CN116333168A - 猪流行性腹泻病毒s蛋白三聚体纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
猪流行性腹泻病毒s蛋白三聚体纳米颗粒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116333168A CN116333168A CN202310135368.8A CN202310135368A CN116333168A CN 116333168 A CN116333168 A CN 116333168A CN 202310135368 A CN202310135368 A CN 202310135368A CN 116333168 A CN116333168 A CN 116333168A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- diarrhea virus
- epidemic diarrhea
- porcine epidemic
- trimer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 title claims abstract description 120
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 title claims abstract description 99
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 title claims abstract description 99
- 239000013639 protein trimer Substances 0.000 title claims abstract description 69
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 17
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 15
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 13
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 28
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 9
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 28
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 2
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101800001632 Envelope protein E Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，由猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53‑50A的复合物与I53‑50B蛋白组装得到；所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53‑50A的复合物由第一重组载体经转染、表达、纯化而得；所述第一重组载体包括第一载体和连接于所述第一载体上的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列由如SEQ ID No.1所示的第一氨基酸序列通过哺乳动物细胞密码子优化后得到。本发明提供的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒为开发针对PEDV安全、高效的广谱纳米颗粒疫苗提供有效途径。
Description
技术领域
本发明涉及猪流行性腹泻病毒疫苗开发技术领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)属于冠状病毒科，α冠状病毒属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV感染能够引起猪急性肠道疾病，临床症状表现为急性水样腹泻、呕吐、脱水等，在新生仔猪中死亡率高。
PEDV基因组全长约28kb，包含至少七个开放阅读框(open reading frame，ORF)，共编码4个结构蛋白—纤突蛋白S；膜蛋白M；囊膜蛋白E；核衣壳蛋白N。其中S蛋白是PEDV主要的囊膜蛋白，属于I型糖蛋白，蛋白大小约200kDa，以三聚体的形式分布在病毒颗粒的表面，在病毒入侵过程发挥重要作用。S蛋白分为两个结构域—S1和S2，S1包含两个结构域—N-terminal domain(NTD)和C-terminal domain(CTD)，功能上主要介导病毒和细胞受体的结合，S2介导病毒囊膜和细胞膜的融合。S蛋白是决定病毒毒力的主要蛋白，可以诱导机体产生中和抗体。
冠状病毒S蛋白具有良好的免疫原性，在病毒表面均呈现三聚体结构，体外表达S蛋白的三聚体形式与病毒表面天然的S蛋白结构更为接近，因此S蛋白三聚体与S蛋白单体相比可以诱导产生更强的免疫反应。S蛋白为三聚体，具有融合前和融合后两个不同的结构状态。免疫系统识别病毒融合前状态对建立有效的免疫反应至关重要，但是融合前状态不稳定，容易向S蛋白融合后状态转变，导致免疫应答反应降低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，其能够稳定地维持融合前的构象状态，有利于刺激机体产生更强的免疫反应。
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，其为开发针对PEDV安全、高效的广谱纳米颗粒疫苗提供有效途径。
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，由猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白组装得到；
所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物由第一重组载体经转染、表达、纯化而得；
