CN112266411A - 一种新型冠状病毒疫苗及其应用 - Google Patents

一种新型冠状病毒疫苗及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112266411A
CN112266411A CN202011025055.XA CN202011025055A CN112266411A CN 112266411 A CN112266411 A CN 112266411A CN 202011025055 A CN202011025055 A CN 202011025055A CN 112266411 A CN112266411 A CN 112266411A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
thr
ser
val
asn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011025055.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112266411B (zh
Inventor
梁明征
马杉姗
汤晓闯
聂李亚
马素永
韩成权
许松山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Northland Biotech Co Ltd
Original Assignee
Beijing Northland Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Northland Biotech Co Ltd filed Critical Beijing Northland Biotech Co Ltd
Priority to CN202011025055.XA priority Critical patent/CN112266411B/zh
Publication of CN112266411A publication Critical patent/CN112266411A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112266411B publication Critical patent/CN112266411B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本申请涉及一种新型冠状病毒疫苗及其应用，具体涉及截短的Spike蛋白，包含所述截短的Spike蛋白的融合蛋白，包含编码所述截短的Spike蛋白或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，以及包含所述核酸分子的载体和宿主细胞。此外，本申请还涉及包含所述截短的Spike蛋白、融合蛋白、核酸分子或载体的药物组合物。

Description

一种新型冠状病毒疫苗及其应用
技术领域
本申请涉及基因工程和分子生物学领域，具体涉及截短的2019 新型冠状病毒Spike蛋白，包含所述截短的Spike蛋白的融合蛋白， 包含编码所述截短的Spike蛋白或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分 子，以及包含所述核酸分子的载体和宿主细胞。此外，本申请还涉及 包含所述截短的Spike蛋白、融合蛋白、核酸分子或载体的药物组合 物。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由2019新型冠状病毒感染导致 的肺炎，随着疫情的蔓延，已在全球多地出现大量病例，对人民的生命 及健康构成了较大的威胁，对社会造成严重的影响。
针对新冠病毒肺炎，尚没有特效的治疗药品，因此疫苗开发就成为 了关注焦点，全球共有115个COVID-19候选疫苗正在研发中(The COVID-19vaccine developmentlandscape.Nature Reviews.Drug Discovery.2020,19:305-306.)，主要有重组蛋白疫苗、mRNA疫苗、 DNA疫苗、非复制型病毒载体疫苗、复制性病毒载体疫苗、多肽疫 苗、病毒样颗粒疫苗、减毒疫苗和灭活疫苗。
在众多的疫苗研发中，新冠病毒表面刺突蛋白抗原(S抗原)DNA 疫苗以其安全性高、生产工艺简单等特点，具有一定的开发前景。但也 存在以下缺点：
DNA疫苗对细胞的转染率较低，表现在体内外的表达效率偏低， 不借助外力，一般裸质粒就需要采用高剂量进行治疗(人体使用一般超 过4mg)。由此，导致临床需要的较高的剂量，一方面导致生产成本 高，病人用药费用高，负担重；另一方面高剂量用药引入的杂质更多， 可能会导致毒副作用的增大，从而增加了临床风险。
因此，为了提高临床治疗效果，减少用量，需要开发可进一步提高 新冠病毒S抗原表达量、降低临床使用剂量的新冠DNA疫苗。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词 具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发 明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“2019新型冠状病毒”、“新型冠状 病毒”“2019-nCov”和“SARS-CoV-2”为“严重急性呼吸综合征 冠状病毒2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)”的 简称，其属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。新型 冠状病毒的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如 GenBank：MN908947。新型冠状病毒至少含有三种膜蛋白，包括表 面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。新型冠状病毒的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域 (Receptor bindingdomain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移 酶2(ACE2)特异性结合后，病毒进行膜融合和入胞，S蛋白在病 毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。
如本文中所使用的，术语“表面刺突蛋白”、“Spike蛋白”和 “S蛋白”是指SARS-CoV-2的一种膜蛋白，它们具有相同的含义， 可互换使用。在新型冠状病毒的相关研究及疫苗治疗中，S蛋白可作 为抗原，在本文中也简称为“S抗原”。
如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID- 19”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含 义，可互换使用。
如本文中所使用的，术语“SARS-CoV”或“SARS-CoV-1”为 “严重急性呼吸综合征冠状病毒1(severe acute respiratory syndrome coronavirus 1)”的简称，其属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-1的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参 见例如GenBank：AAP13567.1。由SARS-CoV-1所导致的肺炎被称为 SARS。
如本文中所使用的，术语“野生的”或“天然的”可互换地使用。 当这些术语用于描述核酸分子、多肽或蛋白时，其表示该核酸分子、多 肽或蛋白在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何修饰 或加工。如本文中所使用的，野生的SARS-CoV-2的Spike蛋白是指天 然存在的，具有生物学活性的Spike蛋白。本领域技术人员可以方便地 从各种公共数据库(例如GenBank数据库)获得Spike蛋白的氨基酸 序列。例如，野生的SARS-CoV-2的Spike蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID NO：1所示。
如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中 的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达 时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细 胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技 术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色 体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人 工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用 作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病 毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表 达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、 选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细 胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞 或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如 纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细 胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿 主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。一种载体可以被引入到宿主 细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、 融合蛋白、分离的核酸分子等。
在第一方面，本申请提供了一种截短的Spike蛋白，其与野生的新 型冠状病毒的Spike蛋白相比，C末端截短了67个氨基酸。
在某些实施方案中，所述新型冠状病毒的Spike蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID NO:1所示。
在某些实施方案中，所述截短的Spike蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在第二方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含如上所述的截短 的Spike蛋白以及另外的多肽。在本申请中，所述融合蛋白不是天然存 在的蛋白或其片段。在某些实施方案中，所述另外的多肽相对于所述截 短的Spike蛋白是异源的。
在某些实施方案中，所述另外的多肽任选地通过接头连接至所述截 短的Spike蛋白的N端或C端。这类接头是本领域熟知的，其实例包 括但不限于，包含一个或多个(例如，1个，2个，3个，4个或5个) 氨基酸(如，Gly或Ser)的肽接头。在某些实施方案中，所述肽接头是柔性的。在某些实施方案中，柔性的肽接头可能是有利的，其能够连 接两种蛋白/多肽成分，并且保持其各自的活性和功能。此类肽接头包 括但不限于，(GGGGS)3。
在某些实施方案中，所述另外的多肽选自标签、信号肽或导肽、可 检测的标记(例如，荧光素酶(fluc)、绿色荧光蛋白(GFP))，或 其任何组合。在某些实施方案中，可以将本申请的截短的Spike蛋白与 标签序列连接，以便于本申请的截短的Spike蛋白的表达、检测和/或纯 化。在某些实施方案中，可以将本申请的截短的Spike蛋白与信号肽或 导肽序列连接，以引导本申请的截短的Spike蛋白的分泌。在某些实施 方案中，可以将本申请的截短的Spike蛋白与可检测的标记序列连接， 以便于对本申请的截短的Spike蛋白进行检测或示踪。
在某些实施方案中，所述信号肽选自Spike蛋白的天然信号肽、 HGF(肝细胞生长因子)的天然信号肽和IgE(免疫球蛋白E)的天然 信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽具有选自下列的氨基酸序列： SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，和SEQ ID NO:12。
