JPS63123395A - 抗ｐｃｉモノクローナル抗体、これを用いた抗ｐｃｉの精製法及び免疫学的測定法 - Google Patents

抗ｐｃｉモノクローナル抗体、これを用いた抗ｐｃｉの精製法及び免疫学的測定法

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JPS63123395A JP61269588A JP26958886A JPS63123395A JP S63123395 A JPS63123395 A JP S63123395A JP 61269588 A JP61269588 A JP 61269588A JP 26958886 A JP26958886 A JP 26958886A JP S63123395 A JPS63123395 A JP S63123395A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト胎盤よシ分離精製した抗血液凝固活性を
有する物質（以下ＰＣＩと略称する）に対して特異的な
モノクローナル抗体、これを産生ずるハイプリドーマお
よびその利用に関する。
〔従来の技術〕
細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報告（Ｎａ
ｔｕｒｅ　、　４９５〜４９７頁、１９７５年）以来急
速に発展した。すなわち、哺乳動物の牌細胞とミニロー
マ（骨髄腫）細胞とを融合させた雑種細胞（ハイプリド
ーマ）は、用いだ牌細胞の性質に応じて種々の抗体を産
生することが知られている。そしてこのハイプリドーマ
の性質を利用してクローニングをすることにより、種々
の蛋白質、ホルモン等の生体物質に対するモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイプリドーマを作製すること、並び
にモノクローナル抗体を生産する試みがなされている（
　Ｅ、Ｄａｌｅ　５ｅｒｖｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｃ
ＩｉｎｉｃＣｌｌｎｉｃａｌＣｈｅ　、　Ｖｏｌ、　２
７　、Ａｌｌ　、　１７９７〜１８０６゜１９８１）。
一方、本出願人は先にヒトの胎盤から抗血液凝固活性を
有する物質（ＰＣＩ）を分離精製することに成功し、特
許出願した（特願昭６０−２１７５１２号）。に工は下
記の性質を有する医薬として有用な物質である。
■　分子量（ＳＤＳ　−、ｌｅソリアクリルアミドダル
電気泳動法還元状態） ３４．０００±２，０００ ■　等電点（アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） ４．７±０．１ ■　安定性 ■　５０℃、３０分加熱処理で失活 ＠ｐＨ４〜１０で安定 θ　血漿中３７℃、３０分で安定 ■作用 ■　カルシウム回加凝固時間を延長 ■　プロトロンビン時間を延長 θ　活性化部分トロンボシラスチン時間を延長 ■　アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アス、Ｑラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、デロリ／、グリシン、アラニン、％
シスチン、バリン、メチオニン、インロイシン、ロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リシン
及びアルギニンの存在が認められる。
ＰＣＩの製造法は、その−例を後記実施例１に示したが
、要約すれば以下のとおりである。
まず、ヒト胎盤から胎盤ホモシュネートを調製し、遠心
分離をおこなう。ホモジナイズ操作は、胎盤よシ羊膜等
を切除した後、生理食塩水にて充分洗浄し、ワーリング
プレンダー及び？リドロンをｍ６ておこなう。？ｉれた
ホモジネートを遠心分離に付し、上滑及び沈渣を得る。
こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣は、緩衝液で充
分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取し、以後
の抽出操作に付す。即ち、洗浄沈渣は、ＥＤＴＡ　、団
ＴＡ、　　クニウ酸、クエン酸、ニトリロ三酢酸ナトリ
ウム、リン酸等のキレート剤を含む緩衝液及び／又は、
トリトンＸ−１００、ルプロール、５Ｌ）Ｓ　、デオキ
シコール酸等の界面活性剤を含む緩衝液に浸し、４Ｃ〜
８℃にて一晩放置後、遠心分離して上清を集め抽出液を
得る。この場合、抽出は、キレート剤及び界面活性剤の
両方を用いて行なうこともできる。
一方、胎盤ホモジネート上清は、更に ｓｏ、ｏｏｏ〜１００，０００Ｆの超遠心分離して沈渣
