CN113151196A - 重组痘苗病毒、痘苗病毒载体疫苗及其应用与制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了重组痘苗病毒、痘苗病毒载体疫苗及其应用与制备方法。所述重组痘苗病毒包括：胸苷激酶(TK)基因和L025基因的联合缺陷；及重组核酸序列，所述重组核酸序列编码新型冠状病毒的S基因中的第一核酸序列，所述第一核酸序列插入所述重组痘苗病毒的基因组中。所述重组痘苗病毒载体疫苗包括所述重组痘苗病毒以及药物学上可接受的载体或佐剂。所述制备重组痘苗病毒的方法包括将所述重组核酸序列引入痘苗病毒的基因组的目标基因的左臂及右臂之间，得到重组穿梭载体并转染入宿主细胞，形成所述重组痘苗病毒。本申请还公开了编码具有新型冠状病毒S蛋白的重组核酸序列及重组病毒载体。

Description

重组痘苗病毒、痘苗病毒载体疫苗及其应用与制备方法

技术领域

本申请涉及生物工程技术领域，尤其涉及多种重组痘苗病毒、痘苗病毒载体疫苗及其制备方法，用于预防新型冠状病毒的感染中的应用。

背景技术

在开发疫苗时需要考虑的因素包括：(1)免疫系统是怎样对病原(病毒或者细菌)产生免疫反应的；(2)哪些人需要疫苗；以及(3)开发疫苗最好的技术或者策略。根据不同病原的特点，科学家们开发不同类型的疫苗。疫苗的类型包括4大类：(1)减毒活疫苗；(2)灭活的疫苗；(3)亚单位多肽疫苗，重组蛋白疫苗，多糖和结合疫苗；以及(4)类毒素疫苗。

近年来科学家们致力于应用新的技术开发疫苗。目的是更快，更有效地开发出相关的疫苗产品。这方面的新技术包括：(1)核酸疫苗，包括DNA疫苗和 mRNA疫苗；以及(2)重组载体疫苗。

核酸疫苗是通过提供编码病原体上相应蛋白质(抗原)的DNA或者mRNA到身体内的细胞，让宿主细胞表达相应的蛋白质，从而激发免疫反应。核酸疫苗的特点是，开发时间短，安全性较好，具有一定的免疫效果。目前有国内和国外的多家研究机构宣称他们已经开发出新型冠状病毒的DNA或者mRNA疫苗，准备进入量产和动物实验阶段。这无疑是令人振奋的好消息。

最近几年，重组载体疫苗越来越受到重视,得益于人们对重组载体疫苗认识的提高以及相关的技术进步。这类疫苗的作用过程像是发生一次感染，因此可以更有效地刺激免疫系统产生免疫反应。默克公司成功地应用水泡性口炎病毒 (VSV,VesicularStomatitis Virus)为载体开发出预防埃博拉病毒的疫苗 rVSV-ZEBOV，展现出很好的安全性，且具有良好的预防效果，并被世界卫生组织认可。

传统用于预防天花病毒的疫苗痘苗病毒(vaccinia virus)具有良好的有效性及安全性，痘苗病毒的基因组比较大(190kb)，可以容纳大片段的外来基因，容量可达20kb，因此在开发大的靶向蛋白疫苗时具有很好的优势。这类载体主要有2类，一是复制缺陷型的MVA(Modified Vaccinia Ankara),二是复制正常的痘苗病毒(vaccinia virus)。MVA是通过在鸡胚上长期传代痘苗病毒后导致多个影响痘苗病毒复制的基因丢失获得的。另一类是用复制能力正常的痘苗病毒为载体开发的疫苗，可以更有效地激活免疫反应，提高预防效果，但缺点是不适合用于存在免疫缺陷的人。

世界卫生组织把新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，基因组全长为29903bp(ACCESSION MN908947，VERSION MN908947.3)。新型冠状病毒是一个正链RNA 病毒，RNA病毒的一大特点是很容易发生基因突变。如果标靶核酸或蛋白的稳定性很差，突变速度快，那么开发出的疫苗将来很难对携带已发生突变的新型冠状病毒发挥作用。

故，有必要提供一种能够预防或治疗新型冠状肺炎病毒的重组痘苗病毒及痘苗病毒载体疫苗，以解决目前缺乏有效预防或治疗新型冠状肺炎病毒的疫苗和药物的问题，以遏制新型冠状肺炎病毒的蔓延。

发明内容

本申请的多个实施例提供一种重组痘苗病毒，并且用所述重组痘苗病毒作为病毒载体开发痘苗病毒载体疫苗，携带新型冠状病毒的全长S基因或包含RBD 的S1基因，重组痘苗病毒感染人体的细胞后可以繁殖，在痘苗病毒的繁殖过程中会表达新型冠状病毒S基因编码的蛋白或者S1蛋白，这样异源性的蛋白会激发人体的免疫系统产生针对它的特异性抗体。痘苗病毒的复制周期为6至8小时，S基因/S1基因的表达受到痘苗病毒内源性启动子的控制，因此在痘苗病毒增殖过程中可以快速表达大量的新型冠状病毒蛋白S或者S1，从而激发免疫系统产生高水平的抗新型冠状病毒蛋白的抗体。

本申请的一实施例提供一种重组痘苗病毒，包括：所述重组痘苗病毒的基因组包括：

胸苷激酶(TK)基因和L025基因的联合缺陷；及重组核酸序列，所述重组核酸序列编码新型冠状病毒的S基因中的第一核酸序列，所述第一核酸序列插入所述重组痘苗病毒的所述基因组中。

在一些实施例中，所述重组核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一些实施例中，所述第一核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一些实施例中，所述第一核酸序列为所述新型冠状病毒的S基因的S1 区域中的受体结合区域。

在一些实施例中，所述重组核酸序列为所述新型冠状病毒的第一核酸序列和所述重组痘苗病毒的部分B5R基因的融合基因。

在一些实施例中，所述重组核酸序列插入所述重组痘苗病毒的L025基因中。

在一些实施例中，所述重组痘苗病毒的胸苷激酶(TK)基因具有突变或缺失。

在一些实施例中，一种将本申请的实施例中的重组痘苗病毒在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒引发疾病的药物中的应用。

