CN118147173A - 一种基于猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的mRNA、用途和疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种基于猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的mRNA，包括依次连接的5’UTR、S蛋白编码序列、3’UTR、poly A；所述S蛋白编码序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.1所示。疫苗有效性试验表明，本发明的PEDV‑S mRNA疫苗具有良好的免疫原性。本发明通过实施SPF级Balb/c小鼠动物试验评价了PEDV‑S mRNA疫苗的免疫效力，结果表明，最低以2μg mRNA疫苗剂量免疫两次（间隔三周），可诱导小鼠体内产生高水平的PEDV S蛋白特异性IgG抗体，且血清抗体对异源的G2a型PEDV毒株具有高水平的中和滴度。同时，本发明还提供了该mRNA的用途、疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的mRNA、用途和疫苗。
背景技术
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是一种急性、高度传染性猪肠道冠状病毒性疾病，不同年龄和性别的猪均可发病，新生仔猪发病后病情最为严重，主要症状为严重呕吐、腹泻、精神抑郁和食欲减退，最终因严重脱水和消瘦而死亡，发病仔猪的死亡率高达80%~100%。自从2010年以来，PEDV G2类群变异毒株广泛流行，其致病性和传播性均高于原有毒株，使猪流行性腹泻的防控难度进一步增加。
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是PED的病原，属于冠状病毒科、α冠状病毒属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组编码多种结构蛋白和非结构蛋白。PEDV病毒颗粒中的结构蛋白包括刺突蛋白（Spike protein，S）、膜糖蛋白（Membrane glycoprotein，M）、包膜蛋白（Envelope protein，E）和核衣壳蛋白（Nucledocapsid protein，N）。S蛋白作为PEDV主要的表面蛋白，负责与宿主细胞受体的结合并介导病毒的进入，能够诱导宿主细胞产生特异性中和抗体，是疫苗开发的重要靶点。
目前尚没有治疗PEDV感染发病猪群的特效药物，接种PED疫苗是防控PED传播流行的重要手段。目前养殖场中广泛使用PED灭活疫苗和减毒活疫苗接种免疫，两种疫苗对于防控PED发挥了重要作用。但是，PEDV灭活疫苗的免疫原性较低，通常需要多次接种以加强免疫效果；而减毒活疫苗存在毒力返强和产生新型重组毒株的风险。此外，PEDV毒株在流行过程中不断重组变异，可能导致传统疫苗毒株与流行毒株的关键抗原不相匹配，进而导致疫苗免疫保护效力下降。据研究，我国具有多个亚群的PEDV共存，推测毒株变异可能是导致传统疫苗免疫效果不佳的重要原因之一；而传统的灭活疫苗和减毒活疫苗的研发和生产周期相对较长，难以满足快速应对新型毒株的要求。总体而言，目前常用的PED传统疫苗免疫防控效果不够理想，PED依然是对生猪养殖业危害最大的动物疫病之一，研发新型高效的PED疫苗，更好地支持PED的防控，具有重要意义。
与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有突出的优势：一是免疫效果良好，能够同时诱导体液免疫和细胞免疫；二是十分安全，其生产过程不涉及活病毒，其体内过程无逆转录和毒株返强风险；三是研发和生产迅速，mRNA疫苗具有高度的可编程性，可以在短时间内快速修改疫苗序列以应对新型病原，在应对新发突发疫情方面具有突出优势。
现有技术：CN113274491A公开了一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗及其构建方法，该方案采用含有5’UTR、猪流行性腹泻病毒的S蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列合成RNA疫苗。该案采用的原始S蛋白的编码序列制备mRNA；在本案的研究过程中，发现对于编码PEDV S蛋白的mRNA疫苗，如果不对S蛋白编码序列进行脯氨酸突变和密码子优化，其表达量、稳定性等均不够理想。