本领域技术人员可以理解，本文意在涵盖的信号肽包括但不限于上 述列举的信号肽，本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，蛋白 的分泌或引导)选择合适的信号肽。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列： SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。
在第三方面，本申请提供了一种核酸分子，其包含编码如前所述的 截短的Spike蛋白或者如前所述的融合蛋白的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述编码截短的Spike蛋白或融合蛋白的核苷 酸序列是根据宿主细胞(例如，人细胞)的密码子偏好性进行了密码子 优化的或是未进行优化的。
在某些实施方案中，所述核酸分子具有选自下列的核苷酸序列： SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，和SEQ ID NO:9。
在第四方面，本申请提供了一种载体，其包含如前所述的核酸分 子。
在某些实施方案中，所述载体选自质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工 染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源 的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体；以及，病毒载 体，例如逆转录酶病毒载体(例如慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病 毒载体、疱疹病毒载体(如单纯疱疹病毒载体)、痘病毒载体、杆状病毒 载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体。
在某些实施方案中，所述载体用于表达(例如在受试者(例如哺乳 动物，例如人)体内表达)所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白。
在某些实施方案中，所述载体是用于基因治疗的载体，例如质粒， 腺病毒载体，腺相关病毒载体，和慢病毒载体。
在第五方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含根据如前所述的 核酸分子或根据如前所述的载体。
在某些实施方案中，所述宿主细胞选自原核细胞例如大肠杆菌细 胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞。
在某些实施方案中，所述动物细胞为哺乳动物的细胞，例如小鼠细 胞、人细胞等。
在某些实施方案中，所述哺乳动物的细胞为人的细胞，例如，造血 细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞。
在某些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌 DH5α细胞；或者所述宿主细胞是人细胞(例如，293T细胞)。
在第六方面，本申请提供了一种表达或产生如前所述的截短的 Spike蛋白或者如前所述的融合蛋白的方法，所述方法包括，使用根据 如前所述的核酸分子或根据如前所述的载体或根据如前所述的宿主细 胞。
在某些实施方案中，所述方法包括，在允许蛋白表达的条件下，在 宿主细胞中表达根据如前所述的核酸分子或根据如前所述的载体；以及 任选地，回收宿主细胞中表达的截短的Spike蛋白或者融合蛋白。
在第七方面，本申请提供了根据如前所述的核酸分子或根据如前所 述的载体或根据如前所述的宿主细胞用于表达或产生所述截短的Spike 蛋白或者融合蛋白的用途。在某些优选的实施方案中，所述的核酸分子 或载体用于在体外表达或产生所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白。在 某些优选的实施方案中，所述的核酸分子或载体用于在细胞内表达或产 生所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白。在某些优选的实施方案中，所 述的核酸分子或载体用于在体外、在细胞内表达或产生所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白。在某些优选的实施方案中，所述的核酸分子 或载体用于在体内表达或产生所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白。在 某些优选的实施方案中，所述的核酸分子或载体用于在患者(例如哺乳 动物，例如人)体内表达或产生所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白。
在第八方面，本申请提供了一种药物组合物，其含有根据如前所述 的截短的Spike蛋白或者根据如前所述的融合蛋白或根据如前所述的核 酸分子或根据如前所述的载体，以及任选地，药学上可接受的载体和/ 或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物通过注射进行施用。
在某些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些实施方案中，所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白或核酸分 子或载体以有效量(例如预防或治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病 毒感染相关的疾病的有效量)存在。
在某些实施方案中，所述的药物组合物以单位剂量形式存在。
在某些实施方案中，所述药物组合物为疫苗。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含佐剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物为蛋白疫苗，其含有如前所述 的截短的Spike蛋白或者如前所述的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述药物组合物为核酸疫苗，其含有如前所述 的核酸分子或如前所述的载体。
在某些实施方案中，所述核酸疫苗为DNA疫苗。
在第九方面，本申请提供了一种制备如前所述的药物组合物的方 法，所述方法包括将如前所述的截短的Spike蛋白或者如前所述的融合 蛋白或如前所述的核酸分子或如前所述的载体与佐剂混合。
在第十方面，本申请提供了根据如前所述的截短的Spike蛋白或者 根据如前所述的融合蛋白或根据如前所述的核酸分子或根据如前所述的 载体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在受试者中预防 或治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病。
在某些实施方案中，所述疾病为新型冠状病毒肺炎。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在某些实施方案中，所述药物组合物通过注射来进行施用。
在某些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含有效量(例如预防或治疗 新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病的有效量)的所述 截短的Spike蛋白或者融合蛋白或核酸分子或载体。
在某些实施方案中，所述的药物组合物以单位剂量形式存在。
在某些实施方案中，所述药物组合物为疫苗。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含佐剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物为蛋白疫苗，其含有如前所述 的截短的Spike蛋白或者如前所述的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述药物组合物为核酸疫苗，其含有如前所述 的核酸分子或如前所述的载体。
在某些实施方案中，所述核酸疫苗为DNA疫苗。
在第十一方面，本申请提供了一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含 有如前所述的截短的Spike蛋白或含有如前所述的融合蛋白；或者，所 述类病毒颗粒由如前所述的Spike蛋白或如前所述的融合蛋白组成。
在第十二方面，本申请提供了一种在受试者中预防或治疗新型冠状 病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病的方法，其包括，给有此需 要的受试者施用有效量的根据如前所述的截短的Spike蛋白或者根据如 前所述的融合蛋白或根据如前所述的核酸分子或根据如前所述的载体或 根据如前所述的药物组合物。
在某些实施方案中，所述疾病为新型冠状病毒肺炎。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在某些实施方案中，通过注射来给受试者施用所述截短的Spike蛋 白或融合蛋白或核酸分子或载体或药物组合物。
发明的有益效果
本申请的截短的Spike蛋白与天然Spike蛋白相比，其在细胞内的 表达水平有了显著提升(提升了4倍以上)。进一步，将含有编码截短 的Spike蛋白的核苷酸序列的载体施用于受试者后，可在体内诱导显著 提高的针对S抗原的总抗体和中和抗体的滴度(提升了约5倍)。因 此，本申请的截短的Spike蛋白以及编码其的核酸分子是特别有利的， 可用作高效的抗病毒疫苗。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域 技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范 围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有 利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列信息
Figure RE-GDA0002853076940000011
Figure BDA0002701894760000101
Figure BDA0002701894760000111
Figure BDA0002701894760000121
Figure BDA0002701894760000131
Figure BDA0002701894760000141
Figure BDA0002701894760000151
Figure BDA0002701894760000161
Figure BDA0002701894760000171
Figure BDA0002701894760000181
Figure BDA0002701894760000191
Figure BDA0002701894760000201
Figure BDA0002701894760000211
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来 描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考 文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发 明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细 胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克 (Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克 隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏 贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、 B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及 《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼 (R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议 的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获 得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明， 且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其 他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.重组质粒的构建