在一些实施例中，所述药物为疫苗。

在一些实施例中，所述新型冠状病毒引发疾病为新型冠状病毒肺炎。

本申请的一实施例提供一种痘苗病毒载体疫苗，所述痘苗病毒载体疫苗包括：本申请的实施例中的所述重组痘苗病毒；以及药物学上可接受的载体或佐剂。

在一些实施例中，所述重组痘苗病毒为活体，所述重组痘苗病毒在被施用的对象的细胞中具有复制能力。

本申请的一实施例提供一种将本申请的实施例中的所述痘苗病毒载体疫苗用于在制备预防新型冠状病毒感染的各种其他疫苗中的应用。

在一些实施例中，所述痘苗病毒载体疫苗是用于皮下注射或皮内注射。

本申请的一实施例提供一种编码具有新型冠状病毒S蛋白的重组核酸序列，所述重组核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本申请的一实施例提供一种编码具有新型冠状病毒S蛋白的重组病毒载体，所述重组病毒载体包括如SEQ ID NO:1所示的序列。

本申请的一实施例提供一种用于制备重组痘苗病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

将本申请的实施例中的所述重组核酸序列引入痘苗病毒的基因组的目标基因的左臂及右臂之间，得到重组穿梭载体；

将所述重组穿梭载体转染入第一宿主细胞；

将所述重组核酸序列插入痘苗病毒的基因组的所述目标基因中，形成所述重组痘苗病毒；及

从所述第一宿主细胞回收所述重组痘苗病毒。

在一些实施例中，所述方法包括：以本申请的实施例中的重组痘苗病毒感染第二宿主细胞，从所述第二宿主细胞回收所述重组痘苗病毒。

在一些实施例中，所述第一宿主细胞为CV-1细胞；及所述第二宿主细胞为 HEK293细胞。

技术效果：

本申请实施例提供一种重组痘苗病毒及包括其的痘苗病毒载体疫苗，用于在制备预防新型冠状病毒感染的疫苗中的应用，所述痘苗病毒载体疫苗对于容易发生突变的新型冠状病毒具有良好的稳定性，阻断病毒的刺突蛋白与细胞表面的ACE2受体的结合，阻止病毒感染细胞，并且促进被施用的对象产生的抗体可以和病毒形成抗原-抗体复合物，这一复合物会激发一系列的免疫反应，从而清除病毒。

附图说明

下面结合附图，通过对本申请的具体实施方式详细描述，将使本申请的技术方案及其它有益效果显而易见。

图1是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)基因组结构示意图。

图2是针对28个新型冠状病毒分离株S基因序列分析。

图3是新型冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)抗体表位的预测。

图4是本申请的实施例的重组穿梭载体示意图和重组痘苗病毒的示意图。

图5是本申请的实施例的痘苗病毒载体疫苗的制造方法的流程图。

图6是本申请的实施例的重组痘苗病毒的制造方法的流程图。

图7是本申请的实施例的痘苗病毒载体疫苗的制造方法的流程图。

图8是本申请的实施例的痘苗病毒载体疫苗的量产流程图。

图9是新型冠状病毒S蛋白特异性IgG检测稀释过程及其结果。

图10是新型冠状病毒S蛋白特异性IgG滴度(Log滴度)。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本申请的不同结构。为了简化本申请的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本申请。此外，本申请可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。此外，本申请提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

请参见图1，图1示出了新型冠状病毒(SARS-CoV-2)基因组结构示意图。新型冠状病毒基因组的5’端带有一个帽状结构，3’端含有一个poly-A尾。冠状病毒基因组包含至少6个开放阅读框架(ORF)。第一个ORF(ORF1a/b),占基因组长度的大约2/3，编码16个非结构蛋白(nsp1-16)。其它的ORFs位于基因组3’端，占基因组长度的1/3，编码至少4个结构蛋白，分别是刺突蛋白 (spike或S蛋白，转译后成为S1和S2两个蛋白)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E) 及核衣壳蛋白(N)。

新型冠状病毒的S基因编码的蛋白形成病毒的刺突，刺突可以特异性地结合细胞表面的ACE2受体而进入细胞，并开始复制产生新的病毒。因此，如果能有效地阻断病毒的刺突与ACE2的结合就可以阻止病毒感染。本申请设计开发的疫苗能诱导机体产生针对冠状病毒刺突蛋白的抗体，与新型冠状病毒结合并阻止病毒与ACE2的结合，从而阻断病毒的感染。另外，接种者产生的抗体可以和病毒形成抗原-抗体复合物，这一复合物会激发一系列的免疫反应，从而清除病毒。

本申请选择刺突蛋白(S蛋白)作为疫苗开发的靶向蛋白，S基因中位于 S1区域中的受体结合区域(RBD)的稳定性显得非常重要。为了确定S基因以及RBD是否稳定，本申请分析了截至到2020-02-06已经公布的28个新型冠状病毒的基因序列。请参见图2，示出了除了澳大利亚分离的病毒(MT007544) 有一个氨基酸突变(S247R)，其它27个病毒分离株没有氨基酸突变。可见， SARS-CoV-2S蛋白变异发生频率相对较低，因此可以作为疫苗开发的靶向蛋白。

为了探索刺突蛋白作为疫苗靶向的可行性，本申请进一步分析了刺突蛋白的免疫原性。请参见图3，图3是新型冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)抗体表位的预测，分析结果示出了刺突蛋白包含了24个潜在的B细胞表位(即产生抗体的表位)。分析工具为IEDB Bepipred线性表位预测(Linear Epitope Prediction) 2.0。

由此可见，新型冠状病毒S基因以及位于S1基因中的RBD稳定性，以及S 蛋白抗体表位的分析结果，表明S蛋白以及RBD是一个理想的疫苗靶位蛋白。针对RBD的中和抗体抗原会直接阻断病毒和受体ACE2的结合，从而阻止新型冠状病毒感染细胞。因此，本申请的重组痘苗病毒、痘苗病毒载体疫苗携带新型冠状病毒S基因，有利于克服新型冠状病毒容易突变而失效的技术问题，针对广域变异型新型冠状病毒仍然具有其特异性，抑制及/或阻断新型冠状病毒在体内存活、复制及扩散。

请参见图4，图4是本申请的实施例的重组穿梭载体示意图和重组痘苗病毒的示意图。

本申请的重组穿梭载体的重组核心区域包括重组核酸序列，用于靶向L025 基因上游序列的L025左臂、用于筛选重组痘苗病毒的红色荧光蛋白(RFP)基因及其启动子H5、编码新型冠状病毒的S基因中的第一核酸序列，以及用于靶向L025基因下游序列的L025右臂。在H5-RFP两侧各有一个FRT位点，用于将红色荧光蛋白基因从构建好的重组痘苗病毒中切除。H5启动子控制S基因的表达。H5-RFP及所述第一核酸序列位于所述重组核心区的L025左臂与L025右臂之间。