本案所要解决的技术问题是：如何针对S蛋白氨基酸序列和编码蛋白的mRNA疫苗的核苷酸序列进行设计和优化，得到性能更为优异的PEDV mRNA疫苗。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的mRNA，本发明选取PEDV的S蛋白作为抗原，设计构建了PEDV-S基因mRNA疫苗。本发明以GenBank数据库中G2b型PEDV CH/GDYJ/03/2021毒株的S基因序列（GenBank:MZ161075.1）为基础，对S蛋白引入了两个脯氨酸突变（I1076P、L1077P），对S蛋白基因编码序列进行了密码子优化，并在序列前端添加了T7启动子、5’端非翻译区（5’UTR）和Kozak序列，后端添加了3’端非翻译区（3’UTR）和多聚腺苷酸尾（Poly A）序列，构成了mRNA疫苗模板DNA序列。将该序列连接在质粒载体上构成了重组质粒pUC57-PEDV-S。将该重组质粒进行酶切线性化后，以共转录方式转录获得mRNA，并用LNP（Lipid nanoparticle）包装技术包装，制成了猪流行性腹泻mRNA疫苗。
疫苗有效性试验表明，本发明的PEDV-S mRNA疫苗具有良好的免疫原性。本发明通过实施SPF级Balb/c小鼠动物试验评价了PEDV-S mRNA疫苗的免疫效力，结果表明，最低以2μg mRNA疫苗剂量免疫两次（间隔三周），可诱导小鼠体内产生高水平的PEDV S蛋白特异性IgG抗体，且血清抗体对异源的G2a型PEDV毒株具有高水平的中和滴度。
同时，本发明还提供了该mRNA的用途、疫苗。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的mRNA，包括依次连接的5’UTR、S蛋白编码序列、3’UTR、poly A；
所述S蛋白编码序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.1所示；
或，
所述S蛋白编码序列与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.1的同源性达到90-100%。
在上述的mRNA中，所述mRNA的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
采用如上所述的mRNA制备用于预防和治疗猪流行性腹泻病毒感染的疫苗的用途。
同时，本发明还公开了一种疫苗，含有如上所述的mRNA以及脂质体，所述mRNA包裹在脂质体中。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）mRNA疫苗设计方面
本研究以PEDV的S蛋白作为靶抗原，选用的S蛋白源自中国近年流行的G2b亚群的PEDV毒株，与当前流行毒株的匹配性较高；结合结构生物学研究，将第1076位的异亮氨酸和第1077位的亮氨酸均突变为脯氨酸，使S蛋白能够稳定在融合前构象并进一步提升了蛋白表达量。通过搭配使用特定的5’ UTR、3’ UTR和Poly A序列，并对S蛋白进行密码子优化设计，所构建的mRNA疫苗序列能够支持mRNA疫苗在细胞中实现高效表达，并实现良好的动物免疫效果。
（2）mRNA疫苗生产方面
本发明采用较为便捷的共转录方法，基于线性化的模板质粒转录生产mRNA，使用成熟的LNP包装工艺制备mRNA-LNP疫苗，保障了mRNA疫苗的质量和递送效率。该疫苗的生产过程中不涉及活病毒繁殖，具有良好的安全性；相较于传统疫苗，本发明的mRNA疫苗能够有效缩短疫苗的研发和生产周期，为防控各种PEDV毒株所导致的暴发流行提供了有效的技术手段。
（3）mRNA疫苗效果方面
本发明的mRNA疫苗能有效诱导体液免疫和细胞免疫。小鼠免疫试验表明，接种该mRNA疫苗的小鼠产生了针对PEDV-S蛋白的高水平IgG抗体，该抗体针对异源的PEDV G2a亚群毒株具有高滴度的中和活性，表明该疫苗具有一定的交叉免疫保护能力；该mRNA疫苗还能同时有效提高小鼠IFN-γ和IL-4细胞因子的表达量。安全性试验表明，该mRNA疫苗在合理的接种剂量下对小鼠具有安全性。
附图说明
图1A为实施例1中重组质粒pUC57-PEDV-S-A的质粒图谱；
图1B为实施例1中重组质粒pUC57-PEDV-S-B的质粒图谱；
图2为实施例2中重组质粒线性化酶切产物的电泳鉴定图；
图3A为实施例2中转录加帽后mRNA的电泳鉴定图；
图3B为实施例2中表达的S抗原蛋白的Western Blot检测结果；
图4为实施例3中LNP-mRNA粒径分析结果；
图5为实施例4中表达的S抗原蛋白的Western Blot检测结果；
图6A为实施例5中SPF小鼠免疫后21天特异性IgG抗体水平结果；
图6B为实施例5中SPF小鼠免疫后35天特异性IgG抗体水平结果；
