CN117257929A - 狂犬病毒mRNA疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及狂犬病毒疫苗，具体涉及狂犬病毒mRNA疫苗及其应用；一种狂犬病毒mRNA疫苗，其特征在于：所述的疫苗包括：(1)用于表达狂犬病毒优化的免疫原mRNA，所述的免疫原为狂犬病毒G蛋白；(2)疫苗载体，所述的疫苗载体为脂质纳米颗粒。本发明中设计了多条经优化的表达狂犬G蛋白的mRNA疫苗，同等免疫条件下，本发明各mRNA疫苗可在小鼠体内快速诱导高水平的针对狂犬病毒G蛋白的免疫反应，抗体水平显著高于已上市的灭活苗和未经序列优化的mRNA疫苗，且本发明更加快速诱导高水平抗体反应，且低剂量也可以实现上述效果，且无明显毒性。

Description

狂犬病毒mRNA疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及狂犬病毒疫苗，具体涉及狂犬病毒mRNA疫苗及其应用
背景技术
狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus,简称RABV)引起的一种高度致命的人畜共患传染病，已在全球150多个国家和地区被发现。RABV具有嗜神经性，当人类被受染动物抓伤或咬伤后，病毒会逐步入侵神经系统，引发脑炎、脊髓炎等严重的神经系统炎症，死亡率近100％。狂犬病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。病毒颗粒头部为半球形，末端常为平端，形态呈子弹状。其基因组编码5种病毒蛋白质：RNA依赖性RNA聚合酶(L)、核蛋白(N)、磷酸化蛋白质(P)、位于病毒蛋白包膜内侧的基质蛋白(M)及外表面糖蛋白(G)。其中G蛋白是狂犬病毒最主要的抗原，可有效刺激特异性辅助性T细胞(Helper Tcell,简称Th)和细胞毒性T细胞(Cytotoxic lymphocyte,简称CTL)增生，并诱导机体产生特异性抗体。丽沙狂犬病毒(Rabies lyssavirus)的G蛋白是由505个氨基酸组成的一种I型糖蛋白，其全长氨基酸序列见SEQ ID NO:1(ACR39382.1，NCBI数据库)。针对G蛋白的单克隆抗体和疫苗能够为宿主提供有效保护，被广泛应用于疫苗的研发中。选择恰当的免疫原和表达系统是疫苗研发中的两个重要技术难点。
目前尚无特异性药物治疗狂犬病，只能借助于疫苗进行预防和控制。然而目前上市的狂犬疫苗仍存在不足。除已上市的灭活疫苗外，现有的狂犬疫苗研发平台还包括减毒活疫苗、亚单位蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒的载体类疫苗以及病毒样颗粒疫苗，但这些疫苗存在着致敏性、病毒污染、需要多次接种、生产周期较长以及费用高等缺点，因此需要更加经济、安全、高效的狂犬疫苗来替代当前使用的疫苗。
发明内容
发明目的
本发明为克服现有技术的不足，提供一种狂犬病毒mRNA疫苗及其制备方法，不但具有安全性高、免疫原性强以及易于生产等特点，而且具有技术先进性。
技术方案
为实现上述目的，本发明一方面公开了一种狂犬病毒mRNA疫苗，其特征在于：所述的疫苗包括：(1)用于表达狂犬病毒优化的免疫原mRNA，所述的免疫原为G蛋白；(2)疫苗载体，所述的疫苗载体为可被mRNA利用的脂质纳米颗粒(LipidNanoparticle,LNP)。
在一些实施方案中，所述的G蛋白为蛋白全部，或为G蛋白膜外部分，或为G蛋白多聚体；
在一些实施方案中，所述的G蛋白全长、胞外域部分或多聚体包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的狂犬病毒选自以下组：PV株、Flury株、SAD株、aG株、CTN株及它们的衍生株或其多种组合。
在一些实施方案中，所述的狂犬病毒为CTN-1株。
在一些实施方案中，所述的优化的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。
