CZ103698A3

CZ103698A3 - Nová protilátka, renin-aktivní substance tuto protilátku obsahující, a použití této protilátky jako reakčního činidla k testování proreninu

Info

Publication number: CZ103698A3
Application number: CZ981036A
Authority: CZ
Inventors: Yuichi Ishida; Kazuo Murakami; Yukio Nakamura; Fumiaki Suzuki; Yasuhiko Hatano
Original assignee: Tokiwa Chemical Industries Co., Ltd.; Yuichi Ishida
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 1998-10-14
Also published as: PL325735A1; DE69800080D1; JPH10279600A; ATE189897T1; KR19980081116A; ES2144328T3; HU9800782D0; CA2234204C; KR100457445B1; AU5971598A; EP0873999B1; JP3271157B2; TW381179B; HUP9800782A2; DE69800080T2; ID20535A; AR011214A1; CN1195667A; RU2198894C2; CA2234204A1

Description

Předkládaný vynález se týká nové protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z profragmentu (dále jen pf) lidského proreninu, která je schopna v kombinaci s lidským proreninem vytvářet imunitní komplex, renin-aktivní substance, která vznikne kombinací této protilátky s lidským proreninem, a použití této protilátky jako reakčního činidla ke stanovování proreninu.

Dosavadní stav techniky

Prorenin je látka bez enzymové aktivity, která se tvoří hlavně v ledvinách jako prekursor reninu kompletně konvertovaného typu, a to jako renin kompletně konvertovaného typu kombinovaný s pf sestávajícím z reziduí 43 aminokyselin. Je známo, že při poškození cév, jehož příčinou je diabetes, se zvyšuje koncentrace lidského proreninu v krvi v závislosti na závažnosti postižení, zatímco při zmírňování postižení se koncentrace snižuje. V tomto smyslu se navrhuje považovat koncentraci lidského proreninu v krvi za ukazatele cévního postižení při diabetů (viz The New England Journal of Medicine, roč. 312, 1985, str. 1412-1417, Memoirs of Tokyo Womens Medical

College, roč. 60, 1990, str. 342-350 a Clinical Investigator, roč. 71, 1993, str.3-6).

V této souvislosti bylo předloženo několik návrhů ke stanovování koncentrace proreninu v lidské plazmě. Metody vyplývající ze známého stavu techniky jsou však problematické, protože lidská plazma obsahuje jak renin kompletně konvertovaného typu, jakožto enzymatický protein, tak i enzymaticky neaktivní lidský prorenin jakožto prekursor reninu kompletně konvertovaného typu. Je tedy nutno použít nepřímou metodu, při níž je lidský prorenin v plazmě nejdříve při nízké teplotě částečně aktivován kyselinou, pak je konvertován na renin kompletně konvertovaného typu při použití trypsinu, s následným stanovením celkového množství reninu enzymatickou metodou jako celkové množství reninové aktivity, nebo imunologickou metodou jako celkové množství aktivního reninu, přičemž množství lidského proreninu se vypočítá jako rozdíl získaný odečtením separátně získané hodnoty reninové aktivity enzymatickou metodou, nebo množství aktivního reninu imunologickou metodou od výše stanovené hodnoty celkové reninové aktivity nebo celkového množství aktivního reninu.

Zde zmiňovaný renin kompletně konvertovaného typu je struktura, odvozená od proreninu oddělením profragmentární části pomocí enzymu, která může vykazovat reninovou aktivitu, protože enzymaticky aktivní část je otevřená. Výše uvedená reninová aktivita je enzymatickou aktivitou, která je vlastní reninu kompletně konvertovaného typu, jakožto proteinu enzymu, a to aktivitou k produkci angiotensinu (dále Ang I) selektivním působením na reninový substrát (angiotensinogen).

Nedávno bylo objeveno, jak konvertovat neaktivní lidský prorenin na strukturu otevřeného typu s využitím účinku jeho navázání na nízkomolekulární inhibitor reninu; tento objev umožnil vypracovat imunologickou metodu ke stanovení celkové aktivity reninu s využitím monoklonální protilátky, která je schopna specificky rozpoznat blízkost renin-aktivní části, a monoklonální protilátky, která je schopna rozpoznat jak lidský prorenin, tak i renin kompletně konvertovaného typu, a také rozvinout metodu ke stanovení aktivního reninu bez přidání inhibitoru reninu pro výpočet množství lidského reninu z rozdílu mezi celkovým aktivním reninem a takto určeným aktivním reninem (viz Clinical Chemistry, roč. 42, 1996, str. 10511053). Tato metoda je ve srovnání se známou trypsin-aktivační enzymatickou metodou neboli metodou aktivace trypsinem ke stanovení aktivity reninu výhodná vzhledem k možnosti potlačit přechodný, trypsinem způsobený rozklad lidského proreninu a reninu kompletně konvertovaného typu, jakož i tím, že s metodou aktivace trypsinem dobře koreluje, avšak vadou této metody je, že reninová aktivita, touto metodou zjištěná, vykazuje pozitivní zkreslení ve srovnání se skutečnou reninovou aktivitou u diabetiků, kdy je pozorován zvýšený titr proreninu v krvi. Tato metoda je navíc pracná, protože pokaždé musí být zvlášť stanovována reninová aktivita a celková reninová aktivita.

Kromě toho je známa imunologická testovací metoda, která je metodou přímou, využívající monoklonální protilátku schopnou rozpoznat C-terminální konec pf lidského proreninu, což jsou

29. až 43. rezidua aminokyselin, jako antigen, a reninovou monoklonální protilátku, schopnou rozpoznat jak monoklonální • · konvertovaného typu (viz and Metabolism, roč. 75, protilátku, tak i renin kompletně Journal of Clinical Endocrinology 1992, str. 617-623).