图6C为实施例5中SPF小鼠免疫后21天和35天的特异性IgG抗体水平对比结果；
图7为实施例5中SPF小鼠免疫后中和抗体水平结果；
图8A实施例5中SPF小鼠免疫后细胞因子（γ干扰素）水平结果；
图8B实施例5中SPF小鼠免疫后细胞因子（白细胞介素4）水平结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1 mRNA疫苗模板质粒的构建
猪流行性腹泻mRNA疫苗模板序列包含以下元件：T7启动子、5’端非翻译区（5’UTR）、S抗原蛋白编码基因、3’端非翻译区（3’UTR）和多聚腺苷酸（Poly A），Poly A尾结构下游连接有质粒线性化的酶切位点（BsaI）。将以上序列通过两端的EcoRI和HindⅢ酶切连接位点连接至pUC57克隆载体。
mRNA疫苗中的S蛋白编码序列以G2b型PEDV流行毒株的S基因序列（GenBank:MZ161075.1）为基础，对S蛋白引入两个脯氨酸突变（I1076P和L1077P），并在3’端加入6×His标签。对S蛋白基因编码序列进行密码子优化和进一步设计，替换掉序列中出现猪的稀有密码子；在规避EcoRI、HindIII、BsaI等特定酶切位点和不利基序的前提下，修改序列以适当提升第三位碱基是G或C的密码子的含量（GC3%），同时兼顾全序列GC分布的均衡性。本发明设计出PEDV-S-A、PEDV-S-B两条S蛋白编码序列，作为PEDV mRNA疫苗中的S抗原蛋白编码序列。
mRNA疫苗的DNA模板序列和重组质粒pUC57-PEDV-S-A（质粒图谱如图1A所示）和pUC57-PEDV-S-B（质粒图谱如图1B所示）委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成和构建。对该质粒的转化子菌株进行扩增培养，使用无内毒素质粒提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司，Cat.#DP103-03）提取质粒，使用NanoPhotometer®N50 超微量紫外可见光分光光度计测量质粒浓度和纯度，合格后-20℃保存备用。
PEDV-S-A mRNA疫苗的模板序列如SEQ ID NO.2所示；
PEDV-S-A mRNA疫苗转录后对应的mRNA序列如SEQ ID NO.3所示；
PEDV-S-B mRNA疫苗的模板序列如SEQ ID NO.4所示；
PEDV-S-B mRNA疫苗转录后对应的mRNA序列如SEQ ID NO.5所示；
PEDV-S-A和PEDV-S-B模板序列所包含的T7启动子序列为：
TAATACGACTCACTATAAG。
PEDV-S-A和PEDV-S-B模板序列所包含的5’UTR序列为：
AGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCGCTAGCCTCGAGGCCACC。
PEDV-S-A和PEDV-S-B模板序列所包含的3’UTR序列为：
CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACC。
poly A序列为50-150A，优选为100A，PEDV-S-A和PEDV-S-B模板序列所包含的polyA序列为：
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
优化后的PEDV S蛋白mRNA编码序列PEDV-S-A如SEQ ID NO.6所示；
优化后的PEDV S蛋白mRNA编码序列PEDV-S-B如SEQ ID NO.1所示；
优化后的PEDV-S-A和PEDV-S-B的S蛋白对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例2 mRNA的体外转录
1.质粒pUC57-PEDV-S的酶切线性化
将实施例1中所获得的质粒用FastDigestBsaI（IIs型，Thermo Scientific，FD0294）限制性核酸内切酶进行酶切，反应体系如表1：
表1 线性化酶切反应体系
| 组分 | 用量 |
| 目的基因质粒 | 5 μg |
| 10×Digestion Buffer Ⅱ | 5 µL |
| FastDigestBsaI酶 | 5 µL |
| RNAase-free ddH2O | 补充至50 µL |
| 总体积 | 50 µL |
将酶切体系混匀后瞬时离心，37℃反应30 min，再65℃反应5 min以灭活内切酶。用1%核酸凝胶以150 V电泳20 min鉴定质粒酶切效果。
结果如图2所示，目的条带约7000 bp，与预期大小一致。