部分であるマイクロシーム分画を得る。このマイクロシ
ーム分画を洗浄後、上記と同様にして、キレート剤及び
／又は界面活性剤抽出を行なった後、超遠心分離して上
清を集め抽出液を得る。
このようにして得られた抽出液は、硫安分画に付される
。硫安分画は、先づ上記抽出液に３５％飽和となるよう
に固形硫安を加えて遠心分離し上清を分取する。次いで
、上清に対し８５％飽和となるように硫安を加えて遠心
分離し、沈渣を分取することによりおこなわれる。
得られた硫安分画は、更に公知の分離・精製手段、例え
ば透析、イオン交換クロマトグラフィー、グル濾過、吸
着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、等
電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体を用いたアフ
ィニティー・クロマトグラフィー等を単独又は組合せ用
いることによシ精製され、に工が得られる。例えば、キ
レート剤又は／及び界面活性剤は抽出液を硫安分画して
得られた両分を充分透析し、この透析液をＤＥＡＥ　−
）い コノ９−ルを用る直線濃度勾配法によシ溶出させ、活性
画分を透析した後、ブルーセファロースを通過させる。
次いで活性画分を濃縮し、セファデックスＧ−１００を
用いるグル濾過させることによりに工を得る。
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかし、胎盤中のＰＣＩは微量であシ、また通常使用さ
れる各種クロマト法では、ＰＣＩとの特異的結合が充分
ではなく、高純度のに工を取得することは困難であり、
加えて工程が長く回収率も満足のいくものではなかった
。
従って、高純度のＰＣＩを簡便に高回収率で取得する特
異的精製法の開発が望まれていた。
また、抗血液凝固剤としての用途において、に工の作用
メカニズムの解明、血中濃度の測定等の手段として、Ｐ
ＣＩの高感度検出法の」発も望まれていた。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らは、これらの問題点を解決すべく鋭意研究を
重ねた結果、細胞融合によシに工に対して特異的なモノ
クローナル抗体を産生ずるハイプリドーマを得、このハ
イプリドーマを利用してに工に特異的なモノクローナル
抗体を取得できること、さらに該モノクローナル抗体を
利用すればＰＣＩの高純度精製、免疫学的定量ができる
ことを見い出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、ＰＣＩに対して特異的なモノクロー
ナル抗体、該モノクローナル抗体を産生ずるハイプリド
ーマ、該モノクロ−たル抗体を免疫吸着剤として使用す
ることを特徴とするＰＣＩの精製法、並びに該モノクロ
ーナル抗体の標識体を使用することを特徴とするＰＣＩ
の免疫学的測定法を提供するものである。
ＰＣＩに対して特異的なモノクローナル抗体を産生ずる
ハイプリドーマは、例えば次の如くして製造される。す
なわち、（１）抗原とじてに工を用いて免疫した動物か
ら抗体産生細胞を調製し、（２）別に骨髄腫細胞を調製
し、（３）これらの細胞を融合させ、（４）得られた・
・イブリドーマを選択的に増殖させ、（５）該ハイプリ
ドーマから抗体産生ハイプリドーマを検索し、（６）ク
ローニングにより目的とするモノクローナル抗体産生ハ
イプリドーマを得る。次に各工程について説明する。
（１）抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよく、抗原
であるＰＣＩで動物を免疫し、その動物の抗体産生細胞
を取得する方法によればよい。動物としては、マウス、
ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示され、
抗体産生細胞としては牌臓、９７１９節、末梢血液等か
ら分離した細胞などが使用される。
免疫方法としては、フロイントのコンプリードアシュパ
ントを併用する方法が使用される。
（２）骨髄腫細胞の調製 細胞融合に使用する骨髄腫細胞は、特に限定されず、多
くの噴孔動物の細胞株が利用できるが、抗体産生細胞の
調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するのが
好ましい。
用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合の骨髄腫細胞
が選択培地で生存できず、ノ・イブリドーマだけが増殖
できるようにすることによって、未融合細胞と融合細胞
とを分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗性を有する
ものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗性の細胞
は、ＨＡで培地中で生育できない性質を有するため好ん
で用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞株ＰＡＩ
、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８゜Ｐ３−ｘａ　３−Ａｇ８−Ｕ
ｌ　、　Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１　。
Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３．、ＳＰ２１０−Ａｇ１４
．Ｆｏ。
８１９４１５ＸＸＯ，ＢＵ、１　、ＭＰＣＩＩ−４５，
６，ＴＧ、　１゜７等が用いられる。
（３）　　＃胞融合 細胞融合は、通常■■培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、
■■ｙ培地などの培地中で、骨ｆｌｉｔ　Ｉｌｉ細胞と
抗体産生細胞を混合（混合比は通常ｌ：４〜１　：　１
０）することにより行なわれる。融合促進剤としては、
平均分子量１，０００〜６．ｏｏ。
の？リエチレングリコール（ＰＥＧ　）が使用できる。
ＰＥＧの使用濃度は通常３０〜５０％である。
（４）ハイプリドーマの選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、１ｏｓｓｅｓ含有工■■培地
などで適当に希釈し、遠心分離する。
沈渣を選択培地（たとえば、ＨＡＴ培地）で浮遊し、９
６ウエルマイクロプレートに接種した後、５％炭酸ガス
培養装置で培養する。選択培地で生育してくる細胞はハ
イプリドーマである。
（５）抗体産生ハイプリドーマの検索 抗体産生ハイプリドーマの検索は、常法に従えばよく、
特に限定されない。たとえば、ハイプリドーマの増殖し
た培養液を採取し、ＰＣＩと反応させたのち、酵素、ケ
イ光物質、発光物質などでラベルした第２抗体との反応
によシ検索できる。
（６）クローニング 抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウェ
ル中の細胞を限界希釈法などによυクローニングを行な
い、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを得る。
以上の操作によってＰＣＩに特異的なモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマＰＣＩ−Ｈ３９、ＰＣＩ−Ｈ４６
、ＰＣＩ−Ｈ１６７、にｌ−Ｈ１６９、にニーＨ１７６
、にｌ−Ｈ１８０を得た。これらのノ・イブリドーマは
それぞれに工に特異的なモノクローナル抗体を産生ずる
新規な細胞である。
そこでこれらの細胞について工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託すべく手続を行なったが、６１微寄文第１
４１５号として拒否された。
ＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体は、上記で得られ
た抗体産生ハイブリドーマを利用することによシ調製さ
れる。すなわち、抗体産生ハイプリドーマを適当な培地
中で培養することによシ、その培養上清から本発明モノ
クローナル抗体が得られる。また、モノクローナル抗体
を大量に製造するには、骨髄腫細胞の由来動物と同種の
動物にシリスタン（２゜６．１０．１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、抗体
産生ハイプリドーマを接種することにより、インビボで
抗体産生ハイプリドーマを大量に増殖させる方法が用い
られる。この方法によれば、接種した動物の血清および
腹水中に高濃度のモノクローナル抗体が生ずる。モノク
ローナル抗体の分離精製は、通常の血清からの抗体の精
製に使用されている方法に従って実施できる。
斯くして得られた本発明モノクローナル抗体は、使用す
る抗体産生ハイブリドーマの種類によりにｌ−Ａ３９、
にｌ−Ａ４６、にＩ−Ａ−１６７、ＰＣＩ−Ａ１６９、
ＰＣＩ−Ａ１７６およびにｌ−Ａ１８０の６種類存在す
る。これらのモノクローナル抗体は、表１に示す性質を
有する。なお表１中、分子量はＳＤＳ　−、ｔＥ’リア
クリルアミドグル電気泳動法によシ、等電点は等電点電
気泳動法（ＬＫＢ−カラム等電点電気泳動装置）によシ
、免疫グロブリンサブクラスはオクタローニーの二重免
疫拡散法〔ウサギピリクローナル抗体（マイルズ社製）
使用〕により測定した。
本発明モノクローナル抗体を免疫吸着剤として利用する
