JPH07146292A - ヒトプロテインｃ活性化ペプチドの測定方法および該測定用試薬キット - Google Patents
ヒトプロテインｃ活性化ペプチドの測定方法および該測定用試薬キットInfo
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- JPH07146292A JPH07146292A JP29320593A JP29320593A JPH07146292A JP H07146292 A JPH07146292 A JP H07146292A JP 29320593 A JP29320593 A JP 29320593A JP 29320593 A JP29320593 A JP 29320593A JP H07146292 A JPH07146292 A JP H07146292A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 固相に固定化された抗ヒトプロテインＣ活性
化ペプチド（ＰＣＰ）抗体と、検体およびキレート剤を
含む緩衝液とを接触させ、抗ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣ
Ｐとの抗原抗体反応を行わせる。未反応の抗ＰＣＰ抗体
と酵素標識ＰＣＰとを接触させて、さらに抗原抗体反応
を行わせる。抗体非結合ＰＣＰを除き、抗原抗体反応に
よって抗ＰＣＰ抗体を介して固相に結合した酵素標識Ｐ
ＣＰの酵素活性を酵素用基質を用いて測定し、別に作成
した検量線と比較することによって、検体中のＰＣＰ量
を求めるものである。 【効果】 検体中のＰＣの影響はほとんど受けないか、
あるいは非常に僅かになるので、特別な方法による検体
処理を特に必要とすることなくＰＣＰの測定が可能とな
る。したがって、ＰＣＰの測定が非常に簡便となり、経
済的負担が低減される。また、ＰＣＰ１０ｐＭ程度まで
の高い測定感度が得られ、実際の臨床検査分野でＰＣＰ
測定が可能となる。
化ペプチド（ＰＣＰ）抗体と、検体およびキレート剤を
含む緩衝液とを接触させ、抗ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣ
Ｐとの抗原抗体反応を行わせる。未反応の抗ＰＣＰ抗体
と酵素標識ＰＣＰとを接触させて、さらに抗原抗体反応
を行わせる。抗体非結合ＰＣＰを除き、抗原抗体反応に
よって抗ＰＣＰ抗体を介して固相に結合した酵素標識Ｐ
ＣＰの酵素活性を酵素用基質を用いて測定し、別に作成
した検量線と比較することによって、検体中のＰＣＰ量
を求めるものである。 【効果】 検体中のＰＣの影響はほとんど受けないか、
あるいは非常に僅かになるので、特別な方法による検体
処理を特に必要とすることなくＰＣＰの測定が可能とな
る。したがって、ＰＣＰの測定が非常に簡便となり、経
済的負担が低減される。また、ＰＣＰ１０ｐＭ程度まで
の高い測定感度が得られ、実際の臨床検査分野でＰＣＰ
測定が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトプロテインＣ活性
化ペプチド（以下「ＰＣＰ」ともいう。）の測定方法お
よびＰＣＰの測定用試薬キットに関する。
化ペプチド（以下「ＰＣＰ」ともいう。）の測定方法お
よびＰＣＰの測定用試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＰは、ヒトプロテインＣ（以下「Ｐ
Ｃ」ともいう。）が活性化される際にＰＣから遊離され
るポリペプチドであり、１２のアミノ酸残基（NH2 -Asp
-Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg-COO
H）から成る、分子量約１４００のポリペプチドであ
る。
Ｃ」ともいう。）が活性化される際にＰＣから遊離され
るポリペプチドであり、１２のアミノ酸残基（NH2 -Asp
-Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg-COO
H）から成る、分子量約１４００のポリペプチドであ
る。
【０００３】ＰＣはビタミンＫ依存性血漿蛋白質の一つ
であり、生理的抗凝固因子として非常に重要な役割を持
つ。ＰＣは通常、不活性型の前駆酵素として存在する。
凝固亢進により生じたトロンビンは、血管内皮細胞上に
存在するトロンボモジュリンに結合し、トロンビン・ト
ロンボモジュリン複合体を形成する。ＰＣはこの複合体
による限定分解を受け、活性化ＰＣとなる。この時、Ｐ
ＣＰがＰＣより遊離される。活性化ＰＣは、プロテイン
Ｓを補助因子として、第VIII因子と第Ｖ因子とを分解し
失活させることによって、凝固反応を抑制する。ＰＣＰ
はＰＣが活性化されるとき遊離されるペプチドであるの
で、ＰＣの活性化の指標、すなわち、凝固亢進状態を知
る指標（血栓症マーカー）となるものである。
であり、生理的抗凝固因子として非常に重要な役割を持
つ。ＰＣは通常、不活性型の前駆酵素として存在する。
凝固亢進により生じたトロンビンは、血管内皮細胞上に
存在するトロンボモジュリンに結合し、トロンビン・ト
ロンボモジュリン複合体を形成する。ＰＣはこの複合体
による限定分解を受け、活性化ＰＣとなる。この時、Ｐ
ＣＰがＰＣより遊離される。活性化ＰＣは、プロテイン
Ｓを補助因子として、第VIII因子と第Ｖ因子とを分解し
失活させることによって、凝固反応を抑制する。ＰＣＰ
はＰＣが活性化されるとき遊離されるペプチドであるの
で、ＰＣの活性化の指標、すなわち、凝固亢進状態を知
る指標（血栓症マーカー）となるものである。
【０００４】ＰＣＰ測定の臨床的意義に関して、例えば
次の報告がある。Kenneth A. Bauerらの報告によると、
健常人におけるＰＣＰの血中濃度は５〜１８ｐｇ／ｍｌ
であるのに対して、前立腺癌では８１．８〜１９７．４
ｐｇ／ｍｌ、急性前骨髄性白血病においては１１８．７
〜２４７．８ｐｇ／ｍｌである（Kenneth A. Bauer et
al., J. Clin. Invest. 1984，74, 2033-2041)。また、
寺尾俊彦らの報告によると、産科的ＤＩＣ（播種性血管
内凝固症候群）では５６０ｐｇ／ｍｌ以上、慢性ＤＩＣ
といわれる妊娠中毒症においても、２８０〜５６０ｐｇ
／ｍｌのＰＣＰが検出されている（寺尾俊彦ら、血液と
脈管、１９８８、第１９巻第５号、ｐ４９０）。このよ
うに、ＰＣＰは血栓症を併発する可能性の大きい患者お
よび凝固亢進状態の患者で著しく増加することが報告さ
れ、血栓の生成あるいは凝固亢進状態を知る指標として
の臨床的意義が認められている。
次の報告がある。Kenneth A. Bauerらの報告によると、
健常人におけるＰＣＰの血中濃度は５〜１８ｐｇ／ｍｌ
であるのに対して、前立腺癌では８１．８〜１９７．４
ｐｇ／ｍｌ、急性前骨髄性白血病においては１１８．７
〜２４７．８ｐｇ／ｍｌである（Kenneth A. Bauer et
al., J. Clin. Invest. 1984，74, 2033-2041)。また、
寺尾俊彦らの報告によると、産科的ＤＩＣ（播種性血管
内凝固症候群）では５６０ｐｇ／ｍｌ以上、慢性ＤＩＣ
といわれる妊娠中毒症においても、２８０〜５６０ｐｇ
／ｍｌのＰＣＰが検出されている（寺尾俊彦ら、血液と
脈管、１９８８、第１９巻第５号、ｐ４９０）。このよ
うに、ＰＣＰは血栓症を併発する可能性の大きい患者お
よび凝固亢進状態の患者で著しく増加することが報告さ
れ、血栓の生成あるいは凝固亢進状態を知る指標として
の臨床的意義が認められている。
【０００５】活性化ＰＣの指標として、活性化ヒトプロ
テインＣとプロテインＣインヒビターとの複合体（ＣＩ
Ｃ）を測定する試みもなされている（特開平２−２３６
４５２号公報）。ＣＩＣはＰＣＰとは物質的に異なり、
用いる抗体や測定方法が全く異なる。
テインＣとプロテインＣインヒビターとの複合体（ＣＩ
Ｃ）を測定する試みもなされている（特開平２−２３６
４５２号公報）。ＣＩＣはＰＣＰとは物質的に異なり、
用いる抗体や測定方法が全く異なる。
【０００６】ヒトの血中ＰＣＰの測定方法として、ラジ
オアイソトープ法（Kenneth A. Bauer et al., J. Cli
n. Invest. 1984，74, 2033-2041)と競合的酵素抗体法
（寺尾俊彦ら、血液と脈管、１９８８、第１９巻第５
号、ｐ４９０）とが報告されている。しかしながら、以
下の理由により、これらの測定方法はルーチン検査を行
うには十分に満足できるものではない。
オアイソトープ法（Kenneth A. Bauer et al., J. Cli
n. Invest. 1984，74, 2033-2041)と競合的酵素抗体法
（寺尾俊彦ら、血液と脈管、１９８８、第１９巻第５
号、ｐ４９０）とが報告されている。しかしながら、以
下の理由により、これらの測定方法はルーチン検査を行
うには十分に満足できるものではない。
【０００７】ラジオアイソトープ法は、抗ＰＣＰ抗体
（ウサギ由来）と抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ由来）を用
いる二抗体法である。具体的には、放射性同位元素で標
