLYMPUSAU640等),利用两点终点法进行测 定,具体操作如下:
加入生理盐水、样本或校准品15μL,再加入225μL的试剂R1预孵 育5min后读取吸光度A1,之后再加入75μl的试剂R2反应5min后,读 取吸光度A2,并计算ΔA。
实施例2:
本实施例的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒包括试剂R1和试剂 R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000071
试剂R2的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000072
检测方法同实施例1的检测方法。
实施例3:
本实施例的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒包括试剂R1和试剂 R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000073
Figure BDA0002775539180000081
试剂R2的成分和含量如下:
Figure BDA0002775539180000082
检测方法同实施例1的检测方法。
灵敏度试验:
选取12个已知不同浓度的抗Ro52抗体样本(如表1),然后将12 个不同的样本分别使用实施例1、实施例2和实施例3中的配方配制的试 剂以及对照试剂进行检测,检测结果如表1所示:
表1灵敏度试验结果
理论浓度(IU/mL) 300 270 240 210 180 150 120 90 60 30 20 10
对比例检测结果 301 271 240 209 180 151 120 91 60 29 21 10
实施例1检测结果 300 271 240 210 180 150 120 90 60 30 20 11
实施例2检测结果 299 270 241 209 180 151 121 90 60 30 20 10
实施例3检测结果 300 270 240 209 180 151 120 91 61 30 21 10
从表1中可以看出,在样本浓度低至10IU/mL时,对比例对应的试 剂盒检测值为10IU/mL,而实施例1-3对应的试剂盒检测值为10-11 IU/mL,仍可以检测出样本的准确值;并且与对比例相比,实施例1-3对 应的试剂盒检测接近线性下限的低值样本时的准确度更高。另外,在样本 浓度在线性上限300IU/mL时,对比例对应的试剂盒检测值为301 IU/mL,,而实施例1-3对应的试剂盒检测值在299-301IU/mL之间,仍可 以检测出样本的准确值,这表明实施例1-3对应的试剂盒拥有更高的分析 灵敏度。
相关性试验:
按照实施例1、实施例2和实施例3的配方分别配制试剂,与对照试 剂盒进行对照检测,同时检测40个临床血清样本,检测结果如表2-表4 所示。
表2实施例1试剂相关性试验结果
Figure BDA0002775539180000091
Figure BDA0002775539180000101
Figure BDA0002775539180000111
表3实施例2试剂相关性试验结果
Figure BDA0002775539180000112
Figure BDA0002775539180000121
Figure BDA0002775539180000131
表4实施例3试剂相关性试验结果
Figure BDA0002775539180000132
Figure BDA0002775539180000141
Figure BDA0002775539180000151
由表2-表4可以看出,实施例1、实施例2和实施例3的试剂盒与对 照试剂盒的相关系数为0.99以上,说明实施例1、实施例2和实施例3与 对照试剂盒有极大的相关性。
稳定性试验:
将本发明实施例1、实施例2和实施例3中所得检测试剂均匀分装两 组,一组检测试剂做37℃热稳定性检测试验,封闭放置在37℃恒温水浴 锅中(每天仅在检测的时候取出,检测完毕后,依然封口放回37℃水浴锅 中,连续12天);另一组检测试剂做15天开瓶稳定性检测试验,将检测 试剂开瓶放置到2-8℃冰箱中(15天不取出)。将试剂同时在日立7180全 自动生化分析仪器上进行检测,并在仪器上建立标准曲线。取冻干粉质控 品,溶解均匀后,平均分成15份,-20℃储存,每天质控一个,并且跟踪 检测结果。实施例1、实施例2和实施例3的试剂盒热稳定性跟踪监测趋 势如图4所示,实施例1、实施例2和实施例3的试剂盒开瓶稳定性跟踪 监测趋势如图5所示。
从图4可以看出,实施例1在37℃热稳定性实验中,7天时的稳定性 仅下降6.8%,实施例2的试剂盒下降5.4%,实施例3下降4.1%,而对照 例试剂盒下降了31.21%,说明本发明的试剂盒在37℃热稳定性试验中性 能指标良好。
从图5可以看出,实施例1在开瓶稳定性实验中,20天时的稳定性仅 下降5.37%,实施例2的试剂盒下降5.56%,实施例3下降4.98%,而对 照例试剂盒下降了21.12%,说明本发明的试剂盒在开瓶稳定性试验中性 能指标良好。
综上所述,本发明的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒具有良好的 准确度、相关性、稳定性和灵敏性。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普 通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改 进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒,其特征在于,包括试剂R1和试剂R2,其中:
所述试剂R1的成分和含量如下:
Figure FDA0002775539170000011
试剂R2的成分和含量如下:
Figure FDA0002775539170000012
2.根据权利要求1所述的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒,其特征在于,所述缓冲液为MES缓冲液、PBS缓冲液中的一种或两种组合,所述试剂缓冲液的PH值为4-6。
3.根据权利要求1所述的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1和试剂R2的体积比为试剂R1:试剂R2=3:1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1的成分和含量如下:
Figure FDA0002775539170000013
Figure FDA0002775539170000021
试剂R2的成分和含量如下:
Figure FDA0002775539170000022
5.根据权利要求1-3中任一所述的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1的成分和含量如下:
Figure FDA0002775539170000023
试剂R2的成分和含量如下:
Figure FDA0002775539170000024
6.根据权利要求1-3中任一所述的灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1的成分和含量如下:
Figure FDA0002775539170000025
Figure FDA0002775539170000031
试剂R2的成分和含量如下:
Figure FDA0002775539170000032
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