所述第一重组载体包括第一载体和连接于所述第一载体上的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列由如SEQ ID No.1所示的第一氨基酸序列通过哺乳动物细胞密码子优化后得到。
在一种实施方式中，所述第一载体为pRK5。
在一种实施方式中，所述I53-50B蛋白由I53-50B重组载体经转染、表达、纯化而得；
所述I53-50B重组载体包括第二载体和连接于所述第二载体上的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列由如SEQ ID No.2所示的第二氨基酸序列通过大肠杆菌密码子优化后得到。
在一种实施方式中，所述第二载体为pET-29a。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将所述第一重组载体经转染、表达、纯化得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物；
I53-50B重组载体经转染、表达、纯化得到I53-50B蛋白
将所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白组装得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体I53-50纳米颗粒；
所述第一重组载体包括第一载体和连接于所述第一载体上的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列由如SEQ ID No.1所示的第一氨基酸序列通过哺乳动物细胞密码子优化后得到。
在一种实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物采用下述方法制得：
将所述第一重组载体转染哺乳动物悬浮细胞293F，转染后离心收集细胞上清，分别通过Ni-NTA镍柱和凝胶过滤层析柱纯化获得细胞上清中分泌表达的所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物。
在一种实施方式中，所述I53-50B重组载体经转染、表达、纯化得到I53-50B蛋白，包括以下步骤：
构建I53-50B重组载体；
将所述I53-50B重组载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞，通过IPTG诱导上清表达，超声破碎菌体后通过镍柱亲和层析纯化上清中的I53-50B蛋白。
在一种实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白组装得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体I53-50纳米颗粒，包括以下步骤：
将所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白放入组装缓冲液中，孵育过夜进行组装，筛除未组装的组分，分离获得成功组装的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体I53-50纳米颗粒。
相应地，本发明提供了所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒在(1)或(2)中的应用：
(1)在猪流行性腹泻病毒纳米颗粒疫苗中的应用；
(2)在猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明提供的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，针对当前流行毒株具有良好的免疫原性。而且，本发明提供的PEDV S三聚体蛋白可以稳定维持融合前构象状态，并通过在I53-50纳米颗粒表面展示更多的PEDV S三聚体蛋白，有利于刺激机体产生更强的免疫反应，在PEDV纳米颗粒疫苗创制和抗体检测试剂盒开发中具有重要的应用价值和广泛的应用前景。
本发明提供的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，通过体外组装了使得I53-50纳米颗粒表面展示PEDV S三聚体抗原蛋白，最终能够获得免疫效果更佳的疫苗，为PEDV诊断方法和纳米颗粒疫苗研发提供新思路。
附图说明
图1为第一重组载体的构建示意图。
图2为PEDV S三聚体和I53-50A复合物凝胶过滤层析结果图。
图3为PEDV S三聚体和I53-50A复合物SDS-PAGE检测图。
图4为I53-50B SDS-PAGE检测图。
图5为I53-50B Western-blot检测图。
图6为PEDV S三聚体I53-50纳米颗粒负染电镜观察图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本发明中，所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本发明中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，由猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白组装得到；
所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物由第一重组载体经转染、表达、纯化而得；
所述第一重组载体包括第一载体和连接于所述第一载体上的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列由如SEQ ID No.1所示的第一氨基酸序列通过哺乳动物细胞密码子优化后得到。
在一种实施方式中，所述第一重组载体采用下述方法得到：
(1)确定PEDV流行毒株S蛋白序列；
在一种实施方式中，通过比对PEDV流行毒株S蛋白序列，选择每个氨基酸位点出现频率最高的氨基酸序列，确定最普遍流行的S蛋白序列。
(2)对所述PEDV流行毒株S蛋白序列进行突变，得到如SEQ ID No.1所示的第一氨基酸序列；
在一种实施方式中，所述对所述PEDV流行毒株S蛋白序列进行突变，包括：
针对(1)中胞外区序列(1-1322aa)进行如下优化：