識したＰＣＰ、検体および抗ＰＣＰ抗体を混合し、続い
てウサギ血清および抗ウサギＩｇＧ抗体を添加する。次
に、低温で１８時間放置した後、遠心分離を行って生じ
た沈澱中の放射活性を測定する。
（ウサギ由来）と抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ由来）を用
いる二抗体法である。具体的には、放射性同位元素で標
識したＰＣＰ、検体および抗ＰＣＰ抗体を混合し、続い
てウサギ血清および抗ウサギＩｇＧ抗体を添加する。次
に、低温で１８時間放置した後、遠心分離を行って生じ
た沈澱中の放射活性を測定する。
【０００８】したがって、本法は、多くの時間を要し、
また放射性物質を取り扱うために設備にかなりの投資が
必要であるので、経済的負担も大きい。さらに、本法に
おいては、用いる抗体がＰＣと僅かに交差反応を示すの
で、検体血漿中の大きな蛋白質を除去する目的で、過塩
素酸処理を行い、中和、濃縮と多くの操作を必要とす
る。また、目的とする測定感度を得るためには、検体血
漿を約１０ｍｌ必要とする。
また放射性物質を取り扱うために設備にかなりの投資が
必要であるので、経済的負担も大きい。さらに、本法に
おいては、用いる抗体がＰＣと僅かに交差反応を示すの
で、検体血漿中の大きな蛋白質を除去する目的で、過塩
素酸処理を行い、中和、濃縮と多くの操作を必要とす
る。また、目的とする測定感度を得るためには、検体血
漿を約１０ｍｌ必要とする。
【０００９】一方、競合的酵素抗体法は、固相化したＰ
ＣＰおよび検体中のＰＣＰが、酵素標識抗体と競合的反
応により結合し、固相化ＰＣＰに結合した酵素標識抗体
の活性を測定することにより、検体中ＰＣＰを測定する
方法である。具体的には、ＰＣＰを化学結合させた固
相、検体および酵素標識抗ＰＣＰ抗体を混合する。一定
時間反応後、混合液を除去、洗浄した後、用いた酵素に
適した発色基質を添加し、残存する酵素に応じた発色度
を得、これを比色定量する。その結果から、予め作成し
た検量線を参照することで抗原量が求められる。
ＣＰおよび検体中のＰＣＰが、酵素標識抗体と競合的反
応により結合し、固相化ＰＣＰに結合した酵素標識抗体
の活性を測定することにより、検体中ＰＣＰを測定する
方法である。具体的には、ＰＣＰを化学結合させた固
相、検体および酵素標識抗ＰＣＰ抗体を混合する。一定
時間反応後、混合液を除去、洗浄した後、用いた酵素に
適した発色基質を添加し、残存する酵素に応じた発色度
を得、これを比色定量する。その結果から、予め作成し
た検量線を参照することで抗原量が求められる。
【００１０】しかし、本法での測定限界はＰＣＰの約１
４０ｐｇ／ｍｌ（１００ｐＭ）であり、初期の凝固亢進
状態を捉える感度としては不十分である。すなわち、上
記のように、健常者のＰＣＰ量は約１４ｐｇ／ｍｌ（１
０ｐＭ）（Kenneth A. Baueret al., J. Clin. Invest.
1984，74, 2033-2041)であり、その濃度近くまで測定
できることが望まれる。また、本法においても、用いる
抗体がＰＣとも僅かに交差反応するので、検体をあらか
じめフィルターを用いてＰＣとＰＣＰとに分離する操作
が必要であり、操作は煩雑となり、経済的負担も大きい
という問題がある。
４０ｐｇ／ｍｌ（１００ｐＭ）であり、初期の凝固亢進
状態を捉える感度としては不十分である。すなわち、上
記のように、健常者のＰＣＰ量は約１４ｐｇ／ｍｌ（１
０ｐＭ）（Kenneth A. Baueret al., J. Clin. Invest.
1984，74, 2033-2041)であり、その濃度近くまで測定
できることが望まれる。また、本法においても、用いる
抗体がＰＣとも僅かに交差反応するので、検体をあらか
じめフィルターを用いてＰＣとＰＣＰとに分離する操作
が必要であり、操作は煩雑となり、経済的負担も大きい
という問題がある。
【００１１】ＰＣＰ測定方法において、用いる抗体とＰ
Ｃとの交差反応は重大な問題である。この問題解決の最
も好ましい方法は、ＰＣとは反応しない抗ＰＣＰ抗体を
取得することであるが、ＰＣＰはＰＣの一部であるの
で、ＰＣと反応しない抗ＰＣＰ抗体を得ることは困難で
あると考えられる。実際に、我々が取得した抗ＰＣＰ抗
体は、僅かながらＰＣと交差反応を示す。ＰＣＰはＰＣ
に比して血中に極微量にしか存在しないことから、用い
る抗体とＰＣとの僅かな交差反応が、ＰＣＰの測定に多
大な影響を及ぼし、ＰＣＰの正確な測定が困難となる。
交差反応するＰＣを除くために、Kenneth A. Bauerらは
過塩素酸処理を、寺尾らはフィルターを用いた濾過処理
を予め検体血漿に行っているが、いずれの方法も多大な
時間および費用がかかる。
Ｃとの交差反応は重大な問題である。この問題解決の最
も好ましい方法は、ＰＣとは反応しない抗ＰＣＰ抗体を
取得することであるが、ＰＣＰはＰＣの一部であるの
で、ＰＣと反応しない抗ＰＣＰ抗体を得ることは困難で
あると考えられる。実際に、我々が取得した抗ＰＣＰ抗
体は、僅かながらＰＣと交差反応を示す。ＰＣＰはＰＣ
に比して血中に極微量にしか存在しないことから、用い
る抗体とＰＣとの僅かな交差反応が、ＰＣＰの測定に多
大な影響を及ぼし、ＰＣＰの正確な測定が困難となる。
交差反応するＰＣを除くために、Kenneth A. Bauerらは
過塩素酸処理を、寺尾らはフィルターを用いた濾過処理
を予め検体血漿に行っているが、いずれの方法も多大な
時間および費用がかかる。
【００１２】一般的に交差反応を回避する方法として、
交差反応の少ない抗体を取得する方法がある。その一例
として、交差反応が予想される抗原とＤ−グルタミン酸
−Ｄ−リジン共重合体との共有結合物を、哺乳動物に投
与して免疫無応答性を誘起した後、目的の抗原で免疫す
ることにより、交差性の低い抗体を得る方法がある（特
開昭５８−９０６９号公報）。しかしながら、ＰＣＰは
ＰＣの一部であるので、本法を応用できる可能性は低
い。
交差反応の少ない抗体を取得する方法がある。その一例
として、交差反応が予想される抗原とＤ−グルタミン酸
−Ｄ−リジン共重合体との共有結合物を、哺乳動物に投
与して免疫無応答性を誘起した後、目的の抗原で免疫す
ることにより、交差性の低い抗体を得る方法がある（特
開昭５８−９０６９号公報）。しかしながら、ＰＣＰは
ＰＣの一部であるので、本法を応用できる可能性は低
い。
【００１３】また、反応溶液中に交差反応性物質または
交差反応性類似物質を添加する方法、すなわち、抗体の
交差反応を引き起こす抗原結合部位をブロックし、それ
によって交差反応を抑制することに基づいた方法がある
（特開昭６３−２６６３５６号公報、特開平５−５２８
４４号公報など）。しかしながら、本法についても、Ｐ
ＣＰはＰＣの一部であり、抗ＰＣＰ抗体がＰＣと僅かに
反応するので、応用できない。
交差反応性類似物質を添加する方法、すなわち、抗体の
交差反応を引き起こす抗原結合部位をブロックし、それ
によって交差反応を抑制することに基づいた方法がある
（特開昭６３−２６６３５６号公報、特開平５−５２８
４４号公報など）。しかしながら、本法についても、Ｐ
ＣＰはＰＣの一部であり、抗ＰＣＰ抗体がＰＣと僅かに
反応するので、応用できない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】以上の実情に鑑み、本
発明は、用いる抗体とＰＣとの交差性を低減させて、臨
床検査分野で応用するために十分な測定感度（１０ｐＭ
程度）を得ることができ、もって簡便に実施でき、経済
的負担を低減させるＰＣＰの測定方法およびＰＣＰ測定
用試薬キットの提供を目的とする。
発明は、用いる抗体とＰＣとの交差性を低減させて、臨
床検査分野で応用するために十分な測定感度（１０ｐＭ
程度）を得ることができ、もって簡便に実施でき、経済
的負担を低減させるＰＣＰの測定方法およびＰＣＰ測定
用試薬キットの提供を目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、固相に結
合した抗ＰＣＰ抗体と検体とを含む反応溶液中にキレー
ト剤を添加し、抗原抗体反応させることによって、検体
中のＰＣの影響をほとんど受けないか、あるいは軽減で
きることを見出し、さらに鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成するに至った。
合した抗ＰＣＰ抗体と検体とを含む反応溶液中にキレー
ト剤を添加し、抗原抗体反応させることによって、検体
中のＰＣの影響をほとんど受けないか、あるいは軽減で
きることを見出し、さらに鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成するに至った。
【００１６】すなわち、本発明は、少なくとも以下のａ
〜ｄの工程を順次行うことを特徴とするＰＣＰの測定方
法である。 ａ）固相に固定化された抗ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣＰ
とを、キレート剤の存在下で反応させる工程。 ｂ）未反応の抗ＰＣＰ抗体と酵素標識ＰＣＰとを反応さ
せる工程。 ｃ）未反応の酵素標識ＰＣＰを分離する工程。 ｄ）抗ＰＣＰ抗体に結合した酵素標識ＰＣＰの酵素活性