本实施例所应用的Spike蛋白的序列参见GenBank登录号 NC_045512.2，其中，第1-12位氨基酸为天然Spike蛋白的信号肽的序 列(SEQ ID NO:10)，其余氨基酸序列为天然Spike蛋白的氨基酸序 列(如SEQ ID NO:1所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所 示)。去除天然Spike蛋白末端67个氨基酸，获得截短的Spike蛋白 (其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)。
根据人细胞的密码子偏好性，对编码天然Spike蛋白和截短的 Spike蛋白的核苷酸序列进行优化，获得了如SEQ ID NO:4和5所示 的核苷酸序列。
接着，在SEQ ID NO:4和5所示的核苷酸序列的5’端分别连接编 码HGF信号肽(SEQID NO:11)的核苷酸序列(96个核苷酸)，获 得了如SEQ ID NO:6和7所示的核苷酸序列。
在SEQ ID NO:4和5所示的核苷酸序列的5’端分别连接编码IgE 信号肽(SEQ IDNO:12)的核苷酸序列，得到如SEQ ID NO:8和9 所示的核苷酸序列。
将如上所述的序列SEQ ID NO:6-9分别构建至pSN载体(具体信 息及序列参见专利CN108611367B)中，获得重组质粒pSN-XGS-H-0、 pSN-XGS-H-1、pSN-XGS-I-0和pSN-XGS-I-1，具体序列信息如表1-3 所示。
表2.序列信息
SEQ ID NO: 序列信息
1 Spike蛋白的氨基酸序列
2 编码Spike蛋白的核苷酸序列
3 截短的Spike蛋白的氨基酸序列
4 经密码子优化的编码Spike蛋白的核苷酸序列
5 经密码子优化的、编码截短的Spike蛋白的核苷酸序列
6 含有编码HGF信号肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:4的核苷酸序列
7 含有编码HGF信号肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:5的核苷酸序列
8 含有编码IgE信号肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:4的核苷酸序列
9 含有编码IgE信号肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:5的核苷酸序列
表3.重组质粒的序列信息
重组质粒名称 携带的核苷酸序列
pSN-XGS-H-0 SEQ ID NO:6
pSN-XGS-I-0 SEQ ID NO:8
pSN-XGS-H-1 SEQ ID NO:7
pSN-XGS-I-1 SEQ ID NO:9
实施例2.重组质粒的生产与检测
本实施例进行的是常规的工程菌的构建筛选、发酵以及质粒纯化。 简言之，将含有序列SEQ ID NO:6-9的重组质粒分别转化到宿主菌 DH5α中，获得稳定的质粒产量高的菌株，作为工程菌进行保存。将工 程菌进行发酵，得到的菌液离心后收取菌泥，并按照常规质粒纯化方法 进行纯化。经电泳检测，得到的四种质粒的纯度均大于95％，超螺旋的 含量大于90％，OD260与OD280的比值大于1.8，说明质粒的质量达 到了要求。具体检测结果如下表所示。
表4.质粒的检测结果
Figure BDA0002701894760000231
Figure BDA0002701894760000241
实施例3.Spike蛋白表达量检测
1.重组质粒转染HEK293T细胞
(1)细胞准备：取待转染的HEK293T细胞，接种于24孔细胞培 养板中，500μl/孔，放入37℃、5％CO2培养箱中过夜培养，使其在转 染日细胞汇合率为90～95％。
(2)质粒转染：对于每孔细胞，使用50μL DMEM无血清培养基 稀释2μLLipofectamine 2000；对于每孔细胞，使用50μl DMEM无血 清培养基稀释质粒，分别加入上述4种重组质粒各0.8μg；室温孵育 5min后，将稀释后的DNA和稀释后的Lipofectamine2000轻轻混匀。 并在室温保温20min。实验组为：培养基+质粒+转染试剂；阴性对照组 为：培养基+转染试剂；以上实验组和对照组分别按照100μL/孔加入准 备转染的细胞中。放入37℃、5％的CO2中培养48h，收集转染上清。
2.表达量测定
采用2019新冠病毒S抗原检测试剂盒(义翘神州)进行定量检 测，按照试剂盒说明书操作，最后在酶标仪450nm处测吸光值，计算 Spike蛋白的含量并进行分析。测定结果见表5。
表5. 4种质粒Spike蛋白表达量测定结果
Figure BDA0002701894760000242
从表中可以看出，不同信号肽对于蛋白表达量的影响差异较小，进 一步的，当信号肽相同时，截短的Spike蛋白表达量为天然Spike蛋白 的4倍以上。
3.体内针对S抗原总抗体和中和抗体含量的测定
6周龄的Balb/c小鼠50只，20-25g，分为5组，第1组为阴性对 照组，pSN空质粒组，第2、3、4、5组分别对应重组质粒SEQ ID NO: 7-10给药组。小鼠于第0天肌肉注射质粒剂量为100ug/0.1mL，总共注 射1次，2周后采血，进行系列稀释，采用新冠S抗原的抗体试剂盒(义翘神州)和中和抗体试剂盒(金斯瑞)，分别按照试剂盒说明书操 作，测定S抗原总抗体及中和抗体平均滴度，结果见表6。
表6.抗体的滴度
质粒名称 总抗体平均滴度 中和抗体平均滴度
pSN-XGS-H-0 2052 212
pSN-XGS-I-0 2325 208
pSN-XGS-H-1 10876 1124
pSN-XGS-I-1 11325 1031
从表中可以看出，不同信号肽对于抗体滴度的影响差异较小，但进 一步的，当信号肽相同时，含有编码截短的Spike蛋白核苷酸序列的质 粒诱导的针对S抗原的总抗体和中和抗体的滴度显著高于含有编码天然 的Spike蛋白核苷酸序列的质粒。
综合上述试验结果，截短的Spike蛋白与天然Spike蛋白相比，体 外抗原表达及体内总抗体和中和抗体表达均获得了出人意料地提高，预 期可大大降低用药剂量，提高DNA疫苗的成药性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人 员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变 动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所 附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京诺思兰德生物技术股份有限公司
<120> 一种新型冠状病毒疫苗及其应用
<130> IDC200356
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1261
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Spike蛋白的氨基酸序列
<400> 1
Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg
20 25 30
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser
35 40 45
Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr
50 55 60
Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe
65 70 75 80
Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr
100 105 110
Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
115 120 125
Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu
130 135 140
Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
145 150 155 160
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn
165 170 175
Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
180 185 190
Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe
195 200 205
Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
210 215 220
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
245 250 255
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
260 265 270
Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys
275 280 285
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
290 295 300
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
305 310 315 320
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
325 330 335
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
340 345 350
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
355 360 365
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
370 375 380
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
385 390 395 400
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
405 410 415
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
420 425 430
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
435 440 445
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
450 455 460
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
485 490 495
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
500 505 510
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
515 520 525
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
530 535 540
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
545 550 555 560
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
565 570 575
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
580 585 590
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val
595 600 605
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
610 615 620
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
625 630 635 640
Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
