JPH02221300A - イムノアフィニティーマトリックス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は担体、担体に固定化させたイムノグロブリン結
合性蛋白、該蛋白に結合した抗体、および該蛋白と抗体
を結合するクロスリンカ−剤からなるイムノアフィニテ
ィーマトリックスにおいて、クロスリンカ−剤としてｎ
−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを２個有する
化合物を用いて製造することを特徴とするイムノアフィ
ニティーマトリックスに関する。

〈従来の技術および解決すべき課題〉 従来、抗体を用いたイムノアフィニティーマトリックス
の作製は、ＣＮＢｒ活性化セファロースやアフィゲル等
の担体に抗体を直接固定化する方法が用いられてきたが
、この場合、抗体分子に多数存在する第一級アミン基も
しくは類似の求核性基が担体と多点でイソウレア結合す
るため、抗体の抗原結合部位が不活性化されたり、マト
リックス間の立体障害により、低い抗原結合容量しか示
さないことがしばしばみられた。

これらの問題点を解消するため、５ｃｈｎｅｉｄｅｒら
は、ＩｇＧのＦｃ領域と特異的に反応するプロティンＡ
を５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂに固定化したプロ
ティンＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂを不溶性担
体に用い、これに抗体を結合させた後、クロスリンカ−
を用いて抗体をプロティンＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃ
Ｌ　−４Ｂに固定化する方法を開発した（Ｊ、　Ｂｉｏ
１、　Ｃｈｅｍ。

亜互１０７６６−１９８２）。

しかしながら、５ｃｈｎｅ　１ｄｅｒらは、クロスリン
カ−として、ジメチルビメリミデート（ＤＭＰ）を用い
たが、筆者らが彼らの実験の再現性を調べたところ、Ｄ
ＭＰの活性基のイミドエステルと一級アミンとの反応の
至適ｐＨが９−ＩＯである為イムノアフィニティーマト
リックス作製に用いる抗体が失活すること、抗原を溶出
する際に抗体の流出が常に観察されることなどの問題点
があった。

これらの問題を解決する為には、より温和な条件でカッ
プリングを行なえるクロスリンカ−を用いて、より安定
性の高いイムノアフィニティーマトリックスを作製する
ことが必要である。

く課題を解決する手段〉 より安定性の高いイムノアフィニティーマトリックスを
開発するため、プロティンＡ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅに
抗体を結合させる際のクロスリンカ−剤を鋭意検討した
ところ、活性基としてｎ−ヒドロキシスクシンイミド（
ＮＨ３）活性エステルを２個有する化合物が、安定で高
活性を保持したイムノアフィニティーマトリックスの作
製に適していることが明らかとなった。ＤＭＰの活性基
のイミドエステルと一級アミンとの反応の至適ｐＨは９
−ＩＯにあるのに対し、該化合物の活性基と一級アミン
との反応の至適ｐＨは７−８とより生理的条件下にあり
、温和な条件下で低濃度で効率よくカップリングできる
。

更に、該化合物のうち、疎水性であるもの、特にジスク
シンイミジルスベレート（ＤＳＳ・ｄｉｓｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｙｌ　５ｕｂｅｒａｔｅ）が抗原結合性が高い等
の点で好ましい。ＤＳＳは、インスリンレセプターに１
２６■−インスリンを共有結合させる場合に用いられた
例（Ｃａｒｔｅｒ−３ｕ、Ｃｅｔ　ａ１、Ｂｉｏｃｈｅ
ｎ＋１ｓｔｒｙ２０、２１６−２２１（１９８１））が
あるもののイムノアフィニティーマトリックスに用いら
れたことはない。

該イムノアフィニティーマトリックスは、安定で繰り返
し使用することができ、研究室レベルだけでな（工業的
な利用価値は極めて高い。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明は、クロスリンカ−剤としてｎ−ヒドロキシスク
シンイミド活性エステルを２個有する化合物を用いるこ
とを特徴とするイムノアフィニティーマトリックスを提
供する。

本発明のイムノアフィニティーマトリックスは、担体、
担体に固定化させたイムノグロブリン結合性蛋白、該蛋
白に結合した抗体、および該蛋白と抗体を結合するクロ
スリンカ−からなる。

本発明のイムノアフィニティーマトリックスは、以下の
ようにして製造することが可能である。

ｌ）担体とイムノグロブリン結合性蛋白とを反応させ、
固相化ゲルを作製する。（或いは市販の固相化ゲルを使
用する。） ２）固相化ゲルに抗体を加え、適温で穏やかに反応させ
、抗体−固相化ゲル複合体を得る。

３）該複合体をカップリングバッファーに懸濁し、溶剤
に溶かしたクロスリンカ−剤を反応させる。

以下、より詳細に説明する。

例えば、ＣＮＢｒ活性化セファロース等の担体をＮ　ａ
　ＨＣＯｓ等のカップリングバッファーで洗浄し、プロ
ティンＡ等のイムノグロブリン結合性蛋白と混合し、４
°Ｃで１晩（或いは室温で２時間）反応させる。イムノ
グロブリン結合性蛋白として、プロティンＡ１プロテイ
ンＧ、プロティンＨゆ特願昭６３−２９５５２７　）、
プロティンＡ　ｒｐ（ＢＰ−２９０７０７−Ａ）または
プロティンＬ（ＢＩＪＯＲＣＫ、Ｌ、　Ｊ、ＩＭＭＵＮ
ＯＬ、　１４０１１９４〜１１９７．１９８８）等が用
いられる。このほか、抗イムノグロブリン抗体などイム
ノグロブリン結合能を有すれば、任意のイムノグロブリ
ン結合性蛋白を用いることが可能である。担体として、
セファロースの他、アフィゲル、アフィプレップ等が用
いられる。固相化ゲルは、上記の方法で作製するほか、
市販のものを使用できる。例えば、プロティンＡ−セフ
ァ０−ス（ファルマシア製）、アフィゲルプロティンＡ
（バイオラッド製）、アフィブレッププロテインＡ（バ
イオラッド製）、プロティンＧ−セファロース（ファル
マシア製）等が挙げられる。固相化ゲルを緩衝液（ｐＨ
７，０〜８．０好ましくはｐＨ７，４）に懸濁しゲルＩ
ｎ／当たりｌＯ〜２５■好ましくは２０■の抗体を加え
温度４〜２５℃好ましくは室温（２０〜２５°Ｃ）で３
０〜６０分間好ましくは３０分間（４℃では約１２時間
）穏やかに振とうし、抗体−固相化ゲル複合体を得る。

抗体は、対象となる抗原に対する抗体を用いればよい。

ＩｇＧ、ＩｇＭ等、いづれのイムノグロブリンクラスで
もよく、限定されない。その後、高塩濃度の緩衝液（例
えば０．５Ｍ　Ｎａｃ！、０．２％ｎ−へブチル−β−
Ｄ−チオグルコシドを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液、ＬＭ　ＮａＣ１、　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、０．
２％ｎ−へブチル−β−Ｄ−チオグルコシドーβ−Ｄ−
チオグルコシドを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
等）で洗浄した後、ゲル容量の５０倍容量のカップリン
グバッファー（例えば５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．
１Ｍ　ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モノホリノ）プロパンスル
ホン酸、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒリン酸バッファー等
））に懸濁する。次いで、溶剤に溶かしたクロスリンカ
−剤をｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７，５で反応させる
。クロスリンカ−剤としては、ＤＳＳの他、Ｄ　Ｓ　Ｔ
　（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｔａｒｔａｒａｔｅ
）等の活性基としてｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ
Ｈ３）活性エステルを有する試薬が用いられるが、ＤＳ
Ｓが特に好ましい。

