TW381179B - Novel antibody, renin-active substance containing the same and prorenin assay reagent using the same - Google Patents

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A7 B7 五、發明説明< ) . 本發明的背景 . 本發明關於一種新穎的人類前腎活素前片段（以下稱 爲p f) N端肽的抗體，此種抗體能與人類前腎活素合倂 而形成一種免疫複合體，本發明還關於一種當該抗體與人 類前腎活素合倂時所形成的腎活素活性物質及一種使用該 抗體的前腎活素分析試劑。 前腎活素爲一種不具有酵素活.性的物質，它主要是由 腎臟所製造’爲完全成熟型之腎活素的先質，或者，也可 說是.：由4 3個胺基酸剩餘物所組成之前片段與完全成熟 型之腎活素所合倂合成的物質。’已知，當因糖尿病的病原 而倂發血管疾病時’人體血中前腎活素的濃度會根據疾病 的嚴重性而加重，而當病情減輕時濃度也會跟著降低。有 學說提出可以人體血中前腎活素的濃度來做爲糖尿病血管 病症的記號（見內科學新英格蘭期刊，第3 1 2冊， 1985 ’ 1412 — 1417頁，東京女子醫學院硏·究 論文，第60冊’ 1990，第342〜350頁，及臨 床審查者，第71冊，19 9 3，3 — 6頁）。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 另外，在此之前有許多用來分析人類血漿中。之前腎活 素濃度的建議。在這些先前技藝的方法中所存在的問題是 :由於人類血漿含有二種型態的腎活素：①爲一種酵素蛋 白質的完全成熟型腎活素’及②酵素上無活性的人類前腎 活素，此爲一種完全成熟型腎活素的先質，因此，必需以 一種間接方法先將血漿中之人類前腎活素在低溫下以一種 酸部分活化後，再以胰蛋白酶將它轉化成完全成熟型的腎 -4- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明$ ) - 活素’接著’利用酵素學上的方法決定全部的腎活素量， 此爲腎活素活性的全部量或者利用免疫學上的方法來決定 活性腎活素的全部量，而人類前腎活素的量便是將分別以 酵素學上的方法所得到的腎活素之活性數値或以免疫學上 的方法得到的活性腎活素量自上述所得之全部腎活素活性 或活性腎活素之全部量中減去所得之差値。 此處’’完全成熟型的腎活素〃一詞所含省的意思指 經由一種酵素處理’使腎活素的前片段部分自前腎活素分 離來後，由前腎活素所衍生出來的一個結構體，而由於該 酵素上的活性部分是打開的，因此，此結構可以顯現出腎 活素的活性。上述之腎活素活性爲完全成熟型之腎活素天 生所具有的酵素活性（完全成熟型的腎活素爲一種酵素蛋 白質）’或者可以說，腎活素活性是藉著選擇性地作用在 腎活素受質上（高壓素原）來製造血管收縮素（An g I )的活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 最近有硏究發現，可將無活性的人類前腎活素，藉.著 其本身的鍵結作用，與一種低分子量的腎活素抑制劑結合 而轉化成開放型的構造。因爲這個發現，可以建立一種免 疫學上的方法來對全部的腎活素活性進行分析，這是利用 一種能特定地鑑識出最接近腎活素活性部分之部位的單株 抗體及一種能鑑識出人類前腎活素及完全成熟型之腎活素 的單株抗體，並以一種發展出來的方法，在不需加入腎活 素抑制‘劑的情況下可決定出腎活素的量，經由計算上述所 決定之全部活性腎活素及活性腎活素的差値來決定人類腎 : ..... ........ Ϊ紙張尺度適财關家標準（⑽）( 210X297公釐]ΓΓ： " - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明4 ) , 活素的量（見臨床化學，第42冊，1996，1051 〜1 0 6 3頁）。在與先前技藝中之以胰蛋白酶活化的酵 素學的方法比較上或與以胰蛋白酶活化來分析腎活素活性 的方法進行比較時，此方法雖然具有可利用胰蛋白酶來壓 抑人類前腎活素及完全成熟型之腎活素的暫時性分解及與 胰蛋白酶活'化法有很好的關聯性等，優點，但也有下述的 缺點：在糖尿病的病例中，由此法所得到之腎活素活性在 與真正的腎活素活性進行比較時，很明顯地，由此方法所 得的結果中可見到在血液中之前腎活素效價增加了。還有 ’此方法也很麻煩，因爲該分析需對腎活素活性及全部的 腎活素活性各自進行分析。 還有，已知有一種免疫學上的直接分析方法，它是利 用①一種能識別人類前腎活素中之p f的C —端（亦即是 :以第2 9，至第4 3個胺基酸剩餘物爲抗原）的單株抗 體及②一種能鑑識該單株抗體及完全成型熟之腎活素的腎 活素單株抗體（見臨床內分泌學及代謝期刊，第7 5冊， 1992，617 〜623 頁）。 本方法的好處在於它除了與胰蛋白酶活化方法有很好 的關聯性外，它的敏感度也很高，所以本方法可以用來分 析健康人血中之前腎活素的效價。另一方面，本方法的缺 點是，由此分析所得到的數値與由胰蛋白酶活化法所得之 數値相比較下有降低的傾向，低至約爲胰蛋白酶活化法所 得數値之8 0%，此種傾向在爲患有可使人類前腎活素效 價增加之疾病的病人進行分析時特別明顯，另一缺點是腎 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —„----C/裝.