645 650 655
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala
660 665 670
Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly
675 680 685
Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr
690 695 700
Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr
705 710 715 720
Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu
725 730 735
Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
740 745 750
Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu
755 760 765
Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp
770 775 780
Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro
785 790 795 800
Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu
805 810 815
Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile
820 825 830
Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val
835 840 845
Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala
850 855 860
Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala
865 870 875 880
Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly
885 890 895
Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala
900 905 910
Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser
915 920 925
Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala
930 935 940
Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala
945 950 955 960
Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu
965 970 975
Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
980 985 990
Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala
995 1000 1005
Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly
1010 1015 1020
Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met
1025 1030 1035
Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val
1040 1045 1050
Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala
1055 1060 1065
Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe
1070 1075 1080
Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr
1085 1090 1095
Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn
1100 1105 1110
Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro
1115 1120 1125
Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr
1130 1135 1140
Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser
1145 1150 1155
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg
1160 1165 1170
Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1175 1180 1185
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr
1190 1195 1200
Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val
1205 1210 1215
Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys
1220 1225 1230
Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp
1235 1240 1245
Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1250 1255 1260
<210> 2
<211> 3786
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Spike蛋白的核苷酸序列
<400> 2
agtcagtgtg ttaatcttac aaccagaact caattacccc ctgcatacac taattctttc 60
acacgtggtg tttattaccc tgacaaagtt ttcagatcct cagttttaca ttcaactcag 120
gacttgttct tacctttctt ttccaatgtt acttggttcc atgctataca tgtctctggg 180
accaatggta ctaagaggtt tgataaccct gtcctaccat ttaatgatgg tgtttatttt 240
gcttccactg agaagtctaa cataataaga ggctggattt ttggtactac tttagattcg 300
aagacccagt ccctacttat tgttaataac gctactaatg ttgttattaa agtctgtgaa 360
tttcaatttt gtaatgatcc atttttgggt gtttattacc acaaaaacaa caaaagttgg 420
atggaaagtg agttcagagt ttattctagt gcgaataatt gcacttttga atatgtctct 480
cagccttttc ttatggacct tgaaggaaaa cagggtaatt tcaaaaatct tagggaattt 540
gtgtttaaga atattgatgg ttattttaaa atatattcta agcacacgcc tattaattta 600
gtgcgtgatc tccctcaggg tttttcggct ttagaaccat tggtagattt gccaataggt 660
attaacatca ctaggtttca aactttactt gctttacata gaagttattt gactcctggt 720
gattcttctt caggttggac agctggtgct gcagcttatt atgtgggtta tcttcaacct 780
aggacttttc tattaaaata taatgaaaat ggaaccatta cagatgctgt agactgtgca 840
cttgaccctc tctcagaaac aaagtgtacg ttgaaatcct tcactgtaga aaaaggaatc 900
tatcaaactt ctaactttag agtccaacca acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt 960
acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct 1020
tggaacagga agagaatcag caactgtgtt gctgattatt ctgtcctata taattccgca 1080
tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg tctcctacta aattaaatga tctctgcttt 1140
actaatgtct atgcagattc atttgtaatt agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca 1200
gggcaaactg gaaagattgc tgattataat tataaattac cagatgattt tacaggctgc 1260
gttatagctt ggaattctaa caatcttgat tctaaggttg gtggtaatta taattacctg 1320
tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc 1380
tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt gttgaaggtt ttaattgtta ctttccttta 1440
caatcatatg gtttccaacc cactaatggt gttggttacc aaccatacag agtagtagta 1500
ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat 1560
ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcaac ttcaatggtt taacaggcac aggtgttctt 1620
actgagtcta acaaaaagtt tctgcctttc caacaatttg gcagagacat tgctgacact 1680
actgatgctg tccgtgatcc acagacactt gagattcttg acattacacc atgttctttt 1740
ggtggtgtca gtgttataac accaggaaca aatacttcta accaggttgc tgttctttat 1800
caggatgtta actgcacaga agtccctgtt gctattcatg cagatcaact tactcctact 1860
tggcgtgttt attctacagg ttctaatgtt tttcaaacac gtgcaggctg tttaataggg 1920
gctgaacatg tcaacaactc atatgagtgt gacataccca ttggtgcagg tatatgcgct 1980
agttatcaga ctcagactaa ttctcctcgg cgggcacgta gtgtagctag tcaatccatc 2040
attgcctaca ctatgtcact tggtgcagaa aattcagttg cttactctaa taactctatt 2100
gccataccca caaattttac tattagtgtt accacagaaa ttctaccagt gtctatgacc 2160
aagacatcag tagattgtac aatgtacatt tgtggtgatt caactgaatg cagcaatctt 2220
ttgttgcaat atggcagttt ttgtacacaa ttaaaccgtg ctttaactgg aatagctgtt 2280
gaacaagaca aaaacaccca agaagttttt gcacaagtca aacaaattta caaaacacca 2340