优选的，所述mRNA序列与SEQ ID NO：3-8所示的序列有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的mRNA序列；所述突变选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为同义氨基酸的密码子替换。
在一些实施方案中，所述的mRNA序列具有以下结构：A1-A2-A3-A4-A5-A6：A1为5’帽子结构，优选为Cap1结构；A2为5’UTR元件；A3为信号肽编码序列，优选为人免疫球蛋白κ轻链可变区信号肽编码序列；A4为狂犬病毒抗原编码序列，其中狂犬病毒抗原选择G蛋白、G蛋白膜外部分、或G蛋白全部；A5为3’UTR元件；A6为poly(A)尾巴结构，优选为100个A。
在一些实施方案中，所述的优化的核苷酸序列如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22。
优选的，所述mRNA序列与SEQ ID NO：9-22所示的序列有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的mRNA序列；所述突变选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为同义氨基酸的密码子替换。
在一些实施方案中，所述的脂质纳米颗粒包括聚乙二醇脂质、中性脂质、阳离子脂质和胆固醇或者胆固醇类似物。
在一些实施方案中，所述的阳离子脂质包括但不限于Dlin-MC3-DMA、DODMA、DODAP、ALC-0315或SM102。
在一些实施方案中，所述的脂质纳米颗粒平均粒径在10-500nm范围内。优选的，脂质纳米颗粒平均粒径范围为100-150nm。
在一些实施方案中，所述的脂质与优化的mRNA质量比为10-30:1。优选的，脂质与优化的mRNA质量比为20:1。
本发明的第二方面提供多种分离的核酸片段，其编码上述任一项G蛋白，或编码上述任一项蛋白。
本发明的第三方面提供多种载体(vector)，其包含上述核酸片段，优选地，为mRNA可利用的脂质纳米颗粒。
本发明的第四方面提供一种制备上述狂犬病毒mRNA疫苗方法，其包括将所述核酸片段引入到施用对象体内。
本发明的第五方面提供一种药物，其包含上述任一项的mRNA疫苗。
本发明的第六方面提供上述任一项的mRNA疫苗，其在施用对象体内可诱导产生针对狂犬病毒的特异性免疫反应。
本发明的第七方面提供上述任一项的mRNA疫苗，所述方法制备获得的产品，或所述药物用于制备在有此需要的个体中预防狂犬病毒感染的药物的用途；任选地，所述的病毒为狂犬病毒。
本发明的第八方面提供一种在有此需要的个体中预防病毒感染的方法，包括向所述个体施用上述任一项的mRNA疫苗，所述方法制备获得的产品；任选地，所述病毒选为狂犬病毒。
有益效果
mRNA疫苗原理：将设计好的mRNA(抗原的mRNA)注射入动物或人体体内，使其在体内表达特定蛋白，进而产生免疫反应。
而mRNA疫苗的研发包括抗原的选择、抗原序列的设计与优化、递送体系选择等多个环节。其中如何优化mRNA序列以及实现体内递送是两大技术壁垒。故理想的mRNA序列优化方案需同时达到以下两个目标：(1)提高mRNA二级结构稳定性，以延缓因mRNA降解而导致的免疫失败；(2)提高mRNA的翻译效率，使之能够大量产生目标抗原蛋白。现有技术公开了免疫原为G蛋白序列，尽管本领域技术人员可以依据该序列设计mRNA疫苗，但依然难以通过简单重复实验获得同时满足上述结构稳定性和翻译效率的理想疫苗。
目前已上市的疫苗是灭活的疫苗，其安全性和有效性得到临床证明，但生产复杂和作用效力有限(需要三次免疫)，难以满足临床需求。而由于设计等诸多原因，现有技术设计的mRNA疫苗的治疗效果不佳，无法代替上市的灭活疫苗，已然成为本领域需要克服的难题。