ことによって、ＰＣＩを精製する方法は、例えば本発明
モノクローナル抗体をデキストラングル、アガロースダ
ル、？リビニルダル等の不溶性担体に結合させ、該モノ
クローナル抗体結合担体を免疫吸着剤として用い、カラ
ムクロマトグラフィーに付すことにより実施される。不
溶性担体とモノクローナル抗体との結合は、ブロムシア
ン法やニーキシ、アミン、カルボキシル、モジくハホル
ミル基等を介して結合させることができる。
このモノクローナル抗体結合不溶性担体からなるカラム
に粗に工を添加し、カラムに吸着したＰＣＩを溶出させ
ることにより高純度のＰＣＩが得られる。
本発明モノクローナル抗体の標識体を利用するに工の免
疫測定法は、例えば本発明モノクローナル抗体を酵素、
各種のアイソトープ、螢光物質等の標識剤で標識し、こ
れにに工を含む試料を加え、に■と標識体との免疫反応
生成物の標識量を測定することによって実施される。ま
た一般的な方法としてＥＬＩＳＡ法を用いることもでき
る。
〔発明の効果〕
本発明のハイプリドーマは、ＰＣＩに対して特異的なモ
ノクローナル抗体を産生する。そしてこのモノクローナ
ル抗体を用いれば、ＰＣＩの分離精製工程を短縮でき、
極めて高純度のに工を高回収率で得ることができる。さ
らに、モノクローナル抗体と結合させた不溶性担体は、
洗浄すれば再使用可能であり、精製工程の短縮だけでな
く、経済的であることから工業的に極めて有用である。
また、本発明の抗に■モノクローナル抗体は、血液の凝
固線溶系の異常疾患の治療におけるＰＣＩの免疫定量に
使用できる。
〔実施例〕
次に実施例を挙げて本発明を説明する。
実施例１ 抗ＰＣＩモノクローナル抗体産生ハイプリドーマの製造
： （１）抗原（ＰＣＩ）の精製 （１）ヒト胎盤５個（約２５００９）　　より、膜等を
除去し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。次いでワ
ーリングゾレンダーを用いて破砕し、これに更に、５Ｑ
ｒｎＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）２Ｊを加え、
？リドＯ：／　（Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ　）　テ磨砕する。
得られたホモジネートを７．００Ｏｒｐｍ１５分間遠心
分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣に再度５９　ｍ
Ｍ　）　ＩＪスス−酸緩衝液（ｐＨ７，４）２Ａ！を加
え、？リドロンでホモジナイズし、７．００Ｏｒｐｍ　
１５分間遠心分離して洗浄沈渣を得た。この操作を数回
繰り返し、血液成分を除去して、洗浄沈渣９３０ｆを得
た。
（ＩＩ）　　（１）で得た沈渣９００？に、５０ｍＭ■
πＡを含む５　Ｑ　ｍＭ　）　リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）を約２１加え、ワーリングブレンダーでホモジ
ナイズする。このホモゾネートを４℃にて、−夜攪拌後
７．００Ｏｒｐｍ　１５分間遠心分離して、抽出液２１
！を得た。
０ＩＩ）　　（１）で得た抽出液に固形硫安を加え、３
５％飽和とし、４℃で３０分〜数時間放置後、７．ＯＯ
Ｏｒｐｍ　１５分間遠心分離し上清を分取した。この上
清に更に硫安を加え、８５％飽和とし、４℃で２時間放
置した後７．ＯＯＯｒｐｍ　１５分間遠心分離し、沈渣
を分取した。得られた沈渣を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液の少量に溶かし、同緩衝液に対し、４℃で一夜、充分
に透析した。透析中に生じた沈澱は、７０００　ｒｐｍ
１５分間遠心分離して除き、透析液３９０−を得た。
（１ｖ）得られた透析液を、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ＰＨ７，４）で平衡化したＤＥパートヨノＱ−ル（
Ｅｌ　５．５　Ｘ　１９の）に吸着させ、同緩衝液にて
充分洗浄した後、０〜０．３　Ｍ塩化ナトリウムを含む
同緩衝液４ｊを用い、直線濃度勾配により１分画２０ゴ
となる様に溶出させた。活性画分は、はぼ０．１５　Ｍ
塩化す）　ＩＪウム濃度付近にて溶出され、３８０ｄの
活性画分を得た。
（Ｖ）　　得られた活性画分を、０．１Ｍ！７ン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に対し、４℃で一夜充分に透析し、同
緩衝液にて平衡化したブルーセファロース（０２，５Ｘ
１２α）カラムを通過させた。４＠６の吸収を示す通過
両分（４８０ｒｄ）を集め、これをダイアフロー　メン
ブランフィルタ−ＹＭ　−Ｉ　Ｑを用いて濃縮した。
