JPH04139200A - タンパク質の固定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗ハプテンモノクローナル抗体とタンパク質
−ハプテン結合体との反応を利用して、タンパク質を固
定及び回収する方法に関する。

〔従来の技術〕

タンパク質を特異的に担体に固定できれば、固定したタ
ンパク質を回収することにより、目的とするタンパク質
を効率良く精製することができる。

また、タンパク質を固定化することにより、タンパク質
が酵素であれば固定化酵素として繰返し利用することが
可能である。

タンパク質の固定には、■官能基を作用する■群特異的
吸着体を利用する■抗体を利用するといった方法がある
。

■は、アミノ基（−ＮＨ２）、カルボキシル基（−Ｃ○
○Ｈ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−Ｓ　Ｈ）な
どの、タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖との結合を
利用した固定方法である。これらの官能基を持つアミノ
酸はタンパク質に共通に含まれる。従って、目的とする
タンパク質を特異的に固定できない欠点がある。■の群
特異的吸着体とは、ある種のタンパク質に共通な構造を
認識する物質のことで、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧＩｎ
＋ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ　）のＦＣ部分と特異
的に結合するプロティンＡや、糖タンパク質の糖鎖と特
異的に結合するレクチン、コンカナバリンＡ等のことで
ある。しかし、群特異的吸着体は少数の限ら九たタンパ
ク質にのみ見出されており、更にＩｇＧのサブクラス（
ＩｇＧ、１．ＩｇＧ２等）の混合試料から、一つのサブ
クラス（例えばＩｇＧ１）を精製するときなどには、よ
り特異性の高い固定方法が必要になる。■は、タンパク
質を抗原として作製した抗体を用いたタンパク質の固定
方法、あるいは逆に、抗原を用いた抗体タンパク質の固
定方法である。この方法は■■に比べ、目的とするタン
パク質を特許的に固定できること。

方法の汎用性の点で優れている。すなわち、モノクロー
ナル抗体を用いることにより、目的とするタンパク質を
極めて特異的に固定することが可能である６また、すべ
てのタンパク質に対して抗体を得ることは可能であり、
汎用性の高い方法と言える。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術のうちモノクローナル抗体を用いる方法は
広く一般に用いられているが、モノクローナル抗体を作
製するために数ケ月或いはそれ以上の期間を要する点、
抗原の種類による免疫原性の差や免疫する動物の個体差
等の感作条件を考慮しなければならない点、また、抗原
との親和性の様々なモノクローナル抗体が生じる点、更
には。

抗体が複数の抗原と交差反応することも考慮しなければ
ならない点において問題があった。

本発明の目的は、上記従来技術の欠点を解消したタンパ
ク質の固定化方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は上記目的を達成するために、抗ハプテンモノク
ローナル抗体を作製し、ハプテンを結合させたタンパク
質を、固定化抗ハプテンモノクローナル抗体と反応させ
、タンパク質を固定あるいは回収することを特徴とする
ものである。

ハプテンとは、高分子と結合させることにより、初めて
抗原となる低分子のことである。ジニトロフェニル（Ｄ
　Ｎ　Ｐ　：　Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）　、　　
トリニトロフェニル（Ｔ　Ｎ　Ｐ　：　Ｔｒｉｎｉｔｒ
ｏｐｈｅｎｙｌ）　、ニトロフェニル（Ｎ　Ｐ　：　Ｎ
１ｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）　、ステロイドホルモン等が挙
げられる。本発明に用いるハプテンは、タンパク質と容
易に結合するものが望ましい。

例えば、ＤＮＰは、Ｎ末端のアミノ基、リジンのε−ア
ミノ基、チロシンの水酸基、ヒスチジンのイミダゾール
基、システィンのチオール基と容易に結合する。

本発明においては、モノクローナル抗体を個々のタンパ
ク質に対して作製する必要はない。すなわち、ハプテン
をタンパク質に結合させれば、−種類の抗ハプテンモノ
クローナル抗体を用いて、タフパフ質−ハプテン結合体
を固定できるからである。

モノクローナル抗体とは、生体内に無数にある抗体の中
から選び出した、単一の抗体のことである。モノクロー
ナル抗体の作製技術は、１９７５年にケーラーとミルシ
ュタインによって初めて報告された。モノクローナル抗
体は、抗体の有用性を高め、バイオテクノロジーの分野
に大きく貢献した。現在では、医学、生物学等広い分野
でモノクローナル抗体は利用されている。［ジー、ケー
ラー及びシー、ミルシュタイン、ネイチャー（ロンドン
）、２５６，４９５　（１９７５）、］モノクローナル
抗体を得るための一般的な方法を次に述べる。マウスス
やラット等の哨乳動物に対し、動物にとって異物となる
物質（抗原）を。