本发明中设计了多条经优化的表达狂犬G蛋白的mRNA疫苗，同等免疫条件下，本发明各mRNA疫苗可在小鼠体内快速诱导高水平的针对狂犬病毒G蛋白的免疫反应，抗体水平显著高于已上市的灭活苗和未经序列优化的mRNA疫苗，且本发明更加快速诱导高水平抗体反应，且低剂量也可以实现上述效果，且无明显毒性。即，mRNA疫苗在初次免疫12天后即诱导高水平抗体反应，显著快于灭活疫苗，表明mRNA疫苗可快速介导免疫反应产生。同时，体外转染实验表明，经优化的mRNA序列稳定性显著优于未经优化序列，可在细胞水平持续表达抗原G蛋白。此外，mRNA疫苗免疫组小鼠体重与灭活苗组无明显差异，表明mRNA疫苗无明显毒性。
具体而言，本发明设计了经过密码子优化获得r1-r6，进而获得mRNA(R1-R6)，其中mRNA对应部分核苷酸用修饰性核苷酸替换，即Ψ表示UTP(U)用假尿嘧啶(Ψ)替换。经密码子优化的R1-R6转染细胞24h后，介导的抗原表达水平明显高于未经优化的R0，转染72h后，R0已基本无表达，而R1-R6仍表达，表明密码子优化提高了mRNA表达水平的同时也提高了其稳定性，而假尿嘧啶(Ψ)的修饰整体有助于进一步提升mRNA的稳定性。
如图5A-B所示，各实验组血清中均能检测到靶向G蛋白的抗体，且各mRNA疫苗组所诱导的IgG型抗体水平在一免及加强免疫后一周，均显著高于灭活苗。mRNA疫苗在初次免疫12天后即诱导高水平抗体反应，显著优于灭活疫苗，表明mRNA疫苗可快速介导免疫反应产生。综合体外及小鼠体内免疫效果，R1和R4组具有相对更高的免疫原性。另外如图5C-D所示，相较于已上市的灭活苗组，mRNA疫苗给药对小鼠体重无明显影响。
如图6所示，各实验组血清中均能检测到靶向G蛋白抗体，且密码子优化后的R1及R4相较于R0可以诱导更高的抗原特异性抗体水平，二免后一周，R1-Ψ高剂量组(5μg)所诱导的特异性抗体的滴定终点对数值高出灭活苗组30％，较R0-Ψ高剂量组(5μg)有10％的增加。对于低剂量组(0.5μg)而言，R1及R4所诱导的抗体水平也已显著高于商品化灭活苗组，而R0组与灭活苗组则无显著性差异，以上结果表明密码子优化进一步提高了疫苗的效果。另外R1、R4低剂量(0.5μg)单次免疫后即可产生显著高于灭活疫苗组的抗体滴度，优于相关文献报道的mRNA疫苗单次免疫效果(PMID:36371169，该文献中1μg狂犬mRNA疫苗单次免疫小鼠后第14天，诱导的抗体水平与灭活疫苗组相比无显著性差异。PMID:36761167，该文献中狂犬mRNA疫苗单次免疫诱导的抗体反应未优于灭活疫苗)。而相较于已上市的灭活疫苗，本发明相关mRNA疫苗给药对小鼠体重无明显影响。
因此，本发明制备了狂犬病毒mRNA疫苗，经优化的序列的稳定性和蛋白表达效率同时显著提高。该疫苗可快速诱导高水平的抗狂犬病毒免疫反应，且无明显毒副作用。本发明可降低现有狂犬灭活疫苗的免疫剂次，并且不涉及病毒污染等问题，是一种更加经济、安全、高效的狂犬疫苗。
附图说明
图1为mRNA的结构示意图。
图2为野生型及优化后G蛋白琼脂糖凝胶核酸电泳鉴定图。A为野生型，B为修饰为Ψ，C为修饰为U，M为RNAmarker，R0-U/Ψ分别为尿嘧啶修饰前/后的野生型CTN-1-G mRNA对应核酸，其余泳道分别为优化后R1-R6修饰前(U)和修饰后(Ψ)的mRNA对应核酸。
图3LNP-mRNA粒径检测图。
图4LNP-mRNAHEK293T细胞转染24、72h后FCM检测结果。(A)为转染24h后293T细胞的LNP-mRNA表达情况，(B)为转染72h后的表达情况。
图5不同序列mRNA疫苗小鼠免疫实验结果。(A-B)为Day12/21小鼠血清抗原特异性IgG ELISA检测结果。(C-D)为小鼠体重变化，其中Ψ为假尿嘧啶修饰组，U为正常尿嘧啶组，inactivated为灭活苗组，blank为PBS组。
图6不同剂量mRNA疫苗免疫小鼠后诱导的免疫反应。(A-C)分别为假尿嘧啶修饰后的R0/R1/R4及灭活苗(Inactivated)免疫小鼠后小鼠血清抗原特异性IgG滴度变化。(D-F)分别为未修饰R0/R1/R4及灭活苗免疫小鼠后的小鼠血清抗原特异性IgG滴度变化。低剂量组(0.5μg)与灭活苗免疫小鼠相比，显著性差异表达为“*”(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，高剂量组(5μg)与灭活苗免疫小鼠相比，显著性差异表达为“#”(#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001)。