使用胶回收试剂盒（E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit，购自OMEGA BIO-TEK）回收经酶切线性化的质粒，使用NanoPhotometer®N50 超微量紫外可见光分光光度计测量质粒浓度和纯度，合格后-20℃保存备用。
2.mRNA的转录
使用mRNA转录试剂盒（诺唯赞，T7 High Yield RNA Transcription Kit（N¹-Me-Pseudo UTP）），以线性化质粒为模板，按照产品说明书转录mRNA，体外转录反应体系如表2。
将除T7 RNA Polymerase Mix外的组分和GAG帽类似物Cap101（购自沧州威克欣生化科技有限公司，Lot: 230222A）振荡混匀，短暂离心收集于管底后，加入T7 RNAPolymerase Mix，用移液器轻轻混匀各组分，再次短暂离心后37℃孵育4 h。反应结束后在反应体系中加入2 μL DNase I，37℃孵育30 min以消化体系中的DNA模板。
表2 体外转录反应体系
| 组分 | 用量 |
| 10×Transcription Buffer | 2 µL |
| N1-Me-Pseudo UTP Solution(100mM) | 2 µL |
| ATP Solution(100mM) | 2 µL |
| CTP Solution(100mM) | 2 µL |
| GTP Solution(100mM) | 2 µL |
| Cap-101(100mM) | 2 µL |
| Inorganic Pyrophosphatase(1U/µL) | 0.4 µL |
| T7 RNA Polymerase Mix | 2 µL |
| 线性化模板 | 1 μg |
| RNAase-free ddH2O | 补充至20 µL |
| 总体积 | 20 µL |
3.mRNA的纯化与鉴定
使用氯化锂纯化法纯化mRNA产物，具体步骤如下：取30 μL DEPC水加入上述转录体系中，然后加入22.7 μL 8M LiCl（DNase/RNase free）将LiCl调节至工作浓度2.5 M，并将体系置于-20℃孵育30 min。之后将体系内液体转移至1.5 mL EP管，15,000×g离心10min后弃去上清，加入1 mL 70%的乙醇溶液，上下颠倒数次以洗涤RNA团块，随后15,000×g离心10 min。重复上述洗涤步骤。根据所得RNA团块的大小，加入适量体积的DEPC水，室温孵育5 min以充分溶解RNA，然后用移液器吹打数次得到mRNA溶液。最后使用NanoPhotometer®N50 超微量紫外可见光分光光度计测量mRNA浓度和纯度，合格后-80℃保存备用。
将纯化后的mRNA与2×RNA上样缓冲液1：1混匀，随后将混合液用70 ℃金属浴热变性10 min，再冰浴5 min。使用变性RNA核酸凝胶电泳（180 V，10 min）验证mRNA产物，结果如图3A所示，目的mRNA大小约为4000 bases，与预期相符。
通过体外细胞转染试验和Western blot试验，验证纯化得到的PEDV-S-A和PEDV-S-B mRNA产物是否能在细胞内有效表达PEDV S蛋白。
1. mRNA的细胞转染和制样
转染前至少12 h，取生长状况良好的HEK-293T细胞，加入胰酶分散后均匀铺在12孔板内，置于37℃ CO2培养箱中培养约12 h。在显微镜下检查细胞的增殖情况，以确保其密度在70%至90%之间。在转染前更换新鲜的DMEM培养基，并添加2%的胎牛血清以维持较好的细胞状态。
取1支1.5 mL无菌离心管，加入100 µL Opti-MEM培养基，再加入1 µg纯化的PEDV-S-A和PEDV-S-B mRNA产物并轻轻吹打混匀。在稀释的mRNA中加入2 µL mRNA Boost试剂并轻轻吹打混匀，再加入2 µL TransIT-mRNA试剂，轻弹管壁混匀，室温静置孵育2-5 min以形成复合物，即包有脂质体的PEDV-S-A和PEDV-S-B mRNA。将混合液逐滴加入12孔板的细胞中，留1孔不加作为阴性对照。轻晃孔板混匀液体，继续置于37℃ CO2培养箱中培养。
转染24 h后，弃去12孔板中的细胞上清液，用PBS缓冲液洗涤底层细胞一次，随后向孔中加入细胞裂解液（RIPA裂解液+1%蛋白酶抑制剂，北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在冰上裂解细胞1 h。随后收集裂解后的细胞，在4℃条件下以12,000 rpm离心15 min，取上清液按1/4比例加入5×SDS蛋白电泳上样缓冲液，混匀后室温放置10 min。
2. Western blot鉴定mRNA-LNP表达S蛋白