将所述PEDV流行毒株S蛋白序列的S1和S2结构域连接处的S1/S2切割位点由913DYKRCSNGRS922突变成913GGGGSGGGGS922；这有助于稳定S蛋白三聚体结构。
将所述PEDV流行毒株S蛋白序列的第893，894，969，1032，1076，1077位氨基酸突变成脯氨酸；即将第893，894，969，1032，1076，1077位氨基酸突变成脯氨酸(K893P，R894P，A969P，A1032P，D1076P，I1077P)，这能够得到PEDV S-6P，使得大部分S蛋白稳定维持融合前的三聚体构象状态，利于刺激机体产生更强的免疫反应。
将所述PEDV流行毒株S蛋白序列的S蛋白自身信号肽更换成IL-2分泌信号肽。即将S蛋白自身信号肽(MKSLTYFWLFLPVLSTFS)更换成IL-2分泌信号肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS)，更利于S蛋白三聚体分泌表达。
在所述S蛋白胞外区序列的C端添加T4 fibritin序列，然后在所述T4 fibritin序列之后添加I53-50A序列；
在所述I53-50A序列之后添加TEV序列，在所述TEV序列之后添加10×His标签序列。
需要说明的是，I53-50纳米颗粒，是一种双组分蛋白质复合物，由二十面体三聚体I53-50A和十二面体五聚体I53-50B在体外组装而成，可用于表面抗原蛋白展示，亦可用于开发针对病原体的多联和多价疫苗。在S蛋白序列C端添加T4 fibritin序列(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)有助于三聚体折叠；在T4 fibritin序列之后添加纳米颗粒组分I53-50A的序列；在I53-50A序列之后添加10×His标签序列(HHHHHHHHHH)，用于S蛋白的纯化和鉴定；最后，考虑到后续存在切割His标签的需求，在I53-50A序列和His标签序列之间添加TEV序列(ENLYFQG)，该序列可被TEV酶特异性识别，在TEV酶的作用下，切割下His标签。
(3)将所述第一氨基酸序列进行哺乳动物细胞密码子优化并合成第一核苷酸序列，再将所述第一核苷酸序列与第一载体连接，得到所述第一重组载体。
优选地，将所述第一氨基酸序列进行哺乳动物细胞密码子优化，并在N端加上Kozak序列(GCCACC)，最终由金唯智公司合成基因。然后通过EcoR I和Hind III限制性内切酶将(3)中的基因序列连接克隆到真核表达载体pRK5上，完成所述第一重组载体的构建。所述表达载体选用真核表达载体pRK5，所述真核表达载体pRK5为商品化可购买。
在一种实施方式中，所述I53-50B蛋白由I53-50B重组载体经转染、表达、纯化而得；
所述I53-50B重组载体包括第二载体和连接于所述第二载体上的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列由如SEQ ID No.2所示的第二氨基酸序列通过大肠杆菌密码子优化后得到。
在一种实施方式中，所述第二载体为pET-29a。
本发明提供的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，针对当前流行毒株具有良好的免疫原性。而且，本发明提供的PEDV S三聚体蛋白可以稳定维持融合前构象状态，并在I53-50纳米颗粒表面展示更多的PEDV S三聚体蛋白，有利于刺激机体产生更强的免疫反应，在PEDV纳米颗粒疫苗创制和抗体检测试剂盒开发中具有重要的应用价值和广泛的应用前景。
相应地，本发明提供了上述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将所述第一重组载体经转染、表达纯化得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物；
在一种实施方式中，采用下述方法制得：
将所述第一重组载体转染哺乳动物悬浮细胞293F，转染后离心收集细胞上清，分别通过Ni-NTA镍柱和凝胶过滤层析柱纯化获得细胞上清中分泌表达的所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物。
优选地，将所述第一重组载体转染哺乳动物悬浮细胞293F，在37℃，5％CO2，120rpm的振荡培养箱中培养6-7d后，离心收集细胞上清，分别通过Ni-NTA镍柱和凝胶过滤层析柱纯化细胞上清中分泌表达的PEDV S三聚体和I53-50A的复合物。
S2、I53-50B重组载体经转染、表达、纯化得到I53-50B蛋白；
在一种实施方式中，包括以下步骤：
构建I53-50B重组载体；
优选地，包括以下步骤：在I53-50B蛋白序列的C端添加6×His标签序列，得到第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。其中，所述6×His标签序列用于蛋白纯化和鉴定；
所述第二氨基酸序列经大肠杆菌密码子优化后合成第二核苷酸序列，通过Xho I和BamH I限制性内切酶将所述第二核苷酸序列构建至原核表达载体pET-29a载体上，完成所述I53-50B重组载体的构建。
再将所述I53-50B重组载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞，通过IPTG诱导上清表达，超声破碎菌体后通过镍柱亲和层析纯化上清中的I53-50B蛋白。更佳地，将构建成功的I53-50B重组载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞，将含I53-50B重组载体的大肠杆菌BL21菌液接种至含卡那抗性的LB培养基，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)16℃，180rpm诱导上清表达，超声破碎菌体后通过镍柱亲和层析纯化上清中的I53-50B蛋白。
S3、将所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白组装得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体I53-50纳米颗粒。
在一种实施方式中，包括以下步骤：
将所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白放入组装缓冲液中，孵育过夜进行组装，筛除未组装的组分，分离获得成功组装的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体I53-50纳米颗粒。