を測定する工程。
〜ｄの工程を順次行うことを特徴とするＰＣＰの測定方
法である。 ａ）固相に固定化された抗ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣＰ
とを、キレート剤の存在下で反応させる工程。 ｂ）未反応の抗ＰＣＰ抗体と酵素標識ＰＣＰとを反応さ
せる工程。 ｃ）未反応の酵素標識ＰＣＰを分離する工程。 ｄ）抗ＰＣＰ抗体に結合した酵素標識ＰＣＰの酵素活性
を測定する工程。
【００１７】また本発明は、ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣ
Ｐとを反応させる際に用いられ、キレート剤を含有する
ことを特徴とする緩衝剤または緩衝液である。
Ｐとを反応させる際に用いられ、キレート剤を含有する
ことを特徴とする緩衝剤または緩衝液である。
【００１８】さらに本発明は、固相に固定化されていて
もよい抗ＰＣＰ抗体と、上記の緩衝剤または緩衝液と、
抗ＰＣＰ抗体と反応し得る酵素標識ＰＣＰと、酵素標識
ＰＣＰの酵素活性を測定するための基質とを少なくとも
含むことを特徴とするＰＣＰ測定用試薬キットである。
もよい抗ＰＣＰ抗体と、上記の緩衝剤または緩衝液と、
抗ＰＣＰ抗体と反応し得る酵素標識ＰＣＰと、酵素標識
ＰＣＰの酵素活性を測定するための基質とを少なくとも
含むことを特徴とするＰＣＰ測定用試薬キットである。
【００１９】本発明のＰＣＰの測定方法は、固相に固定
化された抗ＰＣＰ抗体と、検体およびキレート剤を含む
緩衝液とを接触させ、抗ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣＰと
の抗原抗体反応を行わせた後、未反応の（検体中のＰＣ
Ｐに結合していない）抗ＰＣＰ抗体と酵素標識ＰＣＰと
を接触させて、さらに抗原抗体反応を行わせ、その後、
抗体非結合ＰＣＰ（抗ＰＣＰ抗体に結合していない酵素
標識ＰＣＰ）を除き、抗原抗体反応によって抗ＰＣＰ抗
体を介して固相に結合した酵素標識ＰＣＰの酵素活性を
酵素用基質を用いて測定し、別に作成した検量線と比較
することによって、検体中のＰＣＰ量を求めるものであ
る。
化された抗ＰＣＰ抗体と、検体およびキレート剤を含む
緩衝液とを接触させ、抗ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣＰと
の抗原抗体反応を行わせた後、未反応の（検体中のＰＣ
Ｐに結合していない）抗ＰＣＰ抗体と酵素標識ＰＣＰと
を接触させて、さらに抗原抗体反応を行わせ、その後、
抗体非結合ＰＣＰ（抗ＰＣＰ抗体に結合していない酵素
標識ＰＣＰ）を除き、抗原抗体反応によって抗ＰＣＰ抗
体を介して固相に結合した酵素標識ＰＣＰの酵素活性を
酵素用基質を用いて測定し、別に作成した検量線と比較
することによって、検体中のＰＣＰ量を求めるものであ
る。
【００２０】したがって、本発明方法においては、検体
中にＰＣＰが存在しなければ、固相上に補足される酵素
標識ＰＣＰの量は最大となり、検体中のＰＣＰ量の増大
とともに、固相上に補足される酵素標識ＰＣＰの量は減
少する。すなわち、固相結合酵素量を測定することによ
って、検体中のＰＣＰの量を求めることができるのであ
る。以下にその詳細について説明する。
中にＰＣＰが存在しなければ、固相上に補足される酵素
標識ＰＣＰの量は最大となり、検体中のＰＣＰ量の増大
とともに、固相上に補足される酵素標識ＰＣＰの量は減
少する。すなわち、固相結合酵素量を測定することによ
って、検体中のＰＣＰの量を求めることができるのであ
る。以下にその詳細について説明する。
【００２１】本発明の測定方法に用いられる検体は、ヒ
ト由来の体液または体液成分であり、通常は血漿成分で
あり、血漿そのもの、硫酸バリウム処理血漿などが用い
られる。
ト由来の体液または体液成分であり、通常は血漿成分で
あり、血漿そのもの、硫酸バリウム処理血漿などが用い
られる。
【００２２】なお、血液凝固検査で用いる血漿は、血液
９容に対しクエン酸ナトリウム液（３．１３〜３．８
％）１容を混合し、遠心分離によって得られるものであ
り、既に血漿中にはキレート剤としてのクエン酸が含ま
れる。血漿中のクエン酸は、血液中のカルシウムイオン
をキレートし、血液凝固反応を止める働きをする。カル
シウムイオンは血液凝固反応の進行に重要な役割を果た
し、多くの凝固因子の活性発現に関与する。通常、血漿
中には１０ｍＭ以上のクエン酸が含まれており、凝固反
応が進行しないことから、血漿中のカルシウムイオンは
十分にキレートされていると判断される。
９容に対しクエン酸ナトリウム液（３．１３〜３．８
％）１容を混合し、遠心分離によって得られるものであ
り、既に血漿中にはキレート剤としてのクエン酸が含ま
れる。血漿中のクエン酸は、血液中のカルシウムイオン
をキレートし、血液凝固反応を止める働きをする。カル
シウムイオンは血液凝固反応の進行に重要な役割を果た
し、多くの凝固因子の活性発現に関与する。通常、血漿
中には１０ｍＭ以上のクエン酸が含まれており、凝固反
応が進行しないことから、血漿中のカルシウムイオンは
十分にキレートされていると判断される。
【００２３】本発明で利用されるＰＣＰは、 NH2 -Asp-
Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg-COOH
のアミノ酸配列を有するものであり、化学合成により調
製することができる。このペプチドのアミノ基またはカ
ルボキシル基側にシステインを導入したペプチド〔cys-
ＰＣＰ〕も利用される。
Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg-COOH
のアミノ酸配列を有するものであり、化学合成により調
製することができる。このペプチドのアミノ基またはカ
ルボキシル基側にシステインを導入したペプチド〔cys-
ＰＣＰ〕も利用される。
【００２４】測定に用いる抗ＰＣＰ抗体は、ＰＣＰを公
知の方法で家兎、山羊、馬、マウスなどに免疫すること
によって、ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗
体として得られたものを使用する。各種動物にＰＣＰを
免疫する場合は、ＰＣＰそのもので免疫するよりも、Ｂ
ＳＡ〔Bovin Serum Albumin 〕、ＫＬＨ〔Keyhole Limp
et Hemocyanin 〕、ＯＶＡ〔Ovalbumin 〕などのタンパ
ク質にグルタールアルデヒド、ＥＤＣ〔１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ハ
イドロクロライド〕、Sulfo −ＳＭＣＣ〔スルホサクシ
ンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート〕などの架橋剤を用いて、
ＰＣＰまたは cys−ＰＣＰの複合体としたものを抗原と
するのが好ましい。得られた抗体は、硫安塩析、プロテ
イン−Ａカラムなどによって、さらに純度の高いものと
するのが好ましい。
知の方法で家兎、山羊、馬、マウスなどに免疫すること
によって、ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗
体として得られたものを使用する。各種動物にＰＣＰを
免疫する場合は、ＰＣＰそのもので免疫するよりも、Ｂ
ＳＡ〔Bovin Serum Albumin 〕、ＫＬＨ〔Keyhole Limp
et Hemocyanin 〕、ＯＶＡ〔Ovalbumin 〕などのタンパ
ク質にグルタールアルデヒド、ＥＤＣ〔１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ハ
イドロクロライド〕、Sulfo −ＳＭＣＣ〔スルホサクシ
ンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート〕などの架橋剤を用いて、
ＰＣＰまたは cys−ＰＣＰの複合体としたものを抗原と
するのが好ましい。得られた抗体は、硫安塩析、プロテ
イン−Ａカラムなどによって、さらに純度の高いものと
するのが好ましい。
【００２５】抗ＰＣＰ抗体を固定化（吸着または化学結
合）させる固相としては、例えば、エンザイムイムノア
ッセイ用の各種のマイクロタイタープレートのウエル、
ポリスチレンなどのプラスチックビーズ、磁性粒子など
の公知のものが使用できる。抗ＰＣＰ抗体を固相に固定
化する方法は、物理的吸着や化学結合による方法が公知
であり、それらの方法を用いることができる。
合）させる固相としては、例えば、エンザイムイムノア
ッセイ用の各種のマイクロタイタープレートのウエル、
ポリスチレンなどのプラスチックビーズ、磁性粒子など
の公知のものが使用できる。抗ＰＣＰ抗体を固相に固定
化する方法は、物理的吸着や化学結合による方法が公知
であり、それらの方法を用いることができる。
【００２６】固相に固定化された抗ＰＣＰ抗体と検体中
のＰＣＰとの反応は、検体と緩衝液とを添加した反応溶
液中にて行われる。緩衝液のｐＨは４．５〜９．０、好
ましくは５．５〜７．５の範囲であり、その濃度は０．
