CN102115493A

CN102115493A - 重组蛋白g的制备及应用

Info

Publication number: CN102115493A
Application number: CN2009102442157A
Authority: CN
Inventors: 宫照龙; 何新舟; 曹晖; 许允立
Original assignee: Vector Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Vector Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2011-07-06

Abstract

本发明属于生物工程技术领域。本发明是将链球菌蛋白G的IgG结合域基因单体根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化，将4个单体基因重复插入热诱导型大肠杆菌载体pBV220，构建了含有该基因的大肠杆菌重组表达载体及其转化的大肠杆菌DH5α重组菌株和利用此菌株生产重组蛋白G的方法。此菌株所产生的可溶性重组蛋白G达到细菌可溶性蛋白总量的40％以上，经镍离子螯合层析纯化即可将重组蛋白G的纯度达到95％以上，该蛋白具有表达量高、成本低、易纯化等优点。本发明为获得质量高且价格便宜的重组蛋白G并用其制备多种抗体分离介质提供一条切实可行的途径。

Description

重组蛋白G的制备及应用

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组蛋白G的基因及氨基酸序列，以及含有这种重组蛋白G的载体和转化的菌株，及其纯化方法和亲和填料的制备和用途。

背景技术：

链球菌蛋白G(Streptococcal Protein G，SPG)是一种从链球菌细胞壁和培养上清中分离的蛋白质。1973年，Kronvall报道了链球菌A、C和G群许多菌株的细胞壁及培养上清中含有能与IgG Fc片段结合的蛋白质，其特性与金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus Aprotein，SPA)明显不同。1984年，Bjorck等将其统称为链球菌蛋白G(SPG)。

SPG与SPA虽然都能结合IgG，但分子结构研究表明，它们是完全不同的分子。除C端有小段氨基酸相同外，两者的基因序列和蛋白结构并无相同之处。进一步的研究发现，在G蛋白的C端有3处氨基酸序列相同的结构与IgG结合有关。此外，通过计算蛋白G与IgG反应的平衡常数并与SPA比较，结果蛋白G对多数IgG的亲和常熟较SPA高，表明蛋白G的结合力比SPA强。

对蛋白G与IgG结合谱的研究发现，蛋白G对不同种属的IgG结合力与SPA有明显不同，详见表1。

表1.免疫球蛋白与Protein A和Protein G的结合力

注：

W＝weak binding

S＝strong binding

NB＝no binding

蛋白G、重组蛋白A是不同来源抗体纯化首选介质。尽管目前国内抗体大规模生产的产量还相对较低，但随着我国许多抗体药物大规模生产计划的实施，抗体生产量将在近几年内迅速增加，由此市场对蛋白G、蛋白A的需求量会迅速提高。

基因工程技术的发展，使我们可以按照大肠杆菌对密码子的偏爱，优化SPG的基因序列，以有利于其在大肠杆菌中的高效表达；同时，本发明首创将4个结合IgG的功能区序列进行串联表达(自然状态下的SPG的IgG结合功能区为3个)，其蛋白活性较市售蛋白G有较大幅度提高(见实施例6)。此外，我们在SPG的N端设计由6个组氨酸组成的his标签，以便于通过亲和层析的方法快速高效获得SPG纯品。

发明内容：

本发明需要解决的技术问题之一是提供该重组蛋白G的氨基酸序列，以克服现有技术的不足。

本发明需要解决的技术问题之二是提供含有该重组蛋白G基因的载体。

本发明需要解决的技术问题之三是提供被含有重组蛋白G基因的表达载体转化宿主菌。

本发明需要解决的技术问题之四是提供该重组蛋白G的制备方法。

本发明需要解决的技术问题之五是提供该重组蛋白G的用途。

本发明需要解决的技术问题之六是提供一种由该重组蛋白G组成的亲和层析介质。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的重组蛋白G基因是以4个人工合成的重组蛋白G基因单体(基因序列根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行优化)串联而成。该基因由885个核苷酸组成，编码294个氨基酸(该基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列见序列表SEQ No.1和SEQ No.2)。该基因可以通过直接基因合成的方式获得，或通过基因克隆的方式获得(见实施例1)。

本发明还构建了含有上述重组蛋白G基因的重组表达载体，构建方法是将合成的重组蛋白G基因单体用EcoRI和BamHI双酶切后连接到同样酶切的pBV220载体上，再以AccI内切酶进行单酶切，构建含4个串联重组蛋白G单体的重组蛋白G基因表达载体。

本发明还提供了利用上述含大肠杆菌重组表达载体的大肠杆菌生产重组蛋白G的方法，该方法是将菌株进行发酵，高效表达重组蛋白G，再离心菌液收集菌体，超声破碎，取离心上清进行亲和层析分离纯化，获得重组蛋白G产品。

本发明生产的重组蛋白G为可溶性表达，且具有表达量高(占细菌可溶性蛋白总量的40％以上)、表达时间短(仅数小时)、易于纯化、成本低等优点，有利于基因工程重组蛋白G的产业化生产。

本发明的重组蛋白G基因的表达产物重组蛋白G用于与琼脂糖凝胶等层析介质载体偶联制备亲和层析填料用于抗体(药物)的分离纯化。

本发明生产的重组蛋白G具有IgG结合活性强、纯度及产量高等优点。

本发明生产的重组蛋白G亲和填料具有IgG载量高、结合特异性强、亲和力好、蛋白G配体脱落少等优点。

附图说明

图1是本发明构建的重组表达载体pBV220-SPG，是在载体pBV220中插入由4个单体串联的protein G基因。

图2重组蛋白G表达表达鉴定的SDS-PAGE电泳图。其中泳道1是低分子蛋白marker；泳道2是未经诱导的DH5a/pBV220-SPG菌体；泳道3是经温控诱导后的DH5a/pBV220-SPG菌体。

图3重组蛋白G样品经金属镍亲和层析纯化的SDS-PAGE电泳图。其中泳道1是低分子蛋白marker；泳道2是经50mM咪唑洗脱峰样品；泳道3是经200mM咪唑洗脱峰样品(上样量30ug)；泳道4是经200mM咪唑洗脱峰样品(上样量10ug)。

图4是本发明的重组蛋白G与市售的某种蛋白G的ELISA活性比较图。

图5是重组蛋白G琼脂糖凝胶6B FF的人IgG载量测定的色谱图。峰1和峰2分别为流穿峰和洗脱峰。

图6是重组蛋白G琼脂糖凝胶6B FF的人血清的SDS-PAGE纯化鉴定图。其中泳道1是低分子蛋白marker；泳道2-3是人血清样品；泳道4-5是经重组蛋白G琼脂糖凝胶6B FF纯化的人IgG。

具体实施方式

实施例1重组蛋白G基因单体的合成

为促进金黄色葡萄球菌蛋白G基因在大肠杆菌中的表达，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，优化蛋白G基因中某些碱基序列，通过化学合成的方法，设计合成重组蛋白G基因单体序列，其序列长度为228bp，两端设计AccI酶切位点，用于多个重组蛋白G基因单体连接的接头。此外，还包括起始密码子ATG，终止密码子TAA、克隆用EcoRI和BamHI限制性内切酶位点及5′端6×His标签序列。

实施例2含有一个重组蛋白G基因单体的pBV220表达载体的构建

将化学合成的重组蛋白G基因单体用EcoRI和BamHI双酶切后连接到同样酶切的pBV220载体上，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，抽提质粒经PCR、酶切及测序鉴定后证明重组蛋白G基因单体已克隆至pBV220中。

实施例3含有4个IgG结合域的重组蛋白G串联基因的pBV220-SPG表达载体的构建

将上述含一个重组蛋白G基因单体的pBV220载体及重组蛋白G基因单体以AccI酶切，回收相应片段后连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，抽提质粒经PCR、酶切及测序筛选获得具有4个串联重组蛋白G基因的克隆子。结果如说明书附图1所示。

实施例4pBV220-SPG表达载体转化大肠杆菌

pBV220-SPG用CaCl₂法转化E.coli DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经PCR、酶切及测序鉴定获得含有4个蛋白G串联基因的pBV220-SPG的克隆子。

实施例5利用工程菌E.coli DH5α/pBV220-SPG生产重组蛋白G

1)菌种的培养发酵

按1∶50将大肠杆菌工程菌E.coli DH5α/pBV220-SPG接种于新鲜LB培养基中，30℃培养过夜；次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1∶20接种至发酵培养基中，30℃培养至OD₆₀₀达到0.5-0.8时，升温至42℃诱导，诱导4h后离心收菌。蛋白G诱导表达鉴定结果见图2。

2)表达产物的纯化

取发酵诱导菌用PBS洗涤3次，溶解，超声破碎，4℃离心，收集上清，用0.45μm滤器过滤，适当稀释后，用金属螯合镍琼脂糖凝胶亲和层析柱进行纯化，收集洗脱峰，即为纯化的重组蛋白G，其纯度可达95％以上。结果如说明书附图3所示。

实施例6SPG活性的ELISA测定

1)包被：酶标板每孔加入100ul兔IgG(2ug/ml)，4℃过夜，洗涤；

2)封闭：每孔加入200ul封闭液，37℃2h，洗涤；

3)加入不同稀释度的待测ProG样品，2倍比稀释，37℃1h，洗涤；

4)加入100ul HRP标记兔抗IgG(1∶1000稀释)，37℃1h，洗涤；

5)加入100ul的显色液

6)50ul 2M浓硫酸终止显色，测OD₄₅₀。

经ELISA检测表明，本发明的重组蛋白G具有很好的IgG结合活性，其活性高于目前市售的某种重组蛋白G。结果见附图图4。

实施例7重组蛋白G琼脂糖凝胶6B FF的制备

1)sepharose-6B的活化

100ml sepharose-6B、100ml环氧氯丙烷和150ml 0.8M NaOH(含300mg NaBH₄)、50ml二氧六环混合，40℃作用6h(水浴180转/分)。

充分洗胶(水)

2)含氨基的活性sepharose 6B制备：

100ml含环氧基的活性sepharose 6B，0.1M硼酸盐缓冲液150ml，pH7-9，加入25ml二氨基丙胺，在50-55℃反应3h.

反应结束，用1M NaCl和水大量冲洗。

3)含羰基咪唑基sepharose 6B制备：

将上述合成的氨基活性sepharose 6B用二氧六环淋洗，然后加入150ml二氧六环，5g羰基二咪唑，在20-30℃下反应2h。

4)100ml含羰基咪唑基sepharose 6B，100ml 0.1M硼酸盐缓冲液(pH9)，加入1g蛋白G，在4-20℃反应1.6-24h。

5)反应结束，回收未反应的蛋白G。胶分别用水和含1M NaCl的PBS缓冲液(pH7.4)冲洗。重组蛋白G琼脂糖凝胶6B FF具有以下特点：

1)基质：6％的交联琼脂糖凝胶

2)配体：重组蛋白G

3)配体密度：约6mg重组蛋白G/ml

4)吸附载量：20mg人IgG/ml

5)最大流速：300cm/h

6)pH范围：3-9

7)使用温度：室温

8)保存温度及液体：4-8℃，20％乙醇

9)稳定性高：亲和填料可重复使用多次而IgG载量无明显下降。

实施例8重组蛋白G琼脂糖凝胶6B FF从人血清中分离纯化IgG

1)重组蛋白G琼脂糖凝胶6B FF装柱。

2)用缓冲液A洗5～10个柱床体积平衡柱子，流速为1ml/min。

3)将人血清用缓冲液A稀释10倍，0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min。

4)用缓冲液A再洗5～10个柱床体积，流速为1ml/min。

5)用缓冲液B洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰，立即用中和缓冲液中和到中性。

5)用纯水洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃保存。

6)将分离纯化的IgG样品进行SDS-PAGE电泳分析。

缓冲液组成：

缓冲液A：20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4。配制：0.2M NaH₂PO4 19ml，0.2M Na₂HPO4 81ml，NaCl 9g加水至1000ml。

缓冲液B：20mM柠檬酸缓冲液，pH4.0。配制：柠檬酸2.1g加水950ml，用5M NaOH调至pH4.0，加水至1000ml。

结果：

用本发明的重组蛋白G琼脂糖凝胶6B FF亲和层析介质经一步纯化就可以得到纯度大于95％的人IgG，用BCA法测其人IgG载量为20mg/ml填料。分离纯化色谱图见图5，纯化样品(IgG)纯度经SDS-PAGE鉴定如图6所示。

序列表

1.SEQ ID No.1的信息：

<110>本元正阳基因技术有限公司

<120>重组蛋白G制备及应用

<130>Expression and purification of a truncated recombinant protein G

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>885

<212>DNA

<213>Streptococcus

<400>1

atgcaccatc atcatcatca tgtggtggat acttacaaat taatccttaa tggtaaaaca 60

ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa 120

caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt gaatggactt acgacgatgc gactaagacc 180

tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc gatgcgtctg aattaacacc agccgtggta 240

gacacttaca aattaatcct taatggtaaa acattgaaag gcgaaacaac tactgaagct 300

gttgatgctg ctactgcaga aaaagtcttc aaacaatacg ctaacgacaa cggtgttgac 360

ggtgaatgga cttacgacga tgcgactaag acctttacag ttactgaaaa accagaagtg 420

atcgatgcgt ctgaattaac accagccgtg gtggatactt acaaattaat ccttaatggt 480

aaaacattga aaggcgaaac aactactgaa gctgttgatg ctgctactgc agaaaaagtc 540

ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact 600

aagaccttta cagttactga aaaaccagaa gtgatcgatg cgtctgaatt aacaccagcc 660

gtggtagaca cttacaaatt aatccttaat ggtaaaacat tgaaaggcga aacaactact 720

gaagctgttg atgctgctac tgcagaaaaa gtcttcaaac aatacgctaa cgacaacggt 780

gttgacggtg aatggactta cgacgatgcg actaagacct ttacagttac tgaaaaacca 840

gaagtgatcg atgcgtctga attaacacca gccgtggtgg attaa 885

2.SEQ ID No.2的信息：

<110>本元正阳基因技术有限公司

<120>重组蛋白G制备及应用

<130>Expression and purification of a truncated recombinant protein G

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>294

<212>PRT

<213>Streptococcus

<400>1

Met His His His His His His Val Val Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu

1 5 10 15

Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala

20 25 30

Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val

35 40 45

Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr

50 55 60

Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Val

65 70 75 80

Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr

85 90 95

Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln

100 105 110

Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala

115 120 125

Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser

130 135 140

Glu Leu Thr Pro Ala Val Val Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly

145 150 155 160

Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr

165 170 175

Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly

180 185 190

Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys

195 200 205

Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Val Asp Thr

210 215 220

Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr

225 230 235 240

Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala

245 250 255

Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys

260 265 270

Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu

275 280 285

Thr Pro Ala Val Val Asp

290

Claims

1.一种人工重组蛋白G，其特征是：

1)包含4个人工重组蛋白G的基因单体重复序列；

2)包含his标签序列。

2.根据权利要求1，所述的重组蛋白G的基因序列为SEQ ID No 1。

3.根据权利要求1，所述的重组蛋白G的氨基酸序列为SEQ ID No 2。

4.根据权利要求1，所述的重组蛋白G的基因表达载体为原核表达载体，其特征为所述表达载体优先为pBV220。

5.根据权利要求1，所述的重组蛋白G的基因表达宿主为原核细菌，其特征为所述表达宿主优先为大肠杆菌。

6.一种重组蛋白G琼脂糖凝胶，其特征是以琼脂糖凝胶为基质，采用环氧法活化载体，将所述的蛋白G以间隔臂的方式固定在载体表面，从而合成了蛋白G琼脂糖凝胶。

7.根据权利要求6，所述的琼脂糖凝胶可以用于抗体分离纯化。