CN1195667A - 新抗体,含有该抗体的肾素－活性物质和使用该抗体的前肾素检测试剂 - Google Patents

新抗体,含有该抗体的肾素－活性物质和使用该抗体的前肾素检测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种能特异性地识别至少含有人前肾素前片段的从第一个亮氨酸残基到第十五个精氨酸残基的15个氨基酸残基的肽的人前肾素前片段N－末端肽抗体以及其与人前肾素的复合物。该抗体可用作前肾素检测试剂。该人前肾素前片段N－末端肽抗体可用作血液中人前肾素的检测试剂。

Description

新抗体，含有该抗体的肾素- 活性物质和使用该抗体的 前肾素检测试剂
本发明涉及一种新的能和人前肾素结合形成免疫复合物的人前肾素的前片段(下文称为“pf”)的N-末端肽抗体；一种在该抗体和人前肾素结合时所形成的肾素-活性物质以及一种使用该抗体的前肾素检测试剂。
前肾素是一种没有酶活性的物质，其主要在肾脏中作为完全成熟型的肾素的前体或者作为结合有一个由43个氨基酸残基构成的前片段的完全成熟型肾素而产生。已知当糖尿病引起并发血管疾病时，血液中人前肾素的浓度随着该疾病的严重性而升高，且随着该疾病的好转而降低。因而提议把血液中人前肾素浓度作为糖尿病性血管疾病的标志物(见于“新英格兰医学杂志”(The New England Journal of Medicine)，第312册，1985，第1412-1417页，“东京女子医学院论文集”(Memoirs of Tokyo Women’s Medical College)，第60册，1990，第342-350页，以及“临床研究”(Clinical Investigator)，第71册，1993，第3-6页)。
与此相关，迄今已有几种方案用以测量人血浆中的前肾素浓度。这些现有技术方法的问题是由于人血浆既含有作为酶蛋白的完全成熟型肾素也含有作为完全成熟型肾素前体的无酶活性人前肾素，所以必需采用一种间接方法，即其中的血浆中人前肾素首先用一种酸在低温下部分活化，然后，再用胰蛋白酶将其转变成完全成熟型肾素，再用酶学方法(测肾素活性总量)或免疫学方法(测活性肾素总量)测定肾素总量，而人前肾素量则计为从上述所得的总肾素活性或活性肾素总量中减去分别用酶学方法所得的肾素活性值或通过免疫学方法所得的活性肾素量的差值。
“完全成熟型肾素”在本文中是指通过酶加工分离去其前片段部分而从前肾素衍生的结构体，并且由于酶活性部分的开放，其表现出肾素活性。上述的肾素活性是作为完全成熟型肾素固有功能的酶活性，该完全成熟型肾素是一种酶蛋白，或者，即通过选择性地作用于该肾素底物(血管紧张肽原)而产生出血管紧张肽(血管紧张肽I，Ang I)的活性。
最近发现通过利用其结合于低分子肾素抑制剂的效应可将非活性的人前肾素转变成开放型结构，并且作为该发现的结果，有可能建立一种免疫学方法通过利用能特异性地识别该肾素活性部分的临近区的一种单克隆抗体以及一种能识别人前肾素和完全成熟型肾素的单克隆抗体以测定总肾素活性以及研究出一种无需加入肾素抑制剂而测定活性肾素量以从总活性肾素和上述所测的活性肾素的差值中计算人肾素量的方法(见于“临床化学”(ClinicalChemistry)，第42卷，1996，第1051-1063页)。相比于现有技术的测定肾素活性的胰蛋白酶活化的酶学方法或者胰蛋白酶活化方法，此方法虽然在可能抑制由于胰蛋白酶的人前肾素和完全成熟型肾素的瞬时降解方面以及和胰蛋白酶活化法的良好相关性方面有优势，但有一个缺点是这里所得的肾素活性和糖尿病例(其血液中前肾素滴度升高)的真实肾素活性相比有一个正偏差。
此外，已知一种免疫学测定方法，其是通过利用能识别作为抗原的人前肾素的pfC末端，或者即第29-43位氨基酸残基的单克隆抗体以及能识别该单克隆抗体和完全成熟型肾素的肾素单克隆抗体的直接方法(见于“临床内分泌和代谢杂志”(Journal of Clinical Endocrinology and Matabolism)，第75卷，1992，第617-623页)。