所述重组穿梭载体通过与痘苗病毒基因组通过同源重组的原理，把所述重组穿梭载体的L025左臂和右臂之间的序列重组到痘苗病毒基因组的L025区域，将所述重组核酸序列置换到痘苗病毒基因组中，同时删除L025基因。

在另一实施例中，所述重组穿梭载体包括胸苷激酶(TK)基因的左臂和右臂，将所述重组核酸序列置换到痘苗病毒基因组中，同时删除胸苷激酶(TK) 基因，具体内容请参照上述实施例，不在此处一一赘述。

请参见图5至6，图5是本申请的实施例的痘苗病毒载体疫苗的制造方法的流程图及图6是本申请的实施例的重组痘苗病毒的制造方法的流程图。

S10：合成携带S基因的重组穿梭载体，具体如下：

S101：将新型冠状病毒S蛋白的核苷酸引入痘苗病毒的基因组的目标基因的左臂及右臂之间，得到重组穿梭载体。

具体地，向穿梭载体引入重组核酸序列，所述重组核酸序列依次包括：所述目标基因的左臂序列、启动子、新型冠状病毒S蛋白的第一核酸序列及目标基因的右臂序列。

所述穿梭载体适用于痘苗病毒的载体，在一实施例中，所述穿梭载体为 PUC57载体。所述目标基因为欲删除的痘苗病毒的基因，在一实施例中，所述目标基因为L025基因及/或胸苷激酶(TK)基因，例如L025基因和TK基因的联合缺陷；L025基因及/或胸苷激酶(TK)基因除因删除而缺失外，亦可选择以具有突变的方式存在,导致失活或活性变低；在一实施例中，L025基因通过同源重组而缺失，TK基因具有突变而失活或活性变低；所述启动子为H5序列，所述新型冠状病毒S蛋白的第一核酸序列为所述S蛋白的全长、S1序列或S1 序列的受体结合区域(RBD)。因此，所述重组核酸序列表示为：L025左臂-H5-S 基因-L025右臂。携带L025基因突变可以解除L025基因对免疫系统的抑制，提高抗S蛋白的免疫反应，促进本申请的所述实施例中的所述重组痘苗病毒和痘苗病毒载体疫苗靶向新冠肺炎病毒及其它变异型，增加所述重组痘苗病毒和痘苗病毒载体疫苗杀伤新冠肺炎病毒及其它变异型的能力。携带TK基因突变使本申请的所述实施例中的所述重组痘苗病毒和痘苗病毒载体疫苗选择性地体内复制。同时携带L025基因及TK基因的突变使所述L025基因及TK基因失活，增强了体内免疫细胞对新冠肺炎病毒及其它变异型的免疫反应，有利于激活B 淋巴球及T淋巴球，制造对抗该病原体的抗体，针对新冠肺炎病毒的亲合力更高，增加所述重组痘苗病毒和痘苗病毒载体疫苗在体内的有效时间，保护力更持久。

在另一实施例中，所述重组核酸序列还可包括一B5R重组基因序列，所述 B5R重组基因序列可以设置在L025基因及/或TK基因的前方或后方或单独存在。B5R基因编码一个42kDa的糖蛋白，其含有四个拷贝的50-70-氨基酸重复序列，称为“短共有重复序列”(SCR)。在另一实施例中，所述重组核酸序列可通过同源重组的原理，携带B5R基因的左臂和右臂，并将所述B5R基因的左臂和右臂之间的序列重组到痘苗病毒基因组的B5R基因的区域，以将所述重组核酸序列置换到痘苗病毒基因组中，同时删除B5R基因而失活，使得感染细胞斑块小且EEV形成大幅度减少(≤10倍)，促进重组痘苗病毒扩散。在另一实施例中，所述B5R重组基因序列可携带缺失SCR4、SCR3,4、SCR 2,3,4或SCR 1,2,3,4的B5R基因突变，使得所述重组核酸序列被重组到所述痘苗病毒的基因组后，产生小的细胞感染斑块，产生比野生型病毒多约数十倍的感染性EEV 并形成彗星形斑块分布，促进重组痘苗病毒扩散，加速免疫细胞辨识新冠肺炎病毒的S蛋白。蛋白质片段形成后，指令巨噬細胞及樹突細胞等抗原呈現細胞吞噬新冠肺炎病毒，并且释放穿孔素和颗粒酶分解新冠肺炎病毒，之後將部分新冠肺炎病毒的其它蛋白质作为抗原片段表現在細胞表面，增强了针对新冠肺炎病毒的辩识能力，克服新冠肺炎病毒容易突变的问题，可用于制备预防及消灭新冠肺炎病毒的疫苗及/或药物中的应用，以及可用于制备预防及治疗由新冠肺炎病毒所引起的疾病的疫苗及/或药物中的应用。

为了筛选重组痘苗病毒，所述目标基因的左臂序列与所述第一核酸序列之间可引入启动子H5及红色荧光蛋白(RFP)基因，即H5-RFP核酸序列，构成 H5-RFP核酸序列。在H5-RFP两侧Loxp位点可各自引入一个FRT位点，使得FLP 重组酶将所述红色荧光蛋白基因从构建好的重组痘苗病毒中切除。因此，所述重组核酸序列表示为：L025左臂-FRT-H5-RFP-FRT-H5-S基因-L025右臂。

S102：将所述重组穿梭载体转染入所述第一宿主细胞。

在一实施例中，所述第一宿主细胞为非洲绿猴肾细胞(CV1)。

S103：将所述重组核酸序列插入所述目标基因中，形成重组痘苗病毒。

在所述宿主细胞中，通过例如：同源重组的方式，将所述重组穿梭载体中的所述新型冠状病毒S蛋白的重组核酸序列插入所述目标基因中。

具体地，所述重组穿梭载体的所述目标基因的左臂序列靶向所述新型冠状病毒的基因组中相同的所述目标基因的左臂，所述重组穿梭载体的所述目标基因的右臂序列靶向所述新型冠状病毒的基因组中相同的所述目标基因的右臂，将所述重组穿梭载体的所述左臂序列与所述右臂序列之间的序列克隆到所述新型冠状病毒的基因组中相同的所述目标基因中。即所述重组核酸序列靶向所述目标基因所在的第一位置，插入所述目标基因中，以删除所述痘苗病毒的所述目标基因，使所述痘苗病毒无法再表达所述目标基因。