溶剤としては、ＤＭＳＯの他、Ｄ　Ｍ　Ｆ　（ｄｉｍｅ
ｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）等が用いられる。例えば
、クロスリンカ−の溶剤としてジメチルスルホキシド（
ＤＭＳＯ）を、クロスリンカ−剤としてＤＳＳを用いる
場合、ＤＳＳを０．２　ｍＭ以上好ましくは０．５　ｍ
Ｍ加え、１５〜６０分間好ましくは３０分間反応させる
。

ＤＭＳＯの添加量は反応液量の１％以下とする。

また、クロスリンカ−剤として、ＤＳＳのかわりにＤＳ
Ｔを用いる場合、ＤＳＴを０．５〜１．５　ｍＭ加え、
１５〜４５分程度室温にて反応させる。溶剤としてＤ　
Ｍ　Ｆ　（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を
用いる場合、好ましくはＤＳＳを０．５　ｍＭ（終濃度
）加え、２時間程度室温にて反応させる。ＤＭＦの添加
量は反応液量の１０％以下とする。次いで、０．２　Ｍ
　トリス（ｐＨ７，４或いはｐＨ８，２）を加え、１０
分間振盪する方法等により、反応を停止し、過剰量の高
塩濃度バッファーで洗浄する。このようにして作製され
たイムノアフィニティーマトリックスは、０．０２％Ｎ
ａＮ、を含むＰＢＳ（−）中に４℃で保存できる。該イ
ムノアフィニティーマトリックスはイムノアフィニティ
ークロマトグラフィー、イムノアッセイ等に用いられる
。イムノアフィニティークロマトグラフィーの場合、通
常、マトリックスを適当なカラムに充填し、サンプルを
アプライする。その後、溶出液で溶出し、サンプルを分
離することにより行われる。該イムノアフィニティーク
ロマトグラフィーでは、ゲルｌ−当たり、ｌ〇−３０■
の抗原を結合することが可能である。また、イムノアッ
セイの場合、通常、マトリックスをサンプルと室温で反
応させる。一方、アルカリフォスファターゼ等の酵素で
標識した抗体を作製し、上記の反応混合液に加え、マト
リックスと結合したサンプル中の抗原と反応させる。例
えば、１１０００ｒｐで５分間遠心することにより、マ
トリックス、抗原、酵素標識抗体の結合物を沈降させた
後、再び上記と同様の操作を行い、沈降物を洗浄スる。

次いで、Ｐ−ニトロフェニルリン酸等の基質を加え、吸
光度を測定し、試料中の抗原を定量する。

上記のごとく、作製した本発明のイムノマトリックスは
、抗体の遊離が少なく安定であること、および抗原結合
活性を保持できることを特徴とし、工業的に高品質の抗
原を効率よく精製することを可能としている。

次に、実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが
、本発明はこれのみに限定されないことは言うまでもな
い。

実施例１　抗原及び抗体の調製 （１）Ｆ＋　−ＡＴＰａｓｅの精製。

ラット肝ミトコンドリアの粗Ｆ、−ＡＴＰａｇｅは、Ｐ
ｅｄｅｒｓｅｎらの方法（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ１
、　４５．２０１−３０５（１９７０）　、　Ａｎａ１
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４０．５８１−５８８（１９８
４））を用いて亜ミトコンドリア粒子をクロロホルム処
理し、得られた水溶性画分を、Ａｍ１ｃｏｎ　ＹＭ−５
メンプランを用いて濃縮し、Ｐ　Ｅ　（Ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ−ＥＤＴＡ）バッフｙ　−（２０ｍＭ　Ｋ−Ｐｉ（
ｐＨ７，４）、　５　ｍＭ　　ＥＤＴＡ−Ｎａ３に置換
して調製し、５■Ｐｒｏｔｅｉｎ　／−とした。

ついで、ＤＥＡＥ−５ＰＷ　（東ソー、８．０Ｘ７５Ｎ
り陰イオン交換カラムによるＨＰＬＣを行なった。Ａ溶
液（ＰＥバッファー）で平衡化したカラムに３．５　ｌ
１ｇＰｒｏｔｅｉｎ粗Ｆ、−ＡＴＰａｓｅをアプライし
、３０分後から６０分間Ｂ溶液（２５０ｍＭＫＰｉ（ｐ
Ｈ７，４）　、５ｍＭ　ＥＤＴＡ−Ｎａ　］への直接勾
配をかけ溶出させた。流速は１ｙｎｌ／ｍｉｎ、検出波
長は２８０ｍＭ、ｉ度は室温で行なった。溶出液は１分
ごとに分取し、Ａ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ活性を測定した。Ａ
ＴＰａｓｅ活性の測定は、測定溶液（２５ｍＭにＨＣＯ
ｚ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，２）、　３００ｍＭ　５ｕｃｒ
ｏｓｅ、　２ｍＭ　ＭｇＣｌ　・６８！０）に５０ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸６０μｍ。

ビルベイトキナーゼ５ユニツト、乳酸脱水素酵素５ユニ
ツト、２５０ｍＭ　ＡＴ　Ｐ５　μｍを加え、全量２−
とした。これにサンプルをいれた後、３４０〜４００ｒ
＋ｍの波長対で　定常状態のＡＴＰの分解に対応したＮ
ＡＤＨの減少速度をチャートスピード２０ｎ＋ｍ／ｍｉ
ｎで測定した。酵素活性の標準として０．６６５ｍＭ　
ＡＤＰＩＯｕ　ｌを用いた。ＡＴＰａｇｅ活性の強いピ
ーク画分を集めて、Ａｍ１ｃｏｎ　ＹＭ−５メンプラン
を用いて濃縮し５■Ｐｒｏｔｅｉｎ／ｉとした。得られ
た精製Ｆ、−ＡＴＰａｓｅ標品は急速冷凍後、−８５℃
で保存した。

（２）抗−Ｆ、抗体の調製 抗−Ｆ１抗体は、高度に精製したＦ、−ＡＴＰａｓｅを
抗原として用い、ウサギを免疫し、その血清よりＦ、−
結合５ｅｐｈａｒｏｓｅを用いて精製した。

ウサギの免疫は、第一回目にフロイントの完全アジュバ
ント（ＦＡ）と混和したＦｌをウサギ−匹あたり２ｍｇ
皮下注射投与し、次いで第２〜６回目にフロイントの不
完全アジュバント（ＦＩＡ）と混和したＦ。

をウサギ−匹あたり１ｍｇ皮下注射して行った。

投与は２週問おきに行った。

（３）Ｆ、及び抗−Ｆ１抗体の１２５１標識Ｆ１及び抗
−Ｆ１抗体はＭａｒｃｈａｌｏｎ　ｉｓの方法（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｊ　　１１３．２９９１９６９）をＪｏｈ
ｎ　Ｃ。

Ｂｒｏｗｎが改良した方法（細胞免疫実験操作法。

ｐ、　２８９−、理工学社（１９８３）　）に従って、
ラクトペルオキシダーゼを用いてｉｔｓ　Ｉで標識した
。

実施例２　マトリックスの製造におけるプロティンＡ−
セファロースとＦ、抗体とのクロスリンクの際のＤＳＳ
濃度の検討 ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，４）に
懸濁したプロティンＡ−セファロース（ファルマシア）
に、ゲル１４当り１２■の無標識Ｆ抗体及びＣ”５Ｉ）
−Ｆ、抗体を加え、室温で３０分分間中かに振盪し、得
られた抗体−プロティンＡ−セファロースゲルは、高塩
濃度バッファーｒ５０ｍＭ　Ｎａ−Ｐｉ　（ｐＨ７，４
）　、０．５Ｍ　ＮａＣ１，０，２％ｎ−ｈｅｐｔｙｌ
−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）で洗浄した後
、ゲル容量の５０倍容量のカップリングバッファー（５
０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ）Ｉ　７．４　））に懸濁
した。

ついで、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かした
ＤＳＳを種々の濃度で加え、４５分間反応させた。反応
を停止させるために０．２　ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，４）
を加えて、さらに１０分間振盪した。

さらに、過剰量の高塩濃度バッファーで洗浄した後、マ
トリックスに結合した［１２Ｊ］−Ｆ、抗体の放射活性
をγ−カウンター（Ａｌｏｋａ　ＭＵＬＴＩ−ＭＯＤＥ
ＳＣＡＬＥＲ製）を用いて測定した。約２００倍容量の
溶出バッフｙ　−（５０ｎ＋Ｍ　ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉ
ｎｅ　（ｐＨ１１，５）、０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄ
ｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ　〕で３回洗浄した後、マトリ
ックスに残った［　”’Ｉ）−Ｆ、抗体の放射活性を測
定し、溶出バッファーによる洗浄前のゲルへの［１２Ｊ
ｌ−Ｆ、抗体結合量との比率を求め、マトリックスの安
定性の指標とした。

その結果を第１図に示した。ゲルへの（”’ＩｌＦ１抗
体への結合率はＤＳＳ濃度が０．２　ｍＭ以上でほぼ一
定となった。

実施例３　プロティンＡ−セファロースとＦ１抗体との
クロスリンクの際のＤＳＳによる処理時間の検討 実施例２に示した方法と同様、プロティンＡセファロー
スとＦ１抗体とのクロスリンクを行なった。ただし、そ
の際ＤＳＳ濃度は０．５　ｍＭとし、反応時間を０．２
５．０．５、■、０．１．５．２．０．３．０時間とし
た。

種々の条件で作製した抗体−プロティンＡ−セファ０−
スゲルを、５０ｍＭ　ｇｌｙｃｉｎｅ　（ｐＨ２，８）
で洗浄した後、抗原−抗体反応溶液（０，２Ｍ　Ｎａ−
Ｐｉ（ｐＨ７，４）にスキムミルクを１％の割合で溶か
し、１２、０００ｘｇで１０分間遠心分離して得られた
上清〕に懸濁した。ついで、無標識Ｆ１及び（”り−Ｆ
、を添加し、室温で６時間振盪してＦ、と抗−Ｆ、抗体
−プロティンＡ−セファロースゲルとを反応させた。さ
らに、高塩濃度バッファーで洗浄した後、ゲルに結合し
た（　”’り−Ｆ、の放射活性を測定した。

その結果を第２図に示した。マトリックスに結合したＣ
　”Ｊ〕−Ｆ、の量は０．５時間の反応時間で最大とな
った。

実施例４　　ＤＳＳによるプロティンＡ−セファロース
とＦ１抗体とのクロスリンクの際のｐＨの検討あらかじ
めリン酸緩衝液（ｐＨ７，２、組成ＮａＣＬ（８ｇ／　
ｊ７）　、Ｋｃｌ（０，２ｇ／　１）、ＮａＨＰＯ４１
２１（，０（２，９９ｇ／ｊ７）及びＫＨ２ＰＯ４（０
，２ｇ／　ｌ　）中、室温で３０分間抗体をプロティン
Ａ−セファロースに結合させた後、５０倍容量の各ｐＨ
の反応液にゲルを懸濁し、ＤＳＳを０．５　ｍＭ加えて
３０分間反応させた。得られたゲルに結合している〔１
２ｓＩ〕−Ｆ、の量を実施例３に示した方法と同様にし
て測定した。その結果を第３図に示した。

ｐ）１７．５付近の生理的ｐＨ条件が至適であった。

なお、ｐＨにより至適反応時間が異なることも考えられ
るので、反応時間を変えて同様の実験を行なったが、や
はりｐＨ７，５付近、反応時間３０分が最適であった。

実施例５ 実施例２に示した方法と同様に０．５＋ｎＭＤＳＳを用
いてプロティンＡ−セファロース１７＋７！当たりＦ抗
体、５．１０．１５．２０．２５．３０■を０．５時間
績合させた。作製したマトリックスに結合した［１２’
＋１−Ｆ、の量を実施例３に示した方法と同様に測定し
た。その結果を第４図に示した。ゲルｌ−当たりＦ１抗
体２０ｍｇを添加した際に［”’Ｉ）　−Ｆ結合量が最
大となった。

実施例６　他のクロスリンカ−との比較５ｃｈｎｅｉｄ
ｅｒらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏ１、　Ｃｈｅｍ、　２５７
゜１０７６６−（１９８２）　）に従って２０ｍＭＤＭ
Ｐを用いてマトリックスを作製した。すなわち、ＩｇＧ
のＦｃ領域と特異的に反応するプロティンＡを５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂに固定化したプロティンＡＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂを不溶性担体に用い、
これに抗体を結合させた後、クロスリンカ−として２０
ｍＭＤＭＰを用いて抗体をプロティン八−３ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂに固定化した。一方、実施例２に
従い、０．５ｍＭＤＳＳを用いてマトリックスを作製し
、両マトリックスの安定性の比較を行なった。マトリッ
クスの安定性の指標として、ＤＳＳ、ＤＭＰを用いて作
製したマトリックス及び陰性対照としてカップリング試
薬を用いずに作製したマトリックスを各々溶出バッファ
ーで一定時間処理した後、マトリックスに残ったＣ１２
Ｍ）−Ｆ１抗体の放射活性を測定し、溶出バッファーに
よる処理前のゲルへの［１２’Ｉ）−Ｆ、抗体結合量と
の比を求めた。結果を第５図に示す。　この図からも明
らかなように、ＤＭＰを用いて作製したマトリックスで
はかなりの量の抗体の流出がみられるが、ＤＳＳを用い
て作製したマトリックスでは抗体の流出はほとんど見ら
れず、ＤＳＳをクロスリンカ−として用いた方が、はる
かに安定なマトリックスが作製できることが解る。

なお、他にＢｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙ
ｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（Ｂ　Ｓ　３）　、Ｄｉｓｕｃｃ
ｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｔａｒｔａｒａｔｅ　（Ｄ　ＳＴ）
、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ　　（
ＤＭＳ）といったクロスリンカ−を用いて検討を行った
が、ＢＳ’、ＤＳＴを用いた場合、抗原結合量がＤＳＳ
を用いた場合のそれぞれ１０％及び５０％程度であり、
また、ＤＭＳを用いた場合にはＤＭＰ同様マトリックス
の安定性に問題があり、今回検討を行なったクロスリン
カ−の中ではＤＳＳが最も有効であった。

実施例７　　ＤＳＳを用いて作製したイムノアフィニテ
ィーマトリックスを用いたＦ、の精製Ｐｅｄｅｒｓｅｎ
らの方法（Ａｎａ１、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４０．５８
１−（１９８４）　）に従ってマイトブラストを調整し
た。

すなわち、Ｈ−メディウムに１００ｍｇ／ｍｉ’に懸濁
したミトコンドリアを１２ｍｇ／ｍＡ’ジギトニンで４
℃、２０分間攪拌しながら処理する。これをＨ−メディ
ウムで３倍に希釈し、ロー４℃、１０分間、１００００
　Ｘｇで遠心する。更に沈降物ををＨ−メディウムでも
との容量の１／２容量になるように懸濁し、上記のよう
に遠心する。このようにして調整したマイトブラストを
超音波処理した後、１０５、０００　Ｘ　ｇで３０分間
遠心分離して、得られた上清を粗Ｆ１画分とし、これを
ＤＳＳを用いて作製したマトリックスを充填したカラム
（ｌ　ｃｍ１、　Ｄ。

ｘ４ｃｍ）にアプライした。なお、マトリックスの作製
は、５０ｍＭ　Ｎａ−Ｐｉに懸濁したプロティンＡ−セ
ファロースにゲルｌ−あたり２０■の抗体を添加して、
抗体をプロティンＡと反応させた後、５０倍容量の５０
　ｍＭ　Ｎａ−Ｐｉにゲルを懸濁し、これにＤＳＳをｆ
ｉｎａｌ　０．５ｍＭ加えて３０分間反応させることに
より行なった。カラムを過剰の高塩濃度バッファーで洗
浄した後、５０ｍ１Ｊ　ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２，８）
を用い、室温、約０．２ｍｌ　／ｍｉｎでＦｌを溶出し
た。溶出液はＩＭ　　Ｋ−Ｐｉ　（ｐＨ７，４）で直ち
にｐＨを中性付近に調整した後、低温室において脱イオ
ン水に対して２４時間透析して精製Ｆ１標品とした。

ＤＳＳを用いて作製したマトリックスにより精製したＦ
ｌおよび粗Ｆ１画分の５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動をラピダス・ミニスラブ電気泳動装置（ＡＴＴＯ，
ＡＥ−６４４０型）を用い、Ｌａｅｍｍｌ　ｉの方法（
Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６８５（１９７０）　
）に従って行なった。なお、サンプル添加量は粗Ｆ３０
μｇ、精製Ｆ、２０μｇとし、クーフシ−ブルー染色後
、Ｓｉｍａｄｚｕ　ｄｕａｌ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　
ＴＬＣｓｃａｎｎａｒ　Ｃ５−９０００により、測定波
長５６５ｔ＋ｍとし、単波長リニアスキャンを行なった
。

その結果を第６図に示した。Ｆ、の５つのサブユニット
（α、β、γ、δ、ε）のピークがかなり特異的にみら
れ、ワンステップで非常に効率よく精製が行なわれた。

【図面の簡単な説明】

第１図はマトリックスの安定性に対するＤＳＳＪ度効果
を示す。 第２図は抗原結合量に対するＤＳＳ反応時間の影響を示
す。 第３図は抗原結合量に対するＤＳＳ反応ｐＨの影響を示
す。 第４図は抗原結合量に対する抗体添加量の影響を示す。 第５図はＤＳＳおよびＤＭＰを用いて作製したマトリッ
クスの安定性の比較を示す。 ・はＤＳＳＳＯはＤＭＰ、口は対照（無添加）の結果を
示す。 第６図（Ａ）は粗Ｆ１画分の５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動の泳動パターンを、第６図（Ｂ）はＤＳＳを
用いて作、製したマトリックスにより精製したＦｌの５
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の泳動パターンを示
す。 第 図 ＤＳＳ濃度 （ｍＭ） 第 図 Ｈ 第 図 反応時間 （時間） 第 図 Ｆｌ抗体濃度 （μｙ／μｅ ｆ ｇｅｌ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）担体、該担体に固定化させたイムノグロブリン結
   合性蛋白、該蛋白に結合した抗体、および該蛋白と抗体
   を結合するクロスリンカーからなるイムノアフィニティ
   ーマトリックスにおいて、クロスリンカー剤としてｎ−
   ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを２個有する化
   合物を用いて製造することを特徴とするイムノアフィニ
   ティーマトリックス
2. （２）該クロスリンカー剤が疎水性化合物であることを
   特徴とする請求項１記載のイムノアフィニティーマトリ
   ックス
3. （３）該クロスリンカー剤がジスクシンイミジルスベレ
   ートであることを特徴とする請求項２記載のイムノアフ
   ィニティーマトリックス
4. （４）該イムノグロブリン結合性蛋白が、プロテインＡ
   、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＡｒｐまた
   はプロテインＬであることを特徴とする請求項１、２ま
   たは３記載のイムノアフィニティーマトリックス
5. （５）該イムノグロブリン結合性蛋白が、抗イムノグロ
   ブリン抗体であることを特徴とする請求項１、２または
   ３記載のイムノアフィニティーマトリックス