本发明提供的所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，将优化后的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体及纳米颗粒组分I53-50A的基因序列构建至真核表达载体pRK5，转染哺乳动物悬浮细胞293F，通过分泌表达获得猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A复合物。通过大肠杆菌原核表达系统表达I53-50B重组载体，得到I53-50B蛋白。最后在体外自组装成纳米颗粒，实现在I53-50纳米颗粒表面展示PEDV S-6P三聚体抗原蛋白，以期获得免疫效果更佳的疫苗。本发明提供的PEDV S三聚体纳米颗粒可以稳定维持S蛋白融合前构象状态，有利于刺激机体产生更强的免疫反应，在PEDV纳米颗粒疫苗研制和抗体检测试剂盒开发等方面具有重要的应用价值。
同时，本发明还提供了上述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒在(1)或(2)中的应用：
(1)在猪流行性腹泻病毒纳米颗粒疫苗中的应用；
(2)在猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒中的应用。
下面以具体实施例进一步说明本发明：
实施例1
本实施例提供了一种重组载体，包括真核表达载体pRK5和连接于所述真核表达载体pRK5上的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列由如SEQ ID No.1所示的第一氨基酸序列通过哺乳动物细胞密码子优化后得到。
所述重组载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)确定PEDV流行毒株S蛋白序列；
(2)对所述PEDV流行毒株S蛋白序列进行突变，包括以下步骤：将所述PEDV流行毒株S蛋白序列的S1和S2结构域连接处的S1/S2切割位点由913DYKRCSNGRS922突变成913GGGGSGGGGS922；
将所述PEDV流行毒株S蛋白序列的第893，894，969，1032，1076，1077位氨基酸突变成脯氨酸；
将所述PEDV流行毒株S蛋白序列的S蛋白自身信号肽更换成IL-2分泌信号肽。
(3)在(2)中所述S蛋白优化序列基础上上添加I53-50A序列，得到第一氨基酸序列，包括以下步骤：
在(2)中所述S蛋白优化序列的C端添加T4 fibritin序列，然后在所述T4fibritin序列之后添加I53-50A序列；
在所述I53-50A序列之后添加TEV序列，在所述TEV序列之后添加10×His标签序列，得到如SEQ ID No.1所示的第一氨基酸序列。
(4)将所述第一氨基酸序列进行哺乳动物细胞密码子优化合成第一核苷酸序列，通过EcoRI和HindIII限制性内切酶将第一核苷酸序列连接克隆到真核表达载体pRK5上，得到PEDV S三聚体和I53-50A融合表达质粒，即第一重组载体，图1为所述第一重组载体的构建示意图。
实施例2
本实施例提供了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将所述第一重组载体经转染、表达、纯化得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物；
将构建的所述第一重组载体转染哺乳动物悬浮细胞293F，转染方法如下：每1×106个细胞转染2μg质粒，每1μg质粒使用2μL PEI(Polysciences)转染试剂进行转染。按照每1μg质粒用50μL无血清培养基opti-MEM稀释的比例，根据质粒转染量，用等体积的opti-MEM分别稀释转染试剂PEI和质粒，然后将PEI与质粒稀释液混匀并室温孵育10min，最后将PEI-质粒复合物均匀滴加至293F细胞培养液中。在37℃，5％ CO2，120rpm的振荡培养箱中培养6-7d后，使用1000×g的转速离心收集细胞上清。
然后，通过Ni-NTA镍柱对细胞上清中的PEDV S三聚体和I53-50A复合物进行纯化。取5mL混匀后的Ni-NTA原液，添加至纯化柱。将收集的细胞上清逐渐通过重力流经纯化柱，随后分别使用20mL含10mM、20mM、60mM、80mM、120mM、150mM咪唑的1×PBS进行洗杂，最后再用5mL含500mM咪唑的1×PBS洗脱镍柱上的目的蛋白。
最后，将洗脱后的PEDV S三聚体和I53-50A复合物用50kD的超滤浓缩管(millipore)在4℃以4000×g转速离心浓缩至300μL，随后将浓缩后的蛋白用Superdex200Increase 10/300GL凝胶过滤层析柱(cytiva)进行进一步纯化，收集近600kD的洗脱峰，结果见图2。
通过SDS-PAGE凝胶电泳确认纯化后蛋白的大小，取5μL蛋白样加入20μL5×蛋白Loading，95℃ 5min制备样品，经SDS-PAGE凝胶电泳后，用考马斯亮蓝染色液染色30min，用含40％乙醇和10％乙酸的脱色液进行脱色。纯化后的蛋白大小约200kD，结果见图3。
S2、I53-50B重组载体经转染、表达得到I53-50B蛋白，包括以下步骤；
构建I53-50B重组载体包括：在I53-50B蛋白序列C端添加6×His标签序列(HHHHHH)用于蛋白纯化和鉴定，得到第二氨基酸序列，其氨基酸序列见SEQ ID No.2。经大肠杆菌密码子优化后合成第二核苷酸序列，通过Xho I和BamH I限制性内切酶将所述第二核苷酸序列构建至原核表达载体pET-29a载体上，完成pET-29a-I53-50B原核表达载体的构建，即I53-50B重组载体的构建。
所述I53-50B重组载体进行表达、纯化，包括：将构建的I53-50B重组载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞，将含I53-50B重组载体的大肠杆菌BL21菌液，接种至含卡那抗性的LB培养基，37℃、220rpm振荡培养至菌液OD600值为0.4-0.6，加入终浓度为1mM的IPTG后，16℃、180rpm振荡培养诱导过夜。8000rpm离心5min收集菌体，超声破碎后离心收取上清中的目的蛋白。采用镍柱亲和层析纯化得到高纯度的目的蛋白，最后通过含200mM咪唑的1×PBS洗脱镍柱上的I53-50B蛋白，并用10kD超滤浓缩管(millipore)进行浓缩，SDS-PAGE检测结果见图4，Western Blot检测结果见图5，纯化后的蛋白约17kD。