非経口的に投与する。すなわち、静脈、筋肉、あるい腹
腔内に抗原を注射する。このようにして。

抗原と特異的に反応する抗体を産生ずるリンパ球Ｂ細胞
の増殖を促することかできる。次に、抗原を免疫した哺
乳動物の肺臓を摘出する。肺臓はリンパ球Ｂ細胞を多く
含む器官である。従って、肺臓細胞を培養すれば、抗体
産生細胞を多量に得ることができる。ところが、Ｂ細胞
を生体外で長く維持することはできない。そこで、増殖
能の高い骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合し、ハイブリ
ドーマと呼ばれる融合細胞とする。ハイプリドーマは、
Ｂ細胞とミエローマの遺伝子を併せ持つため、抗体を産
生しながら増殖を続けることができる。

細胞融合はポリエチレングリコール、ＨＪＶウィルス、
あるいは電流等を用いて行う。ミエローマは、核酸合成
に必要な酵素である、ヒポキサンチンーグアニンーフォ
スフォリボシルトランスフェラーゼ、あるいはチミジン
キナーゼを欠損させである。細胞融合はランダムな組合
せで起こるが、融合細胞をハツト培地と呼ばれる培地中
で培養すると、Ｂ１１砲の持つ酵素遺伝子を獲得したハ
イブリドーマのみが生き残ることができる。

ハイブリドーマの中から、目的の抗原を認識する抗体を
産生ずるものを選択するためスクリーニングを行う（−
次スクリーニング）。スクリーニングには、酵素免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ：旦ｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ工ｉ＋
ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔム５ｓａｙ　）と呼ばれる検定
方法を適用する。この方法は、抗原抗体反応の有無を基
質の発色で検知するものである。

一つの抗原に対しては複数種の抗体が反応する。

従って、スクリーニングによって、複数種のハイブリド
ーマが得られてしまう。そこで、−次スクリーニングで
得たハイブリドーマを、１個の細胞にまで希釈し増殖さ
せ、単一の細胞集団（クローン）とする。ハイブリドー
マをクローン化する操作をクローニングと呼ぶ。そして
、再びＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行い、目的の
抗体を生産するハイブリドーマのクローンを選別する。

ここで得られたクローンに対し、抗体産生能、抗体の抗
原との親和性、抗体の交差反応等を検討して、目的のハ
イブリドーマを培養し、培養上清を回収する。培養上清
から抗体を精製すれば、目的のモノクローナル抗体を得
ることができる。抗体の精製は、限外濾過、硫安塩析、
透析、及びクロマトグラフィー等の公知の方法を組み合
わせて行う。

抗ハプテンモノクローナル抗体を作製するためには、ま
ずハプテンを牛血清アルブミン（ＢＳＡ：旦ｏｖｉｎｅ
　ＳｅｒｕｉｌＡｌｂｕｍｉｎ）　、キーホールリンペ
ットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈ
ｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、オバルブミン（ＯＶ　Ａ　：　
Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）等の高分子に結合させる。ハプテ
ンと結合させる高分子としてタンパク質を用いれば、結
合体を作製し易い。

作製したタンパク質−ハプテン結合体を抗原として、マ
ウスやラット等の哺乳動物を免疫する。

免疫は一般的な方法に従い、例えば、腹腔内に１０日〜
２週間後に抗原を注射し、これを数回続けて行う、その
結果、抗ハプテン抗体を産生ずるリンパ球Ｂ細胞の増殖
を促すことができる。

次に、上記哺乳動物の肺臓を摘出し、ミエローマと融合
してハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマの中か
ら、抗ハプテン抗体を産生ずるものを選択するため、Ｅ
ＬＩＳＡによる一次スクリニングを行う。得られた抗ハ
プテン抗体産生ハイブリドーマに対して、二次スクリー
ニングを行い、抗ハプテンモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマのクローンを得る。

クローン化した抗ハプテン抗体産生ハイブリドーマを培
養し、培養上清を回収する。培養上清から抗体を精製す
れば、抗ハプテンモノクローナル抗体を得ることができ
る。抗体の精製は、限外濾過、硫安塩析、透析、及びク
ロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて行う。

タフパフ質−ハプテン結合体を固定するためには、まず
抗ハプテンモノクローナル抗体を担体に固定しなければ
ならない。抗体の固定方法には、■抗体の側鎖の官能基
を利用する■群特異的吸着体を利用する■二次抗体を利
用する、といった方法が考えられる。

■は、抗体分子を構成するアミノ酸の側鎖であるアミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等を結合に利
用する方法である。例えば、グルタルアルデヒドを架橋
剤として用いれば、ガラス表面上に抗体を固定すること
ができる。

■に関しては、抗体（特にＩｇＧ）を固定する際に、Ｉ
ｇＧと特異的に結合するプロティンＡを不溶化したプロ
ティンＡ結合担体を用いれば、ＩｇＧを固定することが
できる。

■は、抗ハプテンモノクローナル抗体と結合する二次抗
体を、上記■、■の方法により固定した後、固定化二次
抗体を介して抗ハプテンモノクローナル抗体を固定する
ものである。

上記の方法により、抗ハプテンモノクローナル抗体を、
ゲル、ガラス表面等の担体に固定すれば、固定化抗ハプ
テンモノクローナル抗体との抗原抗体反応を利用して、
タフパフ質−ハプテン結合体を固定することができる。

固定化したタフパフ質−ハプテン結合体は、ＰＨを１〜
４程度に下げて抗ハプテンモノクローナル抗体からハプ
テンを解離することで回収することができる。

〔作用〕

目的とするタンパク質を固定、あるいは回収するために
モノクローナル抗体を用いるのは有効な手段である。し
かし、目的のモノクローナル抗体を作製することは容易
ではない６そこで、タフパフ質−ハプテン結合体を作製
し、固定化抗ハプテンモノクローナル抗体を用いれば、
それぞれのタンパク質に対するモノクローナル抗体を作
製することなく、目的のタンパク質を固定できる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例について第１図に基づいて説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない
。

第１図は、ガラスピーズ／上に抗ＤＮＰ抗体コを固定化
し、これにパパイン’＠−ＤＮＰｊ結合体を結合させ、
パパインｑを固定したところを示している。抗ＤＮＰ抗
体を固定化する担体は、ガラス基板、プラスチック基板
、あるいは高分子樹脂でも良い。また、パパインの代り
に他の酵素を用いても良い。

本実施例では、ＤＮＰのようなハプテンを酵素に結合さ
せることにより、抗ハプテンモノクローナル抗体を介し
て容易に固定化酵素を作製できるところに特徴がある。

更に、酵素を再利用できるため、高価な酵素を用いる際
に有利である。

（１）　抗ＤＮＰモノクローナル抗体の作製ａ、ＢＳＡ
−ＤＮＰ結合体の作製 １−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（Ｆ　Ｄ　Ｎ
　Ｂ　：　１−ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏ
ｂｅｎｚｅｎｅ）１０ｍＪとジオキサン２ｍＱを混合し
、これを重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）に溶解した。、
７５％ＢＳＡ　（２０ｍＱ）溶液に添加して、暗闇下、
室温で２４時間インキュベートした。反応液を限外濾過
し、保持液を限外濾過によって０．１Ｍリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７，４）に置換し、これを抗原とした。抗原中の
タンパク質濃度は６　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑであった。

ＤＮＰの吸収極大値（３６０ｎｍ）より求めた。ＢＳＡ
とＦＤＮＢの反応効率は７９％であった６ ｂ、ＢＳＡ−ＤＮＰ結合体によるマウスの免疫ＢＳＡ−
ＤＮＰ結合体（１００μｇ、２回目以降は４０μｇ）を
、９０μｇのフロイント完全アジュバントと共に、３　
ｍ　Ｑの０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解
し、この混合液を５００μΩずつマウス （Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ、９週齢）に、２週間後に腹
腔的投与し、これを３〜７回続けた。

Ｃ０抗ＤＮＰ抗体産生ハイブリドーマの作製ＢＳＡ−Ｄ
ＮＰ結合体を免疫したマウスの肺臓を摘出し、ポリエチ
レングリコール（分子量１５００）を用いてミエローマ
と融合。

ハツト培地中でハイブリドーマを選別した。

ここで得られたハイブリドーマには、ＤＮＰ。

ＢＳＡ及びＢＳＡとＤＮＰを同時に認識する抗体を産生
ずる３種類の細胞が含まれている。

そこで、抗ＤＮＰ抗体産生細胞のスクリーニングに際し
ては、ＢＳＡ−ＤＮＰ結合体、ＢＳＡ及びポリーＬ−リ
ジンーＤＮＰ結合体の３種類の抗原を用いてＥＬＩＳＡ
を行い。

ＢＳＡ−ＤＮＰ結合体とポリーＬ−リジンーＤＮＰ結合
体に対して陽性、ＢＳＡに対して陰性の抗体を分泌する
ものを抗ＤＮＰ抗体産生ハイブリドーマとして選別した
。続いて、クローニング、スクリーニングを行い、抗Ｄ
ＮＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのクローン
を５株得た。表１に細胞株と産生する抗体の種類を示す
。

ｄ、抗ＤＮＰモノクローナル抗体の精製抗ＤＮＰ抗体産
生ハイブリドーマ（４ −３８−１０株）を無血清培地中で培養し、培養上清Ｉ
Ｑを濾過滅菌した後、限外濾過、硫安塩析を行った。更
に、ハイトロキシルアパタイトカラム（バイオランド社
製）を用いて、抗ＤＮＰモノクローナル抗体を精製した
。

この結果、５１７μｇ／ｍΩのＩｇＧ溶液を得た。

（２）パパインの固定化 ａ、パパイン−ＤＮＰ結合体の作製 ０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）に溶解した０、
３８％パパイン（２０ｍ１２）をＦＤＮＢと混合し、パ
パイン−ＤＮＰ結合体を得た６反応液の未反応のＦＤＮ
Ｂを限外濾過により除去した後、保持液に０．１Ｍリン
酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、再び限外濾過を行い
、パパイン−ＤＮＰ結合体を含む溶液を得た。

ｂ、固定化パパインの作製 ガラスピーズ（φ６．４ｍｍ）の表面を、３６ｍＭＮ−
β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメソキシ
シラン溶液（チッソ製）を用いてアミノシラン化した。

洗浄した後、２．５％グルタルアルデヒド溶液で処理し
、抗ＤＮＰモノクローナル抗体溶液を０．１Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐＨ７，４）中で反応させ抗体結合体を得た。

ここにパパイン−ＤＮＰ結合体を加え、３７℃、１時間
、同様に０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）中でイ
ンキュベートすることにより、固定化パパインを作製し
た。

第２図は上述の実施例で得た固定化パパインによるマウ
スＩｇＧの消化を模式的に示すものである。マウスＩ　
ｇＧ５は、第１図に示す固定化パパインによりＦａｂ６
とＦｃ７とに分解される。この具体例を示すと次のよう
である。

ポーターの方法に従いマウスＩｇＧをパパイン消化した
。マウスＩｇＧ１■はパパイン−ＤＮＰ結合体を固定し
たガラスピーズ（パパイン１０μｇを結合）を混合し、
１０ｍＭの１０ｍＭシスティン−２ｍＭ　　ＥＤＴＡ−
０，１ＭＴＪン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）中、３７℃で
一晩反応させた。続いて、ヨードアセトアミドを終濃度
が１０ｍＭとなるよう添加し反応を停止させた。マウス
ＩｇＧはパパインの作用を受けてＦａｂとＦｃに分解し
た。

ＦａｂとＦｃの分離は、ハイトロキシルアパタイトカラ
ム（バイオラッド社製）を用いて行った。ｒアール・ア
ール・ポーター、バイオケミカルジャーナル、７３，１
１９ （１９５９）、１ パパインを固定したガラスピーズは洗浄した後０　、　
Ｉ　Ｍ　ＩＪ　ン酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）　中、４℃
にて保存した。

〔発明の効果〕

本発明により、特定のタンパク質にハプテンを結合させ
ることにより、抗ハプテンモノクローナル抗体を用いて
タンパク質を容易に固定することが出来るため、タンパ
ク質の機能の利用や精製が容易になる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一実施例に係る抗ＤＮＰ抗体をガラ
スピーズ上に固定したところを示す模式図、第２図は１
本発明の一実施例に係る固定化パパインによる酵素反応
を示す模式図である。 ｌ・・・ガラスピーズ、−・・・抗ＤＮＯモノクローナ
ル抗体、３・・・ＤＮＰ、　！Ｉ・・・パパイン、５・
・・マウスエ ｇＧ− 乙・・・Ｆａｂ、 ７・・・Ｆｃ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タンパク質と容易に結合しうるハプテンを用いて、
   タンパク質−ハプテン結合体を作製し、担体に固定した
   抗ハプテンモノクローナル抗体を介して、該タンパク質
   −ハプテン結合体を担体に固定することを特徴とするタ
   ンパン質の固定方法。 ２、ジニトロフェニル（ＤＮＰ：￥Ｄ￥ｉ￥ｎ￥ｉｔｒ
   ｏ￥ｐ￥ｈｅｎｙｌ）をハプテンとする特許請求の範囲
   第１項記載のタンパク質の固定方法。 ３、担体に固定した抗ハプテンモノクローナル抗体を用
   いて、タンパク質−ハプテン結合体を回収することを目
   的とするタンパク質の固定方法。 ４、ＤＮＰをハプテンとする特許請求の範囲第３項記載
   のタンパク質の固定方法。