Tato metoda je výhodná, protože - kromě velmi dobré korelace s metodou aktivace trypsinem - je tak vysoce citlivá, že jí lze použít dokonce i ke stanovení titru proreninu v krvi odebrané zdravé osobě. Na druhé straně, nevýhodou metody je skutečnost, že testem získané hodnoty trendují k negativnímu zkreslení, takže zjištěné hodnoty vykazují pouhých 80 % ve srovnání s hodnotami získanými metodou aktivace trypsinem, přičemž tento trend je obzvláště zřetelný u pacientů se zvýšeným titrem lidského proreninu, a k tomu přistupuje nevýhoda, že část, kde je rozpoznávána reninová monoklonální protilátka, je neurčitelná.

Ea.dst.aLa yynáLezu

Vynález si klade za cíl odstranit nevýhody metody aktivace trypsinem, a poskytnout nepřímou metodu stanovení lidského proreninu pomocí stanovení aktivované celkové reninové aktivity s využitím inhibitoru reninu a známého přímého imunologického testu, při němž se používá protilátka, která je schopna rozpoznat C-terminální konec pf lidského proreninu jako antigen, a reakční činidlo pro stanovení proreninu, které je schopno přesně a výhodně detekovat výskyt diabetické cévní poruchy.

Vynález tedy poskytuje protilátku peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu, která je schopna specificky rozpoznat jako antigen jakýkoliv peptid, včetně · 9 9

9 9 9

9 99 • ·

9 9

reziduí aminokyselin od rezidua leucinu na 1. místě až po reziduum argininu na 15. místě peptidu s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu.

Vynález dále poskytuje novou renin-aktivní substanci, která je komplexem lidského proreninu s výše zmíněným peptidem s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu. Protilátka peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu může být použita jako účinná složka reakčního činidla ke stanovování proreninu.

Popis-obrázku

Obr. 1 je graf, znázorňující vztah koncentrace IgG a množství lidského proreninu při reakci lidského proreninu s IgG protilátkou peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf.

Obr. 2 je graf, znázorňující inhibiční aktivitu protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf při reakci lidského proreninu s protilátkou peptidového charakteru s Nterminálním koncem z pf.

Obr. 3 je graf, znázorňující, jak aktivační kapacita komplexu mezi proreninem a IgG protilátkou peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf závisí na dávce.

Obr. 4 je graf, znázorňující vztah mezi proreninkombinační schopností IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf a frakcemi eluátu při gelové filtrační chromatografií.

φ « φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

Obr. 5 je komparativní graf odhadu molekulární hmotnosti proreninu a protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf.

Obr. 6 je graf korelace metody aktivace trypsinem a metody, používající reakčního činidla podle vynálezu.

Obr. 7 je graf, znázorňující vztah mezi koncentrace proreninu a produkce Ang I.

Obr. 8 je graf, znázorňující enzymatickou aktivitu reakčního činidla podle vynálezu vůči třem druhům lidského proreninu jako funkci koncentrace.

Popis výhodného provedení

Vynálezci již dříve vyvinuli reakční činidlo ke stanovení lidského proreninu využívající protilátku schopnou specificky rozpoznávat pf část lidského proreninu, sestávající ze 43 reziduí aminokyselin (viz Kokai, JP Patent 8-285852). Dalším výzkumem byla získána vysoce afinitní protilátka, která je schopná specificky rozpoznat peptid, sestávající z reziduí aminokyselin 1 až 15 na N-terminálu pf lidského proreninu, jako antigen. Také bylo zjištěno, že kombinací této protilátky s Nterminálním koncem z pf a lidského proreninu vzniká reninaktivní substance, která při aplikaci imunologické metody ke stanovení Ang 1 kompetitivního enzymu umožňuje přesné stanovení titru proreninu v krvi (viz Clinical and Experimental Hypertension - Theory and Practice, roč. A12, 1990, str. 8395), a tato zjištění vedla k předkládanému vynálezu.

• · ···· · w · ·«·· ···· ·· ·· ·· ··

Protilátku peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu podle vynálezu lze připravit například následujícím způsobem:

Peptid, který sestává z reziduí aminokyselin leu-pro-thrasp-thr-thr-thr-phe-lys-arg-ile-phe-leu-lys-arg, a který odpovídá peptidu s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu, je nejprve syntetizován metodou syntézy v pevné fázi, a takto syntetizovaný peptid se pomocí zesíťujícího činidla, jako je maleinimidová sloučenina, kombinuje s nosným proteinem, jako je albumin kravského séra, ovalbumin a keyhole lympet hemokyanin, za vzniku imunoantigenu.

Dále se imunoantigen dokonale promísí s Freundovým úplným adjuvans a výslednou látkou se provede imunizace dospělého králíka o hmotnosti cca 2,5 kg. Tato imunizační léčba se opakuje každé dva týdny, a po páté kúře se odebere malé množství krve z žíly na okraji ušního boltce, v níž se stanoví titr protilátky. Je-li titr protilátky dostatečně zvýšen, odebere se králíkovi plná krev, a z krve se získá antisérum. Z tohoto antiséra se chromatografií v koloně s náplní DEAE Sepharose získá IgG protilátka peptidového charakteru s Nterminálním koncem.

Místo získávání polyklonální protilátky imunizací králíka imunoantigenem lze případně připravit monoklonální protilátku imunizací myši imunoantigenem pomocí stejné metody.

Z optické hustoty IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf při vlnové délce 280 nm a při předpokládané hmotnosti IgG 150 000 bylo vypočteno množství proteinu, přičemž zjištěný titr dosahoval hodnoty 2,6 mg/ml. Tato protilátka peptidového charakteru s N-terminálním koncem ·· z pf je protilátkou, která vykazuje vysokou afinitu vůči lidskému proreninu a působí specificky na N-terminální konec PfLátka vykazující enzymatickou aktivitu, a to zejména reninovou aktivitu, se získá kombinací této protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf a lidského proreninu. Postup pro přípravu této renin-aktivní látky je následovný.

Roztok lidského proreninu se smísí s protilátkou peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf, zředěnou fyziologickým roztokem s obsahem kravského séra, a tato směs se po dobu 16-24 hodin uchovává při teplotě 4° C. Poté se reakční směs smísí s roztokem ovčího angiotensinogenu, jakožto substrátu pro lidský prorenin, a inkubuje se po dobu 15 minut při teplotě 37° C k vyvolání další reakce, která je ukončena zchlazením v ledové lázni.

U takto získané renin-aktivní látky se měří aktivita k produkci Ang I a porovnává se s lidským proreninem, aktivovaným trypsinem; výsledkem je zjištění, že reninová aktivita protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf se mění podle stupně zředění.

Graf na obr. 1 uvádí příklad protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu podle vynálezu, a znázorňuje vztah koncentrace IgG a optické hustoty reakční směsi při vlnové délce 450 nm při reakci protilátky s lidským proreninem. Tento graf naznačuje vysokou afinitu protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu podle vynálezu vůči lidskému proreninu.

• to to • toto • · · ·· ·· to · to • to

Graf na obr. 2 ukazuje vztah koncentrace peptidů po smísení protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu se syntetickým peptidem s Nterminálním koncem z pf a optické hustoty téhož při vlnové délce 450 nm. Tento graf naznačuje, že spojení mezi lidským proreninem a protilátkou peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu je úplně zrušeno syntetickým peptidem s N-terminálním koncem z pf, tedy, že spojení vykazuje specifickou aktivitu vůči lidskému proreninu.

Na obr. č. 3 je sloupcový diagram, který na příkladu komplexů získaných reakcí lidského proreninu s protilátkou peptidového charakteru s N-terminálním konce z pf lidského proreninu ukazuje reninovou aktivitu jako funkci koncentrace danou relativními hodnotami, kdy se reninová aktivita lidského proreninu aktivovaného trypsinem považuje za 100 %. Tento diagram naznačuje, že výše uvedený komplex vykazuje reninovou aktivitu, která závisí na použitém množství IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu.

Komplex IgG protilátky peptidového charakteru s Nterminálním koncem z pf lidského proreninu a lidského proreninu byl následně frakcionován gelovou filtrací na koloně vysoce účinné kapalinové chromatografie (high performance liquid chromatography, HPLC), a u každé frakce se stanovila enzymatická aktivita, přičemž výsledek je graficky znázorněn plnou čarou grafu na obr. 4. Přerušovaná čára tohoto grafu ukazuje výsledek, získaný imunoenzymatickým stanovením lidského proreninu po provedení chromatografie gelovou filtrací, když <?Ε8®Ι

9999

9 99

9999 9999 • ·· · • ·· • ···· • ·· • 99 ···· ·· ·· • 9 99

999

9 99

99 byla použita protilátka peptidového charakteru koncem z pf a enzymem značený protein A.

Graf na obr. 5 znázorňuje vztah mezi molekulárními hmotnostmi a retenčními časy několika známých proteinů, včetně feritinu s molekulární hmotností 450 kD, albuminu kravského séra s molekulární hmotností 67 kD, ovalbuminu s molekulární s N-terminálním hmotností 45 kD a chymotrypsinogenu s molekulární hmotností 25 kD, jak ukazují příslušné vynesené hodnoty A, B, C a D (v tomto pořadí), zatímco retenční časy komplexu mezi lidským proreninem a IgG protilátkou peptidového charakteru s Nterminálním šipkami I a

Z obr.

koncem z pf a lidského proreninu jsou označeny II (v tomto pořadí).

a 5 je zřejmé, že enzymatickou aktivitu komplexu vykazují hlavně frakce s retenčními časy zatímco lidský prorenin je zjišťován při 17,0 minut.

12,0 až 12,5 minut, retenčním čase 16,5 až že enzymatickou

Výše uvedená fakta vedou k závěru, aktivitu vykazuje komplex s molekulární hmotností 200 až 240 kD mezi lidským proreninem s molekulární hmotností 43 až 50 kD a IgG protilátkou peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu s molekulární hmotností 150 kD.

Graf na obr. 6 znázorňuje korelaci mezi titry lidského proreninu, které byly stanoveny s použitím výše uvedeného komplexu, a metodou aktivace trypsinem. Tento graf ukazuje, že zjištěné hodnoty velmi dobře korelují, korelace má hodnotu

Y = 0,986.

Při stanovení lidského proreninu v různých koncentracích s použitím tohoto komplexu jako proreninového reakčního činidla ·· lze pozorovat dobrou lineární korelaci s koncentracemi proreninu v rozmezí 12,5 až 400 ng Ang I/ml.hod.

Je-li ve zředěných roztocích lidského séra s vysokou, střední a nízkou koncentrací lidského proreninu stanovována enzymatická aktivita s použitím výše uvedeného komplexu jako reakčniho činidla, lze pozorovat, jak ukazuje graf na obr. 8, dobrou proporcionalitu produkce Ang I a stupně zředění.

Popsaná stanovení vykazovala dobrou reprodukovatelnost s koeficientem v rozmezí 1,8 až 5,5 % pro souběžný test reprodukovatelnosti při n = 7 pro různé koncentrace, a 3,8 až

7,5 % pro denní test reprodukovatelnosti při n = 5.