由于此法除了和胰蛋白酶活化法有极佳的相关性外，其灵敏度甚至高到了能用于测定取自健康人的血液中的前肾素滴度，所以此法是有优势的。另一方面，此法的缺点是通过本测定所得的值相比于胰蛋白酶活化法的有一个低到约80％的负偏差的趋势，这种趋势对那些表现出升高的人前肾素滴度的病人尤其明显，以及识别肾素单克隆抗体的部分的不确定性。
本发明的主要目的因而是通过克服胰蛋白酶活化法的缺点而提供一种通过利用一种肾素抑制剂测定活化的总肾素活性而测定人前肾素的间接法以及一种利用能识别在现有技术中作为抗原的人前肾素的pf的C末端的抗体的直接免疫法，一种能精确地和方便地测定糖尿病性血管疾病发生的检测前肾素的试剂。
因此，本发明提供了一个能特异地识别作为抗原的包括人前肾素前片段的N末端肽的从第一位的Leu残基到第十五位的Arg残基的氨基酸残基的肽的人前肾素前片段的N-末端肽抗体。
此外，本发明提供一种新的肾素-活性物质，其是人前肾素和上述人前肾素前片段的N末端肽的复合物。此人前肾素前片段的N末端肽抗体可用于作前肾素检测试剂的有效成份。附图的简述：
图1是表示当人前肾素和pf的N末端肽抗体IgG反应时，该IgG浓度和人前肾素量间的关系的图。
图2是表示在人前肾素和pf的N末端肽抗体反应时，pf的N-末端肽抗体的抑制活性的图。
图3是表示前肾素和pf的N末端肽抗体的复合物的激活能力的剂量依赖性的图。
图4是表示pf的N末端肽抗体的前肾素结合能力和凝胶过滤层析中的洗脱组分间的关系的图。
图5是表示前肾素分子量和pf的N末端肽抗体间的对比检测的图。
图6是表示胰蛋白酶活化方法和使用本发明的检测试剂的方法的相关性的图。
图7是表示该前肾素浓度和Ang I产生量间的相关性的图。
图8是表示本发明的检测试剂的酶活性对三种人前肾素的浓度函数的图。
本发明人事先研制了一种通过利用能特异性地识别由43个氨基酸残基组成的人前肾素的pf部分的抗体的检测人前肾素的试剂(见于日本专利公开8-285852)。作为进一步研究的结果，他们成功地得到能特异性地识别作为抗原的人前肾素的pf N末端的1-15位氨基酸残基组成的肽的高度亲和性抗体，并且还发现了在该pf N末端抗体结合于人前肾素时形成肾素活性物质，从而可能通过应用该测定AngI竞争性酶的免疫学方法(见于“临床和实验性高血压-理论和实践”(Clinical and Experimental Hypertension-Theory andPractice)，A12卷，1990，第83-95页)精确地测定血液中前肾素滴度并进而完成基于该发现的上述本发明。
可用诸如下列方法制备按照本发明的人前肾素的pfN末端肽抗体。
首先，通过固相肽合成法合成了对应于人前肾素pfN-末端肽的由Leu-Pro-Thr-Asp-Thr-Thr-Thr-Phe-Lys-Arg-Ile-Phe-Leu-Lys-Arg氨基酸残基组成的肽并从而通过使用诸如顺丁烯二酰亚胺化合物的交联剂将该合成肽与一种诸如牛血清白蛋白，卵白蛋白和匙孔血蓝蛋白(keyhole lympet hemocyanin)的载体结合以给出一种免疫抗原。
其次，将每种该免疫抗原和弗氏完全佐剂充分混和，并通过给药而免疫体重大约2.5公斤的成年兔。每两周重复此免疫处理一次，并在第五次处理后，从耳缘静脉取少量血以用于抗体滴度检测。当该抗体滴度充分升高时，对兔采全血并从中获得抗血清。这样得到的抗血清上二乙氨乙基-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose)层析以给出pfN-末端肽抗体IgG。
为了代替通过用免疫抗原免疫兔所得的多克隆抗体，另一个替代的方法是可以通过用该免疫抗原按迄今已知的方法免疫小鼠而制备单抗。
通过假定该IgG的分子量为150,000而从在280纳米(nm)波长处的光密度计算出pf N末端肽抗体IgG的蛋白量为2.6毫充/毫升(mg/ml)。该pf N末端肽抗体是一种呈现出对人前肾素有强烈亲和性的并特异性地作用于该pfN末端的抗体。
通过结合该pfN末端肽抗体和人前肾素可得有酶活性或者，即肾素活性的物质。该肾索活性物质的制备步骤如下。