首先使用10%的SDS-PAGE胶对蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，条件为恒压80 V电泳30 min，随后恒压120V电泳60 min。电泳完成后将蛋白转膜至PVDF膜，条件为恒流250 mA转膜90 min。转膜后用5%脱脂奶粉4℃过夜封闭PVDF膜，之后用PBS缓冲液洗膜3次，每次5min。加入用PBS缓冲液稀释10000倍的鼠抗His标签单克隆抗体（购自亚科因（abbkine）生物技术有限公司），室温孵育1 h。之后用PBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。加入20000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司），室温孵育1 h。之后用PBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。最后用PBS洗涤1次，并使用SuperKineTM增强型ECL发光液（购自亚科因（abbkine）生物技术有限公司），按照说明书进行ECL发光操作。
结果如图3B所示，与对照组相比，转染了PEDV-S-A mRNA和PEDV-S-B mRNA的试验组中均出现了约180 kDa的明显的条带，与预期一致。在转染与鉴定条件相同的情况下，PEDV-S-B mRNA的条带更深，结果表明PEDV-S-B mRNA在细胞内的表达量较高，推测该mRNA序列可能在二级结构、胞内半衰期、翻译效率等方面具有优势，因此选用PEDV-S-B mRNA进行后续的mRNA-LNP疫苗包封以及动物试验。
实施例3 mRNA-LNP疫苗的制备
对于实施例2中所获得的mRNA，使用LNP包装技术进行包装，制备mRNA脂质体纳米颗粒疫苗。将各脂质组分按阳离子脂质：DSPC：胆固醇：DMG-2000=50：10：38.5：1.5的比例溶于无水乙醇，将mRNA溶于50 mM的醋酸缓冲液（pH5.0），随后将醇相和水相按1:3的比例用微流控系统进行混合包裹，获得制剂后用Tris等缓冲液稀释，并进行透析换液和超滤浓缩，将所得制剂加入蔗糖保护液后，用0.22 μm滤膜过滤除菌，得到mRNA疫苗LNP制剂，置于-80℃保存备用。
使用动态光散射法检测mRNA疫苗LNP制剂的平均粒径和多分散指数，使用电泳光散射法测量LNP制剂的Zeta电位，使用荧光染色法检测LNP制剂中mRNA的包封率。结果如图4所示，制剂的粒径均值为76.0 nm，多分散指数（PDI）为0.02；其Zeta电位为-3.7 mv，包封率约为96.8%。
实施例4 S蛋白的表达验证
通过体外细胞转染试验和Western blot试验，验证PEDV-S-B mRNA疫苗LNP制剂是否能在细胞内有效表达PEDV-S蛋白。
1.mRNA制剂的细胞转染和制样
将实施例3所得的mRNA疫苗制剂转染HEK-293T细胞以验证能否表达S蛋白。在转染前至少12 h，用胰酶消化生长状况良好的HEK-293T细胞，接种于6孔板中。待HEK-293T细胞生长至80-90%时进行转染。转染前将培养基更换为新的含2%胎牛血清的DMEM培养基。向6孔板中的HEK-293T细胞中每孔加入2.5 µg或5 µg mRNA疫苗制剂，直接进行转染。
转染24 h后，弃去6孔板中的细胞上清液，用PBS缓冲液洗涤底层细胞一次，随后向孔中加入细胞裂解液（RIPA裂解液+1%蛋白酶抑制剂，北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在冰上裂解细胞1 h。随后收集裂解后的细胞，在4℃条件下以12,000 rpm离心15 min，取上清液按1/4比例加入5×SDS蛋白电泳上样缓冲液，混匀后室温放置10 min。
2.Western blot鉴定mRNA-LNP表达S蛋白PEDV-S-A
首先使用10%的SDS-PAGE胶对蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，条件为恒压80 V电泳30 min，随后恒压120V电泳60 min。电泳完成后将蛋白转膜至PVDF膜，条件为恒流250 mA转膜90 min。转膜后用5%脱脂奶粉4℃过夜封闭PVDF膜，之后用PBS缓冲液洗膜3次，每次5min。加入用PBS缓冲液稀释10000倍的鼠抗His标签单克隆抗体（购自亚科因（abbkine）生物技术有限公司），室温孵育1 h。之后用PBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。加入20000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司），室温孵育1 h。之后用PBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。最后用PBS洗涤1次，并使用SuperKineTM增强型ECL发光液（购自亚科因（abbkine）生物技术有限公司），按照说明书进行ECL发光操作。