００５Ｍ〜０．５Ｍ、好ましくは０．０２Ｍ〜０．２Ｍ
の範囲である。緩衝液の種類としては、ミカエリス緩衝
液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰ
Ｓ、ＭＥＳなどのグッド緩衝液などが挙げられる。
のＰＣＰとの反応は、検体と緩衝液とを添加した反応溶
液中にて行われる。緩衝液のｐＨは４．５〜９．０、好
ましくは５．５〜７．５の範囲であり、その濃度は０．
００５Ｍ〜０．５Ｍ、好ましくは０．０２Ｍ〜０．２Ｍ
の範囲である。緩衝液の種類としては、ミカエリス緩衝
液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰ
Ｓ、ＭＥＳなどのグッド緩衝液などが挙げられる。
【００２７】本発明においては、本緩衝液中にキレート
剤が含有される。キレート剤としては、二価陽イオンを
キレートする作用を有し、ＰＣとの交差性を完全に回避
あるいは軽減させ得るものであれば特に限定されない
が、そのキレート作用が強い物質、例えば分子内に窒素
を含むキレート剤が好ましい。
剤が含有される。キレート剤としては、二価陽イオンを
キレートする作用を有し、ＰＣとの交差性を完全に回避
あるいは軽減させ得るものであれば特に限定されない
が、そのキレート作用が強い物質、例えば分子内に窒素
を含むキレート剤が好ましい。
【００２８】具体的には、クエン酸、ＥＤＴＡ〔エチレ
ンジアミン四酢酸〕、ＥＧＴＡ〔エチレングリコールビ
ス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ’−
四酢酸〕またはこれらの塩のようなキレート剤が挙げら
れる。その他、アミノポリカルボン酸のキレート剤とし
て、ＣｙＤＴＡ〔トランス−１，２−ジアミノシクロヘ
キサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ’−四酢酸〕、ＤＰＴＡ−ＯＨ
〔ジアミノプロパノール四酢酸〕、ＤＴＰＡ（〔ジエチ
レントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ''，Ｎ''−五酢酸〕、
ＥＤＤＡ〔エチレンジアミン二酢酸〕、ＥＤＤＰ〔エチ
レンジアミン二プロピオン酸〕、ＥＤＴＡ−ＯＨ〔ヒド
ロキシエチルエチレンジアミン三酢酸〕、ＨＢＥＤ
〔Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレン
ジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸〕、ＨＤＴＡ〔１，６−ヘ
キサメチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ’−四酢酸〕、
ＨＩＤＡ〔ヒドロキシエチルイミノ二酢酸〕、ＩＤＡ
〔イミノ二酢酸〕、Methyl−ＥＤＴＡ〔ジアミノプロパ
ン四酢酸〕、ＮＴＡ〔ニトリロ三酢酸〕、ＮＴＰ〔ニト
リロ三プロピオン酸〕、ＴＴＨＡ〔トリエチレンテトラ
ミン六酢酸〕などが挙げられる。アミノポリリン酸のキ
レート剤としてはＥＤＤＰＯ〔エチレンジアミン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（メチレンホスホン酸）〕、ＥＤＴＰＯ〔エ
チレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）〕、
ＮＴＰＯ〔ニトロトリス（メチレンホスホン酸）〕など
が挙げられる。これらキレート剤は、１種または２種以
上を組み合わせて用いられ、キレート剤の反応液中の濃
度は、キレート剤の種類により種々異なるが、０．１ｍ
Ｍ〜２００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜２５ｍＭが望まし
い。
ンジアミン四酢酸〕、ＥＧＴＡ〔エチレングリコールビ
ス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ’−
四酢酸〕またはこれらの塩のようなキレート剤が挙げら
れる。その他、アミノポリカルボン酸のキレート剤とし
て、ＣｙＤＴＡ〔トランス−１，２−ジアミノシクロヘ
キサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ’−四酢酸〕、ＤＰＴＡ−ＯＨ
〔ジアミノプロパノール四酢酸〕、ＤＴＰＡ（〔ジエチ
レントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ''，Ｎ''−五酢酸〕、
ＥＤＤＡ〔エチレンジアミン二酢酸〕、ＥＤＤＰ〔エチ
レンジアミン二プロピオン酸〕、ＥＤＴＡ−ＯＨ〔ヒド
ロキシエチルエチレンジアミン三酢酸〕、ＨＢＥＤ
〔Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレン
ジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸〕、ＨＤＴＡ〔１，６−ヘ
キサメチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ’−四酢酸〕、
ＨＩＤＡ〔ヒドロキシエチルイミノ二酢酸〕、ＩＤＡ
〔イミノ二酢酸〕、Methyl−ＥＤＴＡ〔ジアミノプロパ
ン四酢酸〕、ＮＴＡ〔ニトリロ三酢酸〕、ＮＴＰ〔ニト
リロ三プロピオン酸〕、ＴＴＨＡ〔トリエチレンテトラ
ミン六酢酸〕などが挙げられる。アミノポリリン酸のキ
レート剤としてはＥＤＤＰＯ〔エチレンジアミン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（メチレンホスホン酸）〕、ＥＤＴＰＯ〔エ
チレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）〕、
ＮＴＰＯ〔ニトロトリス（メチレンホスホン酸）〕など
が挙げられる。これらキレート剤は、１種または２種以
上を組み合わせて用いられ、キレート剤の反応液中の濃
度は、キレート剤の種類により種々異なるが、０．１ｍ
Ｍ〜２００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜２５ｍＭが望まし
い。
【００２９】本緩衝液中に界面活性剤などを添加するこ
とは、測定感度アップの面で好ましい。例えば、トライ
トンＸ−１００、ツウィーン２０、ブリッジ３５、ノニ
オンＥ−２１５などの非イオン性界面活性剤、アモーゲ
ンＫ、テゴ−５１などの両イオン性界面活性剤、ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）などの物質が挙げられる。
これら物質の緩衝液中での濃度は０．０５％〜１０％、
好ましくは０．５％〜２％である。これら界面活性剤を
組み合わせて用いることができ、種類および濃度はそれ
ぞれ選択することができる。その他の物質、例えば、防
腐剤などは好ましい濃度で随時添加される。
とは、測定感度アップの面で好ましい。例えば、トライ
トンＸ−１００、ツウィーン２０、ブリッジ３５、ノニ
オンＥ−２１５などの非イオン性界面活性剤、アモーゲ
ンＫ、テゴ−５１などの両イオン性界面活性剤、ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）などの物質が挙げられる。
これら物質の緩衝液中での濃度は０．０５％〜１０％、
好ましくは０．５％〜２％である。これら界面活性剤を
組み合わせて用いることができ、種類および濃度はそれ
ぞれ選択することができる。その他の物質、例えば、防
腐剤などは好ましい濃度で随時添加される。
【００３０】固相に固定化された抗ＰＣＰ抗体と検体中
のＰＣＰとの抗原抗体反応を行わせた後に添加する酵素
標識ＰＣＰは、化学合成されたＰＣＰまたは cys−ＰＣ
Ｐに二価性の架橋剤を用いて酵素を結合させたものであ
る。結合させる酵素としては、ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼなどが挙げられる。
のＰＣＰとの抗原抗体反応を行わせた後に添加する酵素
標識ＰＣＰは、化学合成されたＰＣＰまたは cys−ＰＣ
Ｐに二価性の架橋剤を用いて酵素を結合させたものであ
る。結合させる酵素としては、ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼなどが挙げられる。
【００３１】酵素標識ＰＣＰと抗ＰＣＰ抗体との抗原抗
体反応は、緩衝液中で行われる。本緩衝液のｐＨは４．
０〜１２．０、好ましくは６．０〜９．０の範囲であ
り、その濃度は０．００５〜０．５Ｍ、好ましくは０．
０２〜０．２Ｍの範囲である。ｐＨ調節用の緩衝液とし
ては、ＭＥＳ、トリス、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥ
Ｓ、ＢＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、グリシン、グ
リシルグリシンなどが挙げられる。本緩衝液中には、Ｂ
ＳＡなどのタンパク質、チメロサール、硫酸ゲンタマイ
シンなどの防腐剤やその他の物質が好ましい濃度で随時