图7不同剂量mRNA疫苗免疫小鼠后的小鼠体重变化，其中A为R1-Ψ，B为R1-U，C为R4-Ψ，D为R4-U。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1mRNA的合成
本发明提供了基于丽沙狂犬病毒(Rabies lyssavirus)G蛋白(SEQ ID NO:1)氨基酸序列优化设计的mRNA，具体过程如下：
1.1G蛋白核苷酸序列优化
丽沙狂犬病毒G蛋白的氨基酸序列(ACR39382.1，NCBI数据库)：MIPQALLFVPLLVFP LCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYISAIKVNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRSAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESVVIISPSVADLDPYDKSLHSRVFPRGKCSGITVSSAYCSTNHDYTIWMPENPRLGTSCDIFTNSRGKRASKGSKTCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAIQTSNETKWCPPDQLVNLHDFHSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGHVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLMHPLADPSTVFKDGDEVEDFVEVHLPDVHKQVSGVDLGLPNWGKDVLMGAGVLTALMLMIFLMTCCRRTNRAESIQHSLGETGRKVSVTSQSGRVISSWESYKSGGETKL(SEQ ID NO：1)
注释：单横线部分为信号肽。
G蛋白的核苷酸序列(FJ959397.1，NCBI数据库)，见SEQ ID NO：2；
本发明采用本领域常规分子生物学方法，进行相关质粒的构建。以人为宿主对G蛋白核酸序列进行密码子优化，由苏州金唯智生物科技有限公司合成带有相应编码G蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO:2-8)的质粒，相应的核苷酸序列见表1。其中，r0为野生型G蛋白核酸序列(SEQ ID NO：2)，r1-6分别为密码子优化后序列。
表1.密码子优化后的核苷酸序列
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1.2mRNA制备和蛋白表达鉴定
利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增重组质粒中编码G蛋白的核苷酸片段，首先应用PCR试剂(Thermo Scientific，Cat#F531L)及第一对引物扩增出带有目的基因的长片段，然后以第一次PCR产物为模板应用第二对引物再次PCR，最终获得编码G蛋白的线性化DNA模板，过程中通过在第二对引物中添加poly(T)向上述线性化模板中引入poly(T)。按照HiScribe T7高产量RNA合成试剂盒(NEB，Cat#E2040S)的使用说明，在体外进行转录。在转录过程中，poly(T)转变为poly(A)，使用cap1类似物(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG，TriLink)进行共转录加帽，同时将部分序列的UTP全部替换为修饰性核苷酸，即假尿苷(Ψ)(N1-甲基-假尿苷-5’-三磷酸)。体外转录完成后，使用DNA酶I(Vazyme，Cat#EN401-01-AA)去除DNA模板，并按照Monarch RNA纯化试剂盒(NEB，Cat#T2050L)的使用说明去除RNA中的蛋白质和盐等杂质，最终获得包含基本元件的可以在体内稳定翻译的抗原mRNA。其结构如图1所示，相对应的mRNA核苷酸序列见表2，其中每条序列5’端均添加cap1结构，mRNA编号中的U表示UTP为常规UTP，Ψ表示UTP替换为修饰性核苷酸。