结果如图5所示，与对照组相比，转染2.5 μg和5 μg PEDV-S mRNA疫苗制剂后，细胞成功表达出目的蛋白，目的蛋白在180 kDa附近出现明显条带，表明本发明制备的mRNA疫苗可以在HEK-293T细胞中表达出PEDV的S蛋白。
实施例5 mRNA疫苗的有效性试验
1.试验分组与免疫
为验证PEDV-S-B mRNA疫苗的免疫效果，实施了SPF级Balb/c小鼠动物试验。将36只6周龄的Balb/c雌鼠随机分为4组。第1组的8只小鼠接种2 μg PEDV-S-B mRNA疫苗，第2组的8只小鼠接种10 μg PEDV-S-B mRNA疫苗，第3组的10只小鼠接种20 μg PEDV-S-B mRNA疫苗，第4组的10只小鼠接种PBS缓冲液作为空白对照。所有分组首次免疫3周后以相同剂量加强免疫一次。
2.特异性IgG抗体的检测
通过猪流行性腹泻病毒间接ELISA IgG抗体检测试剂盒（深圳真瑞生物科技有限公司）对经免疫后小鼠血清中的IgG抗体进行检测。在初次免疫后第21天和第35天，经小鼠眼眶后静脉丛采血并制备血清。参考抗体检测试剂盒说明书，对血清稀释至合适浓度并加入对应ELISA板中，依次加入酶联标记物和显色液，显色终止后使用酶标仪读取450 nm处的吸光度，同时记录630 nm处的吸光度作为参比波长。检测结果如图6A、图6B、图6C所示，结果表明PEDV-S-B mRNA疫苗免疫小鼠后，诱导小鼠产生了高水平体液免疫反应，免疫20 μgPEDV-S-B mRNA疫苗的小鼠血清S蛋白特异性IgG抗体的OD450nm最高，且特异性IgG抗体水平呈现剂量依赖性升高。加强免疫后IgG抗体水平进一步提高，各免疫剂量组与PBS组相比，IgG抗体的OD450nm差异均极显著（p＜0.001）。
3.特异性中和抗体的检测
通过中和试验，分析小鼠初次免疫mRNA疫苗后第35天的血清中和抗体效价。培养实验室保存G2a型PEDV毒株并制备病毒液，将病毒液与等体积的不同稀释度的小鼠血清在37℃中和作用1 h后，加入至Vero细胞中，逐日观察Vero细胞病变情况直至稳定，观察4 ~ 5天并统计数据。在对照试验有效的前提下，如病毒与血清混合液接种Vero细胞未出现细胞病变，则表示该稀释度的血清具有中和病毒能力。使用Reed-Muench方法计算各组小鼠待测抗体的中和效价，结果如图7所示，免疫20 μg PEDV-S-B mRNA疫苗的小鼠针对G2a型PEDV的中和效价最高，达到1：322（8.33log2），最低2 μg免疫两次的异源中和抗体水平为1:58（5.86log2）；表明PEDV-S mRNA疫苗可诱导高水平的体液免疫。
4.淋巴细胞因子的检测
通过qPCR方法，分析小鼠初次免疫mRNA疫苗后第35天的细胞免疫反应。随机处死免疫10 μg PEDV-S-B mRNA剂量疫苗组和PBS缓冲液对照组的小鼠各3只，使用小鼠脾脏淋巴细胞分离液试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）分离小鼠脾淋巴细胞，调整脾脏淋巴细胞密度至2×106/mL，然后将细胞接种至6孔板。在37℃、5% CO2条件下培养细胞2 h后，加入本实验室自制的PEDV GD-C灭活病毒液以刺激小鼠脾淋巴细胞，在37℃、5% CO2条件下继续培养6 h后收集细胞。使用RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒（购自上海飞捷生物技术有限公司）提取小鼠脾脏淋巴细胞总RNA，并将RNA样品使用Hiscript III RT SuperMix forqPCR（+gDNA wiper）（购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司）反转录成cDNA，使用ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix（购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司）通过荧光定量PCR（qPCR）试验检测小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4的基因表达水平，以细胞中GAPDH基因为内参，每组设3个重复，以2-△△Ct的方法对qPCR结果进行计算分析。