添加される。
体反応は、緩衝液中で行われる。本緩衝液のｐＨは４．
０〜１２．０、好ましくは６．０〜９．０の範囲であ
り、その濃度は０．００５〜０．５Ｍ、好ましくは０．
０２〜０．２Ｍの範囲である。ｐＨ調節用の緩衝液とし
ては、ＭＥＳ、トリス、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥ
Ｓ、ＢＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、グリシン、グ
リシルグリシンなどが挙げられる。本緩衝液中には、Ｂ
ＳＡなどのタンパク質、チメロサール、硫酸ゲンタマイ
シンなどの防腐剤やその他の物質が好ましい濃度で随時
添加される。
【００３２】酵素活性を測定する基質については、選択
した酵素に応じて、それぞれに適した公知の基質を用い
ればよい。例えば、酵素としてβ−ガラクトシダーゼを
用いる場合には、４ＭＵＧ〔４−メチルウンベリフェリ
ル β−Ｄ−ガラクトピラノシド〕、ｏ−ＮＰＧ〔ｏ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクシド〕などが基質とし
て用いられ、ペルオキシダーゼを酵素として用いる場合
には、ＡＢＴＳ〔２，２’−アジノ−ビス（３’−エチ
ルベンゾジアゾリンスルホン酸）〕、ＴＭＢＺ〔３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン〕、ＯＰＤＡ
〔ｏ−フェニレンジアミン〕などの発色剤と過酸化水素
とを使用すればよい。
した酵素に応じて、それぞれに適した公知の基質を用い
ればよい。例えば、酵素としてβ−ガラクトシダーゼを
用いる場合には、４ＭＵＧ〔４−メチルウンベリフェリ
ル β−Ｄ−ガラクトピラノシド〕、ｏ−ＮＰＧ〔ｏ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクシド〕などが基質とし
て用いられ、ペルオキシダーゼを酵素として用いる場合
には、ＡＢＴＳ〔２，２’−アジノ−ビス（３’−エチ
ルベンゾジアゾリンスルホン酸）〕、ＴＭＢＺ〔３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン〕、ＯＰＤＡ
〔ｏ−フェニレンジアミン〕などの発色剤と過酸化水素
とを使用すればよい。
【００３３】測定に使用される試薬として、上記の物質
（試薬）以外にも、基質溶解剤、洗浄剤、反応停止剤な
どの公知の試薬が用いられる。
（試薬）以外にも、基質溶解剤、洗浄剤、反応停止剤な
どの公知の試薬が用いられる。
【００３４】次に、本発明の測定方法の具体的操作につ
いて説明する。本発明のＰＣＰ測定方法においては、固
相に固定化された抗ＰＣＰ抗体に、所定量の検体とキレ
ート剤を含む緩衝液とを添加、混合し、１０〜５０℃、
通常２５℃で５〜６００分間、好ましくは３０〜１５０
分間反応させる。その後、洗浄を行い、あるいは洗浄を
行わずに酵素標識ＰＣＰを添加し、同温度にて３〜３０
０分間、好ましくは１５〜６０分間反応させる。
いて説明する。本発明のＰＣＰ測定方法においては、固
相に固定化された抗ＰＣＰ抗体に、所定量の検体とキレ
ート剤を含む緩衝液とを添加、混合し、１０〜５０℃、
通常２５℃で５〜６００分間、好ましくは３０〜１５０
分間反応させる。その後、洗浄を行い、あるいは洗浄を
行わずに酵素標識ＰＣＰを添加し、同温度にて３〜３０
０分間、好ましくは１５〜６０分間反応させる。
【００３５】未反応の酵素標識ＰＣＰを分離するために
洗浄した後、標識酵素に適した基質を添加し、同温度に
て、３〜３００分間、好ましくは１０〜６０分間酵素反
応を行わせる。この際、必要に応じ、反応停止液を添加
する。次に、発色した色の吸光度または蛍光を測定す
る。別途、標準として種々の既知量のＰＣＰを含有する
検体を同様の操作で測定し、ＰＣＰ量に対して吸光度を
プロットして検量線を得る。得られた検量線に基づい
て、検体中のＰＣＰ量を求める。
洗浄した後、標識酵素に適した基質を添加し、同温度に
て、３〜３００分間、好ましくは１０〜６０分間酵素反
応を行わせる。この際、必要に応じ、反応停止液を添加
する。次に、発色した色の吸光度または蛍光を測定す
る。別途、標準として種々の既知量のＰＣＰを含有する
検体を同様の操作で測定し、ＰＣＰ量に対して吸光度を
プロットして検量線を得る。得られた検量線に基づい
て、検体中のＰＣＰ量を求める。
【００３６】本発明の測定方法によれば、上記の試薬を
用いる操作によって、検体中のＰＣＰ量に依存した発色
が生じ、通常の分光光度分析機または蛍光光度分析機を
用いるだけでよい。
用いる操作によって、検体中のＰＣＰ量に依存した発色
が生じ、通常の分光光度分析機または蛍光光度分析機を
用いるだけでよい。
【００３７】次に、本発明の緩衝剤または緩衝液につい
て説明する。本発明の緩衝剤または緩衝液は、少なくと
も上記のキレート剤を含有する緩衝剤または緩衝液であ
り、抗ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣＰとの抗原抗体反応の
際に、検体と混合して使用されるものである。本発明の
緩衝剤または緩衝液は、精製水などを用いて用時調製で
きる顆粒剤、散剤、錠剤などの形態、あるいは使用時に
所望の濃度に希釈できる濃厚液の形態などを採ることが
でき、必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、安定
剤、保存剤、その他の添加剤が配合され得る。
て説明する。本発明の緩衝剤または緩衝液は、少なくと
も上記のキレート剤を含有する緩衝剤または緩衝液であ
り、抗ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣＰとの抗原抗体反応の
際に、検体と混合して使用されるものである。本発明の
緩衝剤または緩衝液は、精製水などを用いて用時調製で
きる顆粒剤、散剤、錠剤などの形態、あるいは使用時に
所望の濃度に希釈できる濃厚液の形態などを採ることが
でき、必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、安定
剤、保存剤、その他の添加剤が配合され得る。
【００３８】また、本発明のＰＣＰ測定用試薬キット
は、固相に固定化されていてもよい抗ＰＣＰ抗体と、本
発明の緩衝剤または緩衝液と、抗ＰＣＰ抗体と反応し得
る酵素標識ＰＣＰと、酵素標識ＰＣＰの酵素活性を測定
するための基質とを少なくとも含むものであり、上記の
構成試薬の他に、標準抗原、血漿または緩衝液、溶解
液、洗浄液、反応停止液などがキット中に含まれること
は自由である。本発明のＰＣＰ測定用試薬キットにおい
て、抗ＰＣＰ抗体は、予め上記の固相に固定化された形
態だけでなく、用時に固相に固定化できる形態をも包含
するものである。
は、固相に固定化されていてもよい抗ＰＣＰ抗体と、本
発明の緩衝剤または緩衝液と、抗ＰＣＰ抗体と反応し得
る酵素標識ＰＣＰと、酵素標識ＰＣＰの酵素活性を測定
するための基質とを少なくとも含むものであり、上記の
構成試薬の他に、標準抗原、血漿または緩衝液、溶解
液、洗浄液、反応停止液などがキット中に含まれること
は自由である。本発明のＰＣＰ測定用試薬キットにおい
て、抗ＰＣＰ抗体は、予め上記の固相に固定化された形
態だけでなく、用時に固相に固定化できる形態をも包含
するものである。
【００３９】本発明のＰＣＰ測定用試薬キットは、上記
の構成試薬の混合体、または各構成試薬の集合体とする
ことができる。混合試薬または各構成試薬は、常法に従
って、賦形剤とともに反応溶液中で所定の濃度になるよ
うに、精製水、緩衝剤などに溶解された剤形の、そのま
ま直接、測定に供し得る形態、あるいは使用時に適時、
所望の濃度に希釈し得る濃厚液の形態、さらには、凍結
乾燥品の形態とすることができる。また、各構成試薬
は、同一の形または別の形態とすることができる。
の構成試薬の混合体、または各構成試薬の集合体とする
ことができる。混合試薬または各構成試薬は、常法に従
って、賦形剤とともに反応溶液中で所定の濃度になるよ
うに、精製水、緩衝剤などに溶解された剤形の、そのま
ま直接、測定に供し得る形態、あるいは使用時に適時、
所望の濃度に希釈し得る濃厚液の形態、さらには、凍結
乾燥品の形態とすることができる。また、各構成試薬
は、同一の形または別の形態とすることができる。
【００４０】
【作用】本発明のＰＣＰの測定方法によれば、キレート
剤が反応溶液中に存在することによって、検体中のＰＣ
の影響はほとんど受けないか、あるいは非常に僅かにな
るので、特別な方法による検体処理を特に必要とするこ
となくＰＣＰの測定が可能となり、日常検査を容易に行
うことができる。また、ＰＣＰ１０ｐＭ程度までの高い
測定感度が得られ、実際の臨床検査分野でＰＣＰ測定が
可能となる。
剤が反応溶液中に存在することによって、検体中のＰＣ
の影響はほとんど受けないか、あるいは非常に僅かにな
るので、特別な方法による検体処理を特に必要とするこ
となくＰＣＰの測定が可能となり、日常検査を容易に行
うことができる。また、ＰＣＰ１０ｐＭ程度までの高い
測定感度が得られ、実際の臨床検査分野でＰＣＰ測定が