ix------®-----：-----I 經濟部中央標準局.員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明4 ) ·. 活素單株抗體被識別之部分的不確定性。 本發明的總論 因此，本發明的主要目的是藉著克服胰蛋白酶活化法 的缺點來提供①一種間接分析人類前腎活素的方法，此方 法是利用一 i腎活素抑制劑來分析經活化的全部腎活素的 活性，及②一種直接的免疫學分析方法，該直接的免疫學 方法是利用一種能識別人類前腎活素之p f c -端（此在 先前技藝中是做爲一種抗原）的抗體，③一種能正確而方 便地偵測到糖尿病血管疾病之發生的前腎活素分析試劑。 因此，本發明提供一種人類前腎活素前片段N端肽之 抗體，它能特定地識別一段做爲抗原的肽，此段肽包含在 人類前腎活素前片段中第一個位置的白胺酸剩餘物至第十 五個位置的精胺酸剩餘物。 還有，本發明提供一種新穎的腎活素活性物賀，它是 一種人類前腎活素與上述人類前腎活素前片段N -端肽抗 體的複合物。此人類前腎活素前片段N -端肽之抗體可做 爲前腎活素之分析試劑中的有效成分。 圖形的簡單說明 第1圖之圖形所顯示的爲：當人類前腎活素與P f N —端肽抗體之I g G反應時’該I g G濃障與人類前腎 活素量之間的關係。

第2圖之圖形所顯示的爲：人類前腎活素與P f N 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I —.— -^„----,c裝------訂------馨 1 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 ' , B7 五、發明説明$ ) - -端肽抗體反應時，p f N -端肽抗體的抑制活性。 第3圖之圖形所顯示的爲：前腎活素和P f N -端 肽抗體之I g G間複合物的活化能力對劑量的依賴性。 第4圖之圖形所顯示的爲：P f N —端肽抗體之 I g G的前腎活素結合能力與凝膠過濾層析法中之洗提分 餾液間的關ί系。 第5圖的圖形是用來對前腎活素及P f N -端肽抗 體的分子量做比較性的評估。 第6圖的圖形所顯示的爲：胰蛋白酶活化法和利用本 發明之分析試劑的方法之間的關聯性。’ 第7圓的圖形所顯示的爲：前腎活素的濃度與A n g I製造量之間的關聯性。 第8圖的圖形所顯示的爲：本發明之分析試劑對三種 濃度之人類前腎活素的酵素活性。 較佳體系的詳細說明 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明者先前發展了一種用來分析人類前腎活素的試 劑，這是利用一種由4 3個胺基酸剩餘物所組成·，能特定 地識別人類前腎活素P f部分的抗體（見日本專利公開公 報8 - 285852)。由進一步的持續硏究結果中，本 發明成功地得到一種高親和性的抗體，它能特定地識別由 人類前腎活素p f N-端處第1至第1 5個胺基酸剩餘 物所組成的肽（此段肽做爲一種抗原），而且，本發明者 還發現了「當此P f N -端肽抗體與人類前腎活素合倂 -8 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

I A7 ( 五、發明説明$ ) · 時會形成一種腎活素活性物質’而經由應用免疫學的方法 ，可利用此質來進行，Ang I競爭性酵素的分析以準 確地決定出血中前腎活素的效價（見臨床及實驗的高血壓 一理論及實際操作，第A12冊，1990，83〜95 頁），碁於此發現可完成上述之本發明。 根據本發明，人類前腎活素P f N端肽的抗體可依 如下述之步驟來製備。 首先，經由固相肽合成的方法合成一段由"①一種能 識別人類前腎活素中之P f的C 一端（亦即是：以第2 9 至第4 3個胺基酸剩餘物爲抗原）的單株抗體及②一種能 鑑識該單株抗體及完全成熟型之腎活素的腎活素單株抗體 之胺基酸剩餘物所組成的肽（此肽相當於人類前腎活素 ?{1^端的肽），再將由此合成的肽與一種載體蛋白質（ 如：牛血淸白蛋白，卵白蛋白及a鑰孔林白血淸素'利用 一種交叉連結作用劑（如：馬來醯亞胺化合物）加以合倂 以產生一種免疫抗原。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 接著.，將各免疫抗原與弗羅完全佐劑（Freund complete adjuvant )完全混合並以此將一隻體重約2 . 5公 斤的成熟兔子進行免疫。此免疫處理每二週重覆一次且在 第五次處理後，自耳朵之周邊靜脈中取出一點血液，並將 此血液樣品進行抗體效價分析。當此抗體效價已增加到足 夠量時，將此兔子的全身血液收集起來並自血液中取得抗 血淸。將由此取得的抗血淸再進行D E A E塞弗洛斯（ DEAE Sephiarose )層析法以得到p f N端之肽抗體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -9 - 部 中 央 標 準 局 員 工 消 費 合 作 社 印 裝 A7 B7 經 五、 發明説明X ) I S G。 或者 > 可根據過去 已 知 的 方 法 > 以 免 疫 抗 原 將 老 鼠 進 行 免 疫以 製 備單株抗體 » 取 伐 用 免 疫 抗 原 將 兔 子 免 疫 來 取 得 多株抗 體 的方法。 在分 子 量爲1 5 0 0 0 的 I g G 會 具 有 2 • 6 毫 克 / 毫 升 的效 價 的假設下， 我 們 可 在 2 8 0 η m 波 長 處 測 量 光. 學 密 度來 決 定蛋白質的 量 » 由 此 可 計 算 出 P f N 端 肽 抗 體 I g G 的 量。