（ｖｉ）　　（ｖ）で得た濃縮液をセファデックスＧ−
ｉｏｏを用いるゲル濾過（ｌ　４．５　Ｘ　７５ｃＷＩ
）に付し、生理食塩水で１分画８ｆｆ１７！になるよう
に溶出させ、活性画分８８〜 １０４を集め、これを限外濾過により濃縮して、に１１
４．５−（蛋白重量１３６．１ｍｇ　、　Ｌｏｗｒｙ法
）を得た。
なお、各精製段階において得た蛋白の 収量を下に示す。
工程　　　　　　　　　　　　　　　蛋白重量（翼９）
（ＩＩ）工程（ＥＤＴＡ抽出）　　　　　　　　　　７
２２６（ｌｌｉ）工程（硫安分画、透析）　　　　　　
　　３１８４（１ｖ）工程（ＤＥＡＥ−）＝ｚ／Ｑ−ル
吸着）　　　　　　５３１（Ｖ）工程（ブルー−セファ
ロース吸着）　　　　　１６３（ｖｉ）工程（セファデ
ックスＧ−１００吸着）　　　１３６（２）　　免疫牌
細胞の調製 上述の如く精製したに工１００μｔを７０インド・コン
プリート・アゾユパントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与した。
以後、２週間の間隔で５０μ？のＰＣＩとアジュバント
乳濁液を２回投与し、最後ににＩ５０μｔのみを投与し
免疫を完了した。
３日後にマウスを殺し、牌臓を摘出、細断した後１００
メツシユのナイロン網で濾過し、牌臓の単離細胞を得た
。
（３）　　ハイプリドーマの調製 得られた免疫溝細胞に低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニ
ウム）を加え赤血球を溶血した後ｌ５ｃｏｖｅ’ｓ　Ｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（
ＩＭＤＭ　）で細胞を３回洗い、マウス骨髄腫細胞ＦＡ
Ｉは工■Ｍで３回洗った。両細胞数を計測し、牌細胞と
ＦＡＩ細胞の割合を５対ＩＫして遠心した。上清を捨て
、細胞沈渣を十分解きほぐした後？リエチレングリコー
ル（ＰＥＧ　）　４，０００を培地で希釈した４５％液
を０．５−滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間靜
装した後、ＩＭＤＭｌ−を１分間かけて静かに添加した
。続いて１０−を５分間かけて加え、最終４０−にした
遠心管を１．００　Ｏｒｐｍ　８分間遠心した。
沈渣を１０％Ｆｅ、ｓ添加ＩＭＣＭで浮遊し再度遠心し
て上清を捨てた。
ヒ？キサンチン　１０”’　Ｍ、アミノゾテリン　４　
Ｘ　１０”’　Ｍ及びチミジン　１．６×１０”’　Ｍ
ｔ加ｔｆＣ（ＨＡＴ−）１０　％　Ｆｅ２　ｔｓ加ＩＭ
ＤＭを用い沈渣を再浮遊し、９６ウエルマイクロプレー
トに１００μｌずつ分注した。３〜４日ごとに培地５０
μｌ追加し、細胞の増殖を見た。
ｆ（ＡＴ選択により、）・イブリドーマのみ増直するこ
とを確認した。
（４）抗体産生ノ・イブリドーマの検索ハイプリドーマ
が増殖したウェルの培養液を採取し酵素免疫法により、
に工に対する抗体産生ノ１イブリドーマを調べた。まず
、９６ウエルマイクロゾレート（イムノプレート１１ヌ
ンク社襄）にに工を０．１μｔ／１００μｊ／ウェル分
注し、２５℃で１８時間靜装し吸着させる。次いで検体
である培養液を１００μｌ／ウエル注入し、２５℃で２
時間反応させる。０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むリ
ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　）で３回洗浄後
、ワサビ、ｅ−オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ　
（カペル社ｍ）ｔ”１００μＩｔ／’）エル加え、２時
間後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　テ３回洗浄する。これに、０
．００１％過酸化水素、０．４ｍｇ／−オルトフェニレ
ンシアミン（シグマ社製）の０．１Ｍクエン酸−水酸化
ナトリウム緩衝液（Ｐ）（４−０）を加え、波長４９２
ｎｍの吸光度を測定した。
検体中、ＰＣＩに対する抗体が存在したウェルにのみ発
色が観察されるので、発色したウェルの細胞を採取した
。
（５）　　ＰＣＩに対するモノクローナル抗体産生細胞
のクローニング マウスの腹腔にＩＭＤＭを注射して採取した腹腔細胞を
フィーダー細胞として使用した。
１０％ＦＣ８添加ＩＭＤＭに浮遊した腹腔細胞（１×１
０５個／−）を９６ウエルマイクロプレートに１００μ
ｌずつ分注した。翌日、抗体産生ハイブリドーマを５個
／ゴに調製し、各ウェルに１００μｌずつ分注した。３
日ごとに培地を交換し適当な量まで細胞が増殖したウェ
ルから順に培養上清を採取し、上記と同一の方法により