ccaattaaag attttggtgg ttttaatttt tcacaaatat taccagatcc atcaaaacca 2400
agcaagaggt catttattga agatctactt ttcaacaaag tgacacttgc agatgctggc 2460
ttcatcaaac aatatggtga ttgccttggt gatattgctg ctagagacct catttgtgca 2520
caaaagttta acggccttac tgttttgcca cctttgctca cagatgaaat gattgctcaa 2580
tacacttctg cactgttagc gggtacaatc acttctggtt ggacctttgg tgcaggtgct 2640
gcattacaaa taccatttgc tatgcaaatg gcttataggt ttaatggtat tggagttaca 2700
cagaatgttc tctatgagaa ccaaaaattg attgccaacc aatttaatag tgctattggc 2760
aaaattcaag actcactttc ttccacagca agtgcacttg gaaaacttca agatgtggtc 2820
aaccaaaatg cacaagcttt aaacacgctt gttaaacaac ttagctccaa ttttggtgca 2880
atttcaagtg ttttaaatga tatcctttca cgtcttgaca aagttgaggc tgaagtgcaa 2940
attgataggt tgatcacagg cagacttcaa agtttgcaga catatgtgac tcaacaatta 3000
attagagctg cagaaatcag agcttctgct aatcttgctg ctactaaaat gtcagagtgt 3060
gtacttggac aatcaaaaag agttgatttt tgtggaaagg gctatcatct tatgtccttc 3120
cctcagtcag cacctcatgg tgtagtcttc ttgcatgtga cttatgtccc tgcacaagaa 3180
aagaacttca caactgctcc tgccatttgt catgatggaa aagcacactt tcctcgtgaa 3240
ggtgtctttg tttcaaatgg cacacactgg tttgtaacac aaaggaattt ttatgaacca 3300
caaatcatta ctacagacaa cacatttgtg tctggtaact gtgatgttgt aataggaatt 3360
gtcaacaaca cagtttatga tcctttgcaa cctgaattag actcattcaa ggaggagtta 3420
gataaatatt ttaagaatca tacatcacca gatgttgatt taggtgacat ctctggcatt 3480
aatgcttcag ttgtaaacat tcaaaaagaa attgaccgcc tcaatgaggt tgccaagaat 3540
ttaaatgaat ctctcatcga tctccaagaa cttggaaagt atgagcagta tataaaatgg 3600
ccatggtaca tttggctagg ttttatagct ggcttgattg ccatagtaat ggtgacaatt 3660
atgctttgct gtatgaccag ttgctgtagt tgtctcaagg gctgttgttc ttgtggatcc 3720
tgctgcaaat ttgatgaaga cgactctgag ccagtgctca aaggagtcaa attacattac 3780
acataa 3786
<210> 3
<211> 1194
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 截短的Spike蛋白的氨基酸序列
<400> 3
Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg
20 25 30
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser
35 40 45
Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr
50 55 60
Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe
65 70 75 80
Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr
100 105 110
Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
115 120 125
Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu
130 135 140
Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
145 150 155 160
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn
165 170 175
Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
180 185 190
Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe
195 200 205
Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
210 215 220
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
245 250 255
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
260 265 270
Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys
275 280 285
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
290 295 300
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
305 310 315 320
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
325 330 335
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
340 345 350
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
355 360 365
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
370 375 380
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
385 390 395 400
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
405 410 415
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
420 425 430
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
435 440 445
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
450 455 460
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
485 490 495
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
500 505 510
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
515 520 525
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
530 535 540
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
545 550 555 560
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
565 570 575
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
580 585 590
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val
595 600 605
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
610 615 620
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
625 630 635 640
Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
645 650 655
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala
660 665 670
Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly
675 680 685
Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr
690 695 700
Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr
705 710 715 720
Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu
725 730 735
Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
740 745 750
Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu
755 760 765
Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp
770 775 780
Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro
785 790 795 800
Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu
805 810 815
Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile
820 825 830
Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val
835 840 845
Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala
850 855 860
Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala
865 870 875 880
Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly
885 890 895
Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala
900 905 910
Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser
915 920 925
Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala
930 935 940
Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala
945 950 955 960
Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu
965 970 975
Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
980 985 990
Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala
995 1000 1005
Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly
1010 1015 1020
Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met
1025 1030 1035
Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val
1040 1045 1050
Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala
1055 1060 1065
Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe
1070 1075 1080
Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr
1085 1090 1095
Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn
1100 1105 1110
Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro
1115 1120 1125
Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr
1130 1135 1140
Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser
1145 1150 1155
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg
1160 1165 1170
Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1175 1180 1185
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr
1190
<210> 4
<211> 3786
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 经密码子优化的编码Spike蛋白的核苷酸序列
<400> 4
tcacaatgcg tgaaccttac aacaagaaca caacttcctc ctgcatacac aaactcattt 60
acaagaggtg tgtactatcc cgacaaagtg tttagatctt ccgtcctcca tagcacacaa 120
gatctatttc tccctttctt ctctaacgtg acatggtttc acgcaatcca cgtgtcagga 180
acaaacggaa caaagcgctt cgataaccct gtgcttcctt tcaatgacgg agtgtacttt 240
gcatcaacag agaagagcaa tatcatcaga ggatggatct ttggaacaac attggacagc 300
aagactcagt cacttcttat agtaaataat gccacgaacg tggtgatcaa agtgtgcgag 360
ttccagttct gtaatgaccc attccttggg gtatattacc acaagaacaa caagtcatgg 420
atggaatcag aatttagggt ttattcgtcg gctaacaact gcacatttga atacgtgtca 480
caacctttcc tgatggactt ggagggtaag caggggaatt tcaaaaacct gcgggaattt 540
gtcttcaaaa atatagacgg ttattttaag atttattcaa agcatactcc tatcaacctt 600
gtgagagatc ttcctcaagg attcagtgcc cttgaacctc ttgtggatct tcctatcgga 660
atcaacatca caagatttca aacacttctt gcacttcaca gatcatacct tacacctgga 720
gattcatctt ccggctggac tgcgggcgcg gccgcttatt acgtgggata ccttcaacct 780
agaacatttc ttcttaaata caacgagaat ggaactatta ctgatgccgt tgactgtgca 840
cttgatcctc tttcagaaac aaagtgtacc cttaaatcat ttacagtgga gaagggtata 900
taccaaacat caaactttag agtgcaacct acagaatcaa tcgtgagatt tcctaacatc 960
acaaaccttt gccctttcgg cgaagtcttt aacgcaacaa gatttgcatc agtgtacgca 1020
tggaacagaa agcgtatatc aaactgcgtg gcagattact cagtgcttta caactcagca 1080
tcattctcca cctttaaatg ctacggagtg tcacctacaa agctgaatga tctttgcttt 1140
acaaacgtgt acgcagattc atttgtgatc agaggagatg aagtgagaca aatcgcacct 1200
ggacaaacag gaaagattgc tgattacaac tacaaacttc ctgatgattt cactgggtgc 1260
gtgatcgcat ggaactcaaa caacctagac tccaaagttg gaggtaatta taattatctc 1320
tatcgcctgt tccgaaagtc aaatctgaaa cctttcgagc gagatatctc aacagaaatc 1380
taccaagcag gatcaacacc ttgcaacgga gtggaaggat ttaactgcta ctttcctctt 1440
caatcatacg gatttcaacc tacaaacgga gtgggatacc aaccttacag agtggtggtg 1500
ctttcatttg aacttcttca cgcacctgca acagtgtgcg gacctaagaa gtctacgaac 1560
cttgtgaaga ataagtgcgt gaactttaac ttcaatggtt tgacgggtac tggagtgctt 1620
acagaatcaa acaagaagtt cttacctttc cagcagtttg gacgtgacat agctgacact 1680
actgacgcgg tccgagaccc tcaaacactt gaaatccttg atatcacacc ttgctcattt 1740
ggaggagtgt cagtgatcac acctggaaca aacacatcaa accaagtggc agtgctttac 1800
caagatgtga actgcacaga agtgcctgtg gcaatccacg cagatcaact tacacctaca 1860
tggagggtct attctactgg gtcaaacgtg tttcaaacaa gagcaggatg ccttatcgga 1920
gcagaacacg tgaacaactc atacgaatgc gatatcccta tcggagcagg aatctgcgca 1980
tcataccaaa cacaaacaaa ctcacctaga agagcaagat cagtggcatc acaatcaatc 2040
atcgcataca caatgtcact tggagcagag aattctgtgg catacagtaa caactcaatt 2100
gcaatcccta caaactttac aatctcagtg acaacagaga ttctgccggt ttctatgaca 2160
aagacctctg tggattgcac aatgtacatc tgcggagatt caacagaatg ctcaaacctt 2220
cttcttcaat acggatcatt ctgtacccaa cttaacagag cacttacagg aatcgcagtg 2280
gaacaagata agaatactca agaagtgttt gcacaagtga aacaaatcta caagacacct 2340
cccataaaag atttcggtgg tttcaatttc tcccagattc tgccagaccc atcaaagcca 2400
tcgaagcgaa gtttcattga ggatttattg ttcaacaaag tgacacttgc agatgcagga 2460
tttatcaaac aatacggaga ttgcttaggt gatattgcgg cacgagatct tatctgcgca 2520
cagaagttta acggcctgac cgtattgcct cctcttctta cagatgaaat gatcgcacaa 2580
tacacatcag cacttcttgc agggacgatt acatctggat ggactttcgg cgccggtgcc 2640
gccttacaga tccctttcgc tatgcaaatg gcatacagat ttaacggaat cggagtgaca 2700
cagaatgtcc tttacgagaa tcagaaacta attgcaaacc aatttaactc agcaatcgga 2760
aagattcagg attcactttc atcaacagca tcagcacttg gaaagctgca ggatgtggtg 2820
aaccagaatg cccaagcact taacacactt gtgaaacaac tttcatcaaa ctttggagca 2880
atctcttcgg tattaaatga catcctttca agacttgata aagtggaagc agaagtgcag 2940
attgaccgtc taattacggg aagacttcaa tcacttcaaa catacgttac tcagcagctc 3000
attagagcag cagaaatcag agcatcagca aaccttgcag caacaaagat gagtgaatgc 3060
gtgcttggac aatcaaagcg agttgatttc tgtggcaagg gctaccatct tatgtcattt 3120
cctcaatcag cacctcacgg agtggtgttt cttcacgtga catacgtgcc tgcacaagag 3180
aagaatttca caacagcacc tgcaatctgc cacgatggaa aggcccattt ccctcgcgag 3240
ggagtgtttg tgtcaaacgg aacacactgg tttgtgacac aaagaaactt ctatgagcct 3300
caaatcatca caacagataa cacatttgtg tcaggaaact gcgatgtggt gatcggaata 3360
gtaaacaaca cagtctatga ccctcttcaa cctgaacttg attcatttaa agaagaactt 3420
gataaatatt tcaagaatca tacctcacct gatgtggatc tcggtgacat atcgggcatc 3480
aacgcatcag tggtgaacat ccagaaggaa atcgaccgac tcaatgaggt ggcaaagaat 3540
ctaaacgaat cacttatcga tcttcaagaa cttggaaagt atgagcaata catcaaatgg 3600
ccttggtaca tctggcttgg atttatcgca ggacttatcg caatcgtgat ggtgacaatc 3660
atgctttgct gcatgacatc atgttgttcc tgtttgaagg gatgttgttc ttgtggctct 3720
tgctgcaaat ttgatgaaga tgattcagaa cctgtgctta aaggagtgaa acttcactac 3780
acatga 3786
<210> 5
<211> 3585