此p f Ν 端 肽 抗 體 爲 — 種 對 人 體 ^ r- 刖 腎 活 素 具 有強 親 和性的抗體: 並特定地作用於P i 的N端上。 藉著 將 此p f N — 端 肽 抗 體 與 人 類 V/. 刖 腎 活 素 合 倂 可 以 得 到一 種 能顯現出酵 素 活 性 ( 也 就 是 腎 活 素 活 性 ) 的 物 質 〇 製備 此 腎活素-活性物質的步驟如下: 將一 種 人類前腎活 素 溶 液 與 P f Ν — 丄山 m 肽 抗 體 加 以 混 合 (此 抗 體先以含牛 血 淸 的 生 理 食 鹽 溶 液 加 以 稀 釋 ) 並 將 此混 合 物在4 °C下 放 置 1 6 至 2 4 小 時 0 然 後 將 反 應 混 合物 與 羊高壓素原 溶 液 ( 做 爲 人 類 刖 腎 活 素 的 受 質 ) 加 以 混合 並在3 7 °C 下 溫 育 1 5 分 鐘 以 使 進 —. 步 反 應 生 效 ，接 著 ，將混合物在冰浴中冷卻以結束此反應。 由此 方 法所得到之 腎 活 素 活性 物 質 與 以 胰 蛋 白 酶 活 化 的 人 類則 腎 活素進行比 較 以 測 量 其 製 造 A η S I 的 活 性 結 果可 發 現：p f Ν 端 肽 抗 體 的 腎 活 素 活 性 會 根. 據 稀 釋 的 程度 而 有不同。 附屬 的 第1圖的圖 形 是 以 根 據 本 發 明 之 人 類 W. 刖 腎 活 素 N 一 端肽 抗 體爲範例， 顯 示 出 在 該 抗 體 與 人 類 、.丨-刖 腎 活 素 反 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) J----- -IT------©-----'---^---- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10 - 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 A7 ' , ........ . _ . B? , :. - . 五、發明説明$ ) ’ 應中I g G的濃度與在4 5 0 nm波長處所測得之反應混 合物的光學密度二者之間關係。此圖顯示的訊息是根據本 卞 發明的人類前腎活素P f N -端肽抗體與人類前腎活素 有很高的親和性。 第，2圖的圖形顯示當人類前腎活素？ f N_端肽抗 體與一種合成的p f N _端狀混合時’狀濃度與其在 4 5 0 nm波長處之光學密度兩者之間的關係。此圖形表 示在人類前腎活素與人類前腎活素P f N -端肽抗體之 間的連結會被合成的P f N -端肽所完全抑制或，亦即 是，該連結顯示出對人類前腎活素的特定活性。 第3圖爲一種棒條製圖，此圖所顯示的爲人類前腎活 素與人類前腎活素P f N -端肽抗體反應所形成之複合 物的腎活素活性，此活性可代表I g G長度的作用。不同 濃度之腎活素的活性是以由胰蛋白酶活化之人類前腎活素 的腎活素活性（此値當成1 0 0%)的相對値來表示。此 圖形指出.：上述之複合物所顯現的腎活素活性是依據其中 所使用之人類前腎活素pf N—端肽抗體IgG的量來 決定。 還有，人類前腎活素pf N-端肽抗體IgG與人 類前腎活素的複合物是利用凝膠過濾高效能液態層析法來 進行分餾，且將各分餾液再進行酵素活性分析以得到在第 4圖中以實線，曲線圖形所顯示的結果。類似方法，第4 圖中虛‘線曲線所顯示的爲先利用人類p f N —端肽抗體 及以酵素標示之蛋白質A來進行凝膠過濾層析法之後，再 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---f裝· 、1T--^----β-----：--I-- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -11- 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明$ ) · 進行人類前腎活素的酵素免疫分析所得到的結果。 第5圖的圖形顯示出數種已知蛋白質之分子量與持留 時間之間的關係。這些蛋白質包括：帶有分子量4 5 0 KD的鐵蛋白，帶有分子量6 7KD的牛血淸白蛋白’帶 有分子4 5 KD的卵白蛋白’及帶有分子量2 5 KD的胰 凝乳蛋白酶'原，它們分別以圖A，B，C，D來表示’而 人類前腎活素與P f N -端肽抗體I gG間之複合物的 持留時間以箭頭I來表示，人類前腎活素則以箭頭1 1表 不 ° 如由第4圖和第5圖中所了解的，複合物的酵素活性 較可能在持留時間12.0至12.5分處的分餾液中找 到，而人類前腎活素可在持留時間16.5至17.0分 間的分餾液中發現。 從上述的事實可以得到一個結論：酵素活性是由具有 分子量2 0 0至2 4 OKD的複合物顯現出來的，此爲具 分子量4 3 KD至5 OKD之人類前腎活素及具分子量 1 50KD之人類前腎活素p f N —端肽抗體I gG之 間的複合物。 ' 第6圖之圖形顯示出利用上述複合物進行之分析所得 到的人類前腎活素效價及利用胰蛋白酶活化法所得到之人 類前腎活素效價二者之間的關係。此圖表示出：在二値之 間的r : 〇 . 9 8 6，這顯示出二者具有很好的關聯性。 利用此複合物來做爲一種前腎活素分析試劑可以對不 同濃度之人類前腎活素進行分析，結果發現：當前腎活素 ............ .. .... ... - ；· _； - ·...... 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -12 - n· n^— i ^^^1 ^)-1 .^^, Hi nn Hr n^i 一疒 nn m m n^i z^='f^ -r.> .t 囊 _ · > (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