可能となる。
【００４１】
【実施例】以下、実施例および参考例を挙げて本発明を
さらに詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定す
るものではない。
さらに詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定す
るものではない。
【００４２】参考例１ ＰＣＰ−ＢＳＡの調製 ＰＣＰ〔（株）東レリサーチセンターに合成依頼〕７．
９ｍｇとＢＳＡ４０ｍｇに０．０１Ｍのリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）を４ｍｌ加えて溶解し、室温で攪
拌しながら、０．０２１Ｍのグルタールアルデヒド溶液
２ｍｌを徐々に滴下して、３０分間反応を行わせた後、
０．０１Ｍのバルビタールを含む生理的食塩水に対して
３回透析を行い、ＰＣＰ−ＢＳＡを得た。
９ｍｇとＢＳＡ４０ｍｇに０．０１Ｍのリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）を４ｍｌ加えて溶解し、室温で攪
拌しながら、０．０２１Ｍのグルタールアルデヒド溶液
２ｍｌを徐々に滴下して、３０分間反応を行わせた後、
０．０１Ｍのバルビタールを含む生理的食塩水に対して
３回透析を行い、ＰＣＰ−ＢＳＡを得た。
【００４３】参考例２ 抗ＰＣＰ抗体の調製 ＰＣＰ−ＢＳＡ２００μｇを同容量のフロイント完全ア
ジュバントとともに２週間の間隔で４回家兎の皮下に投
与し、さらに追加投与を行い、計６回投与後、全血３２
ｍｌを採血し、血清１８ｍｌを得た。血清１８ｍｌにＢ
ＳＡ（終濃度２％）を添加し、４℃で一晩放置後、３０
００回転で１５分間遠心分離を行い、上清を採取した。
上清採取液に、硫酸アンモニウム粉末を加えて４０％飽
和とし、１時間攪拌後、３０００回転で３０分間遠心分
離を行い、沈澱を採取した。
ジュバントとともに２週間の間隔で４回家兎の皮下に投
与し、さらに追加投与を行い、計６回投与後、全血３２
ｍｌを採血し、血清１８ｍｌを得た。血清１８ｍｌにＢ
ＳＡ（終濃度２％）を添加し、４℃で一晩放置後、３０
００回転で１５分間遠心分離を行い、上清を採取した。
上清採取液に、硫酸アンモニウム粉末を加えて４０％飽
和とし、１時間攪拌後、３０００回転で３０分間遠心分
離を行い、沈澱を採取した。
【００４４】沈澱に０．０３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０、０．９％ＮａＣｌを含む）１７ｍｌを加えて溶
解し、同緩衝液に対して３回透析を行った。透析後、
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）を１：１の容量
で抗体に加え、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）
で平衡化したプロテインＡ−アガロース（RepliGen社
製：米国）カラムに付して、抗体をカラムに結合させた
後、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出し
た。その溶出液１容に対し、０．４Ｍのリン酸水素二ナ
トリウムを２容添加してｐＨ７．０とした後、セントリ
プレップ−１０（アミコン社製：米国）を用いて、遠心
分離によって濃縮し、抗ＰＣＰ抗体画分を約５ｍｌ得
た。
７．０、０．９％ＮａＣｌを含む）１７ｍｌを加えて溶
解し、同緩衝液に対して３回透析を行った。透析後、
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）を１：１の容量
で抗体に加え、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）
で平衡化したプロテインＡ−アガロース（RepliGen社
製：米国）カラムに付して、抗体をカラムに結合させた
後、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出し
た。その溶出液１容に対し、０．４Ｍのリン酸水素二ナ
トリウムを２容添加してｐＨ７．０とした後、セントリ
プレップ−１０（アミコン社製：米国）を用いて、遠心
分離によって濃縮し、抗ＰＣＰ抗体画分を約５ｍｌ得
た。
【００４５】参考例３ ＰＣＰ(cys）−ＰＯＤの作製 ペルオキシダーゼ（市販品を購入、西洋ワサビ由来）４
８ｍｇを０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．５
ｍｌに溶解し、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト２１ｍｇ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド０．２ｍ
ｌに溶解する）を添加し３０℃で１時間攪拌した後、３
０００回転、１０分間遠心分離を行った。上清を採取
し、０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラムに付し、吸光度４０３ｎｍ
でモニターし、ＰＯＤとしての画分を集め、セントリプ
レップ−１０を用いて遠心分離によって濃縮し、マレイ
ミド化ＰＯＤを約１ｍｌ得た。
８ｍｇを０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．５
ｍｌに溶解し、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト２１ｍｇ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド０．２ｍ
ｌに溶解する）を添加し３０℃で１時間攪拌した後、３
０００回転、１０分間遠心分離を行った。上清を採取
し、０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラムに付し、吸光度４０３ｎｍ
でモニターし、ＰＯＤとしての画分を集め、セントリプ
レップ−１０を用いて遠心分離によって濃縮し、マレイ
ミド化ＰＯＤを約１ｍｌ得た。
【００４６】ＰＣＰ(cys）〔アミノ末端にシステイン基
を挿入したＰＣＰ、（株）東レリサーチセンターに合成
依頼〕１．０ｍｇを０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０、１ｍＭのＥＤＴＡを含む）０．１ｍｌに溶解し、先
に調製したマレイミド化ＰＯＤと混合し、４℃で一晩放
置した。システイン１００ｍｇ／ｍｌを含む０．１Ｍの
リン酸緩衝液ｐＨ６．５、１ｍｌを添加した後、０．１
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したセファデ
ックスＧ−２５カラムに付し、吸光度４０３ｎｍでモニ
ターし、ＰＯＤとしての画分を集め、セントリプレップ
−１０を用いて濃縮し、ＰＣＰ(cys）−ＰＯＤを約１．
８ｍｌ得た。
を挿入したＰＣＰ、（株）東レリサーチセンターに合成
依頼〕１．０ｍｇを０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０、１ｍＭのＥＤＴＡを含む）０．１ｍｌに溶解し、先
に調製したマレイミド化ＰＯＤと混合し、４℃で一晩放
置した。システイン１００ｍｇ／ｍｌを含む０．１Ｍの
リン酸緩衝液ｐＨ６．５、１ｍｌを添加した後、０．１
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したセファデ
ックスＧ−２５カラムに付し、吸光度４０３ｎｍでモニ
ターし、ＰＯＤとしての画分を集め、セントリプレップ
−１０を用いて濃縮し、ＰＣＰ(cys）−ＰＯＤを約１．
８ｍｌ得た。
【００４７】参考例４ 抗ＰＣＰ抗体結合固相の作製 参考例２で得られた抗ＰＣＰ抗体を０．０５Ｍの酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）で５００倍希釈し、９６ウェルマイ
クロプレート（Avid plate, BioProbe International社
製：米国）に１ウェルにつき５０μｌずつ分注し、室温
で３０分間放置後、同一緩衝液で溶解した５ｍＭのメタ
過ヨウ素酸ナトリウムを５０μｌずつ分注し、さらに室
温で６０分間放置した。生理食塩水で５回洗浄後、１．
０％ＢＳＡおよび０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ
のＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌを注入し
て２時間放置し、生理食塩水で５回洗浄して、抗ＰＣＰ
抗体結合固相を作製した。
衝液（ｐＨ５．０）で５００倍希釈し、９６ウェルマイ
クロプレート（Avid plate, BioProbe International社
製：米国）に１ウェルにつき５０μｌずつ分注し、室温
で３０分間放置後、同一緩衝液で溶解した５ｍＭのメタ
過ヨウ素酸ナトリウムを５０μｌずつ分注し、さらに室
温で６０分間放置した。生理食塩水で５回洗浄後、１．