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 经密码子优化的、编码截短的Spike蛋白的核苷酸序列
<400> 5
tcacaatgcg tgaaccttac aacaagaaca caacttcctc ctgcatacac aaactcattt 60
acaagaggtg tgtactatcc cgacaaagtg tttagatctt ccgtcctcca tagcacacaa 120
gatctatttc tccctttctt ctctaacgtg acatggtttc acgcaatcca cgtgtcagga 180
acaaacggaa caaagcgctt cgataaccct gtgcttcctt tcaatgacgg agtgtacttt 240
gcatcaacag agaagagcaa tatcatcaga ggatggatct ttggaacaac attggacagc 300
aagactcagt cacttcttat agtaaataat gccacgaacg tggtgatcaa agtgtgcgag 360
ttccagttct gtaatgaccc attccttggg gtatattacc acaagaacaa caagtcatgg 420
atggaatcag aatttagggt ttattcgtcg gctaacaact gcacatttga atacgtgtca 480
caacctttcc tgatggactt ggagggtaag caggggaatt tcaaaaacct gcgggaattt 540
gtcttcaaaa atatagacgg ttattttaag atttattcaa agcatactcc tatcaacctt 600
gtgagagatc ttcctcaagg attcagtgcc cttgaacctc ttgtggatct tcctatcgga 660
atcaacatca caagatttca aacacttctt gcacttcaca gatcatacct tacacctgga 720
gattcatctt ccggctggac tgcgggcgcg gccgcttatt acgtgggata ccttcaacct 780
agaacatttc ttcttaaata caacgagaat ggaactatta ctgatgccgt tgactgtgca 840
cttgatcctc tttcagaaac aaagtgtacc cttaaatcat ttacagtgga gaagggtata 900
taccaaacat caaactttag agtgcaacct acagaatcaa tcgtgagatt tcctaacatc 960
acaaaccttt gccctttcgg cgaagtcttt aacgcaacaa gatttgcatc agtgtacgca 1020
tggaacagaa agcgtatatc aaactgcgtg gcagattact cagtgcttta caactcagca 1080
tcattctcca cctttaaatg ctacggagtg tcacctacaa agctgaatga tctttgcttt 1140
acaaacgtgt acgcagattc atttgtgatc agaggagatg aagtgagaca aatcgcacct 1200
ggacaaacag gaaagattgc tgattacaac tacaaacttc ctgatgattt cactgggtgc 1260
gtgatcgcat ggaactcaaa caacctagac tccaaagttg gaggtaatta taattatctc 1320
tatcgcctgt tccgaaagtc aaatctgaaa cctttcgagc gagatatctc aacagaaatc 1380
taccaagcag gatcaacacc ttgcaacgga gtggaaggat ttaactgcta ctttcctctt 1440
caatcatacg gatttcaacc tacaaacgga gtgggatacc aaccttacag agtggtggtg 1500
ctttcatttg aacttcttca cgcacctgca acagtgtgcg gacctaagaa gtctacgaac 1560
cttgtgaaga ataagtgcgt gaactttaac ttcaatggtt tgacgggtac tggagtgctt 1620
acagaatcaa acaagaagtt cttacctttc cagcagtttg gacgtgacat agctgacact 1680
actgacgcgg tccgagaccc tcaaacactt gaaatccttg atatcacacc ttgctcattt 1740
ggaggagtgt cagtgatcac acctggaaca aacacatcaa accaagtggc agtgctttac 1800
caagatgtga actgcacaga agtgcctgtg gcaatccacg cagatcaact tacacctaca 1860
tggagggtct attctactgg gtcaaacgtg tttcaaacaa gagcaggatg ccttatcgga 1920
gcagaacacg tgaacaactc atacgaatgc gatatcccta tcggagcagg aatctgcgca 1980
tcataccaaa cacaaacaaa ctcacctaga agagcaagat cagtggcatc acaatcaatc 2040
atcgcataca caatgtcact tggagcagag aattctgtgg catacagtaa caactcaatt 2100
gcaatcccta caaactttac aatctcagtg acaacagaga ttctgccggt ttctatgaca 2160
aagacctctg tggattgcac aatgtacatc tgcggagatt caacagaatg ctcaaacctt 2220
cttcttcaat acggatcatt ctgtacccaa cttaacagag cacttacagg aatcgcagtg 2280
gaacaagata agaatactca agaagtgttt gcacaagtga aacaaatcta caagacacct 2340
cccataaaag atttcggtgg tttcaatttc tcccagattc tgccagaccc atcaaagcca 2400
tcgaagcgaa gtttcattga ggatttattg ttcaacaaag tgacacttgc agatgcagga 2460
tttatcaaac aatacggaga ttgcttaggt gatattgcgg cacgagatct tatctgcgca 2520
cagaagttta acggcctgac cgtattgcct cctcttctta cagatgaaat gatcgcacaa 2580
tacacatcag cacttcttgc agggacgatt acatctggat ggactttcgg cgccggtgcc 2640
gccttacaga tccctttcgc tatgcaaatg gcatacagat ttaacggaat cggagtgaca 2700
cagaatgtcc tttacgagaa tcagaaacta attgcaaacc aatttaactc agcaatcgga 2760
aagattcagg attcactttc atcaacagca tcagcacttg gaaagctgca ggatgtggtg 2820
aaccagaatg cccaagcact taacacactt gtgaaacaac tttcatcaaa ctttggagca 2880
atctcttcgg tattaaatga catcctttca agacttgata aagtggaagc agaagtgcag 2940
attgaccgtc taattacggg aagacttcaa tcacttcaaa catacgttac tcagcagctc 3000
attagagcag cagaaatcag agcatcagca aaccttgcag caacaaagat gagtgaatgc 3060
gtgcttggac aatcaaagcg agttgatttc tgtggcaagg gctaccatct tatgtcattt 3120
cctcaatcag cacctcacgg agtggtgttt cttcacgtga catacgtgcc tgcacaagag 3180
aagaatttca caacagcacc tgcaatctgc cacgatggaa aggcccattt ccctcgcgag 3240
ggagtgtttg tgtcaaacgg aacacactgg tttgtgacac aaagaaactt ctatgagcct 3300
caaatcatca caacagataa cacatttgtg tcaggaaact gcgatgtggt gatcggaata 3360
gtaaacaaca cagtctatga ccctcttcaa cctgaacttg attcatttaa agaagaactt 3420
gataaatatt tcaagaatca tacctcacct gatgtggatc tcggtgacat atcgggcatc 3480
aacgcatcag tggtgaacat ccagaaggaa atcgaccgac tcaatgaggt ggcaaagaat 3540
ctaaacgaat cacttatcga tcttcaagaa cttggaaagt attga 3585
<210> 6
<211> 3879
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 含有编码HGF信号肽的核苷酸序列与SEQ ID NO: 4的核苷酸序列
<400> 6
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggatcacaat gcgtgaacct tacaacaaga 120
acacaacttc ctcctgcata cacaaactca tttacaagag gtgtgtacta tcccgacaaa 180
gtgtttagat cttccgtcct ccatagcaca caagatctat ttctcccttt cttctctaac 240
gtgacatggt ttcacgcaat ccacgtgtca ggaacaaacg gaacaaagcg cttcgataac 300
cctgtgcttc ctttcaatga cggagtgtac tttgcatcaa cagagaagag caatatcatc 360
agaggatgga tctttggaac aacattggac agcaagactc agtcacttct tatagtaaat 420
aatgccacga acgtggtgat caaagtgtgc gagttccagt tctgtaatga cccattcctt 480
ggggtatatt accacaagaa caacaagtca tggatggaat cagaatttag ggtttattcg 540
tcggctaaca actgcacatt tgaatacgtg tcacaacctt tcctgatgga cttggagggt 600
aagcagggga atttcaaaaa cctgcgggaa tttgtcttca aaaatataga cggttatttt 660
aagatttatt caaagcatac tcctatcaac cttgtgagag atcttcctca aggattcagt 720
gcccttgaac ctcttgtgga tcttcctatc ggaatcaaca tcacaagatt tcaaacactt 780
cttgcacttc acagatcata ccttacacct ggagattcat cttccggctg gactgcgggc 840
gcggccgctt attacgtggg ataccttcaa cctagaacat ttcttcttaa atacaacgag 900
aatggaacta ttactgatgc cgttgactgt gcacttgatc ctctttcaga aacaaagtgt 960
acccttaaat catttacagt ggagaagggt atataccaaa catcaaactt tagagtgcaa 1020
cctacagaat caatcgtgag atttcctaac atcacaaacc tttgcccttt cggcgaagtc 1080