因此，人前肾素溶液和用含牛血清的生理盐水溶液稀释的该pfN末端肽抗体混合，将该混合物置于4℃下16-24小时。然后，将该反应混合物和绵羊血管紧张肽原溶液(作为人前肾素的底物)混合并在37℃下温育15分钟以进行进一步的反应，然后在冰浴中速冷终止反应。
将用此法所得的肾素活性物通过与用胰蛋白酶活化的人前肾素相比较而检测该产生Ang I活性，发现该pfN末端肽抗体的肾素活性随着稀释度而相应地变化。
图1是以按本发明的pfN末端肽抗体的人前肾素作为例子，表明抗体和人前肾素反应中的IgG浓度和该反应混合物在450nm波长处的光密度间的关系的图。该图提示：按照本发明的人前肾素pfN末端肽抗体和人前肾素间的高度的亲和性。
图2是当人前肾素pf N-末端肽抗体和一种合成的pf N-末端肽混合时，肽浓度和其在450nm波长处的光密度间的关系图。此图表明：人前肾素和人前肾素pf N-末端肽抗体间的连结被合成的pf N-末端肽完全抑制，或者，即该连结对人前肾素有特异活性。
图3是柱状图表，表示，以通过人前肾素和人前肾素pfN-末端肽抗体反应所得的复合物为例，用相对值(视用胰蛋白酶活化的人前肾素的肾素活性为100％)给出的作为浓度函数的肾素活性。此图表显示上述复合物表现依赖于此处所用的人前肾素pfN-末端肽抗体IgG的量的肾素活性。
此外，将该人前肾素pfN-末端肽抗体IgG和人前肾素的复合物通过凝胶过滤高效相色谱进行分级分离，并将每一级分进行酶活性检测以得到图4中实线所示的结果。类似地，图4的虚线表示在凝胶过滤色谱后通过使用该pfN-末端肽抗体和酶标记的蛋白质A的酶免疫检测所得的结果。
图5示分子量和几种已知蛋白的保留时间间的关系，该已知蛋白包括分子量为450千道尔顿(KD)的铁蛋白、分子量为67KD的牛血清白蛋白、分子量为45KD的卵白蛋白以及分子量25KD的糜蛋白酶原，其分别以位置A，B，C和D表示，而人前肾素和pfN-末端肽抗体IgG间的复合物，以及人前肾素的保留时间则分别用箭头和II表示。
如从图4和5中所知，复合物的酶活性大多见于保留时间为12.0-12.5分钟的级分，而人前肾素的则见于保留时间为16.5-17.0分钟的级分。
从上述事实得出结论：该酶活性是通过分子量为43-50KD的人前肾素和分子量为150KD的人前肾素pf N-末端肽抗体IgG间的分子量为200-240KD的复合物而展现的。
图6示用上述复合物的检测和用胰蛋白酶活化方法所得的人前肾素滴度间的相关性。此图表明在两个数值间发现有γ＝0.986的极好的相关性。
使用该复合物作为一种前肾素检测试剂，检测不同浓度的人前肾素试验发现前肾素浓度在12.5-400ng Ang I/ml·小时的范围内有良好的线性关系。
此外，如图8所示，使用上述同样的复合物作为检测试剂测定用人血清稀释成或高，中和低浓度的人前肾素血清发现Ang I产生和每一稀释度间有良好的比例关系。
上述检测试验具有良好的重现性，其变异系数在n＝7的不同浓度的同时重复测试中为1.8-5.5％，而对n＝5的每天重复测试则为3.8-7.5％。
从上述结果得出结论：按照本发明的人前肾素pfN-末端肽抗体表现出对人前肾素的高度的亲和性以及对pfN-末端的特异活性，而且此抗体和人前肾素间的复合物具有酶活性，其活性和浓度有良好的相关性以至于该复合物可用作前肾素检测试剂。
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明，然而，没有一个实施例以任何方式限制本发明的范围。以下分别是用于实施例中的试剂的制备步骤。该前肾素的滴度表达是参照产生Ang I的活性而进行的。(1)色原溶液
该溶液是通过将四甲基联苯胺(下文称为TMB)溶于pH6.5的乙酸盐缓冲液(浓度为5.5毫摩尔/升(mM))而制备的。(2)血管紧张肽原试剂
从双例肾切开术48小时后的绵羊取血并立即分离血清，冻干。将如此获得的一份20mg的这样得到的干燥物溶于1升0.2摩尔/升(M)磷酸缓冲液(pH 6.5，含10毫摩尔(mmoles)二异丙基氟磷酸(DFP)和10mmoles EDTA，下文称为PBS)以得到该试剂。(3)洗涤缓冲液：