S3、所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白组装得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体I53-50纳米颗粒，包括以下步骤：
按摩尔浓度比1:1分别将纯化的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A复合物与I53-50B蛋白加入1×PBS组装缓冲液中，4℃孵育过夜进行组装，通过分子筛Superdex200Increase 10/300GL凝胶过滤层析柱去除未组装的组分，分离获得成功组装的PEDV S三聚体I53-50纳米颗粒。
最后，对得到的PEDV S三聚体I53-50纳米颗粒的形态进行鉴定。通过负染电镜鉴定PEDV S三聚体I53-50纳米颗粒形态：取3μL PEDV S三聚体I53-50纳米颗粒，滴加到预加负电荷的200目铜网，室温静置1min，随后用ddH2O洗去多余的蛋白，并用无尘纸吸去ddH2O。用5μL 2％的乙酸双氧铀溶液室温孵育染色1min，洗去多余的染色液后自然干燥，并用透射电镜在120kV下进行观察拍照，可观察到大小均匀的PEDV S三聚体I53-50纳米颗粒，表面有刺突状凸起，表明PEDV S三聚体抗原成功展示在颗粒表面，结果见图6。
综上，本发明提供的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，实现了在I53-50纳米颗粒表面展示PEDV S-6P三聚体抗原蛋白，能够获得免疫效果更佳的疫苗。而且，本发明提供的PEDV S三聚体纳米颗粒可以稳定维持S蛋白融合前构象状态，有利于刺激机体产生更强的免疫反应，在PEDV纳米颗粒疫苗研制和抗体检测试剂盒开发等方面具有重要的应用价值。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，由猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白组装得到；
所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物由第一重组载体经转染、表达、纯化而得；
所述第一重组载体包括第一载体和连接于所述第一载体上的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列由如SEQ ID No.1所示的第一氨基酸序列通过哺乳动物细胞密码子优化后得到。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，所述第一载体为真核表达载体pRK5。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，所述I53-50B蛋白由I53-50B重组载体经转染、表达、纯化而得；
所述I53-50B重组载体包括第二载体和连接于所述第二载体上的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列由如SEQ ID No.2所示的第二氨基酸序列通过大肠杆菌密码子优化后得到。
4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，所述第二载体为原核表达载体pET-29a。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述第一重组载体经转染、表达、纯化得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物；
I53-50B重组载体经转染、表达、纯化得到I53-50B蛋白；
将所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白组装得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体I53-50纳米颗粒；
所述第一重组载体包括第一载体和连接于所述第一载体上的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列由如SEQ ID No.1所示的第一氨基酸序列通过哺乳动物细胞密码子优化后得到。
6.如权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物采用下述方法制得：
将所述第一重组载体转染哺乳动物悬浮细胞293F，转染后离心收集细胞上清，分别通过Ni-NTA镍柱和凝胶过滤层析柱纯化获得细胞上清中分泌表达的所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物。
7.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述I53-50B重组载体经转染、表达、纯化得到I53-50B蛋白，包括以下步骤：
构建I53-50B重组载体；
将所述I53-50B重组载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞，通过IPTG诱导上清表达，超声破碎菌体后通过镍柱亲和层析纯化上清中的I53-50B蛋白。
8.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白组装得到猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体I53-50纳米颗粒，包括以下步骤：
将所述猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体和I53-50A的复合物与I53-50B蛋白放入组装缓冲液中，孵育过夜进行组装，筛除未组装的组分，分离获得成功组装的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体I53-50纳米颗粒。
9.如权利要求1-4任一项所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白三聚体纳米颗粒在(1)或(2)中的应用：
(1)在猪流行性腹泻病毒纳米颗粒疫苗中的应用；
(2)在猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310135368.8A CN116333168A (zh) | 2023-02-17 | 2023-02-17 | 猪流行性腹泻病毒s蛋白三聚体纳米颗粒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310135368.8A CN116333168A (zh) | 2023-02-17 | 2023-02-17 | 猪流行性腹泻病毒s蛋白三聚体纳米颗粒及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116333168A true CN116333168A (zh) | 2023-06-27 |
Family
ID=86875484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310135368.8A Pending CN116333168A (zh) | 2023-02-17 | 2023-02-17 | 猪流行性腹泻病毒s蛋白三聚体纳米颗粒及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116333168A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118147173A (zh) * | 2024-05-11 | 2024-06-07 | 华南农业大学 | 一种基于猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的mRNA、用途和疫苗 |
-
2023
- 2023-02-17 CN CN202310135368.8A patent/CN116333168A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118147173A (zh) * | 2024-05-11 | 2024-06-07 | 华南农业大学 | 一种基于猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的mRNA、用途和疫苗 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2624470B2 (ja) | ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造 | |
| US6072039A (en) | Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest | |
| Berdichevsky et al. | Matrix-assisted refolding of single-chain Fv–cellulose binding domain fusion proteins | |
| JP2528232B2 (ja) | 組換え蛋白質を活性化する方法 | |
| CN111117977B (zh) | 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用 | |
| CN112209995B (zh) | 一种SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区制备方法 | |
| JP2016026169A (ja) | 原核生物における発現構築物 | |
| CN116333168A (zh) | 猪流行性腹泻病毒s蛋白三聚体纳米颗粒及其制备方法 | |
| WO2002004007A9 (en) | Stable (fixed) forms of viral capsid proteins, fusion proteins and uses thereof | |
| CN103184229A (zh) | 重组蛋白a/g基因及其表达产物的制备、应用 | |
| JPH10508207A (ja) | 表面アンカーリングベクターおよびその異質蛋白質のための方法 | |
| CN101760466B (zh) | 重组蛋白a基因及其表达产物的制备 | |
| CN112831523A (zh) | 一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途 | |
| JPH04158797A (ja) | 融合型での異種蛋白質類を大腸菌中での発現により製造する方法、該蛋白質の用途、発現ベクターおよび組換体株 | |
| CN116334139A (zh) | 基于猪圆环病毒2型病毒样颗粒的通用型模块化纳米抗原展示载体及其应用 | |
| CN115960252A (zh) | 新型冠状病毒免疫原性物质、其制备方法和应用 | |
| CN116284453A (zh) | 猪流行性腹泻病毒s蛋白突变体及其制备方法、应用 | |
| CN106046177B (zh) | P-5m-Fc融合蛋白及其表达基因、制备方法和应用 | |
| CN113087807B (zh) | 用于检测糖类抗原的基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针、制备方法 | |
| CN114292314B (zh) | 一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用 | |
| CN111423505B (zh) | 一种核糖体p蛋白改构蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN114292339B (zh) | 鞭毛素突变体与非洲猪瘟抗原的融合蛋白及其应用 | |
| CN112390862B (zh) | 用于检测蓝舌病的蛋白质及其编码基因和可溶制备方法 | |
| JP2844870B2 (ja) | 組み替えｄｎａ法によるポリペプチドの製造法 | |
| CN111732667B (zh) | 小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |