CN104181300A - 一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途。该免疫亲和纯化柱利用蛋白G偶联到琼脂糖凝胶载体上，然后用抗伏马毒素的抗体与琼脂糖上的蛋白G偶联。偶联后的伏马毒素抗体-蛋白G-琼脂糖凝胶载体复合载体装填亲和柱。该免疫亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的伏马毒素的纯化，以便于后期对样本中伏马毒素的高效液相色谱(HPLC)检测和荧光检测。

Description

一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及一种伏马毒素的免疫亲和柱及其制备方法和用途。属食品安全检测领域。

背景技术：

伏马毒素(Fumon isins)是一组主要由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的真菌毒素。伏马毒素在自然界中分布广泛，且危害性大，逐渐引起了国内外学者的高度重视。目前，已发现的伏马毒素结构类似物主要分为A、B、C、P四类。研究证实伏马毒素可致马大脑白质软化症(EL-EM)，神经性中毒而表现意识障碍、失明和运动失调等症状，严重者甚至造成死亡。对猪造成肺水肿综合征(PPE)，并能造成肝脏和食道损伤。伏马毒素还可引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变，诱发大鼠肝癌。与人类食道癌的发生也密切相关。国际癌症研究机构与加利福尼亚环境保护机构已宣布伏马毒素为人类潜在的致癌物质(2B级致癌物)。伏马毒素污染的主要是玉米及其制品，此外还有一些如大米、高粱、小米、牛奶、啤酒等食品。目前世界各地关于伏马毒素污染的报导较多，其中玉米及其制品的污染占了大部分。高含量的伏马毒素在很多国家和地区的玉米及玉米制品中都有报道，如韩国、中国、巴西、尼日利亚、南非、英国、法国和意大利。中国四川、浙江、河南等省份也有伏马毒素污染情况的调查，阳性检出率都较高。有调查在2005年从河南、湖北、广东、四川、广西、吉林等6个省市收集了282份玉米样品进行检测。99.6％的样品表现伏马毒素阳性，平均污染含量为6662ng/g。

基于伏马毒素的污染范围较广，毒性作用也较基于伏马毒素的污染范围较广，毒性作用也较大，许多国家和地区对伏马毒素进行了系统研究。但目前国际上对于食品与饲料中伏马毒素的限量及检测方法尚无统一标准。瑞典规定人类食物中伏马毒素的限量为1mg/kg，美国食品与药品管理局(FDA)发布了供人类食用的玉米和玉米产品伏马毒素的最高限量指导性公告，规定人类食用玉米中伏马毒素最高限量为2mg/kg。同时，FDA的畜牧医学中心(CVM)也发布了动物饲料中伏马毒素的最高限量指导性公告，规定其限量范围为1～50mg/kg。在FAO/WHO联合会上关于食品添加剂的会议(2001年2月)中规定，伏马毒素对人体的安全限量为每天摄入量按人体体重算FB1、FB2、FB3量不超过2ug/kg。我国对此的相关法规也正在制定中。在出入境检验检疫行业推荐标准中，液相色谱法对伏马毒素B1、B2的测定低限均为0.05mg/kg。

目前伏马毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫分析法等。

其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测伏马毒素的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器，。但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量，主观影响较大，灵敏度不高等，已远远不能满足现代检测要求。

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。成本低的特点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查，可以大大节省时间和费用，因此越来越受到基层检验单位的欢迎。ELISA方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于基层的筛查检测。

高效液相色谱法(HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的需要，所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱(IAC-HPLC))将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术，在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时，其中的抗原与抗体结合，其他杂质则通过水溶液洗掉，再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来，从而使样品中的毒素得以净化。

目前制备免疫亲和纯化柱的方法大概有：溴化氰活化直接偶联法、环氧氯丙烷法、过碘酸钠法等。这些方法的基本原理都是将载体基质进行化学活化后，将抗体偶联到载体上。但是由于偶联是非特异性的，抗体的任何部位都有可能和载体偶联，方向性是不可控制的。势必影响亲和纯化柱纯化伏马毒素的效率。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途

为了达到上述目的，在本发明中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合。并且具有很高的亲和力。我们克隆了蛋白G的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到载体上后，再将伏马毒素抗体偶联到蛋白G上，制备出了伏马毒素-蛋白G-载体，再用交联剂将载体进行交联。交联后的载体装柱后就形成了高亲和力的伏马毒素免疫亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化伏马毒素效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的伏马毒素。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。

具体操作如下：

本发明最大的优势就是利用了蛋白G与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fc区，其中，Fab区是抗原结合的区域。

蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fc区域有特异性的结合能力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白G，1个分子的蛋白G可以结合3个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。并且只有抗体能与蛋白G结合，其余蛋白均不能与蛋白G结合，特异性很高。以此蛋白G为基础制备的免疫亲和柱具有特异性好，伏马毒素结合量大，纯化效率高的特点。

伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法说明如下：

1.载体活化

选择琼脂糖载体，sepharose4B，以环氧氯丙烷活化法进行活化。

取2％的预溶胀的琼脂糖凝胶sepharose4B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分。

称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氧化钠NaBH4，5毫升，在25℃下摇床反应8小时。

反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。

2.将蛋白G与活化载体sepharose4B的偶联

将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液(0.1M的NaHCO₃，0.8MNaCl，PH8.9)洗涤3次。加入2mg/ml的蛋白G，室温偶联4小时。

将偶联好的琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有蛋白G的琼脂糖载体sepharose命名为蛋白G-sepharose。

3.抗伏马毒素抗体与蛋白G-sepharose载体上的蛋白G连接

蛋白G与抗体具有特异性的亲和力，在一定的反应条件下，将偶联有蛋白G的琼脂糖凝胶与抗体进行连接。将抗体连接于琼脂糖上。由于蛋白G与抗体的结合部位是抗体的Fc区域，抗体的抗原结合区不受影响，充分保证了抗体的抗原结合能力。

将抗伏马毒素抗体溶于20mM、PH7.4的PBS中，终浓度2mg/ml。将抗体加入用20Mm PH7.4的PBS缓冲液洗涤过的蛋白G-sepharose中。室温结合30分钟。

结合后的载体用PBS洗涤。连接有抗体的载体命名为抗体-蛋白G-sepharose。

4.载体交联

将抗体-蛋白G-sepharose用0.1M PH9.0的硼酸缓冲液洗涤3次。然后加入0.1M PH9.0的硼酸缓冲液，在缓冲液中加入交联剂如庚二亚氨酸二甲酯(DMP)至终浓度20mM。室温交联1小时。

加入50mM，PH9.0的乙醇胺终止反应。并用50mM的乙醇胺封闭10分钟。

交联后的抗体-蛋白G-sepharose载体用20mM，PH7.4的PBS洗涤3次。

5.装柱

将交联后的抗体-琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的伏马毒素亲和纯化柱。层析柱的结构如附图1所示：

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)充分的利用了蛋白G与IgG抗体特异性结合的特性，使抗体通过蛋白G偶联到载体上。并且IgG抗体的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了伏马毒素的捕捉能力，伏马毒素的纯化效率也得到有效提高。。

2)本发明使用了基因改造后的蛋白G，通过对密码子的优化和IgG结合域基因的优化。使蛋白G的抗体结合能力大幅度提高，进而提高了伏马毒素的纯化效率。

3)使用本发明纯化伏马毒素操作简便，几步就可以得到纯度较高的伏马毒素。更方便操作者使用。

4)使用本发明的产品得到的伏马毒素纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测。节省了操作者的时间和费用。

附图说明

图l：伏马毒素免疫亲和柱结构组份示意图

A：进样口塞；B：进样口；C：稳定箍；D：上筛板；E：柱体；F：载体填料；

G：下筛板；H：出样口堵头

图2：伏马毒素免疫亲和柱外观结构图

A：进样口塞；B：进样口；C：稳定箍；D：上筛板；E：柱体；F：载体填料；

G：下筛板；H：出样口堵头

图3：玉米样品中加入伏马毒素标准品的检测结果

具体实施方式

实施例1：伏马毒素免疫亲和纯化柱的制备

本发明制备伏马毒素免疫亲和纯化柱的一个优选的实施方案如下：

1.琼脂糖凝胶活化

取2％的琼脂糖凝胶sepharose2B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇。用漏斗过滤掉水分。称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4，5毫升，在25℃下摇床反应8小时。

反应后，用50毫升蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。

2.蛋白G与活化的琼脂糖凝胶的偶联

取1克活化后的琼脂糖凝胶，用偶联缓冲液(0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，PH8.9)洗涤3次。加入2mg/ml的蛋白G20ml，室温偶联4小时。

将偶联好的琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有蛋白G的琼脂糖载体sepharose命名为蛋白G-sepharose。

3.抗伏马毒素IgG单抗与蛋白G-sepharose结合

将抗伏马毒素FB1、FB2、FB3单克隆抗体溶于20mM、PH7.4的PBS中，终浓度2mg/ml，总体积10ml。

将蛋白G-sepharose用20Mm PH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，每次30ml。将溶解于PBS中的伏马毒素抗体加入洗涤过的蛋白G-sepharose中。室温结合30分钟。

结合后的载体用20Mm PH7.4的PBS洗涤三次，每次30ml。连接有抗体的载体命名为抗体-蛋白G-sepharose。

4.结合IgG的琼脂糖sepharose交联

将抗体-蛋白G-sepharose用0.1M PH9.0的硼酸缓冲液洗涤3次，每次30ml。

将湿凝胶固体，加入0.1M PH9.0的硼酸缓冲液20ml，在缓冲液中加入交联剂庚二亚氨酸二甲酯(DMP)至终浓度20mM。室温交联1小时。

加入100mM，PH9.0的乙醇胺20ml终止反应。并用50mM的乙醇胺20ml封闭10分钟。

交联后的抗体-蛋白G-sepharose载体用20mM，PH7.4的PBS洗涤3次，每次30ml。

5.装柱

将交联后的sepharose用10毫升20mM PBS PH7.4重悬，然后装入空的亲和纯化柱柱体中。

1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlPBS，使其自然流干。

2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的抗体-蛋白G-sepharose载体，静止5分钟，使载体自然沉降。

3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方。

4)加入进样口，进样口有一个压紧作用，是上方筛板紧贴载体。

5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口。

6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlPBS，将注射器接在进样口上，缓慢的将PBS注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱。

7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的伏马毒素免疫亲和柱放入4℃保存。

实施例2：利用伏马毒素免疫亲和柱纯化和检测玉米样品中的伏马毒素

本实施例利用正常的玉米样本定量加入伏马毒素的标准品，然后用免疫亲和柱进行纯化，纯化后用高效液相色谱检测。测定回收率。

1.玉米样品处理

1)将玉米样品粉碎；

2)按照每克样品15微克的标准，在粉碎后的玉米样品中添加伏马毒素标准品；

3)称取1样品，加入100mL的提取液；

4)高速匀浆2min；

5)用快速定性滤纸过滤；

6)取1.5mL滤液，加入36mL稀释液，振荡混匀；

7)用微纤维滤纸过滤；

8)取全部滤液用于上样检测。

2.将伏马毒素免疫亲和纯化柱室温平衡30分钟。

3.取出免疫亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上。

4.打开出样口塞，用去离子水洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出。

5.将样品加入纯化柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出纯化柱。

6.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升。

7.加入1ml甲醇，收集洗脱产物。

8.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测。

9.高效液相色谱检测结果见表1，色谱图见附图3：

表1玉米中伏马毒素含量HPLC检测结果

从检测结果可以看出，这份玉米样品经伏马毒素免疫亲和柱纯化后，用高效液相色谱HPLC可以检测到伏马毒素峰，峰值为1493.19420。

从检测结果可以看出，在1g的粉碎后玉米样品中加入1.5ug的伏马毒素，用本发明的免疫亲和柱可以回受到1.493ug。回收率为99.5％。

Claims (11)

1.一种伏马毒素的免疫亲和柱，其特征在于包含有载体、蛋白G和伏马毒素抗体。 

2.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于蛋白G通过化学键偶联在载体上，伏马毒素抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。 

3.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于蛋白G是基因重组表达的蛋白G。 

4.根据权利要求2中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的蛋白G包括按照GenBank CAA27638.1序列表达的蛋白G，以及进过序列优化后表达的蛋白G。 

5.根据权利要求3中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的序列优化的蛋白G，包括针对大肠杆菌表达进行的蛋白G密码子进行优化、对蛋白G进行抗体结合区域进行序列改变以增加亲和力以及增加蛋白G基因序列中抗体结合区域数量以提高抗体亲和能力。 

6.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的载体是琼脂糖凝胶。 

7.根据权利要求6中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶包含但不限于溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶以及纤维素。 

8.根据权利要求6中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的抗伏马毒素抗体包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。 

9.一种纯化伏马毒素的免疫亲和柱制备方法，其特征在于 

1)琼脂糖sepharose4B，加入0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4，，在25℃下摇床反应8小时进行活化。或者购买溴化氰活化的sepharose4B。 

2)每克活化的sepharose4B加入30-200nmol的蛋白G，在0.1M NaHCO3，0.5M NaCl PH8.8的缓冲液中，室温偶联2小时。或者4℃偶联过夜。 

3)偶联产物用1M Tris.HCl PH8.0室温反应2小时。 

4)偶连好的sepharose-蛋白G，用20mM PH7.4的PBS洗涤。 

5)将伏马毒素抗体溶解在同样的20mM PH7.4的PBS中，每克蛋白G-sepharose加入200nmo1-1.2umol抗体。室温反应30分钟。 

6)将伏马毒素抗体-蛋白G-sepharose载体用20mM PBS PH7.4洗涤，然后加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3.室温反应1小时。 

7)用20mM PH7.4的乙醇胺终止反应，用含有0.01％硫柳汞的10mMPBS PH7.4洗涤伏马毒素抗体-蛋白G-sepharose载体。装柱，放于4℃保存。 

10.根据权利要求1所述的免疫亲和柱检测伏马毒素的用途。 

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：包含但不限于粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液、水中伏马毒素的分离纯化。