该溶液通过将表面活性剂吐温20(Tween20)以0.05％重量浓度溶于PBS生理盐水溶液中而制备。(4)用于稀释的人血清：
由Nippon Biological Materials Center公司供应的市售正常人血清通过使用能识别完全成熟肾素和人前肾素的抗体进行亲和层析以吸附完全成熟肾素和人前肾素，再通过在56℃下加热的灭活处理30分钟。制备1
用下列方法制备重组人前肾素主溶液。按照Murakami等的报告于高血压杂志，第4卷，第S388-S390页(1986)的方法，将一种已导入衍生于人肾脏的人前肾素cDNA的表达载体构建于中国仓鼠卵巢细胞(下文称为CHO细胞)并培养于Dulbecco改进的Eagle培养基(含10％胎牛血清)，随后当该CHO细胞已充分生长时，代替以无血清培养基以获得含有该重组人前肾素的培养上清液。
将如此获得的一份5ml的CHO培养上清液对含5毫摩尔/升(mM)EDTA的PBS生理盐水溶液透析，随后调节该所得的重组前肾素的浓度到200微克(μg)Ang I/ml·小时以获得重组前肾素主溶液，贮存于4℃下。制备2
以下述方法制备酶标记Ang I。将1ml 2.5％的戊二醛溶液在剧烈搅拌下滴加入通过将5mg辣根过氧化物酶溶于500微升(μl)0.2M PBS所得的溶液中。滴加完戊二醛溶液后，将该混合物再在25℃下搅拌30分钟，然后在冰浴中速冷下用滤膜(Zaltrius公司)将其浓缩至体积为约100μl，再用凝胶过滤除去过量的戊二醛以回收该酶组分。
其次，进一步浓缩该混合物并和130μl的通过将1mg合成的Ang I肽溶于1ml纯水而制备的溶液混合并在30℃下温育2小时。然后，通过加入100μl0.2M的赖氨酸水溶液而终止反应并再将反应混合物浓缩到100μl的体积，通过凝胶过滤除去未反应的AngI以给出所需的酶标记的AngI溶液。
将如此所获的酶标记Ang I溶液和牛血清白蛋白(下文称为BSA)以0.1％浓度混合以得到一种酶标记Ang I主溶液，贮存于-80℃下。
在用含0.1％BSA，0.1M NaCl和0.05％Tween 20的PBS稀释3000倍后，可以使用如此制备的主溶液。制备3
用下列方法制备Ang I抗体，将6.8mg市购的合成的Ang I肽溶于1ml0.2M的PBS得到一种溶液，再在其中滴加入溶于0.5ml四氢呋喃的3.4mg间-马来酰亚胺基苯甲酸N-脱水琥珀酰亚胺酯(下文称为MBS)溶液。
将该溶液置于30℃下30分钟，随后通氮气蒸发四氢呋喃。将残留液在搅拌下和5ml二氯甲烷混合，随后通过离心相分离以得到作为水相的MBS和Ang I的溶液。
将通过将10mg BSA溶于500μl的含0.1M EDTA的6M尿素溶液而制备的溶液分别和20mg硼氢化钠及100μl作为消沫剂的正丁醇混合并静置30分钟，随后加入1ml 0.2M PBS和0.4ml丙酮以得到还原BSA。
将Ang I和MBS的溶液以及上述所制的还原BSA混合在一起并在37℃下温育2小时以进行反应，随后对PBS透析以除去未反应的Ang I。
用如此所得的反应产物作为免疫抗体进行免疫处理以得到Ang I抗血清。制备4
用下列方式制备Ang I抗体板。将制备3所得的Ang I抗血清用0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释5000倍并将100μl的一份如此稀释液加入到96孔微孔板的每一孔以进行免疫检测(Maxisorp，Nunc公司产品)，在4℃下静置16-24小时。然后，弃去孔中稀释液并代置以每孔200μl PBS生理盐水溶液(含1％酪蛋白)，随后在4℃下静置至少16小时以固定Ang I抗体。然后将所制板贮存于4℃下。
                         实施例1
将一种通过将16mg匙孔血蓝蛋白的溶于pH 7.2的0.1M PBS所制的溶液和100μl的15mg/ml的N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺(N-(γ-maleimidobutyroxy)succimide)的二甲基甲酰胺溶液混合并在室温下静置3小时。反应完成后，通过将混合物过葡聚糖(Sephadex)G-25柱分离反应混合物中的未反应的N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺。然后，用0.1M PBS(pH6.0)洗脱该反应产物，并将该洗脱液和10mg由除去保护基的该前肾素的pf N-末端的1-15位氨基酸残基组成的合成肽混合，并静置于室温下3小时以得到作为免疫抗体的前肾素和pfN-末端合成肽血蓝蛋白的复合物。将该溶液贮存于-80℃下直至用于免疫动物。
用生理盐水稀释如此制备的免疫抗体到1mg/ml蛋白浓度并进一步用等体积的完全弗氏佐剂混合。将如此制备的全体积溶液皮下注射到体重约2.5kg的新西兰大白兔的几处。以两周的时间间隔免疫该兔7次，每次所用免疫抗体的体积为第一次的一半。最后一次免疫后，收集该兔全血并从中制备抗血清。
将如此制备的抗血清对pH 7.0的0.1M PBS透析，随后浓缩，加入100倍体积的通过溶解100克叠氮钠NaN3于1升生理盐水中而制备溶液，贮存于4℃下。
将1ml的一份上述所得抗血清溶液用硫酸钠进行盐析处理并将沉淀的固体溶于17.5mM PBS(pH 6.3)。将该溶液对同样的PBS透析过夜并以0.3-0.5ml/分钟的流速通过用相同PBS平衡的DEAE Sepharose柱以收集在280nm波长处有光吸收的级分。此级分溶液对pH 7.0的0.1M PBS透析并用Centricon-30(Amicon公司制造)浓缩，随后加入100倍体积的上述NaN3溶液(100g/升)，贮存于4℃下。
从280nm波长处的光密度并假定该IgG的分子量为150,000计算出该所得的pfN末端肽抗体IgG中的蛋白质含量是2.6mg/ml。
其次，以下列方式进行了该所得的pfN-末端肽抗体IgG和人前肾素的结合活性检测。
因此，用0.05M，pH 9.6的碳酸钠缓冲液稀释上述制备1中所制备的浓度为200μg Ang I/ml·小时的重组人前肾素主溶液到浓度为1μg Ang I/ml·小时并将此稀释液加入96孔微孔板(Polysorp，Nunc公司产品)的每一孔以进行免疫分析，在4℃下至少静置16小时。然后，弃去孔中的稀释液并代替以每孔200μl PBS生理盐水溶液(pH 7.4，含1％酪蛋白)，随后在4℃下静置至少16小时以得到固定了前肾素的微孔板，贮存于4℃下。
其次，用pH 7.2且含0.1％BSA和0.05％Tween 20的PBS生理盐水稀释上述的N末端肽抗体IgG到10-109倍的不同程度。将100μl一份的每种稀释溶液加入到固定了前肾素的微孔板的孔中并在室温下静置2小时以进行反应，然后加入100μl的通过将含有0.1％BSA，0.1M NaCl和0.05％Tween 20的过氧化物酶标记的A蛋白(Zymed Laboratories公司产品)稀释4000倍而制得的溶液，在室温中静置2小时进行反应。反应完成后，弃去孔中的上述溶液，用300μl洗涤缓冲液反复洗涤5次。
然后，将150μl的一份色原溶液加入到微孔板的每孔中，在37℃下温育5分钟后，加入50μl的一份0.03％过氧化氢溶液，在37℃下温育30分钟。
最后，加入100μl 2M硫酸终止反应，在450nm波长下用微孔板阅读仪(Molecular Device公司制造)测定光密度得到如图1所示的结果。从该图中可清楚地看出，该pfN-末端肽抗体IgG对人前肾素表现出强烈的亲和性。
其次，利用下述抑制试验研究该pfN-末端肽抗体IgG的特异性。
将1mg用于制备抗体的上述pfN-末端合成肽溶解于1ml含有BSA和Tween 20的PBS生理盐水中，用相同的PBS生理盐水以10-107倍的不同程度稀释该溶液以制备一系列稀释液。将取自每种这样稀释的溶液的500μl一份的和10μl pfN-末端肽抗体IgG混合，并将100μl的一份该溶液加入到前肾素-固定的微孔板孔中，并将其置于室温下2小时。