S104：从所述第一宿主细胞回收所述重组痘苗病毒。

收集所述第一宿主细胞的培养液及/或病毒培养物，裂解处理细胞释放胞内病毒(例如：通过超声破碎的方式)，接着可选用合适的复合层析介质(例如： Capto Core 700)进行复合层析法纯化所述重组痘苗病毒。所述复合层析法简述如下：清洗及平衡上样泵；清洗及平衡管柱；以特定流速将样本加载至管柱中；以特定流速及移动相(例如：病毒保存液)洗脱管柱；及收集纯化后的所述重组痘苗病毒。

S20：鉴定重组区域插入所述重组痘苗病毒的目标基因以及删除目标基因，得到重组痘苗病毒载体疫苗，具体如下：

用纯化的重组痘苗病毒感染CV1细胞，感染1至2天后收集细胞提取DNA，然后用聚合酶链式反应(PCR)鉴定所述重组痘苗病毒。请见表1，表1的多个 PCR引物被用来进行鉴定所述纯化的重组痘苗病毒中的L025基因被剔除，并且携带有S基因。

表1：

名称	基因序列	序列编号
			L025正向引物	5′-TATCTAGCAATGGACCGT-3′	SEQ ID NO:3
L025反向引物	5′-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3′	SEQ ID NO:4
			S基因正向引物	5′-GCTCCAGGGCAAACTGGAAA-3′	SEQ ID NO:5
S基因反向引物	5′-GTCTGTGGATCACGGACAGC-3′	SEQ ID NO:6
			对照组(L09)正向引物	5′-TGTTGTTCGCTGCTATGA-3′	SEQ ID NO:7
对照组(L09)反向引物	5′-TGGCACAACCATATCTTGTA-3′	SEQ ID NO:8

PCR条件为94℃退火2分钟，然后进入36个PCR循环：94℃20秒，52 ℃ 20秒，72℃30秒。PCR产物用1％的琼脂糖电泳分析，所述纯化的重组痘苗病毒的L025基因确实已被剔除，并且携带有S基因。

请见图7，图7是本申请的实施例的痘苗病毒载体疫苗的制造方法的流程图。确定所述重组痘苗病毒的目标基因确实被剔除且携带有S基因后，进行下列步骤：

S201：将所述重组痘苗病毒感染第二宿主细胞；及

S202：从所述第二宿主细胞回收所述重组痘苗病毒。

在一些实施例中，加入药物学上可接受的载体或佐剂，得到重组痘苗病毒载体疫苗。

在一些实施例中，所述第一宿主细胞为CV-1细胞；及所述第二宿主细胞为 HEK293细胞。在一实施例中，所述第一宿主细胞亦可与所述第二宿主细胞相同，皆为CV-1细胞或HEK293细胞。

S30：生产和纯化携带S基因的重组痘苗病毒以及病毒滴度测定，具体方法请见相关文献。

请见图8，图8是本申请的实施例的痘苗病毒载体疫苗的量产流程图。

S40：进行符合优良药品生产规范(GMP)标准的病毒生产，简述如下：

采用有血清培养的贴壁生产工艺，选用HEK293细胞作为所述重组痘苗载体的生产用细胞，进行毒种的产业化评估及种子批建立及检定。

S401：采用225cm²的培养瓶对构建的痘苗病毒载体疫苗毒种进行小试产量评估，评价所述毒种的产量是否适合进行后续的中试放大生产。

S402：完成毒种评估后建立毒种两级种子批系统进行中试产量评估，，利用工作种子批毒种进行后续的工艺放大研究和试验用样品的制备。制备工艺放大方面，初步进行14L细胞罐的制备工艺研究，后续将对所述疫苗的制备工艺进行横向和纵向的放大，通过对制备工艺进行逐级放大研究，建立针对所述疫苗的规模化制备工艺。

S403：确认所述重组痘苗病毒载体疫苗的质量，进行质量标准研究和完善，质控方法学研究和验证，产品质量标准及控制体系的建立，确保所述痘苗病毒载体疫苗的品质。

S404：对所述重组痘苗病毒载体疫苗进行产业化研究，进行生产和纯化工艺放大和验证、疫苗产品长期稳定性质量研究、新型冠状病毒疫苗的产业化研究。

本申请的多个实施例中的所述重组痘苗病毒及包括其的痘苗病毒载体疫苗可以在动物体内实验激发抗新型冠状病毒刺突蛋白的抗体。剂量组分别为 10⁶PFU和10⁷PFU/只小鼠。第一次接种后4周用同样的剂量加强免疫一次。加强免疫后的14天取血并处死动物。分离血清以进行抗新型冠状病毒刺突蛋白的抗体检测，具体如下：

使用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测免疫后小鼠体内存在抗新型冠状病毒刺突蛋白的抗体。可以使用商业上可取得的抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒可以检测样本是否针对新型冠状病毒刺突蛋白的重要抗原表位的抗体(包括中和抗体)，所述检测方法的原简述如下，在固相(测定板、微粒等)上涂覆新型冠状病毒刺突蛋白，以作为抗原，接着加入封闭液封闭剩余的结合位点。加入样本，例如：多个小鼠经注射(皮下注射或皮内注射)本申请的多个实施例中的所述重组痘苗病毒及包括其的痘苗病毒载体疫苗后的血清，使所述样本中的IgG或IgM抗体与所述固相上的所述抗原结合。然后通过合适的第二抗体及底物，通过可被检测物(例如：萤光)并使用对应的波长下的吸光值(OD)，检测所述样本中是否存在抗新型冠状病毒的刺突蛋白的抗体。

实验结果请参见图9至10，图9是新型冠状病毒S蛋白特异性IgG检测稀释过程及其结果及图10是新型冠状病毒S蛋白特异性IgG滴度(Log滴度)，使用本申请的多个实施例中的所述重组痘苗病毒及包括其的痘苗病毒载体疫苗进行抗新型冠状病毒刺突蛋白抗体体外中和新型冠状病毒实验。利用假病毒的方法测试中和抗体。收集用携带刺突蛋白S基因的重组痘苗病毒免疫小鼠的血清，测定抗体滴度，并且将所述多个小鼠的血清分别进行10倍梯度稀释，测定在不同的抗体浓度下，抗体对新型冠状病毒感染靶细胞能力的影响。多个小鼠经注射本申请的多个实施例中的所述重组痘苗病毒及包括其的痘苗病毒载体疫苗后，检测所述多个小鼠的血清中确实具有抗新型冠状病毒刺突蛋白的抗体，稀释度(dilution)到达4*10⁵倍后，试剂盒才无法检测到所述抗体，所述多个小鼠的新型冠状病毒刺突蛋白的特异性IgG滴度如图10所示。所述抗体中和实验是检测新型冠状病毒可以用疫苗来预防新型冠状病毒感染的直接证据。