AY B7 五、發明説明<〇 ) 的各個不同濃度是在12.5至400毫微克Ang I /毫升•小時的範圍內時，它們之間可以有很好的線性關 聯性。 還有，如第8圖中所顯示的，以人類血淸做爲稀釋劑 來製備高，中，低等三種不同濃度的人類前腎活素血淸時 ，若將這些血淸利用與上述分析試劑中相同的複合物來進 行酵素活性分析時可發現：在各假情況下，A n g I的 製造量與腎活素之稀釋程度間有很好的比例關係。 上述分析試驗有很好的重複性，在此可重複的試驗中 ，不同濃度的n = 7，其差異係數爲1 . 8至5 . 5%， 而每日重複試驗中，n = 5且其差異係數爲3 . 8至 7.8%。 上述結果可得到一個結論是：根據本發明之人類前腎 活素p f N -端肽抗體對人類前腎活素有很高的親和性 且帶有一特定活性是作用在P f N -端上，而此抗體和 人類前腎活素之間的複合物具有一酵素活性，此活性與腎 活素之濃度間有很好的關聯性。因此，此複合物可做爲一 種前腎活素的分析試劑。 下述中，將藉由實施例來詳述本發明，然而，這些實 施例並不在任何方面限制本發明的範圍。下述內容爲用來 製備實施例中所需使用之各相對試劑的步驟。前腎活素之 效價表現是以Ang I之製造活性爲參考。 (1 )發色劑溶液

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -IS I.--L------广裝-- - ' - - (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) *-° ΙΘ. A7 __ B7 五、發明説明Ο1 ) 此溶液是將四甲基聯苯胺（以下稱爲ΤΜΒ )溶於 ΡΗ6 . 5之醋酸緩衝溶.液中所製成的，其濃度爲5 . 5 m Μ。 (2 )高壓素原試劑 將一隻V羊進行二側腎臟切開術後4 8小時取出血液， 然後，立即將血淸自血液樣品中分離出來，再加以冷凍乾 燥，將由此得到的乾燥物質取2 Omg溶於一pH値爲 6 . 5的0·. 2M磷酸緩衝液1升（其中含1 0毫莫耳之 二異丙基氟磷酸酯（DFP)及1 〇毫莫耳之EDTA， 以下稱爲P B S )中，以製得試劑。 (3 )用來沖洗的緩衝溶液： 此溶液是將一種表面活性劑 ' 吐溫2 O' ( Tween 20 )溶於P B S生理食鹽水中所製成的其濃度爲〇 . 〇 5% (以重量計）。 (4 )稀釋用之人類血淸 - 經濟部中央標箪局員工消費合作社印掣 將一種由日本生物物質中心公司所販售之正常人類血 淸以一種能識別完全成熟型之腎活素及人類前腎活素的抗 體進行親和力層析法，以使完全成熟型的腎活素及人類前 腎活素能吸附於上，接著再於5 6 °C下，處理3 0分鐘以 進行去活化處理。 -14- (請先閱请背面之注意事項洱填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — .... .. . . B7 五、發明説明（12 ) * 製備方法1 依下列方法來製備重組之人類前腎活素的主溶液。因 此’根據、慕如卡米"等人所著，於"高血壓期刊’第4 冊，3388〜3390頁（198.6)，中所報告的方 法’將一段衍生自人類腎臟之人類前腎活素的c DNA引 入一種表現k體後，將此載體植於中國腮鼠卵細胞（以下 稱爲CHO細胞）中，並將此紐胞於含有1 0%胎牛血淸 的A杜白可"修正的、伊高"培養液（Eagleculture medium of Dulbecco’s modified methcd )中加以培養，當 C Η 0細胞完全長成後，置換以不含血淸的培養液，以得 到含重組之人類前腎活素的培養上淸液。 取5毫升由此方法所得到的CH0培養上淸液，並將 此上淸液對含5mM EDTA的PBS生理食鹽水進行 透析’接著，將重組之人類前腎活素濃度調整爲2 0 0微 克A n g I /毫升•小時，以得到一種重組之前腎活素 主溶液，並將它貯存在4 °C。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 製備方法2 依下列方法來製備以酵素標示的A n g I 。在劇烈 攪拌下，將1毫升之2.5%戊二醛溶液一滴滴地加入一 含5毫克辣根0.2M PBS溶液500微升中。當戊 二醛溶液被一滴滴地全部加入後，將此混合物在2 5 0 °C 下’繼續攪動3 0分鐘，再將體積濃縮至10 〇微升.，此 濃縮步驟是利用一個膜過濾器（機爾奇斯公司）進行過濾 -15- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐) 經濟部中央標瘅局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（13 ) ， ，並一邊在冰浴中加以冷卻。接著，利用凝膠過濾法·將多 餘的戊二醛移走，以回收酵素分餾液。 下一步，將混合物進一步濃縮並與一種依下列步驟所 製備之溶液，1 3 0微升加以混合，該溶液是經由將1毫 克之合成的Ang I肽溶於1毫升純水中，並於30 °C 下’溫育約'2小時而製成的。然後，經由加入1 0 0微升 之0 . 賴胺酸水溶液來終止反應，且將該反應混合物 再次加以濃縮以使體積成爲1 0 0 # z 。經由凝膠過濾法 除去未被處理的Ang I ，以得到所需要之以酵素標示 的A n g I溶液β 將由此得到之以酵素標示的A η g I溶液與牛血淸 白蛋白（以下稱爲B S A )加以混合，所得到之溶液濃度 爲0 . 1%，此即爲以酵素標示之Ang I主溶液，並 將它貯存於一，8 0 °C。 由此製得之主溶液在以一種含0 . 1%之BSA， 0 . 1M之氯化鈉及〇 . 05%之"吐溫20"的PBS 進行3 0 0 0倍的稀釋後才可使用。 製備方法3 依下列方法來製備Ang I抗體。將一種可由商業 購得之合成的Ang I肽6.8毫克溶於1毫升之. 0 . 2MPBS中以產生一種溶液，然後將3 . 4毫克之 / 間-馬來醯亞胺基苯甲醯N -脫水琥珀醯亞胺酯（以下稱 爲MB S Γ溶於〇 · 5毫升之四氫呋喃中，接著，將後者 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16 - I---L-------^_裝------訂------ -' (請毛閲讀背面之注意事項再填巧本頁) 經濟部中央標聿局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（14 ) .* 溶液一滴滴地加入前者溶液中。 將上述製備好之溶液於3 0°C下置放3 0分鐘，再將 氮氣吹入其中以將四氫呋喃蒸發掉。將剩餘溶液與5毫升 之二氯甲烷一邊攪動一邊加以混合，再以離心的相分離法 得到含Μ B S及A n g I之溶液，此爲水溶液相。 另外，#10毫克BBSA溶於含0.1M EDTA之6M尿素溶液5 0 0微升中。將此溶液與2 0 毫克之氫硼化鈉及1 0 0微升之正丁醇混合在一起以做爲 —種去泡沫試劑。將此試劑置放3 0分鐘後，加入0 . 2 M PBS1毫升及丙酮0.4毫升以得到一還厚的 B S Α。 由上述製得之An g I及MB S溶液與還原BSA 混合在一起，於3 7 °C下溫育2小時，.使反應開始作用， 然後再以PBS進行透析以移去未反應之Ang I。 將由此所得之反應產品進行免疫處理以得到A n g I抗血淸。 製備方法4 依下列方法製備Ang I抗體盤。將由製備方法3 得到之Ang I抗血淸以pH爲9 . 6的0 . 05M碳 酸緩衝液稀釋5 0 0 0倍。取1 0 0微升爲一份之稀釋好 的溶液各加入9 6凹槽的微培養盤中的各凹槽內以進行免 疫分析’（"麥斯索普〃，由 > 諾克'公司出品），將此培 養盤在4 °C下置放1 6至2 4小時。然後，將凹槽中的稀 (請先閱讀背面之注意事項再填艿本頁) .I -r、裝------訂------^蠻----I --- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -17- 經濟部中央標準局兵工消費合作社印^ A7 ' , B7 ._ - . + : 五、發明説明（15 ) * 釋液丟棄並以每凹槽2 0 0微升之含1 %酪蛋白的P B S 生理食鹽水取代之，接著，在4 °C下依同樣情置放至少 1 6小時，以使Ang I抗體發生停止移動的作用。將 此製好的抗體盤於4 °C下貯存。 實施例1 將1 6毫克的"鑰孔林白血淸素"溶於pH7 · 2的 0 . 1MPBS 1毫升中，再將此溶液與含有1 5毫克/ 毫升濃度之N - ( r —馬來醯亞胺丁氧基）琥珀醯亞胺的 二甲基甲醯胺溶液1 0 0微升一起混合並在室溫下置放3 小時。當反應完成後，將混合物通過"塞弗徳克斯〇- 2 5 〃 （ Sephadex G-25 )分析柱以去除未反應的N — ( r -馬來醯亞胺丁氧基）琥珀醯亞胺。然後，以PH6 . 0 之0 . IMP BS洗提該反應產物並將洗提液與10毫克 之合成肽加以混合，此合成肽是由前腎活素之p i N端 的第1個至第1 5個胺基酸剩餘物所組成，它並且不具有 保護基團。將混合物在室溫下靜置3小時後可產生前腎活 素及P f N -端合成肽血青蛋白的複合物，以·做爲一種 免疫抗體。將此溶液在-8 下貯存直至用來對動物進 行免疫作用。 '以生理食鹽水將製備好之免疫抗體加以稀釋，使蛋白 質濃度爲1毫克/毫升並且再與等體積之弗羅完全佐劑混 合。將由此製好之全部溶液以皮下注射法打入一隻約 2 . 5公斤體重之紐西蘭白兔的皮下數個點中。接著，每 ..... ..... - -· ..... - - -. -. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) .-)〇 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T A7 B7 五、發明説明（16 ) ’ '隔二週進行一次免疫化注射，每次注射的免疫抗體體積爲 第一次注射所用之體積的一半，總共注射七次。在最後一 次免疫化注射後，白兔子體中收集全部血液並自此血液樣 品中製備抗血淸。 將由此製備好之抗血淸對PH7.0的0.1M PB S進行透析再加以濃縮。然後，將1 0 0克之疊氮化 鈉溶於1升的生理食鹽水中，取百分之一體積的溶液加入 前述濃縮好的抗血淸中，並貯存於4 t。 取1毫升由上述所得之抗血淸溶液，硫酸鈉進行鹽析 處理，再將沉澱溶於PH6.3的17.5mMPBS中 。將此溶液對相同的P B S透析一整晚，然後將它通過一 D E A E塞弗洛斯的分析柱（此分析柱是以流速爲 0.3至0·5毫升/分之相同的PBS來平衡的），收 集其光吸收處在波長2 8 0 nm的分餾液。將此分餾液對 p Η 7 . 0的0 · 1 Μ P B S進行透析，然後，以"山德 利康—3 0 " ( Centdcaon-30,由艾米康公司所製造）加以 經"部中央標準局兵工消资合作社印製 濃縮，接著，再加入百分之一體積的上述疊氮化鈉溶液（ 濃度爲1 0 0克/升，以貯存在4 t：。 ; 利用在波長2 5 0 n m處所測得之光學密度來計算出 在所製備得到之pH N —端肽抗體I gG中之蛋白質含 量爲2 . 6毫克/毫升（其中假設I gG的分子量爲 1 5 0 0 0 0 )。 .下一步，依下列方法進行上述所得之p f n -端肽 抗體I g G‘與人類前腎活素的合倂活性的分析。 -19 - (請先閱讀背面之注意事項再填"本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公楚） A7 ( /- • Ά^β I ,.. 五、發明説明（17 ) ’ 將由上述製備方法1中所製備之重組的人類前腎活素 主溶液（濃度爲2 Ό 0微克A n g I /毫升•小時）以 PH9 . 6之0 . 0 5MM碳酸緩衝液稀釋成濃度爲1微 克Ang 1/毫升·小時的溶液並將此稀釋好的溶液加 入9 6凹槽培養盤中之各凹槽中以用來進行免疫分析（" 波利索普（Polysorb ) 〃 ，由 '諾克（Nunc ) 〃公司出品 )，將此培養盤於4 t下置放至少1 6小時。然後，將凹 槽中之稀釋的溶液丟棄，以2 0 0微升之含有1 %酪蛋白 ，pH7 .4的PBS生理食鹽水取代之，並於4°C下至 少置放1 6小時以產生一個經前腎活素免疫化的微培養盤 ,再將它貯存於4 °C。 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製 接著，以含0 . 1%BSA及0 · 05%之吐溫20 的p H7 . 2的PBS生理食鹽水將上述之p f N_端 肽抗體I gG稀釋成由1 0倍至1 09倍的不同倍數稀釋液 。取各稀釋液的1 0 0微升爲一份各加入經腎活素免疫化 之微培養盤凹槽中，並於室溫下置放2小時以使反應開始 作用，再將含0 . 1%BSA，〇 . 1M氯化鈉及 0 . 05%吐溫20之經400 0倍稀釋的以過氧化酶標 示的蛋白質A (由萊姆德（Zymed )實驗室出品）1 〇 〇 微升加入其中，並將此反應物於室溫下置放2小時。在反 應完全後，將上述溶液自凹槽中丟棄，^將凹槽以3 0 0 微升之緩衝液淸洗五次。 然後，將1 5 0微升之發色劑溶液加入微培養盤之各 凹槽中，並在3 7 t下溫育5分鐘後，在各凹槽中加入 -20- (請先閱讀背面之注意事項再填艿本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 B7______ ' 五、發明説明（18 ) . . ·* ·〇 .0 3%過氧化氫溶液5 0微升再於3 7 °C下溫育3 0 分鐘。 最後，經由加入1 0 0微升之2M硫酸來終止反應’ 並於4 5 0 n m波長處測量其光學密度，測量方法則是利 用一種微培養盤讀計（microplate reader，由分子儀器公司 所出品），所得到的結果以第1圖的圖形來表示。由此圖 中可淸楚知道，p f N-端肽抗體I gG對人類前腎活 素有很強的親和性。 下一步，依下述抑制試驗的步驟來檢查該ρ ί Ν-端肽抗體I g G。 將抗體製備方法中所使用之上述N -端肽抗體1毫克 溶於含B S A及吐溫2 0之P B S生理食鹽水1毫升中。 並將此溶液以相同的P B S生理食鹽水稀釋成從1 0倍至 1 0 7倍等不同程度的稀釋液，以製備一序列的稀釋溶液。 自各稀釋好的溶液中各取5 0 0微升爲一份並與1 0微升 之P Η端肽抗體I g G及1 〇 〇微升之溶液加入經腎活素 免疫化的微培養盤凹槽中，並於室溫下置放2小時。 在反應完成後，以3 0 0微升之緩衝液沖洗微培養盤 .五次’並將以過氧化過氧化酶標示的蛋白質A溶液加入凹 槽中’在4 5 0 nm波長處測量其光學密度（方法如抗體 效價分析中之方法），所得之結果爲第ά圖之圖形。.由此 圖中可知，在Ν -端肽抗體及人類腎活素間的抗原一抗體 反應會受到p f N —端合成肽（做爲抗原）的完全抑制 或’也可以說，p f N —端肽抗體具有抗原專一性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐) _ 21 - I — i J„----ο裝------，訂------©. 一 一 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印掣 A7 ' , .... ...... 7 . • .., · .... 五、發明説明（19 ) . 實施例2

以含1%BSA之pH7 . 0的PBS生理食鹽溶液 將製備方法1中所得之C Η 0培養上淸液稀釋1 〇倍，並 取此稀釋好的溶液2 0 0微升爲一份與4 0微升之抗血淸 溶液加以混合，該抗血淸溶液是利用含有〇 . 1 % B S A 之pH7 . 6PBS生理食鹽溶液來將p f N_端肽抗 血淸稀釋成1 0倍至1 0 6倍而得到的。將混合液於4 °C下 置放1 6小時。 然後，將上述所得之反應混合物分成5 0微升爲一份 並將它們各與1 5 0微升之高壓素原試劑加以混合，在 3 7 °C下，將混合液溫育3 0分鐘。 下一步，將上述所得之反應混合物以1 〇 〇微升爲一 份的加入於製備方法4中所得之以A n g I抗體免疫化 的微培養盤中，並加入1 Ο 0微升之以酵素標示的A n g I (於製備方法2中所製得者），再將此培養盤於4 °C 下置放2小時。當反應完成後，以3 0 0微升之沖洗緩衝 液沖洗該微培養盤三次，並加入1 5 0微升之發色劑溶液 ，於37 °C分溫育5分鐘。然後，將50微升之0 . 03 %過氧化氫溶液加入其中，再於3 7 °C下溫育3 0分鐘以 使反應開始作用並開始產生顏色。 最後，經由加入2 %硫酸1 0 0微升來終止反應並於 波長4 _ 5 0 n m處利用·一個微培養盤讀計測量其光學密度 —m n? *m n^i I 1^\ I - - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---1----— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -22- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印掣 A7 B7 五、發明説明如） - 另外，將由製備方法1中所得之CHO培養上淸液一 份2 0 〇微升與5微升之胰蛋白酶溶液混合在一起’並於 2 5 °C下置放1 〇分鐘，該胰蛋白溶液是將來自牛胰臟之 胰蛋白酶（*史格所公司# Sigma Co的產品）1毫克溶於 1毫升之ImM鹽酸中所製成的。2毫克之黃豆胰蛋白酶 抑制劑史格馬公司〃的產品）溶於1毫升之0 . 2 Μ PBS (ρΗ7 . 4)中，取5 —微升之此製備好的溶 液加入上述C Η 0培養上淸液可胰蛋白酶溶液的混合物中 以終止反應·，如此可將人類前腎活素轉化成完全成熟型的 前腎活素。 下一步，取1 0 0微升爲一份之上述反應混合物，再 將它加入固定有A n g Γ抗體之微培養盤的凹槽中依上 述方法來進行λ n g I的分析。所得之結果以棒條製圖 顯示於第3圖中，圖中由P f N —端肽抗體所引起的活 化作用，其.表示法是以由胰蛋白酶所引起之人類前腎活素 的活化作用（將此數値當做1 0 0%)的相對値來表示。 由圖中可知，p f N —端肽抗體I gG及人類前腎活素 間之複合物的活化能力會受其劑量濃度的影響。· 實施例3 取一份2 0 0微升之經稀釋的重組之人類前腎活素溶 液（濃度爲800毫微克Ang 1/毫升•小時）.將此 溶液加入由製備方法1中所製得之p f N —端肽抗體 I gG2a〇微升中，然後再將含5mM之EDTA的

(請先閱讀背面之注意事項再填艿本頁J -----{3哀------訂 •^'~^ I 1^1 »- ! — - - i I i - · -- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23 A7 B7 五、 發明説明幻） P B S 生 理食鹽水加入其中，使全部 體 積 成 爲 5 0 0 微 升 > 接 著 在4 °C下靜置2 4小時以形成人類前腎活素與 P f N 一端肽抗體IgG的複合物 D 下 一 步，取一份1 0 0微升之反 應 混 合 物 ，將 它 置 入 凝 膠 過 濾 高效液態色層分析柱中（模 型 T S K -G Ε L — G 3 0 0 OSXL ，由投索（Tos 0 ) 公 司 製備 ) 再 利 用 含 5 m M EDTA 之 PBS 生 理 食 鹽 溶 液來 進 行 洗 提 > 其 流 速設定爲0·6毫升/分’ 並 以 每 0 .3 毫 升 之 分 餾 液 爲 一份來收集該洗提液。 將 各 分餾液以5 0微升爲一份5 0 微 升 之 高壓 素 原 試 劑 混 合 在 —起，以做爲腎活素之受質 並 將 此 混合 在 3 7 °c 下 » 溫 育15分鐘，以製造Ang I 〇 妖 J» 後， 將 溶 液 刻 放 入 冰中並與含〇 . 1%之BS A 0 1 Μ 之 氯 化 鈉 及 0 05%之吐溫20的PBS 1 5 0 微 升混 合 在 一 起 使 全 部的體積成爲2 5 0微升。 下 — 步，將此反應混合物以1 0 0 微 升 爲 —份 將 它 加 入 固 定 A n g I抗體的培養凹槽中 並 將 由 製備 方 法 2 經 中 所 製 得 之以酵素標示的Ang I 溶 液 1 0 0微 升 加 入 濟 部 其 中 再 於4 °C置放2小時使反應開 始 作 用 0 然後 以 淸 央 標 洗 緩 衝 液 3 0 0微升來沖洗培養盤三次。 局 接 著 ，將反應產物與1 5 0微升 之 發 色 劑 溶液 混 合 在 消 費 —* 起 並 於 2 5 °C下置放5分鐘，然後 加 入 0 • 0 3 % 之 過 合 作 社 氧 化 氫 5 〇微升，在2 5 °C下置放30分鐘。 製 取 後 ，‘加入1 0 0微升之2 Μ硫酸以終止反應並 •於 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -------!ll·——-1-Q衣------11------Ψ 本纸張尺及通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -24 A7 ... .... 7 五、發明説明铃） ， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 5 0 nm波長處利用一微培養盤讀計來測量其光學密度 ’所得之結果以實線曲線顯示於第4圖中。由此圖中可知 ，腎活素活性（即：腎活素製造活性）主要是在持留時間 爲1 2 . 0至1 2 . 5分處之分餾液中。 在比較相中：取1 0 0微升爲一份之上述實驗中所使 用的重組之人類前腎活素溶液之相同稀釋在上述之相同情 況下進行凝膠過濾高效能液態層析法，並自每一組洗提出 之分餾液中取100微升，再以在P f N —端肽抗體I g G的複合物形成試驗中的相同方法處理之，然後將處理 好的分餾液與以過氧化酶標示之蛋白質A，發色劑溶液及 0 . 0 3%的過氧化氫混合在一起。接著，在4 5 O nm .波長處以一種微培養盤讀計來測量其光學密度，所得結果 以虛線曲線顯示於第4圖中。