Výše uvedené výsledky vedou k závěru, že protilátka peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf lidského proreninu podle předloženého vynálezu vykazuje vysokou afinitu vůči lidskému proreninu spolu se specifickou aktivitou vůči Nterminálnímu konci pf, a že komplex mezi touto protilátkou a lidským proreninem vykazuje enzymatickou aktivitu, která koreluje s koncentrací tak dobře, že lze komplex použít jako reakčni činidlo ke stanovování proreninu.

Předložený vynález je podrobněji vysvětlen pomocí příkladů, které však žádným způsobem neomezují rozsah jeho využití. Nejdříve jsou uvedeny postupy přípravy činidel, která jsou v příkladech po řadě použita. Titrace proreninu byla provedena ve vztahu k aktivitě k produkci Ang 1.

• v	• »	··	··	• ·		··
• ·	• ·	• ·	•	• ·	•	··	•
•	•	• ·	• · ·	• ·
•	•	• · ·	• ·	• ···	•		•
•	•	• ·	• ·	•	•	• ·	•
·*··	*···	• β	• ·	··

(1) Roztok chromogenu:

Roztok byl připraven rozpuštěním tetramethylbenzidinu (dále TMB) v koncentraci 5,5 mM v roztoku acetátového pufru s pH 6,5.

(2) Angiotensinogenní reakční činidlo:

hodin po bilaterální nefrotomii byla ovci odebrána krev, z níž bylo okamžitě separováno sérum, které bylo lyofilizováno. 20 mg takto získaného vysušeného materiálu bylo rozpuštěno v 1 litru 0,2 M fosfátového pufru s pH 6,5, který obsahoval 10 mmol diisopropylfluorfosfátu (DFP) a 10 mmol EDTA,(dále PBS), čímž bylo získáno reakční činidlo.

(3) Vymývací pufrovy roztok:

Roztok byl připraven rozpuštěním povrchově aktivního činidla Tween 20 v koncentraci 0,05 % podle hmotnosti ve fyziologickém roztoku PBS.

(4) Lidské sérum pro ředění:

Komerčně dostupné normální lidské sérum, dodávané společností Nippon Biological Materials Center Co., bylo zpracováno afinitní chromatografií při použití protilátky schopné rozpoznat jak renin kompletně konvertovaný, tak i lidský prorenin, aby adsorbovalo kompletně konvertovaný renin i lidský prorenin, a poté deaktivováno zahřátím na teplotu 56° C po dobu 30 minut.

Krok 1 přípravy

Základní roztok rekombinantního lidského proreninu byl připraven následujícím způsobem. V buňkách vaječníku čínského křečka (Chinese hamster ovary cells, dále CHO) byl podle metody φφφφ · · · · · φ φ • · · · ··· φ · ·· • · φ φ φ φ φ · φφφ · φ • · ΦΦΦΦ ΦΦΦ φφφφ Φ··· ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ

Murakamiho a spol., popsané v Journal of Hypertension, roč. 4, str. S388-S390 (1986), vytvořen vektor exprese, do něhož byla zavedena cDNA lidského proreninu derivovaného z lidské ledviny, který byl kultivován modifikovanou metodou Dulbecco v kultivačním médiu Eagle, obsahujícím 10 % fetálního kravského séra, které bylo po úplném dozrání buněk CHO vyměněno za kultivační médium bez séra, a tím byl získán supernatant kultury, obsahující rekombinantní lidský prorenin.

5ml takto získaného supernatantu kultury CHO bylo dialyzováno proti fyziologickému roztoku PBS s obsahem 5 mM EDTA, s následnou úpravou koncentrace rekombinantního lidského proreninu na hodnotu 200 gg Ang I/ml.hod., aby takto byl získán základní roztok rekombinantního proreninu, který byl uchováván při teplotě 4° C.

Krok 2 přípravy

Enzymaticky značený Ang I byl připraven následujícím způsobem. 1 ml 2,5% roztoku glutaraldehydu byl nakapán za intenzivního třepání do roztoku, který byl připraven rozpuštěním 5 mg křenové peroxidázy v 500 μΐ 0,2 M PBS. Po nakapání roztoku glutaraldehydu se směs dalších 30 minut protřepávala při teplotě 25° C, a poté byla koncentrována do objemu přibližně 100 μΐ při použití membránového filtru (Zaltrius Co.) za současného chlazení v ledové lázni, s následným odstraněním přebytečného množství glutaraldehydu gelovou filtrací, čímž byla získána enzymová frakče.

Tato směs byla dále koncentrována a přimíchána k 130 μΐ roztoku, připraveného rozpuštěním 1 mg syntetického peptidu • · ·· ·

Ang I v 1 ml čisté vody, a inkubována po dobu 2 hodin při teplotě 30° C. Reakce pak byla zastavena přidáním 100 μΐ 0,2 M vodného roztoku lysinu a reakční směs byla znovu koncentrována na objem 100 μΐ; reakcí nespotřebovaný Ang I byl odstraněn gelovou filtrací, čímž byl získán požadovaný roztok enzymaticky značeného Ang I.

Do takto získaného roztoku enzymaticky značeného Ang I byl přimíchán albumin kravského séra (dále BSA) v koncentraci

0,1 %, a tak byl získán základní roztok enzymaticky značeného Ang I, který byl uchováván při teplotě -80° C.

Takto připravený základní roztok byl používán ve 3000násobném zředění v PBS, obsahujícím 0,1 % BSA, 0,1 M chloridu sodného a 0,05 % média Tween 20.

KrQk 3 přípravy

Protilátka Ang I byla připravena následujícím způsobem.

6,8 mg komerčně dostupného syntetického peptidu Ang I bylo rozpuštěno v 1 ml 0,2 M PBS, a do takto získaného roztoku byl nakapán roztok připravený rozpuštěním 3,4 mg m-maleinimidobenzoyl-N-anhydrosukcinmidesteru (dále MBS) v 0,5 ml tetrahydrofuranu.

Roztok se pak ponechal stát po dobu 30 minut při teplotě

30° C s následným probubláním dusíku k odpaření tetrahydrofuranu. Zbylý roztok byl za současného protřepávání smíchán s 5 ml methylenchloridu, a následně separován centrifugaci, čímž byl získán roztok MBS a Ang I ve formě vodné fáze.

• · • · • ·

Rozpuštěním 10 mg BSA v 500 μΐ 6 M roztoku močoviny, která obsahovala 0,1 M EDTA, byl odděleně připraven roztok, který byl smíchán s 20 mg borohydridu sodného a 100 μΐ n-butylalkoholu jako odpěňovacího činidla. Roztok se nechal stát po dobu 30 minut, pak byl přidán 1 ml 0,2 M PBS a 0,4 ml acetonu, čímž vznikl redukovaný BSA.

Roztoky Ang I a MBS a redukovaný BSA, připravené výše uvedenými postupy, byly smíchány a inkubovány po dobu 2 hodin při teplotě 37° C, aby proběhla reakce, po níž následovala dialýza s PBS k odstranění reakcí nespotřebovaného Ang I.

S takto získaným produktem, jakožto imunoprotilátkou, byla provedena imunizační léčba k získání antiséra Ang I.

Krok 4 přípravy

Destička s protilátkou Ang I byla připravena následujícím způsobem. Antisérum Ang I získané v kroku 3 přípravy bylo zředěno SOOOnásobně 0,05 M uhličitanovým pufrem s pH 9,6, a 100 μΐ takto získaného roztoku bylo přidáno do každé jamky 96jamkové mikrodestičky pro imunoesej (Maxisorp, výrobek Nunc Co.), která se nechala stát po dobu 16 až 24 hodin při teplotě 4° C. Poté se zředěný roztok z jamek vylil a nahradil v každé jamce 200 μΐ fyziologického roztoku PBS, který obsahoval 1 % kaseinu, s následným stáním po dobu minimálně 16 hodin při teplotě 4° C, aby se zajistila imobilizace protilátky Ang I. Takto připravená destička se uchovávala při teplotě 4° C.

• · • · • 4

4 4444 444

4444 4444 44 44 44 44

Příklad-l

Roztok, připravený rozpuštěním 16 mg keyhole lympet hemokyaninu v 1 ml 0,1 M PBS s pH 7,2, byl přimíchán k 100 μΐ dimethylformamidového roztoku N- (γ-maleinimidobutyroxysukcinimidu v koncentraci 15 mg/ml, a nechal se stát po dobu 3 hodin při pokojové teplotě. Po skončení reakce se reakční směs uvolnila z reakcí nespotřebovaného N- (γ-maleinimidobutyroxysukcinimidu tak, že se nechala projít kolonou Sephadex G-25. Poté se provedla eluce reakčního produktu s 0,1 M PBS s pH 6,0, a eluát se přimíchal k 10 mg syntetického peptidů z pf proreninu, sestávajícího z reziduí aminokyselin 1 až 15 na Nterminálním konci, uvolněného z protektivních skupin, a vše se nechalo stát po dobu 3 hodin při pokojové teplotě za vzniku komplexu proreninu a syntetického peptidů s N-terminálním koncem z pf hemokyaninu, jakožto imunitní protilátky. Tento roztok se uchovával při teplotě -80° C až do použití při imunizaci zvířat.

Takto připravená imunitní protilátka byla zředěna fyziologickým roztokem tak, aby se dosáhlo koncentrace proteinu 1 mg/ml, a pak byla přimíchána ke stejnému objemu Freundova úplného adjuvans. Celý objem takto získaného roztoku byl subkutánně aplikován na několika místech bílému novozélandskému králíkovi o hmotnosti přibližně 2,5 kg. Imunizace králíka byla provedena 7krát ve dvoutýdenním odstupu, přičemž imunitní látka byla pokaždé aplikována v polovičním objemu, než jaký byl objem použitý při první injekci. Po konečné imunizaci byla králíkovi odebrána plná krev, a z krve bylo připraveno antisérum.

• · · ·· · · ·

Takto připravené antisérum bylo dialyzováno proti 0,1 M PBS s pH 7,0, poté následovala koncentrace, a dále byla přidána jedna setina objemu roztoku, který byl připraven rozpuštěním 100 g azidu sodného NaN₃ v 1 litru fyziologického roztoku, pro uchování při teplotě 4° C.

ml roztoku antiséra, získaného jak uvedeno výše, byl vysolen síranem sodným, a pevná vysrážená látka byla rozpuštěna v 17,5 mM PBS s pH 6,3. Roztok byl přes noc dialyzován proti stejnému PBS, a poté zpracován v koloně s náplní DEAE Sepharose, ekvilibrované stejným PBS, při rychlosti průtoku 0,3 až 0,5 ml/min, aby byla získána frakce se slabou absorpcí při vlnové délce 280 nm. Roztok této frakce byl dialyzován proti 0,1 M PBS s pH 7,0, a poté koncentrován pomocí zařízení Centricon-30 (výrobek firmy Amicon Co.) s následným přidáním jedné setiny objemu výše uvedeného roztoku azidu sodného v koncentraci 100 g/litr pro uchování při teplotě 4° C.

Obsah proteinu v takto získané IgG protilátce peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf byl 2,6 mg/ml, jak bylo vypočítáno z optické hustoty při vlnové délce 280 nm při předpokládané molekulární hmotnosti 150 000 pro IgG.

Dále bylo následujícím způsobem provedeno stanovení aktivity takto získané IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf ke kombinaci s lidským proreninem.

Základní roztok rekombinantního lidského proreninu, který byl připraven krokem 1 přípravy, byl zředěn 0,05 M roztokem uhličitanového pufru s pH 9,6 k dosažení koncentrace 1 gg Ang i/ml-hod., a takto zředěný roztok byl přidán do jamek 96jamkové mikrodestičky pro imunoesej (Polysorp, výrobek firmy Nunc Co.), která se nechala stát po dobu minimálně 16 hodin při teplotě 4° C. Poté byl zředěný roztok z jamek vylit a nahrazen v každé jamce 200 μΐ fyziologického roztoku PBS s pH 7,4, který obsahoval 1 % kaseinu, s následným stáním po dobu minimálně 16 hodin při teplotě 4° C, čímž byla získána proreninem imobilizovaná mikrodestička, která byla uchovávána při teplotě 4° C.

Dále byla výše uvedená IgG protilátka peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf ředěna fyziologickým roztokem PBS s pH 7,2, obsahujícím 0,1 % BSA a 0,05 % Tween 20, na různé stupně, od lOnásobného zředění po zředění 10⁹. 100 μΐ každého ze zředěných roztoků bylo přidáno do jamek proreninem imobilizované mikrodestičky, která se nechala stát po dobu 2 hodin při pokojové teplotě, aby proběhla reakce, s následným přidáním 100 μΐ roztoku, který byl připraven 4000násobným zředěním peroxidázou značeného proteinu A (výrobek firmy Zymed Laboratories lne.), obsahujícího 0,1 % BSA, 0,1 M chloridu sodného a 0,05 % média Tween 20, a destička se nechala stát 2 hodiny při pokojové teplotě, aby proběhla reakce. Po skončení reakce byl výše uvedený roztok vylit z jamek, které byly opakovaně pětkrát vymyty 300 μΐ vymývacího pufrového roztoku.

Poté bylo do každé z jamek mikrodestičky přidáno 150 μΐ roztoku chromogenu, a po inkubaci po dobu 5 minut při teplotě 37° C bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ 0,03% roztoku peroxidu vodíku, s následnou inkubací po dobu 30 minut při teplotě 37° C.

Reakce byla ukončena přidáním 100 μΐ 2 M kyseliny sírové, a na mikrodestičce byla poté měřena optická hustota při vlnové • · • · • · • · · · to · · · · · · . ········ ··· ♦ « • · ···· ·*· ···· ···· ·· ·· ·· ·· délce 450 nm s použitím čtečky mikrodestiček (výrobek firmy Molecular Device Co.), přičemž výsledky j sou uvedeny v grafu na obr. 1. Z tohoto grafu je zřejmá silná afinita IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf vůči lidskému proreninu.

Dále byla zkoumána specificita IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf provedením následujícího inhibičního testu.

mg výše uvedeného syntetického peptidu s N-terminálním koncem z pf, použitého k přípravě protilátky, byl rozpuštěn v 1 ml fyziologického roztoku PBS s obsahem BSA a média Tween 20, a roztok byl zředěn stejným fyziologickým roztokem PBS na různé stupně ředění od lOnásobného až po hodnotu 10⁷, aby tak byla připravena řada zředěných roztoků. 500μ1 díly odebrané z každého takto zředěných roztoků byly smíchány s 10 μΐ IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf, a 100 μΐ roztoku bylo přidáno do jamek proreninem imobilizované mikrodestičky, která se nechala stát 2 hodiny při pokojové teplotě.

Po skončení reakce byla mikrodestička opakovaně pětkrát vymyta 300 μΐ vymývacího pufru, a do jamek se přidalo po 100 μΐ roztoku proteinu A značeného peroxidázou, aby mohla být změřena optická hustota při vlnové délce 450 nm stejným způsobem jako při zjišťování titru protilátky, přičemž výsledky jsou uvedeny v grafu na obr. 2. Tento graf ukazuje, že reakce antigenu a protilátky (antigen-antibody reaction) mezi protilátkou peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf a lidským proreninem byla úplně inhibována syntetickým peptidem s N• ΦΦΦ φφφ φ φφφ φ φ φ φφφφ φ φφφ φ φ φφ φφ φφ φφφφ φ φ φ φφφφ φφφ φφφφ φφφ· φφ φφ φφ φφ terminálním koncem z pf jako antigenem, neboli, jinými slovy, protilátka peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf je antigen specifická.

Příklad 2

Supernatant kultury CHO, získaný v kroku 1 přípravy, byl lOnásobně zředěn fyziologickým roztokem PBS s pH 7,0, obsahujícím 1 % BSA, a 200 μΐ takto zředěného roztoku bylo přimícháváno ke 40 μΐ roztoku antiséra, které byly odebírány při postupném ředění (od lOnásobného zředění až po stupeň ředění 10⁶) antiséra peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf fyziologickým roztokem PBS s pH 7,6 a s obsahem 0,1 % BSA, a roztoky se ponechaly stát 16 hodin při teplotě 4° C.

Poté bylo 50 μΐ každé z takto získaných reakčních směsí . smícháno se 150 μΐ angiotensinogenního reakčního činidla a inkubováno po dobu 30 minut při teplotě 37° C.

100μ1 díly z výše získaných reakčních směsí byly postupně přeneseny na mikrodestičku, imobilizovanou protilátkou Ang I, připravenou krokem 4 přípravy, a bylo přidáno 100 μΐ enzymem značeného Ang I, který byl připraven krokem 2 přípravy, a mikrodestička se nechala stát po dobu 2 hodin při teplotě 4° C. Po skončení reakce byla mikrodestička opakovaně třikrát vymyta 300 μΐ vymývacího pufrového roztoku, a doplněna 150 μΐ roztoku chromogenu, s následnou inkubací po dobu 5 minut při teplotě 37° C, a dále bylo přidáno 50 μΐ 0,03% roztoku peroxidu • « · · ·φ φ * φ φ φ φ φ φφφ φφφφ φ * · · · φ · · ·· φφ φφ φφ vodíku s následnou inkubací po dobu 30 minut při teplotě 37° C, aby proběhla reakce a vyvinula se barva.

Reakce byla ukončena přidáním 100 μΐ 2% kyseliny sírové a provedlo se měření optické hustoty při vlnové délce 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček.

Odděleně byl ze supernatantu kultury CHO, který byl získán krokem 1 přípravy, odebrán 200μ1 díl a smíchán s 5 μΐ roztoku, připraveného rozpuštěním 1 mg trypsinu z kraví slinivky břišní (produkt Sigma Co.) v 1 ml 1 mM kyseliny chlorovodíkové, nechal se stát po dobu 10 minut při teplotě 25° C, a enzymatická reakce trypsinu byla ukončena přidáním 5 μΐ roztoku, připraveného rozpuštěním 2 mg inhibitoru sojového trypsinu (produkt Sigma Co.) v 1 ml 0,2 M PBS s pH 7,4 tak, aby došlo k přeměně lidského proreninu na kompletně konvertovaný prorenin.

Dále bylo 100 μΐ výše získané reakční směsi přidáno na jamky mikrodestičky imobilizované protilátkou Ang I ke stanovení Ang I způsobem, který byl popsán výše. Získané výsledky jsou uvedeny ve sloupcovém diagramu na obr. 3, jakožto relativní aktivace protilátkou peptidového charakteru s Nterminálním koncem z pf, přičemž za 100% hodnotu je považováno množství produkce Ang I z lidského proreninu po aktivaci trypsinem. Z tohoto grafu je zřejmé, že aktivační kapacita komplexu mezi IgG protilátkou peptidového charakteru s Nterminálním koncem z pf a lidským proreninem je závislá na dávce.

• φ · φ «φφ φφφφ « φ · φφφφ · φφφ φ φ φ · ·· φφ φφφ 4 « φ φ φφφφ φφφ φφφφ φφφφ ·♦ φφ «φ ··

Příklad 3 μΐ zředěného roztoku rekombinantního lidského proreninu v koncentraci 800 ng Ang i/ml.hod. byly přidány do 200 μΐ IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf, která byla získána krokem 1 přípravy, a dále byl přidán fyziologický roztok PBS obsahující 5 mM EDTA až do celkového objemu 500 μΐ, s následným stáním po dobu 24 hodin při teplotě 4° C, za vzniku komplexu lidského proreninu a IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf.

Dále bylo 100 μΐ této reakční směsi zpracováno gelovou filtrací na koloně HPLC (typ TSK-GEL-G3000SXL, výrobce Toso Co.), a s použitím fyziologického roztoku PBS s obsahem 5 mM EDTA byla provedena eluce při průtoku 0,6 ml/min, čímž byl získán roztoku elutátu ve frakcích o objemu 0,3 ml.

50μ1 díl odebraný z každé frakce se smíchal s 50 μΐ angiotensinogenního reakčního činidla, jakožto se substrátem reninu, a byl inkubován po dobu 15 minut při teplotě 37° C, aby vyprodukoval Ang I, a poté byl roztok okamžitě přenesen na led a smíchán se 150 μΐ PBS s obsahem 0,1 % BSA, 0,1 M chloridu sodného a 0,05 % média Tween 20 tak, že celkový objem činil 250 μΐ.

100 μΐ této reakční směsi bylo poté přidáno do každé z jamek destičky, imobilizované protilátkou Ang I, spolu se 100 μΐ roztoku enzymaticky značeného Ang I, který byl získán krokem 2 přípravy, s následným stáním po dobu 2 hodin při • · φ · · · · φ · φφφ φ · φφ • φ φφ φφ φφφφ ·

Φ Φ · φ ΦΦΦ φφ φφ φφ φφ

ΦΦΦ· ΦΦΦ· teplotě 4° C, aby proběhla reakce. Poté byla destička opakovaně třikrát vymyta 300 μΐ vymývacího pufrového roztoku.

Produkt reakce byl poté smíchán se 150 μΐ roztoku chromogenu a nechal se stát po dobu 5 minut při teplotě 25° C s následným přidáním 50 μΐ 0,03% roztoku peroxidu vodíku a stáním po dobu 30 minut při teplotě 25° C.

Reakce byla ukončena přidáním 100 μΐ 2 M kyseliny sírové, a pomocí čtečky mikrodestiček byla změřena optická hustota při vlnové délce 450 nm, a takto získané výsledky jsou vyznačeny plnou křivkou v grafu na obr. 4. Z tohoto grafu je zřejmé, že reninová aktivita, tedy aktivita k produkci reninu, byla shledána hlavně ve frakcích s retenčními časy 12,0 až 12,5 minut.

Pro srovnání bylo 100 μΐ stejného zředěného roztoku rekombinantního lidského proreninu, který byl použit výše, zpracováno gelovou filtrací na koloně HPLC za stejných podmínek, jako výše, a 100μ1 díl, odebraný z každé frakce eluátu, byl zpracován stejným způsobem jako při analýze tvorby komplexu IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf, a smíchán s peroxidázou značeným proteinem A, s roztokem chromogenu a s 0,03% roztokem peroxidu vodíku, a následně byla pomocí čtečky mikrodestiček změřena optická hustota při vlnové délce 450 nm. Výsledky toho měření ukazuje přerušovaná křivka grafu na obr. 4. Jak z tohoto grafu vyplývá, prorenin stanovený metodou imunoeseje vykazovaly téměř výlučně frakce s retenčními časy 16,5 až 17,0 minut.

Ve snaze zjistit vztah mezi retenčním časem a molekulární hmotností byla provedena gelová filtrace markéru molekulární ·· φφ ·φ ·· ·· φφ φφφφ φ · φ φφφφ • φ φ · ··· φ · ·· • φ φ φ φ φ φ φ φφφ · · φ φ φφφφ φφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ hmotnosti (výrobek firmy Server Co.) za stejných podmínek, jak uvedeno výše, a byly získány výsledky znázorněné grafem na obr. 5, podle nichž byla molekulární hmotnost proreninu přibližně 43 až 50 kD, o něco vyšší, než 45 kD molekulární hmotnosti ovalbuminu, a komplex proreninu a IgG protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf měl molekulární hmotnost 200 až 240 kD.

Výše uvedené výsledky vedou k závěru, že reakcí antigenprotilátka proreninu a protilátky peptidového charakteru s Nterminálním koncem z pf byl vytvořen imunokomplex, vykazující enzymatickou aktivitu, neboli reninovou aktivitu, a že rozklad angiotensinogenu jakožto reninového substrátu vedl k produkci Ang I.

Příklad 4

Ekvivolumetrickým ředěním roztoku proreninu 200 ng

Ang i/ml.hod. lidským sérem byla připravena řada zředěných roztoků a odebráním 100μ1 dílu z každého zředěného roztoku byly připraveny dvě sady vzorků.

Dále byla u vzorků roztoků z první sady stanovena produkce Ang I známou metodou aktivace trypsinem, a u vzorků roztoků z druhé sady byla produkce Ang I stanovena za použití komplexu lidského proreninu a protilátky peptidového charakteru s Nterminálním koncem z pf, který byl získán postupem uvedeným v příkladu 3.

• · • · ········ • · · · ·♦ *·

Φ · « φ φ · ·♦

Na obr. 6 je korelační graf, který ukazuje dobrou korelaci s korelačním koeficientem γ² = 0,972 mezi oběma sadami takto získaných hodnot.

Dále byla ekvivolumetrickým ředěním roztoku proreninu 400 ng Ang I/ml.hod. lidským sérem připravena řada zředěných roztoků a odebráním ΙΟΟμΙ dílu z každého zředěného roztoku byla získána sada vzorků. Na těchto vzorcích se provedlo měření množství produkce Ang I s použitím výše zmíněného komplexu, a tak byly získány výsledky uvedené v grafu na obr. 7, což je graf vztahu mezi koncentrací proreninu a množstvím produkce Ang I. Z tohoto grafu je patrné, že existuje dobrá linearita v rozmezí koncentrace proreninu 12,5 až 400 ng Ang 1/ml.hod.

Dále byly připraveny tři řady (A), (B) a (C) zředěných roztoků lidského proreninu ekvivolumetrickým zředěním roztoků o vysoké, střední a nízké počáteční koncentraci 503,2, 106,4 a

70,6 ng Ang I/ml.hod. (v tomto pořadí) lidským sérem, a odebráním ΙΟΟμΙ dílů ze všech zředěných roztoků každé řady byly připraveny tři sady vzorků, u nichž se měřila enzymatická aktivita při použití výše zmíněného komplexu, a byly získány výsledky, které jsou uvedeny v grafu na obr. 8. Z tohoto grafu je patrné, že výslednicí měření ve všech řadách vzorků je přímka, procházející počátkem.

Příklad použití

Komplex lidského proreninu a protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z pf, získaný postupem • · • to · · • · • to • ·· • · · · toto ·· to*·· • · · ♦ · · ·· ········ ·· ♦· ·· ·· uvedeným v příkladu 3, byl způsobem, uvedeným v příkladu 4, použit ke stanovení titru proreninu ve vzorcích séra, odebraných čtyřem dospělým mužům ve věku 20 až 40 let.

Pro srovnání se u stejných vzorků séra provedlo stanovení titru proreninu klasickou metodou aktivace trypsinem.

Výsledky těchto stanovení pro každou ze čtyř testovaných osob jsou uvedeny v jednotkách ng Ang I/ml.hod. v následující tabulce.

Tabulka

Případ č.	Titr proreninu v séru, ng Ang 1/ml.hod.
	s reakčním činidlem podle vynálezu	aktivací trypsinem
1	20,5	31,5
2	28,8	24,4
3	21,1	25,9
4	32,2	13,8

• φ

Claims

1. Protilátka peptidového charakteru s N-terminálním koncem z profragmentu lidského proreninu, která je schopná specificky rozpoznat peptid obsahující přinejmenším 15 reziduí aminokyselin od 1. rezidua leucinu po 15. reziduum argininu v peptidů s N-terminálním koncem z profragmentu lidského proreninu.

2. Renin-aktivní substance sestávající z komplexu protilátky peptidového charakteru s N-terminálním koncem z profragmentu lidského proreninu podle nároku 1 a lidského proreninu.

3. Způsob stanovení lidského proreninu v krvi, ,, vy z n a č u j í c í se t í m, že sestává z těchto kroků:

(a) reakce lidského proreninu v krvi s protilátkou peptidového charakteru s N-terminálním koncem z profragmentu lidského proreninu podle nároku 1, za vzniku renin-aktivní substance podle nároku 2, (b) přidání angiotensinogenu jakožto reninového substrátu k renin-aktivní látce, za vzniku angiotensinu I, a (c) stanovení angiotensinu I.