表2.mRNA的核苷酸序列
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用核酸定量仪(凯奥，Cat#K5500)对获得的mRNA溶液进行浓度测定。各取200ng添加适量的RNase-free ddH2O和6x loading buffer(TaKaRa，Cat#3587A)，吹打混匀后置于PCR仪(TE Thermo Cycler)中，在65℃孵育10min。孵育完成后将已变性的样品加入电泳槽内的琼脂糖凝胶中，添加适量1x TBE缓冲液后在电压140V条件下进行电泳并成像，结果见图2。如图2所示，M为RNAmarker RL6000(TaKaRa，Cat#3587A)，R0-U/Ψ分别为修饰前/后的野生型CTN-1-G mRNA对应核酸分子量，其余泳道分别为修饰前(U)和修饰后(Ψ)的R1-R6mRNA对应核酸分子量，各组条带大小一致，这表明体外转录合成的mRNA的分子量与目的CTN-1-G核酸分子量一致。
实施例2丽沙狂犬病毒mRNA疫苗的制备和检测
使用微流控系统制备LNP-mRNA颗粒。用柠檬酸缓冲液对获得mRNA溶液进行溶液替换，调整mRNA终浓度至0.05mg/mL。按照阳离子脂质/辅助磷脂/胆固醇/聚乙二醇脂质＝50/10/38.5/1.5的摩尔比例，分别取适量脂质并用无水乙醇溶解配制成终浓度为2.85mg/mL混合液。用注射器吸取2mL mRNA柠檬酸缓冲液和0.67mL脂质混合液，注入微流控芯片中，按照微流控仪器(苏州汶颢微流控技术股份有限公司)的操作说明，制备并收集LNP-mRNA混合物溶液。对获得的LNP-mRNA混合物溶液进行超滤浓缩，收集浓缩后样品便获得丽沙狂犬病毒mRNA疫苗。
使用布鲁克海文粒径仪对LNP-mRNA颗粒的粒径进行检测。按照布鲁克海文粒径仪(NanoBrook Omni)的操作说明，对已获得LNP-mRNA进行粒径大小测定，检测结果如图3所示。LNP-mRNA样品的平均粒径范围集中在100-150nm，符合高免疫原性LNP的制备要求。
使用流式细胞术(Flow cytometry，简称FCM)对LNP-mRNA的G蛋白表达能力进行鉴定。取形态良好的HEK 293T细胞(购自国家模式与特色实验细胞资源库，中国上海)，按照1x105个细胞/孔接种于12孔板，置于恒温培养箱内培养，培养条件为37℃，5％CO2。待细胞贴壁后，将0.8μg mRNA/孔LNP-mRNA样品分别加入板孔内，继续培养24或72h。FCM实验当天，用PBS缓冲液(VivaCell，Cat#C3580-0500)润洗细胞，加入500μL胰酶(新赛美，Cat#C100C1)进行消化，用1mL添加10％胎牛血清的DMEM完全培养基(DMEM，VivaCell，Cat#C3110-0500；胎牛血清，VivaCell，Cat#C04001-500)终止反应。吹打并将细胞浊液转移至1.5mL EP管中，在300×g，4℃条件下离心5min，弃上清后用PBS缓冲液清洗两次。向清洗后的细胞样品加入100μL 1:200稀释的抗狂犬病毒单克隆抗体(Santa Cruz，Cat#sc-57995)，重悬后置于冰上孵育30min。孵育结束后用1x PBS缓冲液离心清洗细胞两次，离心参数设置为300×g，4℃，5min。向清洗后的细胞样品加入100μL1:200稀释的PE anti mouse IgG2a抗体(BioLegend，Cat#407108)，重悬后置于冰上避光孵育30min。孵育结束后用1mL PBS缓冲液离心清洗细胞样品两次，离心参数设置为300×g，4℃，5min。重悬细胞样品，过滤后使用流式细胞仪(Thermofisher，型号Attune NxT)进行蛋白表达检测，检测结果见图4。如图4所示，mRNA可通过LNP成功递送进入细胞，并在体外实现高水平表达。其中，经密码子优化的R1-R6转染细胞24h后，介导的抗原表达水平明显高于未经优化的R0，转染72h后，R0已基本无表达，而R1-R6仍表达，表明密码子优化提高了mRNA表达水平的同时也提高了其稳定性，而假尿嘧啶(Ψ)的修饰整体有助于进一步提升mRNA的稳定性。