由此圖形中可知，以免疫分 析法所測之前腎活素幾乎大部分都存在於持留時間爲 16. 5至17.0分之間的分餾液中。 經濟部中央標羋局員工消费合作社印掣 爲了硏究持留時間與分子量之間的關係，在如上述的 相同情況下，將一種分子量記號（由思弗（Server )公司 出品）進行凝膠過濾分析以得到第5圖中所顯示.的結果， 根據此結果可知：前腎活素的分子量約爲4 3 K D至5 0 KD間，較卵白蛋白之分子量4 5KD稍大，且前腎活素 前Pf N-端肽抗體IgG之複合物的分子量約爲 200KD 至 240KD。 由上述所得之結果可推論到：展現酵素活性或腎活素 活性之免疫複合物是由前腎活素及P f N —端肽抗體的 本ϋ尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25- A7 B7 五、發明説明的） ·’ 抗原-抗體反應所形成，而An g I是由高壓素原分解 所製造的，此Ang I爲腎活素受質。 實施例4 利用人類血淸依等體積稀釋法將2 0 0毫微克A n g I /毫升'.小時之前腎活素溶液進行稀釋，以製得一系 列之稀釋溶液》自各稀釋溶液中取出10 0微升爲一份’ 來製備二組樣本溶液。 下一步，將第一組樣本溶液利用已知的胰蛋白酶活化 法來決定A n g I的製造量，並且將第二組樣本溶液以 實施例3中所得之人類前腎活素和p f N -端肽抗體之 間的複合物來決定Ang I的製造量。 第6圖爲由此方法所得之二組數値間的相關圖形’此 圖形表示在二組數値間有良好的關聯性，其相關係數r 2 = 0.9 7 2。 經漪部中央標準局員工消費合作社印製 (锖先閱讀背面之注意事¾.再填寫本頁) 接著，以稀釋用之人類血淸依等體積稀釋法來稀釋 400毫微克Ang 1/毫升•小時的前腎活素溶液以 製備一系列的稀釋溶液。自各稀釋溶液中各取一份1 0 0 微升的溶液來製備一組樣本溶液。將這些樣本以上述複合 物來測量A n g I製造量，所得之結果顯示於第7圖中 ，此爲前腎活素濃度及A n g I製造量之間的關係圖形 。由此圖形中可淸楚看到，在1 2 · 5至4 0 0毫微克 Ang I /毫升•小時的前腎活素濃度範圍中有良好的 線性。 ‘ ....... - ...... ...· ·· * ..... ...... . , ..... · * 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- 經濟部中央標準局角工消費合作社印¾ A7 B7 五、發明説明知） . 還有’以人類血淸依等體積稀釋法將起始濃度分別爲 503 . 2，160 · 4 及.70 . 6 毫微克 Ang I / 毫升•小時的高’中，低三種濃度之前腎活素溶液製備成 相對的（A) ’ ( B ) ’ (C)三系列稀釋的人類前腎活 素溶液。自各稀釋的溶液中取一份1 〇 〇微升的溶液來製 成屬於各相'對索列之三組樣本，利用上述之複合物來測量 此三組樣本之酵素活性，其結果顯示於第8圖中。由此圖 可淸楚看到，屬於各系列之稀釋溶液的結果都可得到一條 通過原點的直線。 應用實施例 利用實施例3中所得之人類前腎活素與pf N—端 肽抗體的複合物依實施例4的方法來決定自4個健康成年 男性（2 0至4 0歲）的血淸樣本中的前腎活素效價。 在比較組方面，將相同的血淸樣本利用傳統的胰蛋白 酶活化法來決定其前腎活素效價。 進行測試的4個人在這些試驗中所得的結果顯示於下 表中，其單位爲：毫微克Ang 1/毫升·小時。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) - -—-1— - ---1 - I - -!< - - - - -I Λ.. - -I - n ^^1 -- -、一3J- -I - .--- - - ---- i - -- A7 B7 經漪部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明蚱 表 編號 血淸中之前腎活素的效價毫微克 A n g I /毫升•小時 利用發明的分析試 劑 利用胰蛋白酶活化 法 1 20.5 31.5 2 28.8 24.2 3 21.1 25.9 4 3 2.2 13.9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28-

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8 871 050 8 9 々、申請專利範圍 1 . 一種人類前腎活素前片段N -端肽抗體，它能特 定地識別一段至少含1 5個胺基酸剩餘物的肽，這些胺基 酸剩餘物是從從人類前腎活素前片段N端肽中的第一個白 胺酸剩餘物至第1 5個精胺酸剩餘物。 2 . —種腎活素一活性物質，它是由如申請專利範圍 第1項之人類前腎活素前片段N -端肽抗體與人類前腎活 素的複合物所組成的。 3 .—種用來分析血中之人類前腎活素的方法，它包 含了下列步騾： (a )將血中之人類前腎活素與根據申請專利範圍第丄項 之人類前腎活素前片段N -端肽抗體進行反應以形成根據 申請專利範圍第2項之腎活.素-活性物質。 (b )將做爲腎活素受質的高壓素原加入腎活素活性物質 以形成高壓素I ;及 (c )決定高壓素I。 ---1!—一^·------ (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) --° 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） -29 -