本申请的实施例中的重组痘苗病毒及痘苗病毒载体疫苗使新型冠状病毒能被抗原呈现细胞(APC)分解，将S蛋白等外来抗原呈现在APC的细胞表面，并活化T淋巴细胞或B淋巴细胞，产生具抗原特异性的细胞性免疫反应或体液免疫反应，并产生记忆作用，获得对新型冠状病毒的免疫效果，可用于制造用于预防及/或治疗新型冠状病毒的疫苗及/或药物中的应用，以及可用于制备预防及治疗由新冠肺炎病毒所引起的疾病的疫苗及/或药物中的应用。与传统疫苗相比，本申请的实施例中的重组痘苗病毒及痘苗病毒载体疫苗接种后在宿主细胞内表达抗原蛋白，直接与抗原呈递复合体结合，同时引起细胞免疫和体液免疫，因此诱导产生的抗原特异性免疫反应具有广谱性。重组痘苗病毒及痘苗病毒载体疫苗由于由具有自行大量复制的能力，与传统疫苗相比省去了抗原提取和纯化等成本较高的工艺流程，生产成本低廉。

本说明书所用的术语“PFU“是空斑形成单位，是计量病毒的一种单位。

本说明书所用的术语“稀释度”是溶液被冲淡的程度。例如：1ml血清加 179ml的生理盐水，则稀释度为180。

本说明书所用的术语“滴度“是稀释度的倒数。

本说明书所用的术语“封闭液”是用于封闭固相的剩余的结合位点，例如：溶于PBS的1％BSA。

本申请的一实施例中所使用的痘苗病毒为野生型李斯特菌痘苗病毒，可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)以ATCC登录号VR-1549^TM购得，详细信息也可以从ATCC VR-1549^TM的产品表中获得。所述野生型VV Lister也以CCTCC保藏号为V201937保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019 年7月4日，菌株名称为李斯特菌痘苗病毒01(VV01)。

本说明书所用的术语“核酸”，又称“寡核苷酸”或“多核苷酸”，指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也确定了互补链的序列。因此，核酸还包括所描述的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还包括基本上同一的核酸及其互补序列。

核酸可以是单链或双链的，或可包含双链和单链序列的部分。核酸可以是 DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可利用化学合成法或通过重组方法获得。

当参考多个特定的序列表时，所述参考应当被理解为还包括基本上对应于所述多个特定的序列表的互补序列的多个序列，包括：由于例如定序错误、克隆错误或导致碱基置换、碱基缺失或碱基增加的其他改变而导致的多个较小的序列变异，前提条件是所述多个变异的频率为小于五十分之一个核苷酸、小于一百分之一个核苷酸，替代地，小于二百分之一个核苷酸、小于五百分之一个核苷酸，替代地，在小于一千分之一个核苷酸，替代地，小于五千分之一个核苷酸，替代地，小于一万分之一个核苷酸中。

本说明书所用的术语“穿梭载体”可以包含编码一种或多种抗原的核酸。质粒还可以包含起始密码子，其可以位于编码序列的上游，以及终止密码子，其可以为与编码序列的下游。起始和终止密码子可以与编码序列在一个阅读框内。所述载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主复制的染色体外载体，或整合进宿主基因组的载体。

本说明书所用的术语“穿梭载体”可以包含可操作地连接到编码序列的启动子。可操作地连接到编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽类白血病病毒(ALV) 启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子还可以是组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子，天然或合成的。此类启动子的实例在美国专利申请公布US 20040175727中有所描述，将其内容以引用方式整体并入本文。

本申请的疫苗或组合物通常但不必须是(药物)制剂，所述制剂包括至少一种(药学上可接受的)稀释剂、运载体或佐剂。通常，药学上可接受的化合物(例如，稀释剂、运载体和佐剂)可参见例如《药典手册》(例如，美国、欧洲或国际药典)。本申请的疫苗或组合物常规上包含(预防或治疗上)有效量的一种或多种活性成分，其中，所述有效性与待预防或治疗的病症和疾病相关。具体而言，本申请的组合物是用于预防或治疗应用的疫苗。

本申请的疫苗或组合物可能需要作为包含多次给予所述疫苗或组合物的预防性或治疗性方案一部分给予需要的对象。所述多次给药通常依次进行，而两次给药之间的时间间隔可不同，且可根据所述活性成分的性质和待预防或治疗的病症性质予以调整。在单次给药中给予需要对象的活性成分量也可以不同，且将取决于例如所述对象的身体状况(例如，体重、年龄)、待预防或治疗的病症状况以及实施治疗的医生、医师或护士的经验等因素。

佐剂的示例包括矿物质盐类或凝胶类(例如：铝盐、磷酸铝凝胶或磷酸钙胶)、以乳剂、两性分子和界面活性剂为基础的制剂、微粒佐剂、病原体相关分子、人类内源性免疫调节佐剂、惰性载体或其组合中的一个。

本申请的多个实施例提供了用于递送包含重组痘苗病毒的疫苗，以诱导治疗性和预防性免疫应答。接种过程可在哺乳动物中产生抗免疫原免疫应答。可向个体递送疫苗以调节哺乳动物的免疫系统的活动以及增强免疫应答。疫苗的递送可以是转染新型冠状病毒的S基因的至少部分序列，所述编码序列在细胞中表达并递送到细胞表面或细胞外，在其上免疫系统加以识别并诱导细胞、体液或细胞和体液应答。疫苗的递送可用于通过向哺乳动物施用如上所述的疫苗来诱导或引发哺乳动物中针对免疫原的免疫应答。

在将疫苗递送进哺乳动物细胞后，转染的细胞将表达和分泌由通过疫苗注射的重组痘苗病毒所编码的S基因的至少部分序列，这些免疫原将被免疫系统识别为外来物并将产生针对它们的抗体，这些抗体将被免疫系统维持并能对后续感染产生有效的应答。

可向哺乳动物施用疫苗以引起哺乳动物的免疫应答。哺乳动物可以为人、灵长类动物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、胳马、羊盤、小鼠、大鼠和鸡。

本申请所用的术语“预防”是指避免一疾病、病症或病况在可能有所述疾病的风险，但尚未被诊断为患有所述疾病、病症或病况的一个体中发生。本领域技术人员将会理解，可以使用各种方法及分析来评估一病理学的发展。