反应完成后，用300μl缓冲液反复洗涤该微孔板五次，并在孔中加入1001μl的一份过氧化物酶标记的A蛋白的溶液以在450nm波长处以相同于抗体滴度测定的方法测定光密度从而得到了如图2所示的结果。从图中可了解到该pf N-末端肽抗体和人前肾素间抗原-抗体反应被作为抗原的pf N-末端合成肽完全抑制，或者换句话说，该pf N-末端肽抗体具有抗原特异性。
                            实施例2
用pH 7.0，且含有1％BSA的PBS生理盐水溶液将制备1所得的CHO培养上清液稀释10倍，取200μl这样的稀释液和40μl抗血清溶液(通过用pH7.6且含0.1％BSA的PBS生理盐水液以10-108倍的各种稀释度稀释pfN-末端肽抗血清而制得)混合，并置于4℃下16小时。
然后，将50μl的一份每种以上得到的反应混合液和150μl血管紧张肽原试剂混合，并在37℃下温育30分钟。
其次，取100μl的一份以上得到的反应混合液分批加至制备4所得的AngI抗体-固定的微孔板，加入100μl制备2所得的酶-标记的Ang I并置于4℃下2小时。反应完成后，用300μl洗涤缓冲液重复洗涤微孔板3次，并加入150μl色原溶液，在37℃下温育5分钟，再加入50μl的一份0.03％过氧化氢溶液，在37℃下温育30分钟以进行反应并显色。
最后，加入100μl 2％硫酸终止反应并用微孔板阅读仪在450nm波长处测定光密度。
分别将制备I所得的200μl的一份CHO培养上清液和5μl的通过将1mg的源于牛胰脏的胰蛋白酶(Sigma公司产品)溶于1ml的1mM盐酸而制备的溶液并置于25℃下10分钟，加入5μl的通过将2mg的大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma公司产品)溶于1ml，pH 7.4，0.2mM的PBS而终止该胰蛋白酶反应从而将人前肾素转变成完全成熟的前肾素。
其次，用上述方法将100μl的一份以上所得的混合液加入Ang I抗体-固定的微孔板孔中进行Ang I检测。这样所得的结果在图3中以柱状图表表示为以人前肾素的胰蛋白酶活化值(即Ang I产生量)为100％的pf N-末端肽抗体的相对活性。正如从此图可理解的那样，pfN-末端肽抗体IgG和人前肾素的复合物呈现出活化能力的剂量依赖性。
                         实施例3
将2μl的一份浓度为800ng Ang I/ml·小时的稀释的重组人前肾素液加入到制备1所得的200μl pfN-末端肽抗体IgG中，再加入含5mM乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS生理盐水液使总体积达500ul，随后在4℃下置24小时以形成人前肾索和pfN-末端肽抗体IgG的复合物。
其次，将100μl的一份该反应混合液加到凝胶过滤HPLC柱(TSK-GEL-G3000SXL型，Toso公司制备)，用含5mM EDTA的PBS生理盐水液以0.6ml/分钟流速洗脱以收集0.3ml的每级分洗脱液。
将取自每个级分的50μl的一份和50μl的作为肾素底物的血管紧张肽原试剂制混合，在37℃下温育15分钟生成Ang I，随即将该溶液转移至冰上，并和150μl含0.1％BSA，0.1M NaCl和0.05％Tween 20的PBS混合使总体积达250μl。
其次，取100μl的一份该反应混合液加入到Ang I抗体-固定板的每一孔中，再加入制备2所得的100μl的一份酶标记的Ang I液，随后置于4℃下2小时以进行反应。然后，用300μl洗涤缓冲液重复洗涤该板3次。
其次，将该反应产物和150μl色原溶液混合并置于25℃下5分钟，随后加入50μl 0.03％的过氧化氢液，在25℃下30分钟。
最后，加入100μl 2％硫酸终止反应，并用微孔板阅读仪测定450nm波长处的光密度从而得到图4中实线所示的结果。从此图中可了解到肾素活性(即肾素生产活性)大多发现于保留时间为12.0-12.5分钟的级分中。