０％ＢＳＡおよび０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ
のＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌを注入し
て２時間放置し、生理食塩水で５回洗浄して、抗ＰＣＰ
抗体結合固相を作製した。
【００４８】参考例５ 検量線用検体の作製 血漿からＰＣを除く目的で硫酸バリウム吸着処理を行っ
た。その方法は、ヒト正常血漿（クエン酸採血：日本生
物材料センターより購入）１００ｍｌに対して硫酸バリ
ウム２５ｇを添加し、室温で３０分間攪拌した後、３０
００回転、１０分間の遠心分離を行って、上清を回収す
る。得られた上清に対して再度同じ操作を繰り返し、上
清（以下「バリウム吸着処理血漿」という。）を得た。
バリウム吸着処理血漿にＰＣＰを終濃度０、１０、３
０、１００、３００、１０００ｐｇ／ｍｌとなるように
添加し、これらを検量線用検体とした。
た。その方法は、ヒト正常血漿（クエン酸採血：日本生
物材料センターより購入）１００ｍｌに対して硫酸バリ
ウム２５ｇを添加し、室温で３０分間攪拌した後、３０
００回転、１０分間の遠心分離を行って、上清を回収す
る。得られた上清に対して再度同じ操作を繰り返し、上
清（以下「バリウム吸着処理血漿」という。）を得た。
バリウム吸着処理血漿にＰＣＰを終濃度０、１０、３
０、１００、３００、１０００ｐｇ／ｍｌとなるように
添加し、これらを検量線用検体とした。
【００４９】実施例１ ＰＣＰ測定の検量線の作製 抗ＰＣＰ抗体結合固相に１ウェルあたり検量線用検体を
５０μｌずつ分注し、続いて１．０％ノニオンＥ−２１
５および２０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１ＭのＭＥＳ−
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を１ウェルあたり５０μ
ｌずつ分注し、ミクロミキサー〔三光純薬（株）製〕を
用いて室温で２時間攪拌した後、０．２％ブロックエー
ス〔雪印乳業（株）製〕を含む０．１５Ｍのグリシン緩
衝液（ｐＨ８．０）で５０，０００倍に希釈したＰＣＰ
(cys）−ＰＯＤを１ウェルあたり５０μｌずつ分注し、
さらに３０分間攪拌した。
５０μｌずつ分注し、続いて１．０％ノニオンＥ−２１
５および２０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１ＭのＭＥＳ−
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を１ウェルあたり５０μ
ｌずつ分注し、ミクロミキサー〔三光純薬（株）製〕を
用いて室温で２時間攪拌した後、０．２％ブロックエー
ス〔雪印乳業（株）製〕を含む０．１５Ｍのグリシン緩
衝液（ｐＨ８．０）で５０，０００倍に希釈したＰＣＰ
(cys）−ＰＯＤを１ウェルあたり５０μｌずつ分注し、
さらに３０分間攪拌した。
【００５０】ウェルを生理的食塩水で５回洗浄した後、
０．５７ｍＭのＴＭＢＺおよび０．０２５％過酸化水素
を含む５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１００μｌ
を各ウェルに添加し、室温で３０分間放置した。２Ｎ硫
酸５０μｌを各ウェルに添加して反応を停止させ、マイ
クロプレートリーダーＴＨＥＲＭＯ ｍａｘ〔和光純薬
工業（株）製〕を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し
た。その結果をＰＣＰ量に対する吸光度として、図１に
示す。
０．５７ｍＭのＴＭＢＺおよび０．０２５％過酸化水素
を含む５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１００μｌ
を各ウェルに添加し、室温で３０分間放置した。２Ｎ硫
酸５０μｌを各ウェルに添加して反応を停止させ、マイ
クロプレートリーダーＴＨＥＲＭＯ ｍａｘ〔和光純薬
工業（株）製〕を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し
た。その結果をＰＣＰ量に対する吸光度として、図１に
示す。
【００５１】図１の検量線から明らかなように、ＰＣＰ
の１０〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲内でＰＣＰ濃度依存
的な吸光度変化が認められ、１０ｐＭ（１４ｐｇ／ｍ
ｌ）程度までの高い測定感度が得られることが実証され
た。
の１０〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲内でＰＣＰ濃度依存
的な吸光度変化が認められ、１０ｐＭ（１４ｐｇ／ｍ
ｌ）程度までの高い測定感度が得られることが実証され
た。
【００５２】実施例２ ＰＣとの交差反応性 １）抗ＰＣＰ抗体結合固相に１ウェルあたり市販の正常
管理血漿カリプラズマIndex-100（登録商標、フランス
国、ビオメリュー社製）、ヒト正常血漿、および検量線
用検体を５０μｌずつ分注し、続いて、０〜５０ｍＭの
キレート剤（反応液中では１／２濃度）および１．０％
ノニオンＥ−２１５を含む０．１ＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓ
緩衝液（ｐＨ６．０）を１ウェルあたり５０μｌずつ分
注し、実施例１と同様にＰＣＰの測定を行った。検量線
用検体から、実施例１と同様に検量線を作成し、各検体
の吸光度から測定されるＰＣＰ量を求め、キレート剤を
用いた場合の効果を調べた。その結果を表１に示す。な
お、表１に記載の添加濃度は、緩衝液中における濃度を
示す。
管理血漿カリプラズマIndex-100（登録商標、フランス
国、ビオメリュー社製）、ヒト正常血漿、および検量線
用検体を５０μｌずつ分注し、続いて、０〜５０ｍＭの
キレート剤（反応液中では１／２濃度）および１．０％
ノニオンＥ−２１５を含む０．１ＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓ
緩衝液（ｐＨ６．０）を１ウェルあたり５０μｌずつ分
注し、実施例１と同様にＰＣＰの測定を行った。検量線
用検体から、実施例１と同様に検量線を作成し、各検体
の吸光度から測定されるＰＣＰ量を求め、キレート剤を
用いた場合の効果を調べた。その結果を表１に示す。な
お、表１に記載の添加濃度は、緩衝液中における濃度を
示す。
【００５３】
【表１】
【００５４】キレート剤の添加によりＰＣとの交差性
は、ヒト正常血漿においては、コントロール（無添加）
の１／３〜１／５に軽減され、正常域といわれるＰＣＰ
濃度であった。市販の正常管理血漿カリプラズマ Index
-100においては、検出されない程度に抑制された。
は、ヒト正常血漿においては、コントロール（無添加）
の１／３〜１／５に軽減され、正常域といわれるＰＣＰ
濃度であった。市販の正常管理血漿カリプラズマ Index
-100においては、検出されない程度に抑制された。
【００５５】２）上記１）と同様の方法により、検体血
漿を用いて、ＥＤＴＡの濃度の効果をより詳細に調べ
た。その結果を表２に示す。なお、表１と同様に、表２
に記載の添加濃度は、緩衝液中における濃度を示す。
漿を用いて、ＥＤＴＡの濃度の効果をより詳細に調べ
た。その結果を表２に示す。なお、表１と同様に、表２
に記載の添加濃度は、緩衝液中における濃度を示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】添加濃度として１ｍＭのＥＤＴＡでは効果
は認められなく、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭと濃度が増
すにつれ、ＰＣＰとして測定される値が小さくなった。
検体中の真のＰＣＰ量としては不明であるが、ＰＣの影
響が少なくなったと判断される。
は認められなく、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭと濃度が増
すにつれ、ＰＣＰとして測定される値が小さくなった。
検体中の真のＰＣＰ量としては不明であるが、ＰＣの影
響が少なくなったと判断される。
【００５８】３）上記１）と同様の方法により、血漿検
体と、参考例５の方法により同検体を硫酸バリウム処理
してＰＣを除いたものとをそれぞれ試料として、ＥＤＴ
Ａ添加濃度０ｍＭと１０ｍＭ（反応液中では５ｍＭ）で
測定し、その値を比較した。
体と、参考例５の方法により同検体を硫酸バリウム処理
してＰＣを除いたものとをそれぞれ試料として、ＥＤＴ
Ａ添加濃度０ｍＭと１０ｍＭ（反応液中では５ｍＭ）で
測定し、その値を比較した。
【００５９】その結果、ＥＤＴＡ無添加では、元の検体
４６ｐｇ／ｍｌに対し、硫酸バリウム処理検体１７ｐｇ
／ｍｌであった。ＥＤＴＡ１０ｍＭ添加では、元の検体
１３ｐｇ／ｍｌ、硫酸バリウム処理検体１５ｐｇ／ｍｌ
であった。測定のバラツキを考慮すると、検体中の真の
ＰＣＰの値は約１５ｐｇ／ｍｌであると考えられ、ＥＤ
ＴＡ添加によって、効果的にＰＣの影響を回避できたと
判断された。
４６ｐｇ／ｍｌに対し、硫酸バリウム処理検体１７ｐｇ