实施例3小鼠体内药效实验鉴定不同mRNA疫苗的诱导产生抗体能力
为对上述不同mRNA疫苗诱导产生的针对G蛋白的抗体能力进行评价，通过小鼠体内药效实验进行鉴定。对6～8周龄BALB/c雌鼠进行分组，每组5只，具体分组方案见表3。实验组中U代表RNA合成中使用正常尿嘧啶，而Ψ代表RNA合成中使用假尿嘧啶(Ψ)替代正常尿嘧啶。同时设置PBS组以及灭活疫苗组(瑞倍尔安，购自怡安生物)，每组5只，在第0天，PBS组及灭活苗组分别注射100μL PBS或0.25IU灭活疫苗，各mRNA疫苗组分别肌肉注射1.5μgLNP-mRNA，在第12天进行眼眶采血。在第14天重复注射PBS、灭活苗或1.5μg LNP-mRNA进行加强免疫，在加强免疫后一周眼眶采血，采集的血液样本在室温静置2h，然后在3000rpm，4℃条件下离心10min，分离血清。免疫期间定期进行小鼠体重监测。
表3.各组别小鼠免疫方案
组别 疫苗 剂量
1 PBS 100μL/只
2 灭活苗 0.25IU/只
3 R1-U 1.5μg/只
4 R1-Ψ 1.5μg/只
5 R2-U 1.5μg/只
6 R2-Ψ 1.5μg/只
7 R3-U 1.5μg/只
8 R3-Ψ 1.5μg/只
9 R4-U 1.5μg/只
10 R4-Ψ 1.5μg/只
11 R5-U 1.5μg/只
12 R5-Ψ 1.5μg/只
13 R6-U 1.5μg/只
14 R6-Ψ 1.5μg/只
使用酶联免疫吸附测定技术(Enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA)对各组血清样本中靶向G蛋白的抗体水平进行测定。将10xELISA包被液(新赛美，Cat#E30500)稀释为1x包被工作液，用该包被工作液将抗原蛋白CTN-1-G(购自南京德泰生物工程有限公司)稀释为终浓度1μg/mL，得到包被抗原溶液。向96孔EIA/RIA透明平底聚苯乙烯微孔板(Corning，Cat#3590)加入包被抗原溶液，每孔100μL，并置于4℃过夜。次日弃去包被液，用200μLELISA清洗液(新赛美，Cat#E21000)清洗孔板4次，拍干并加入100μL含3％牛血清白蛋白(索莱宝，Cat#A8020)的抗原封闭液，置于37℃封闭2h。弃去封闭液，用200μLELISA清洗液清洗3次后拍干，用含1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液(即抗体稀释液)将血清样品进行1:100或1:10000稀释，取100μL加入到上述孔板内。随后将孔板移入37℃恒温箱内孵育2h。弃去血清样本，用ELISA清洗液清洗孔板5次，拍干后加入100μL1：8000稀释的GoatAnti-MouseIgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech，Cat#1036-05)，37℃孵育1h。弃去二抗，用200μLELISA清洗液清洗孔板5次，拍干后加入100μLTMB，室温避光反应15min，用50μLELISA终止液(新赛美，Cat#E40500)进行终止，随后利用酶标仪(TECAN，型号MultiskanMk3)读取450nm吸光度值，结果见图5。如图5A-B所示，各实验组血清中均能检测到靶向G蛋白的抗体，且各mRNA疫苗组所诱导的IgG型抗体水平在一免及加强免疫后一周，均显著高于灭活苗。mRNA疫苗在初次免疫12天后即诱导高水平抗体反应，显著优于灭活疫苗，表明mRNA疫苗可快速介导免疫反应产生。综合体外及小鼠体内免疫效果，R1和R4组具有相对更高的免疫原性。另外如图5C-D所示，相较于已上市的灭活苗组，mRNA疫苗给药对小鼠体重无明显影响。
实施例4小鼠体内药效实验鉴定不同剂量的mRNA疫苗诱导产生抗体能力