本申请所用的术语“治疗”是指抑制、预防或阻止一病理(疾病、病症或病况)的发展和/或导致一病理的减少、缓解或压制。本领域技术人员将理解，可以使用各种方法及分析来取得一病理的所述发展，相似地，各种方法及分析可用于取得一病理的减少、缓解或压制。根据多个具体实施例，治疗包括增加存活。

本申请所用的术语“注入“指的是将治疗剂输送到或注入患者体内的任何机制。注入的示例性机制或技术包括但不限于：皮下注射、真皮注射、肌肉注射、局部注射等。

对于注射，所述药物组合物的所述活性成分可以配制在多种水溶液中(例如：WFI)中，优选地在多种生理上相容的缓冲液中，例如：汉克氏溶液(Hanks’ s solution)、林格溶液(Ringer’s solution)或生理缓冲盐水。

本申请所用的术语“皮内注射”或“皮下注射”包括表皮注射、真皮注射或肌肉内注射。

如果需要，本申请的疫苗或组合物可以存在于一包装或分配器装置中，例如：FDA/EMA(美国食品和药物管理局、欧洲药物管理局)批准的套组，所述套组可以包含一种或多种含有所述活性成分的单位剂量调剂。所述包装可以例如：包括金属或塑料箔，例如但不限于：一泡罩包装或一加压容器。包装或分配器装置可附有多个给药说明。所述包装或分配器还可以附有与所述容器相关联的一注意事项，所述注意事项是以由管理多个药品的制造、使用或销售的一政府机构所规定的一形式，所述注意事项反映由人类的多个组合物的形式或兽医管理的机构所发出的批准。例如：所述注意事项可以是例如由美国食品和药物管理局批准用于多个处方药的标签或一批准的产品说明书。如本说明书所详述，还可以制备本申请的多个实施例的一蛋白质结构，所述蛋白质结构包括在一相容的药物载体中，放置在一合适的容器中，并且被标记用于一指定的病症或诊断的治疗。

通常地，本说明书使用的命名法及本申请中使用的多个实验室步骤包括：分子、生物化学、微生物学及重组脱氧核糖核酸(DNA)技术，这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：“分子克隆：实验室手册”，Sambrook等人，(1989)；“分子生物学中的当前的操作流程”第1至3卷，Ausubel，R.M.，编辑(1994)； Ausubel等人，“分子生物学中的当前的操作流程”，John Wiley及其儿子，巴尔的摩，马里兰州(1989)；Perbal，“分子克隆的一实践指南”，JohnWiley 及其儿子，纽约(1988)；Watson等人，“重组脱氧核糖核酸”，科学美国图书，纽约；Birren等人(编辑)“基因组分析：实验室手册系列”，第1至4卷，冷泉港实验室出版社，纽约(1998)；“细胞生物学：实验室手册”，第1至3卷， Cellis，J.E.，编辑(1994)；由Freshney，Wiley-Liss所著的“动物细胞培养 -基础技术手册”，纽约(1994)，第三版；“免疫学中的现有方案”第1至3 卷，Coligan J.E.，编辑(1994)；Stites等人(编辑)，“基础与临床免疫学”(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell及Shiigi(编辑)，“细胞免疫学中的多个选择方法”，W.H.弗里曼公司，纽约(1980)；“寡核苷酸合成”Gait，M.J.，编辑(1984)；“核酸杂交”Hames，B.D.及Higgins S.J.，编辑(1985)；“转录与转译”Hames，B.D.及HigginsS.J.，编辑(1984)；“动物细胞培养”Freshney，R.I.，编辑(1986)；“固定化细胞及酶”IRL出版社，(1986)；“分子克隆的一实践指南”Perbal，B.，(1984)以及“酶学方法”第1至317卷，学术出版社；“聚合酶链式反应(PCR)操作流程：方法及应用指南”，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)；Marshak等人，“蛋白质纯化及表征策略-实验室课程手册”CSHL出版社(1996年)；所有的这些文献均通过引用并入本说明书，如同在本说明书中完全阐述一样。本说明书文档中提供了其他一般参考文献，当中的多个步骤被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的，其中包含的所有信息都通过引用并入本说明书。

本说明书所述的多个活性成分的毒性及治疗功效可通过在体外、细胞培养或多个实验动物中的标准药学方法来确认(参见下面的示例部分，以及Sekido 等，2002，《肿瘤遗传学与细胞遗传学》(Cancer Genet Cytogenet)137(1)： 33至42)。从这些在体外及细胞培养测定以及多个动物研究中获得的数据可用于配制用于人体的一系列的剂量。所述剂量可根据所采用的剂量以及所使用的给药途径而变化。确切的配方、给药途径以及剂量可以由个别的医生根据患者的病况来选择。(参见例如：Fingl等，1975，“治疗学的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)”，第1章第1页)。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上对本申请实施例所提供的一种重组痘苗病毒进行了详细介绍，本文中应用了具体示例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例的技术方案的范围。

序列表

<110> 深圳市华药康明生物药业有限责任公司

<120> 重组新冠疫苗、痘苗病毒载体疫苗及其应用

<130> SZ202044-CN

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5982

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<221> 人工序列(Artificial Sequence)

<222> (1)..(5982)

<223> 重组核酸序列

<400> 1

acgcgtgtcc tatcgtaggc gatagaaccg ctaaaaagcc tattgaattt ctacaaaaga 60

atctgttata tggtataggg agagtataaa acattaaatg tccgtactta ttaaagtatt 120

cagtagccaa tcctaactct ttcgaatact tattaatggc tcttgttctg tacgaatcta 180

tttttttgaa caacggacct agtggtatat cttgttctat gtatctaaaa taatgtctga 240

ctagatccgt tagtttaata tccgcagtca tcttgtctag aatggcaaat ctaactgcgg 300

gtttaggctt tagtttagtt tctatatcta catctatgtc tttatctaac accaaaaata 360

taatagctaa tattttatta caatcatccg gatattcttc tacgatctca ctaactaatg 420

tttctttggt tatactagta tagtcactat cggacaaata aagaaaatca gatgatcgat 480

gaataataca tttaaattca tcatctgtaa gatttttgag atgtctcatt agaatattat 540

tagggttagt actcattatc attcggcagc tattacttat tttattattt ttcaccatat 600

agatcaatca ttagatcatc aaaatatgtt tcaatcatcc taaagagaag ttcctatact 660

ttctagagaa taggaacttc aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt 720