／ｍｌであった。ＥＤＴＡ１０ｍＭ添加では、元の検体
１３ｐｇ／ｍｌ、硫酸バリウム処理検体１５ｐｇ／ｍｌ
であった。測定のバラツキを考慮すると、検体中の真の
ＰＣＰの値は約１５ｐｇ／ｍｌであると考えられ、ＥＤ
ＴＡ添加によって、効果的にＰＣの影響を回避できたと
判断された。
【００６０】以上の結果から、固相結合抗ＰＣＰ抗体と
検体中のＰＣＰとの反応時に、キレート剤を存在させる
ことによって、ＰＣの影響をほとんど受けないか、ある
いは軽減できることが実証された。したがって、本発明
のＰＣＰの測定方法によって、ＰＣの影響は皆無か、ま
たは非常に僅かであるので、検体として、前処理をしな
いで血漿をそのまま用いることが可能となる。検体の前
処理を特に必要としないということによって、ＰＣＰの
測定が非常に簡便となり、日常検査を容易に行えるよう
になる。
検体中のＰＣＰとの反応時に、キレート剤を存在させる
ことによって、ＰＣの影響をほとんど受けないか、ある
いは軽減できることが実証された。したがって、本発明
のＰＣＰの測定方法によって、ＰＣの影響は皆無か、ま
たは非常に僅かであるので、検体として、前処理をしな
いで血漿をそのまま用いることが可能となる。検体の前
処理を特に必要としないということによって、ＰＣＰの
測定が非常に簡便となり、日常検査を容易に行えるよう
になる。
【００６１】実施例３ 塩化ナトリウム ８．０ｇ 塩化カリウム ０．２ｇ リン酸水素二ナトリウム・１２水 ２．９ｇ リン酸二水素カリウム ０．２ｇ ＥＤＴＡ ５．８ｇ ＰＥＧ−６０００ １０．０ｇ 上記の試薬を配合して、ＰＣＰ測定用緩衝剤を得た。
【００６２】実施例４ 実施例３の緩衝剤を１Ｌの精製水に溶解して、ＰＣＰ測
定用緩衝液（ｐＨ７．２）を得た。
定用緩衝液（ｐＨ７．２）を得た。
【００６３】実施例５ ２１．３ｇのＭＥＳ、７．４ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム
（２水和物）および１０．０ｇのノニオンＥ−２１５を
約７００ｍｌの精製水に攪拌、溶解し、０．５Ｍのトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液（６０．６ｇ
／Ｌ）を適量添加、混合して、ｐＨメータにてｐＨ６．
０に調整した。その混合溶液に精製水を添加して、１Ｌ
のＰＣＰ測定用緩衝液を得た。
（２水和物）および１０．０ｇのノニオンＥ−２１５を
約７００ｍｌの精製水に攪拌、溶解し、０．５Ｍのトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液（６０．６ｇ
／Ｌ）を適量添加、混合して、ｐＨメータにてｐＨ６．
０に調整した。その混合溶液に精製水を添加して、１Ｌ
のＰＣＰ測定用緩衝液を得た。
【００６４】実施例６ 参考例２と同様の方法によって得られた抗ＰＣＰ抗体
（約１ｍｌ）、実施例３の緩衝剤、参考例３と同様の方
法によって得られたＰＣＰ(cys）−ＰＯＤ（約０．１ｍ
ｌ）、０．５７ｍＭのＴＭＢＺおよび０．０２５％過酸
化水素を含む５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５、約１
Ｌ）をそれぞれ密封して、ＰＣＰ測定用試薬キットを得
た。
（約１ｍｌ）、実施例３の緩衝剤、参考例３と同様の方
法によって得られたＰＣＰ(cys）−ＰＯＤ（約０．１ｍ
ｌ）、０．５７ｍＭのＴＭＢＺおよび０．０２５％過酸
化水素を含む５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５、約１
Ｌ）をそれぞれ密封して、ＰＣＰ測定用試薬キットを得
た。
【００６５】
【発明の効果】本発明のＰＣＰの測定方法によれば、検
体中のＰＣの影響はほとんど受けないか、あるいは非常
に僅かになるので、特別な方法による検体処理を特に必
要とせず、すなわち検体の前処理をしないで血漿をその
まま用いることが可能となる。したがって、ＰＣＰの測
定が非常に簡便となり、経済的負担が低減する。また、
ＰＣＰ１０ｐＭ程度までの高い測定感度が得られ、実際
の臨床検査分野でＰＣＰ測定が可能となる。
体中のＰＣの影響はほとんど受けないか、あるいは非常
に僅かになるので、特別な方法による検体処理を特に必
要とせず、すなわち検体の前処理をしないで血漿をその
まま用いることが可能となる。したがって、ＰＣＰの測
定が非常に簡便となり、経済的負担が低減する。また、
ＰＣＰ１０ｐＭ程度までの高い測定感度が得られ、実際
の臨床検査分野でＰＣＰ測定が可能となる。
【００６６】本発明の緩衝剤または緩衝液によれば、検
体と混合することによって、検体中のＰＣと用いる抗体
との交差反応を完全に、またはほとんど回避させるの
で、特別な方法による検体処理が不要となる。したがっ
て、例えば予めフィルターを用いて検体をＰＣとＰＣＰ
とに分離する操作が不要となり、検体の前処理をしない
で血漿をそのまま用いることが可能となるので、操作が
簡易となり、経済的負担が低減される。
体と混合することによって、検体中のＰＣと用いる抗体
との交差反応を完全に、またはほとんど回避させるの
で、特別な方法による検体処理が不要となる。したがっ
て、例えば予めフィルターを用いて検体をＰＣとＰＣＰ
とに分離する操作が不要となり、検体の前処理をしない
で血漿をそのまま用いることが可能となるので、操作が
簡易となり、経済的負担が低減される。
【００６７】本発明のＰＣＰ測定用試薬キットによれ
ば、本発明のＰＣＰの測定方法を実施するために必要不
可欠な試薬を少なくとも含んでいるので、本発明方法に
よる上記の効果を奏する。
ば、本発明のＰＣＰの測定方法を実施するために必要不
可欠な試薬を少なくとも含んでいるので、本発明方法に
よる上記の効果を奏する。
【図１】４５０ｎｍの吸光度とＰＣＰ量との相関関係を
示す検量線である。
示す検量線である。
Claims (3)
- 【請求項１】 少なくとも以下のａ〜ｄの工程を順次行
うことを特徴とするヒトプロテインＣ活性化ペプチド
（ＰＣＰ）の測定方法。 ａ）固相に固定化された抗ＰＣＰ抗体と検体中のＰＣＰ
とを、キレート剤の存在下で反応させる工程。 ｂ）未反応の抗ＰＣＰ抗体と酵素標識ＰＣＰとを反応さ
せる工程。 ｃ）未反応の酵素標識ＰＣＰを分離する工程。 ｄ）抗ＰＣＰ抗体に結合した酵素標識ＰＣＰの酵素活性
を測定する工程。 - 【請求項２】 抗ヒトプロテインＣ活性化ペプチド（Ｐ
ＣＰ）抗体と検体中のＰＣＰとを反応させる際に用いら
れ、キレート剤を含有することを特徴とする緩衝剤また
は緩衝液。 - 【請求項３】 固相に固定化されていてもよい抗ヒトプ
ロテインＣ活性化ペプチド（ＰＣＰ）抗体と、請求項２
記載の緩衝剤または緩衝液と、抗ＰＣＰ抗体と反応し得
る酵素標識ＰＣＰと、酵素標識ＰＣＰの酵素活性を測定
するための基質とを少なくとも含むことを特徴とするＰ
ＣＰ測定用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29320593A JPH07146292A (ja) | 1993-11-24 | 1993-11-24 | ヒトプロテインｃ活性化ペプチドの測定方法および該測定用試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29320593A JPH07146292A (ja) | 1993-11-24 | 1993-11-24 | ヒトプロテインｃ活性化ペプチドの測定方法および該測定用試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07146292A true JPH07146292A (ja) | 1995-06-06 |
Family
ID=17791788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29320593A Withdrawn JPH07146292A (ja) | 1993-11-24 | 1993-11-24 | ヒトプロテインｃ活性化ペプチドの測定方法および該測定用試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07146292A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112485443A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-03-12 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒 |
-
1993
- 1993-11-24 JP JP29320593A patent/JPH07146292A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112485443A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-03-12 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20010130 |