为对上述不同剂量LNP-mRNA(即疫苗)诱导产生的针对G蛋白的抗体水平进行评价，通过小鼠体内药效实验进行鉴定。对6～8周龄BALB/c雌鼠进行分组，每组6只，具体分组方案见表4。实验组中U代表RNA合成中使用正常尿嘧啶，而Ψ代表RNA合成中使用假尿嘧啶替代正常尿嘧啶，同时设置灭活苗组，每组6只。在第0天各实验组分别肌肉注射0.5/1.5/5μg LNP-mRNA，灭活苗对照组肌肉注射0.25IU灭活苗，在第14、20天进行眼眶采血。在第21天重复注射0.5/1.5/5μg LNP-mRNA或0.25IU灭活苗进行加强免疫，在第28、35、42天眼眶采血。按照实施例3内的方法分离血清并进行抗体滴度测定。其中，ELISA检测滴度时，先用抗体稀释液从1:100或1:1000起始对血清样品进行倍比稀释，然后每个样品浓度分别取100μL，逐一加入到孔板中进行后续检测，其余步骤同实施例3，根据450nm吸光度值进行滴定终点计算。结果见图6。如图6所示，各实验组血清中均能检测到靶向G蛋白抗体，且密码子优化后的R1及R4相较于R0可以诱导更高的抗原特异性抗体水平，二免后一周，R1-Ψ高剂量组(5μg)所诱导的特异性抗体的滴定终点对数值高出灭活苗组30％，较R0-Ψ高剂量组(5μg)有10％的增加。对于低剂量组(0.5μg)而言，R1及R4所诱导的抗体水平也已显著高于商品化灭活苗组，而R0组与灭活苗组则无显著性差异，以上结果表明密码子优化进一步提高了疫苗的效果。另外R1、R4低剂量(0.5μg)单次免疫后即可产生显著高于灭活疫苗组的抗体滴度，优于相关文献报道的mRNA疫苗单次免疫效果(PMID:36371169，图3A，该文献中1μg狂犬mRNA疫苗单次免疫小鼠后第14天，诱导的抗体水平与灭活疫苗组相比无显著性差异。PMID:36761167，图3，该文献中狂犬mRNA疫苗单次免疫诱导的抗体反应未优于灭活疫苗)。而相较于已上市的灭活疫苗，本发明相关mRNA疫苗给药对小鼠体重无明显影响(图7)。
表4.各组别小鼠免疫方案
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总之，本发明制备的丽沙狂犬病毒mRNA疫苗具有很好的免疫原性，低剂量即可诱导小鼠产生高滴度的抗体，效价优于现有疫苗。

Claims (8)

1.一种狂犬病毒mRNA疫苗，其特征在于：所述的疫苗包括：（1）用于表达狂犬病毒优化的免疫原mRNA，所述的免疫原为狂犬病毒G蛋白；（2）疫苗载体，所述的疫苗载体为脂质纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的狂犬病毒mRNA疫苗，其特征在于，所述的SEQ ID NO：11-22中任意一条核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的狂犬病毒mRNA疫苗，其特征在于，所述的脂质纳米颗粒为聚乙二醇脂质、中性脂质、阳离子脂质和胆固醇或者胆固醇类似物形成的脂质纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的狂犬病毒mRNA疫苗，其特征在于，所述的阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA、DODMA、DODAP、ALC-0315或SM102。
5.根据权利要求4或5所述的狂犬病毒mRNA疫苗，其特征在于，脂质纳米颗粒与mRNA质量比为10-30:1。
6.一种药物组合物，其特征在于其包含权利要求1-5任一项的mRNA疫苗和药学可接受的辅料。
7.根据权利要求1-5任意一项所述的mRNA疫苗或权利要求7所述的药物组合物在制备狂犬病毒mRNA疫苗中的应用。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的狂犬病毒选自：PV株、Flury株、SAD株、aG株、CTN株及它们的衍生株或其多种组合。
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