、抗体産生を確認した。陽性のウェルは再度クローニン
グし、抗にエモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを
得た。これらのハイプリドーマは、６種類得られ、前記
表１の如くそれぞれ産生ずる抗にエモノクローナル抗体
の種類により、にＩ　−Ｈ３９、にｌ−Ｈ４６、にｌ−
Ｈ１６７、にｌ−Ｈ１６９、にｌ−Ｈ１７６、にｌ−Ｈ
１８０と命名した。
実施例２ 抗ＰＣＩモノクローナル抗体の調製ニ ア退会以上のＢＡＬＢ　／Ｃ系マウスにシリスタン（ア
ルドリッチ社製）０．５−を腹腔内投与し、約１週間後
、上記で得たハイプリドーマＩ　Ｘ　１０’１ｒｌＡ／
マウス腹腔内接種した。約１０日後、マウス腹腔より腹
水を採取した。これをａｏｏｏｒｐｍ、１０分間遠心分
離し、上清を分取しその５１ｎｔに硫酸アンモニウムを
終濃度が５０％飽和濃度になるように加え、４℃で一夜
放置する。次いで、３，０００ｒｐｍ、１５分゛間遠心
分離し、沈渣を０．１　Ｍ　）　ＩＪスス−酸緩衝液（
ｐＨ８）に溶かし同緩衝液に対して透析した。これを同
緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ　ＡＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　ＣＬ−４Ｂ　　（７７Ａ／　？　シフ社製）カラ
ムクロマトグラフィーに付した。
モノクローナル抗体の溶出は、０．１Ｍグリシン−０，
１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨｚ７）で行い、抗Ｐ
ＣＩモノクローナル抗体を得た。ＰＣＩ−）（３９ヲ用
イア１１ハ、ＰＣＩ−Ａ３９１４、２１ｇ、ＰＣＩ−Ｈ
４６を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ４６２０．２畔、にｌ
−Ｈ１６７を用いた場合は、にｌ−Ａ１６７　２λ９　
ｍ９、にｌ−Ｈ１６９を用いた場合はにｌ−Ａ１６９　
２５．０哩、ＰＣＩ−Ｈ１７６を用いた場合は、にｌ−
Ａ１７６２５．０哩、ＰＣＩ−Ｈ１８０を用いた場合は
、にｌ−Ａ１８０８、６３１９をそれぞれ得た。これら
の抗ＰＣＩモノクローナル抗体は、前記表１の性質を示
した。
実施例３ 免疫吸着クロマトグラフィーによるＰＣＩの精製： （１）抗にエモノクローナル抗体の担体への結合 ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ （０，４ｆ　）を、１ｒｒＭ塩酸、０．１Ｍ重炭酸ナト
リウム−０，５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８，３）緩衝液
で順次洗浄し、ブロムシアン活性化セファロース４Ｂの
カップリング緩衝液（１，ｓ　、ｚ　）溶液を調製した
。
これに、精製モノクローナル抗体にニーＡ４６２１９の
カップリング緩衝液（１ｍ）溶液を加え、室温で２時間
振とうしグラスフィルターで脱水した。更に、０．１Ｍ
）ＩＪスス−酸緩衝液（ｐ）Ｉ８．Ｏ）　１０ｔｎｔを
加え、室温で２時間振とうし、残った活性部位をブロッ
クした。
得られた抗体結合セファロース４Ｂを、０、１　Ｍ　）
リス−塩酸−０，５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８゜
３）、０．１Ｍ酢酸−０，５Ｍ塩化す）　ＩＪウム緩衝
液（ｐＨ４，０）で交互に３回洗浄し、０．１　Ｍ　）
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化し、抗体カラ
ム４６を得た。
（２）抗体カラムによるに工の精製 上記で作製した抗体カラム４６に、実施例１−　（＋）
　−（ｉｔ）で得た粗に工溶液をかけ、平衡化に用いた
緩衝液で充分洗浄した。
ＰＣＩの溶出は、０．１Ｍ酢酸−０，５Ｍ塩化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５，０）を用いる方法あるいは、０．１
Ｍ）リス−塩酸−０，１Ｍ塩化カルシウム（ｐＨ７，４
）を用いる方法で行うことができる。
に工は、素通シ両分には認められず、溶出画分から７０
％以上の回収率で精製することができた。
尚、精製係数などの結果は表２に示した。
ＰＣＩの測定は、実施例４の方法で行った。
以下余二。
表　　　　　２ 表中、Ｎ、Ｄ、は、検出されなかったことを示す。
実施例４ 抗ＰＣＩモノクローナル抗体を用いるＰＣＩの測定： Ｓ、　Ｙｏｓｈｉｔａｋｅらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　９２　。
１４１３−１４２４．１９８２）　　に準じてホースラ
ディツシュ（西洋わさび）−（ルオキシダーゼ（以下層
と略す）を、抗ＰＣＩモノクローナル抗体を結合させた
。このＨＲＰ標識、抗にエモノクローナル抗体を用いて
、以下の如（ＥＬＩＳＡ法によりＰＣＩの測定を行なっ
た。９６ウエル平底マイクロプレートの各ウェルに０．
０５　Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９，６）に溶解したモノ
クローナル抗体を１００μｊずつ添加し、２５℃で２時
間コーティングした。ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、
試料の０．１　Ｍ　Ｔｒｉ　ａ　−ＨＣＩ　、　２５　
ｍＭＥＤＴＡ。
０、０５　％　　Ｔｗｅｅｎ　２０　（ｐＨ７，４）緩
衝液溶液１００μｊを加えた。２５℃で一晩反応させた
後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、Ｗ標識％／クローナ
ル抗体のＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ希釈溶液を１００μ！加
え、２５℃で２時間反応させた。ＰＢＳ　−Ｔｗｅ　ｅ
　ｎで洗浄後、１００μｌの基質溶液（オルトフェニレ
ンシアミン０．４１ｇ／−および０．０１チ過酸化水素
の０．１　Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５，０）を添
加し、２５℃で３０分間反応させた。４．５Ｍ硫酸５０
μｊを加えて反応を停止させた後、４９２ｎｒｎにおけ
る吸光度を測定した。その結果、表３に示す如く、コー
ティング用モノクローナル抗体としてにｌ−Ａ４６を用
い、標識用モノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ３９．
１６９．１７６．１８０を用いた場合、及びコーティン
グ用モノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ１７６を用い
、標識用モノクローナル抗体としてにｌ−Ａ４６．１８
０を用いた場合には、５〜１００　ｎｔ／−の範囲のＰ
ＣＩを検出できる。
以下余白 マタ、コーティング用モノクローナル抗体としてにｌ−
Ａ４６及び１７６を用い、標識用モノクローナル抗体と
してにｌ−Ａ１８０を用いた場合の検量線は、図１に示
す如く極めて感　　１度が高く、シかも良好な直線性を
示した。また、コーティング用モノクロナール抗体とし
てＰＣＩ−Ａ４６を用い、標識用モノクローナル抗体と
してにｌ−Ａ３９．１６９及び１７６を用いた場合の検
量線は図２に示す如く、良好な直線性を示した。
【図面の簡単な説明】
図１及び２は、実施例４０に１測定法におけるＰＣＩ濃
度と吸光度（４９２ｎｍ）との関係を示す図面である。 図１：コーティング用モノクローナル抗体としてにｌ−
Ａ４６及び１７６使用 標識用モノクローナル抗体としてにニ ーＡ１８０使用 図２：コーティング用モノクローナル抗体とり、てＰｃ
ｌ−Ａ４６使用 標識用モノクローナル抗体としてに工　　□−Ａ３９．
１６９及び１７６使用 以上 一″−丁　！

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特異的
    なモノクローナル抗体。 ２、ヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特異的
    なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 ３、ヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特異的
    なモノクローナル抗体を免疫吸着剤として使用すること
    を特徴とするヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質の精製
    法。 ４　ヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特異的
    なモノクローナル抗体の標識体を使用することを特徴と
    するヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質の免疫学的測定
    法。
JP61269588A 1986-11-14 1986-11-14 抗ｐｃｉモノクローナル抗体、これを用いた抗ｐｃｉの精製法及び免疫学的測定法 Expired - Lifetime JPH08840B2 (ja)

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