taaattgaaa gcgagaaata atcataaata cccgagccac catggcctcc tccgagaacg 780

tcatcaccga gttcatgcgc ttcaaggtgc gcatggaggg caccgtgaac ggccacgagt 840

tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg ccacaacacc gtgaagctga 900

aggtgaccaa gggcggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtccccc cagttccagt 960

acggctccaa ggtgtacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacaag aagctgtcct 1020

tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc gtggcgaccg 1080

tgacccagga ctcctccctg caggacggct gcttcatcta caaggtgaag ttcatcggcg 1140

tgaacttccc ctccgacggc cccgtgatgc agaagaagac catgggctgg gaggcctcca 1200

ccgagcgcct gtacccccgc gacggcgtgc tgaagggcga gacccacaag gccctgaagc 1260

tgaaggacgg cggccactac ctggtggagt tcaagtccat ctacatggcc aagaagcccg 1320

tgcagctgcc cggctactac tacgtggacg ccaagctgga catcacctcc cacaacgagg 1380

actacaccat cgtggagcag tacgagcgca ccgagggccg ccaccacctg ttcctgtagg 1440

aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcaaaaatt gaaaataaat acaaaggttc 1500

ttgagggttg tgttaaattg aaagcgagaa ataatcataa ataactaaac gaacaatgtt 1560

tgtttttctt gttttattgc cactagtctc tagtcagtgt gttaatctta caaccagaac 1620

tcaattaccc cctgcataca ctaattcttt cacacgtggt gtttattacc ctgacaaagt 1680

tttcagatcc tcagttttac attcaactca ggacttgttc ttacctttct tttccaatgt 1740

tacttggttc catgctatac atgtctctgg gaccaatggt actaagaggt ttgataaccc 1800

tgtcctacca tttaatgatg gtgtttattt tgcttccact gagaagtcta acataataag 1860

aggctggatt tttggtacta ctttagattc gaagacccag tccctactta ttgttaataa 1920

cgctactaat gttgttatta aagtctgtga atttcaattt tgtaatgatc catttttggg 1980

tgtttattac cacaaaaaca acaaaagttg gatggaaagt gagttcagag tttattctag 2040

tgcgaataat tgcacttttg aatatgtctc tcagcctttt cttatggacc ttgaaggaaa 2100

acagggtaat ttcaaaaatc ttagggaatt tgtgtttaag aatattgatg gttattttaa 2160

aatatattct aagcacacgc ctattaattt agtgcgtgat ctccctcagg gtttttcggc 2220

tttagaacca ttggtagatt tgccaatagg tattaacatc actaggtttc aaactttact 2280

tgctttacat agaagttatt tgactcctgg tgattcttct tcaggttgga cagctggtgc 2340

tgcagcttat tatgtgggtt atcttcaacc taggactttt ctattaaaat ataatgaaaa 2400

tggaaccatt acagatgctg tagactgtgc acttgaccct ctctcagaaa caaagtgtac 2460

gttgaaatcc ttcactgtag aaaaaggaat ctatcaaact tctaacttta gagtccaacc 2520

aacagaatct attgttagat ttcctaatat tacaaacttg tgcccttttg gtgaagtttt 2580

taacgccacc agatttgcat ctgtttatgc ttggaacagg aagagaatca gcaactgtgt 2640

tgctgattat tctgtcctat ataattccgc atcattttcc acttttaagt gttatggagt 2700

gtctcctact aaattaaatg atctctgctt tactaatgtc tatgcagatt catttgtaat 2760

tagaggtgat gaagtcagac aaatcgctcc agggcaaact ggaaagattg ctgattataa 2820

ttataaatta ccagatgatt ttacaggctg cgttatagct tggaattcta acaatcttga 2880

ttctaaggtt ggtggtaatt ataattacct gtatagattg tttaggaagt ctaatctcaa 2940

accttttgag agagatattt caactgaaat ctatcaggcc ggtagcacac cttgtaatgg 3000

tgttgaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat ggtttccaac ccactaatgg 3060

tgttggttac caaccataca gagtagtagt actttctttt gaacttctac atgcaccagc 3120

aactgtttgt ggacctaaaa agtctactaa tttggttaaa aacaaatgtg tcaatttcaa 3180

cttcaatggt ttaacaggca caggtgttct tactgagtct aacaaaaagt ttctgccttt 3240

ccaacaattt ggcagagaca ttgctgacac tactgatgct gtccgtgatc cacagacact 3300

tgagattctt gacattacac catgttcttt tggtggtgtc agtgttataa caccaggaac 3360

aaatacttct aaccaggttg ctgttcttta tcaggatgtt aactgcacag aagtccctgt 3420

tgctattcat gcagatcaac ttactcctac ttggcgtgtt tattctacag gttctaatgt 3480

ttttcaaaca cgtgcaggct gtttaatagg ggctgaacat gtcaacaact catatgagtg 3540

tgacataccc attggtgcag gtatatgcgc tagttatcag actcagacta attctcctcg 3600

gcgggcacgt agtgtagcta gtcaatccat cattgcctac actatgtcac ttggtgcaga 3660

aaattcagtt gcttactcta ataactctat tgccataccc acaaatttta ctattagtgt 3720

taccacagaa attctaccag tgtctatgac caagacatca gtagattgta caatgtacat 3780

ttgtggtgat tcaactgaat gcagcaatct tttgttgcaa tatggcagtt tttgtacaca 3840

attaaaccgt gctttaactg gaatagctgt tgaacaagac aaaaacaccc aagaagtttt 3900

tgcacaagtc aaacaaattt acaaaacacc accaattaaa gattttggtg gttttaattt 3960

ttcacaaata ttaccagatc catcaaaacc aagcaagagg tcatttattg aagatctact 4020

tttcaacaaa gtgacacttg cagatgctgg cttcatcaaa caatatggtg attgccttgg 4080

tgatattgct gctagagacc tcatttgtgc acaaaagttt aacggcctta ctgttttgcc 4140

acctttgctc acagatgaaa tgattgctca atacacttct gcactgttag cgggtacaat 4200

cacttctggt tggacctttg gtgcaggtgc tgcattacaa ataccatttg ctatgcaaat 4260

ggcttatagg tttaatggta ttggagttac acagaatgtt ctctatgaga accaaaaatt 4320

gattgccaac caatttaata gtgctattgg caaaattcaa gactcacttt cttccacagc 4380

aagtgcactt ggaaaacttc aagatgtggt caaccaaaat gcacaagctt taaacacgct 4440

tgttaaacaa cttagctcca attttggtgc aatttcaagt gttttaaatg atatcctttc 4500

acgtcttgac aaagttgagg ctgaagtgca aattgatagg ttgatcacag gcagacttca 4560

aagtttgcag acatatgtga ctcaacaatt aattagagct gcagaaatca gagcttctgc 4620

taatcttgct gctactaaaa tgtcagagtg tgtacttgga caatcaaaaa gagttgattt 4680

ttgtggaaag ggctatcatc ttatgtcctt ccctcagtca gcacctcatg gtgtagtctt 4740

cttgcatgtg acttatgtcc ctgcacaaga aaagaacttc acaactgctc ctgccatttg 4800

tcatgatgga aaagcacact ttcctcgtga aggtgtcttt gtttcaaatg gcacacactg 4860

gtttgtaaca caaaggaatt tttatgaacc acaaatcatt actacagaca acacatttgt 4920

gtctggtaac tgtgatgttg taataggaat tgtcaacaac acagtttatg atcctttgca 4980

acctgaatta gactcattca aggaggagtt agataaatat tttaagaatc atacatcacc 5040

agatgttgat ttaggtgaca tctctggcat taatgcttca gttgtaaaca ttcaaaaaga 5100

aattgaccgc ctcaatgagg ttgccaagaa tttaaatgaa tctctcatcg atctccaaga 5160

acttggaaag tatgagcagt atataaaatg gccatggtac atttggctag gttttatagc 5220

tggcttgatt gccatagtaa tggtgacaat tatgctttgc tgtatgacca gttgctgtag 5280

ttgtctcaag ggctgttgtt cttgtggatc ctgctgcaaa tttgatgaag acgactctga 5340

gccagtgctc aaaggagtca aattacatta cacataaatc taataagtag agtcctcatg 5400

cttagttaac aactattttt tatgttaaat caattagtac accgctatgt ttaatactta 5460

ttcatatttt agtttttagg attgagaatc aatacaaaaa attaatgcat cattaatttt 5520

agaaatactt agtttccacg tagtcaatga aacatttgaa ctcatcgtac aggacgttct 5580

cgtacaggac gtaactataa accggtttat atttgttcaa gatagataca aatccgataa 5640

ctttttttac gaattctacg ggatccactt taaaagtgtc ataccgggtt ctttttattt 5700

ttttaaacag atcaatggtg tgatgttgat taggtctttt acgaatttga tatagaatag 5760

cgtttacata ttctccataa tggtcaatcg ccatttgttc gtatgtcata aattctttaa 5820

ttatatgaca ctgtgtattg tttagttcat ccttgttcat tgttaggaat ctatccaaaa 5880

tggcaattat actagaacta taggtgcgtt gtatacacat attgatgtgt ctgtttatac 5940

aatccatgat atttggatcc atgctactac cttcggacgc gt 5982

<210> 2

<211> 3822

<212> DNA

<213> Betacoronavirus Severe acute respiratory syndrome–relatedcoronavirus

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3822)

<223> 新型冠状病毒的S基因

<400> 2

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Vaccinia virus

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(18)

<223> L025正向引物

<400> 3

tatctagcaa tggaccgt 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Vaccinia virus

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(19)

<223> L025反向引物

<400> 4

ccgaaggtag tagcatgga 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Betacoronavirus Severe acute respiratory syndrome–relatedcoronavirus

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(20)

<223> s基因正向引物

<400> 5

gctccagggc aaactggaaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Betacoronavirus Severe acute respiratory syndrome–relatedcoronavirus

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(20)

<223> S基因反向引物

<400> 6

gtctgtggat cacggacagc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(18)

<223> 对照组(L09)正向引物

<400> 7

tgttgttcgc tgctatga 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(20)

<223> 对照组(L09)反向引物

<400> 8

tggcacaacc atatcttgta 20

Claims (18)

1.一种重组痘苗病毒，其特征在于：所述重组痘苗病毒的基因组包括：

胸苷激酶(TK)基因和L025基因的联合缺陷；及

重组核酸序列，所述重组核酸序列编码新型冠状病毒的S基因中的第一核酸序列，所述第一核酸序列插入所述重组痘苗病毒的所述基因组中。

2.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述重组核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述第一核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述第一核酸序列为所述新型冠状病毒的S基因的S1区域中的受体结合区域(RBD)。

5.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述重组核酸序列为所述新型冠状病毒的第一核酸序列和所述重组痘苗病毒的部分B5R基因的融合基因。

6.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述第一核酸序列插入所述重组痘苗病毒的L025基因中。

7.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述重组痘苗病毒的胸苷激酶(TK)基因具有突变或缺失。

8.一种将如权利要求1所述的重组痘苗病毒在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒引发疾病的药物中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其特征在于：所述药物为疫苗。

10.权利要求8所述的应用，其特征在于：所述新型冠状病毒引发疾病为新型冠状病毒肺炎。

11.一种痘苗病毒载体疫苗，其特征在于：所述痘苗病毒载体疫苗包括：如权利要求1的所述的重组痘苗病毒；以及药物学上可接受的载体或佐剂。

12.如权利要求11所述的痘苗病毒载体疫苗，其特征在于：所述重组痘苗病毒为活体，所述重组痘苗病毒在被施用的对象的细胞中具有复制能力。

13.如权利要求11所述的痘苗病毒载体疫苗，其特征在于：所述痘苗病毒载体疫苗是用于皮下注射或皮内注射。

14.一种编码具有新型冠状病毒S蛋白的重组核酸序列，其特征在于：所述重组核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

15.一种编码具有新型冠状病毒S蛋白的重组病毒载体，其特征在于：所述重组病毒载体包括如SEQ ID NO:1所示的序列。

16.一种用于制备重组痘苗病毒的方法，其特征在于：所述方法包括以下多个步骤：

将如权利要求14所述的重组核酸序列引入痘苗病毒的基因组的目标基因的左臂及右臂之间，得到重组穿梭载体；

将所述重组穿梭载体转染入第一宿主细胞；

将所述重组核酸序列插入痘苗病毒的基因组的所述目标基因中，形成所述重组痘苗病毒；及

从所述第一宿主细胞回收所述重组痘苗病毒。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于：所述方法包括：以所述的重组痘苗病毒感染第二宿主细胞，从所述第二宿主细胞回收所述重组痘苗病毒。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述第一宿主细胞为CV-1细胞；及所述第二宿主细胞为HEK293细胞。

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