结果如图8A和图8B所示，10 μg PEDV-S-B mRNA疫苗组小鼠脾脏淋巴细胞的IFN-γ mRNA表达量的是PBS组的1.57倍；10 μg PEDV-S-B mRNA疫苗组IL-4 mRNA表达量的是PBS组的1.40倍，表明免疫mRNA疫苗有效激活了小鼠的细胞免疫反应。
上述各项试验结果表明，本发明提供的表达PEDV-S蛋白的mRNA疫苗免疫小鼠后，可以有效诱导体液免疫和细胞免疫反应，诱导产生的高水平中和抗体对异源G2a PEDV毒株具有高水平的中和滴度。
实施例6 mRNA疫苗的安全性试验
为评价PEDV-S-B mRNA疫苗的安全性，实施了SPF级Balb/c小鼠动物试验。将36只6周龄Balb/c雌鼠随机分为4组，向小鼠后肢肌肉注射接种mRNA疫苗。第1组的8只小鼠接种2μg PEDV-S-B mRNA疫苗（低剂量组），第2组的8只小鼠接种10 μg PEDV-S-B mRNA疫苗（中剂量组），第3组的10只小鼠接种20 μg PEDV-S-B mRNA疫苗（高剂量组），第4组的10只小鼠接种PBS缓冲液作为空白对照。所有分组首次免疫3周后以相同剂量进行加强免疫。免疫后24h检查小鼠注射部位变化，每日观察小鼠的精神状态、活动情况和食欲等行为表现。
初次免疫24 h后，观察小鼠腿部注射部位无异样，与PBS组相同。初次免疫后以20μg高剂量组小鼠竖毛较明显，且小鼠竖毛程度与mRNA疫苗剂量呈正相关，但竖毛情况在免疫48 h后消失，小鼠恢复正常。加强免疫后，各组小鼠竖毛情况与初免时类似。
PEDV-S-B mRNA疫苗的安全性试验表明，高剂量的PEDV-S-B mRNA-LNP疫苗在一定程度上影响了小鼠的生长，但在合理的剂量范围内，小鼠不良影响微小且能快速恢复。
结果分析：
1.通过对PEDV-S-A、PEDV-S-B两条S蛋白的密码子优化措施来看，在密码子优化策略一致、优化具体结果不同的情况下，两条mRNA转录序列在转染细胞后的蛋白表达水平方面存在差异；说明制备合适的PEDV-S mRNA具有一定的随机性，需要反复试验才能得到在胞内半衰期、翻译效率等方面具有优势的mRNA。
2.如不考虑ELISA试验材料方法差异，仅从ELISA抗体水平数据来看，CN113274491A的图3展示了其IgG抗体的OD450nm水平为0.8左右，其表2记载的中和抗体为1：320-1：480（其图4中和抗体约为1：104-1：181）；根据本发明试验数据，在血清稀释20000倍（常规为稀释500倍即可）时，抗体OD450nm达到2-2.5，才能支撑中和抗体数据达到1：64-1：512。
所以从抗体水平来说，本发明的抗体水平明显优于现有技术。
3.本案采用的是异源攻毒（攻毒为PEDV G2a，疫苗源为PEDV G2b），其抗体水平达到非常优异的水平，可以预期，如果本案采用同源攻毒，其抗体水平会更高。
4.疫苗有效性试验表明，本发明的PEDV-S mRNA疫苗具有良好的免疫原性。本发明通过实施SPF级Balb/c小鼠动物试验评价了PEDV-S mRNA疫苗的免疫效力，结果表明，最低以2 μg mRNA疫苗剂量免疫两次（间隔三周），可诱导小鼠体内产生高水平的PEDV S蛋白特异性IgG抗体，且血清抗体对异源的G2a型PEDV毒株具有高水平的中和滴度。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，既不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (4)
1.一种基于猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的mRNA，其特征在于，包括依次连接的5’UTR、S蛋白编码序列、3’UTR、poly A；
所述S蛋白编码序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的mRNA，其特征在于，所述mRNA的序列如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.5所示。
3.采用如权利要求1所述的mRNA制备用于预防和治疗猪流行性腹泻病毒感染的疫苗的用途。
4.一种疫苗，其特征在于，含有如权利要求1所述的mRNA以及脂质体，所述mRNA包裹在脂质体中。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118147173A true CN118147173A (zh) | 2024-06-07 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |