CN102407098A

CN102407098A - 一种免疫亲和层析介质的制备方法及在纯化河豚毒素中的应用

Info

Publication number: CN102407098A
Application number: CN2011103614035A
Authority: CN
Inventors: 余勃; 马春燕; 陆豫
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2012-04-11

Abstract

一种免疫亲和层析介质的制备方法及在纯化河豚毒素中的应用，免疫亲和层析介质的制备包括：固相载体溴化氰法活化；河豚毒素特异性抗体与溶胀后的活化固相载体偶联；封闭；洗涤。所述的免疫亲和层析介质用于河豚毒素纯化的方法，包括：含有河豚毒素的样品前处理；河豚毒素免疫亲和层析柱的制备；上样；洗脱；收集洗脱液。本发明的免疫亲和层析介质具有高选择性，对样品中的河豚毒素有很强的保留和浓缩能力，且水相操作，操作简单，纯化效果好，免疫亲和色谱柱能重复使用，能节省大量的溶剂，降低分析成本和环境污染。

Description

一种免疫亲和层析介质的制备方法及在纯化河豚毒素中的应用

技术领域

本发明属于生物活性分子的分离纯化领域，涉及一种层析材料，具体说是一种用于河豚毒素分离纯化的免疫亲和层析介质及其应用。

技术背景

河豚毒素(tetrodotoxin，TIX)是一种毒性很强的小分子非蛋白类神经毒素，其可与神经细胞膜的钠离子通道受体高度特异性的结合，从而阻断钠离子通道，抑制神经冲动的传导。因此，河豚毒素具有出色的神经止痛作用，其麻醉效果比一般麻醉药强1000倍以上，而且具有不成瘾的优点，可取代化学药物和中草药用于戒毒。同时，它还具有镇静、抗心律失常、预防肾功能衰竭及降血压等作用，因而具有很大的药用开发价值。虽然河豚毒素具有极强的医疗效果，但其提取工艺极其复杂、纯品的产量极低，目前只有美国、日本﹑中国等少数几个国家有研究和生产的报道，而在国际市场上高纯度的河豚毒素每克价格高达18-20万美金。

目前在制备河豚毒素工艺中涉及到的分离纯化方法主要有：活性炭吸附法、大孔树脂吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等。此类方法如单独使用都存在分离特异性差、回收率不高、产率较低等缺陷。通常是采用多种方法联用的策略，但这同时又会带来分离步骤过于繁琐，目标产物损失过大，消耗大量洗脱试剂等新问题。另有报道利用超滤方法对河豚毒素进行纯化的，但河豚毒素是一个分子量只有319道尔顿的小分子，使用超滤必须使用截留分子量小于500的超滤膜才能起到一定的分离效果，但仍难以将河豚毒素和分子量与之接近的盐类很好的分离，同时超滤法对仪器设备要求极高。目前还有报道利用C₁₈固相萃取小柱来纯化河豚毒素，此方法分离步骤少，但C₁₈固相萃取柱的介质对河豚毒素的分离特异性较低，分离到的河豚毒素达不到标准品纯度，而且C₁₈固相萃取小柱价格高且每次处理量较少。因此，有必要对传统的河豚毒素分离纯化模式和工艺进行创新和改进。

免疫亲和层析（immune affinity chromatography，IAC）是一种利用抗体与抗原之间存在高度特异性的亲和力而发生特异性、可逆性结合的原理，从多组分的混合物中分离特定抗原或抗体的一种层析技术。目前，该方法在抗体、激素、多肽及小分子化合物的分离纯化和分析检测中被广泛应用。虽然免疫亲和技术在上世纪80年代开始在分离纯化领域得到逐步应用，但利用免疫亲和层析来分离纯化河豚毒素尚未见报道，更无商品化的河豚毒素免疫亲和层析（介质）柱出售。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于河豚毒素分离纯化的免疫亲和层析介质。所述免疫亲和介质是由经活化后的固相载体与河豚毒素特异性抗体偶联而成。利用本发明所述免疫亲和介质填料装柱可制备成相应免疫亲和色谱柱，用于河豚毒素的分离纯化。

1、河豚毒素免疫亲和层析介质的制备。

本发明所述的免疫亲和介质是由经活化的固相载体与河豚毒素特异性抗体偶联而成。

（1）先将固相载体经溴化氰法（CNBr）活化。

（2）取河豚毒素特异性抗体与溶胀后的活化固相载体（湿凝胶）置于pH 6.0-7.5，0.1-0.5 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液中在室温下振荡偶联，其中抗体与溶胀后的活化固相载体的质量比为1: 100。

（3）将上述偶联凝胶产物转入其5-10 倍体积的pH 6.0-7.5，含有0.1-0.5 mol/L 醋酸的Tris-HCl缓冲液中，室温下振荡反应2 h进行封闭；最后用5-10 倍于封闭后凝胶体积的pH 6.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2-4 次。

本发明所述的固相载体可为交联葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P）、交联琼脂糖（Sepharose）、多孔玻璃等。优选为交联琼脂糖（Sepharose CL-2B）。

本发明所述的河豚毒素特异性抗体是通过河豚毒素与载体蛋白的偶联物为免疫原来免疫动物得到的。其具体获得有两种途径：1、根据免疫学方法和程序自主制备；2、直接购买商品化河豚毒素特异性抗体。

2、利用本发明所提供免疫亲和层析介质制备成色谱柱用于河豚毒素纯化的方法，包括以下步骤。

（1）含有河豚毒素的样品前处理。

（2）河豚毒素免疫亲和层析柱的制备。

将得到的免疫亲和介质填充入固相萃取柱中，加入pH 6.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液后自然沉降，制成河豚毒素特异性抗体免疫亲和柱，于4℃保存待用。

（3）上样，将含河豚毒素样品以每分钟1-4ml 的流速通过预先用缓冲液平衡好的装有上述免疫亲和层析介质的层析柱。所说的缓冲液平衡免疫亲和层析柱包括如下步骤：将pH6.0-7.0 的缓冲液以每分钟1-4ml 的流速通过装有免疫亲和层析介质的层析柱，用量为层析柱体积的3-10 倍，通过紫外检测保证层析柱己平衡至基线。

（4）洗脱，然后用 pH6.0-7.0的缓冲液清洗上样后的免疫亲和层析柱，再用pH 为4.5-6.5 的洗脱液以每分钟1-4ml 的流速将河豚毒素从层析柱上洗脱并收集洗脱峰，洗脱液的用量为层析柱体积的3-10倍。

（5）收集洗脱液。

本发明所述的河豚毒素纯化方法步骤（3）、（4）中的pH6.0-7.0 的缓冲液选自PBS、Tris-HCl、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种或两种以上，所述的pH 为4.5-6.5的洗脱液选自醋酸-醋酸纳、柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液中的一种或两种以上。

该免疫亲和介质以及由该免疫亲和介质填料制备的色谱柱基于免疫反应和色谱反应，适合从样品（河豚毒素发酵液，河豚内脏提取液）中富集、纯化河豚毒素，便于样品分析检测和高纯度精制。本发明的免疫亲和层析介质具有高选择性，对样品中的河豚毒素有很强的保留和浓缩能力，只要加样量不超过柱容量，在实测样品条件下免疫亲和吸附剂对组分的保留能力几乎不受样品体积或组分浓度的影响。本发明的方法水相操作，操作简单，纯化效果好，免疫亲和色谱柱能重复使用，能节省大量的溶剂，降低分析成本和环境污染。

附图说明

图1为经本发明的亲和层柱纯化后河豚毒素的高效液相（HPLC）色谱图。

图2 为经本发明的亲和层柱纯化后河豚毒素的质谱（MS）图。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例作进一步说明。

实施例1：河豚毒素免疫亲和层析柱的制备。

其中，河豚毒素抗体购于上海雅吉生物科技有限公司，SepharoseCL-2B购于上海锐谷生物科技有限公司，其他所需试剂购于广东光华科技股份有限公司。

（1）河豚毒素抗体及基质的预处理。

将商品化的河豚毒素抗体置于pH 6.5，0.1 mol/L醋酸-醋酸钠偶联缓冲液中透析过夜，稀释至0.1mg/ml。

称取经溴化氰活化后的Sepharose CL-2B冻干粉，于盛有1mmol/L HCL溶液的容器中充分溶胀得到一定体积的湿胶。用8倍以上湿胶体积的pH 6.5，0.1 mol/L醋酸-醋酸钠偶联缓冲液快速洗涤2次，5000r/min离心2分钟，将湿胶定容到20ml。

（2）偶联。

将湿胶加入0.1mg/ml的抗体溶液中，使抗体与湿凝胶的质量比为1: 100，室温振荡10h。偶联反应结束后，用10倍偶联胶体体积的偶联缓冲液洗涤除去未偶联的抗体，收集洗涤液。偶联率计算公式：偶联率=（偶联前抗体量-未偶联抗体量）/偶联前抗体量。经溴化氰活化后的Sepharose CL-2B与河豚毒素抗体的偶联率在90%以上。

（3）封闭。

将偶联凝胶产物转入其5-10 倍体积的pH 6.5的含有0.1 mol/L 醋酸的Tris-HCl封闭缓冲液中混合，室温下振荡反应2 h封闭未偶联的活化位点。

（4）洗涤。

凝胶用10倍体积的pH 6.5醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤4次。

（5）装柱。

将得到的偶联有河豚毒素抗体的亲和吸附剂填充入与其体积比为4:1的固相萃取柱里，制成偶联有河豚毒素抗体的免疫亲和层析柱，4℃保存备用。

实施例2：利用免疫亲和层析纯化微生物源河豚毒素。

（1）免疫亲和层析柱采用实施例1 制得的亲和层析柱。

（2）样品前处理，河豚组织源样品前处理：河豚鱼组织（卵巢，肝脏等）捣碎后经过0.1% 醋酸水溶液浸泡煮沸10min，过滤除去残渣，提取3次，合并澄清液，旋转蒸发浓缩澄清液，经0.45ｕm滤膜抽滤得到含河豚毒素的样品。微生物源样品前处理：产河豚毒素的菌种发酵液经离心后（8000×g，30min）收集上清液，用醋酸调pH 4-5，沸水浴10min，离心后收集上清液，旋转蒸发10倍浓缩，经0.45ｕm滤膜抽滤得到含河豚毒素的样品。

（3）上样：首先平衡柱子：用0.1mol/L pH7.0醋酸缓冲液以每分钟1ml 的流速通过装有免疫亲和层析介质的层析柱，用量为层析柱体积的5 倍，通过紫外检测保证层析柱己平衡至基线。

将含河豚毒素样品以每分钟1ml 的流速通过预先用缓冲液平衡好的亲和层析柱。

（4）清洗：上样完后，用0.1mol/L pH7.0醋酸缓冲液以2ml/min的流速清洗层析柱，用量为柱体积的5倍，通过紫外检测（205nm）以清洗至基线。

（5）洗脱：清洗至基线后，用PH 4.5醋酸-醋酸纳缓冲液以1ml/min的流速洗脱柱上吸附的河豚毒素，收集洗脱峰，缓冲液用量为柱体积的5倍。

（6）进行液相色谱分析。

液相色谱条件：分离柱Hypersil BOS C18，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；检测波长为205nm，流速为0.5ml/min，进样量为20 ml，柱温20℃。

将上述（5）中收集的洗脱峰液以上述HPLC条件进行分析，所得色谱图如附图1所示。HPLC谱图显示只有一个吸收峰，并与报告的河豚毒素在此波段的吸收峰及保留时间相符，对峰积分峰面积达99%。

由HPLC分析可知，利用实施例1所制备的亲和层析柱分离纯化微生物发酵液制备河豚毒素，可得到纯度较高的河豚毒素。

（6）进行质谱分析。

质谱条件: 电喷雾离子源( ESI)，正离子模式，喷雾电压 5.5KV，干燥气流速8 L/m in，干燥气温度500℃，质量扫描范围50- 400 m / z，分子离子: m /z 320，二级碎片子离子m /z301.6，为定量检测离子；阱离子累积时间200 ms，最大累积电荷数50 000，二级碎裂电压0. 80 Ampt。

将经过本发明的免疫亲和层析柱分离到的河豚毒素进行质谱检测，所得质谱图中有一个319.92的分子离子峰（见附图2），即为河豚毒素的分子量，其他为碎片离子峰。说明此亲和层析柱能特异性的用于河豚毒素的分离纯化。

Claims

1.一种免疫亲和层析介质的制备方法，其特征是由固相载体和河豚毒素特异性抗体组成，包括以下步骤：

（1）先将固相载体经溴化氰法活化；

（2）取河豚毒素特异性抗体与溶胀后的活化固相载体置于pH 6.0-7.5，0.1-0.5 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液中在室温下振荡偶联，其中抗体与溶胀后的活化固相载体的质量比为1: 100；

（3）将上述偶联凝胶产物转入其5-10 倍体积的pH 6.0-7.5，含有0.1-0.5 mol/L 醋酸的Tris-HCl缓冲液中，室温下振荡反应2 h进行封闭；最后用5-10 倍于封闭后凝胶体积的pH 6.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2-4 次；

所述的固相载体可为交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、交联琼脂糖或多孔玻璃等。

2.根据权利要求1所述的免疫亲和层析介质的制备方法，其特征是固相载体为交联琼脂糖。

3.权利要求1所述的免疫亲和层析介质的制备方法制备的免疫亲和层析介质用于河豚毒素纯化的方法，包括以下步骤：

（1）含有河豚毒素的样品前处理；

（2）河豚毒素免疫亲和层析柱的制备：

将得到的免疫亲和介质填充入固相萃取柱中，加入pH 6.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液后自然沉降，制成河豚毒素特异性抗体免疫亲和柱，于4℃保存待用；

（3）上样，将含河豚毒素样品以每分钟1-4ml 的流速通过预先用缓冲液平衡好的装有上述免疫亲和层析介质的层析柱；

所说的缓冲液平衡免疫亲和层析柱包括如下步骤：将pH6.0-7.0 的缓冲液以每分钟1-4ml 的流速通过装有免疫亲和层析介质的层析柱，用量为层析柱体积的3-10 倍，通过紫外检测保证层析柱己平衡至基线；

（4）洗脱，然后用 pH6.0-7.0的缓冲液清洗上样后的免疫亲和层析柱，再用pH 为4.5-6.5 的洗脱液以每分钟1-4ml 的流速将河豚毒素从层析柱上洗脱并收集洗脱峰，洗脱液的用量为层析柱体积的3-10倍；

（5）收集洗脱液；

所述的河豚毒素纯化方法步骤（3）、（4）中的pH6.0-7.0 的缓冲液选自PBS、Tris-HCl、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种或两种以上，所述的pH 为4.5-6.5的洗脱液选自醋酸-醋酸纳、柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液中的一种或两种以上。