为了比较，将100μl的一份同样稀释的以上所用的重组人前肾素溶液的溶液在与上述相同的条件下进行凝胶过滤HPLC，并以与pfN-末端肽抗体IgG的复合物形成检测中同样的方法处理取自每一洗脱级分100μl的各份，并和过氧化物酶标记的A蛋白，色原溶液及0.03％过氧化氢溶液混合，随后通过微孔板阅读仪测定450nm波长的光密度从而得出如图4的虚线所示的结果。由此图了解到免疫分析法检测的该前肾素表现出其几乎全部见于保留时间为16.5-17.0分钟的级分中。
为研究保留时间和分子量间的关系，将分子量标记物(Server公司产品)在与上相同的条件下进行凝胶过滤，结果如图5所示。从图上可见前肾素具有比卵清白蛋白的分子量45KD稍大的大约43KD-50KD的分子量，而前肾素和pfN-末端肽抗体IgG的复合物的分子量则为200KD-240KD。
从以上得到的结果得出一个结论：表现出酶活性或者肾素活性的免疫复合物是通过前肾素和pf N-末端肽抗体的抗原-抗体反应而形成的而Ang I是通过降解作为肾素底物的血管紧张肽原而产生的。
                           实施例4
通过用人血清等体积稀释200ng Ang I/ml·小时制备一系列稀释液，并从每种稀释液取100μl的一份而制备两套样品。
其次，用已知的胰蛋白酶活化法检测第一套样品液的Ang I产生，而第二套样品液则使用实施例3所得的人前肾素和pfN-末端肽抗体的复合物测定Ang I产生。
图6示用此方式得到的两套数值的相关性，其表明两者间有相关系数为γ2＝0.972的良好相关性。
接着，用人血清等体积稀释400ng Ang I/ml·小时的前肾素溶液制备一系列稀释液，再从每个稀释液中各取100μl的一份而制备一套样品。通过用上述复合物测定这些样品的Ang I产生量得到如图7所示的结果，图7表示前肾素浓度和Ang I产生量间的关系。根据此图，显然在前肾素浓度从12.5到400ngAng I/ml·小时的范围内有良好的线性。
此外，用人血清分别等体积稀释浓度为503.2，160.4和70.6ng Ang I/ml·小时的高，中，和低浓度起始溶液制备(A)，(B)，(C)三个系列的稀释的人前肾素溶液，分别从各个系列的每种稀释液中取100μl的一份制备三套样品，用上述复合物测定酶活性以得出图8所示的结果。根据此图，显然对每个系列的稀释液得到通过起点的直线。
                         应用实施例
实施例3所得的人前肾素和pfN-末端肽抗体的复合物用于以相同于实施例4中的方法测定那些取自年龄在20-40岁的四个健康成年男子的血清样中的前肾素滴定。
为了对比，用常规的胰蛋白酶活化方法测定相同血清样的前肾素滴度。
对四个受试者中的每一个，这些实验所得结果以ng Ang I/ml·小时的单位示于下表。
                    表
  病例号     血清中的前肾素滴度，ng Ang I/ml·小时
  用本发明的检测试剂   通过胰蛋白酶活化
    1          20.5         31.5
    2          28.8         24.2
    3          21.1         25.9
    4          32.2         13.8

Claims (3)

1.一种能特异性地识别至少含有人前肾素前片段的N-末端肽的第一位亮氨酸残基到第十五位精氨酸残基的15个氨基酸残基的肽的人前肾素前片段的N-末端肽抗体。
2.一种由如权利要求1的人前肾素前片段N-末端肽抗体和人前肾素的复合物组成的肾素-活性物质。
3.一种检测血液中人前肾素的方法，其包括步骤：(a)血液中人前肾素和如权利要求1的人前肾素前片段N-末端肽抗体反应形成如权利要求2的肾素-活性物质；(b)将作为肾素底物的血管紧张肽原加入该肾素-活性物质以生成血管紧张肽I；以及(c)测定血管紧张肽I。
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