tttaacgcaa caagatttgc atcagtgtac gcatggaaca gaaagcgtat atcaaactgc 1140
gtggcagatt actcagtgct ttacaactca gcatcattct ccacctttaa atgctacgga 1200
gtgtcaccta caaagctgaa tgatctttgc tttacaaacg tgtacgcaga ttcatttgtg 1260
atcagaggag atgaagtgag acaaatcgca cctggacaaa caggaaagat tgctgattac 1320
aactacaaac ttcctgatga tttcactggg tgcgtgatcg catggaactc aaacaaccta 1380
gactccaaag ttggaggtaa ttataattat ctctatcgcc tgttccgaaa gtcaaatctg 1440
aaacctttcg agcgagatat ctcaacagaa atctaccaag caggatcaac accttgcaac 1500
ggagtggaag gatttaactg ctactttcct cttcaatcat acggatttca acctacaaac 1560
ggagtgggat accaacctta cagagtggtg gtgctttcat ttgaacttct tcacgcacct 1620
gcaacagtgt gcggacctaa gaagtctacg aaccttgtga agaataagtg cgtgaacttt 1680
aacttcaatg gtttgacggg tactggagtg cttacagaat caaacaagaa gttcttacct 1740
ttccagcagt ttggacgtga catagctgac actactgacg cggtccgaga ccctcaaaca 1800
cttgaaatcc ttgatatcac accttgctca tttggaggag tgtcagtgat cacacctgga 1860
acaaacacat caaaccaagt ggcagtgctt taccaagatg tgaactgcac agaagtgcct 1920
gtggcaatcc acgcagatca acttacacct acatggaggg tctattctac tgggtcaaac 1980
gtgtttcaaa caagagcagg atgccttatc ggagcagaac acgtgaacaa ctcatacgaa 2040
tgcgatatcc ctatcggagc aggaatctgc gcatcatacc aaacacaaac aaactcacct 2100
agaagagcaa gatcagtggc atcacaatca atcatcgcat acacaatgtc acttggagca 2160
gagaattctg tggcatacag taacaactca attgcaatcc ctacaaactt tacaatctca 2220
gtgacaacag agattctgcc ggtttctatg acaaagacct ctgtggattg cacaatgtac 2280
atctgcggag attcaacaga atgctcaaac cttcttcttc aatacggatc attctgtacc 2340
caacttaaca gagcacttac aggaatcgca gtggaacaag ataagaatac tcaagaagtg 2400
tttgcacaag tgaaacaaat ctacaagaca cctcccataa aagatttcgg tggtttcaat 2460
ttctcccaga ttctgccaga cccatcaaag ccatcgaagc gaagtttcat tgaggattta 2520
ttgttcaaca aagtgacact tgcagatgca ggatttatca aacaatacgg agattgctta 2580
ggtgatattg cggcacgaga tcttatctgc gcacagaagt ttaacggcct gaccgtattg 2640
cctcctcttc ttacagatga aatgatcgca caatacacat cagcacttct tgcagggacg 2700
attacatctg gatggacttt cggcgccggt gccgccttac agatcccttt cgctatgcaa 2760
atggcataca gatttaacgg aatcggagtg acacagaatg tcctttacga gaatcagaaa 2820
ctaattgcaa accaatttaa ctcagcaatc ggaaagattc aggattcact ttcatcaaca 2880
gcatcagcac ttggaaagct gcaggatgtg gtgaaccaga atgcccaagc acttaacaca 2940
cttgtgaaac aactttcatc aaactttgga gcaatctctt cggtattaaa tgacatcctt 3000
tcaagacttg ataaagtgga agcagaagtg cagattgacc gtctaattac gggaagactt 3060
caatcacttc aaacatacgt tactcagcag ctcattagag cagcagaaat cagagcatca 3120
gcaaaccttg cagcaacaaa gatgagtgaa tgcgtgcttg gacaatcaaa gcgagttgat 3180
ttctgtggca agggctacca tcttatgtca tttcctcaat cagcacctca cggagtggtg 3240
tttcttcacg tgacatacgt gcctgcacaa gagaagaatt tcacaacagc acctgcaatc 3300
tgccacgatg gaaaggccca tttccctcgc gagggagtgt ttgtgtcaaa cggaacacac 3360
tggtttgtga cacaaagaaa cttctatgag cctcaaatca tcacaacaga taacacattt 3420
gtgtcaggaa actgcgatgt ggtgatcgga atagtaaaca acacagtcta tgaccctctt 3480
caacctgaac ttgattcatt taaagaagaa cttgataaat atttcaagaa tcatacctca 3540
cctgatgtgg atctcggtga catatcgggc atcaacgcat cagtggtgaa catccagaag 3600
gaaatcgacc gactcaatga ggtggcaaag aatctaaacg aatcacttat cgatcttcaa 3660
gaacttggaa agtatgagca atacatcaaa tggccttggt acatctggct tggatttatc 3720
gcaggactta tcgcaatcgt gatggtgaca atcatgcttt gctgcatgac atcatgttgt 3780
tcctgtttga agggatgttg ttcttgtggc tcttgctgca aatttgatga agatgattca 3840
gaacctgtgc ttaaaggagt gaaacttcac tacacatga 3879
<210> 7
<211> 3678
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 含有编码HGF信号肽的核苷酸序列与SEQ ID NO: 5的核苷酸序列
<400> 7
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggatcacaat gcgtgaacct tacaacaaga 120
acacaacttc ctcctgcata cacaaactca tttacaagag gtgtgtacta tcccgacaaa 180
gtgtttagat cttccgtcct ccatagcaca caagatctat ttctcccttt cttctctaac 240
gtgacatggt ttcacgcaat ccacgtgtca ggaacaaacg gaacaaagcg cttcgataac 300
cctgtgcttc ctttcaatga cggagtgtac tttgcatcaa cagagaagag caatatcatc 360
agaggatgga tctttggaac aacattggac agcaagactc agtcacttct tatagtaaat 420
aatgccacga acgtggtgat caaagtgtgc gagttccagt tctgtaatga cccattcctt 480
ggggtatatt accacaagaa caacaagtca tggatggaat cagaatttag ggtttattcg 540
tcggctaaca actgcacatt tgaatacgtg tcacaacctt tcctgatgga cttggagggt 600
aagcagggga atttcaaaaa cctgcgggaa tttgtcttca aaaatataga cggttatttt 660
aagatttatt caaagcatac tcctatcaac cttgtgagag atcttcctca aggattcagt 720
gcccttgaac ctcttgtgga tcttcctatc ggaatcaaca tcacaagatt tcaaacactt 780
cttgcacttc acagatcata ccttacacct ggagattcat cttccggctg gactgcgggc 840
gcggccgctt attacgtggg ataccttcaa cctagaacat ttcttcttaa atacaacgag 900
aatggaacta ttactgatgc cgttgactgt gcacttgatc ctctttcaga aacaaagtgt 960
acccttaaat catttacagt ggagaagggt atataccaaa catcaaactt tagagtgcaa 1020
cctacagaat caatcgtgag atttcctaac atcacaaacc tttgcccttt cggcgaagtc 1080
tttaacgcaa caagatttgc atcagtgtac gcatggaaca gaaagcgtat atcaaactgc 1140
gtggcagatt actcagtgct ttacaactca gcatcattct ccacctttaa atgctacgga 1200
gtgtcaccta caaagctgaa tgatctttgc tttacaaacg tgtacgcaga ttcatttgtg 1260
atcagaggag atgaagtgag acaaatcgca cctggacaaa caggaaagat tgctgattac 1320
aactacaaac ttcctgatga tttcactggg tgcgtgatcg catggaactc aaacaaccta 1380
gactccaaag ttggaggtaa ttataattat ctctatcgcc tgttccgaaa gtcaaatctg 1440
aaacctttcg agcgagatat ctcaacagaa atctaccaag caggatcaac accttgcaac 1500
ggagtggaag gatttaactg ctactttcct cttcaatcat acggatttca acctacaaac 1560
ggagtgggat accaacctta cagagtggtg gtgctttcat ttgaacttct tcacgcacct 1620
gcaacagtgt gcggacctaa gaagtctacg aaccttgtga agaataagtg cgtgaacttt 1680
aacttcaatg gtttgacggg tactggagtg cttacagaat caaacaagaa gttcttacct 1740
ttccagcagt ttggacgtga catagctgac actactgacg cggtccgaga ccctcaaaca 1800
cttgaaatcc ttgatatcac accttgctca tttggaggag tgtcagtgat cacacctgga 1860
acaaacacat caaaccaagt ggcagtgctt taccaagatg tgaactgcac agaagtgcct 1920
gtggcaatcc acgcagatca acttacacct acatggaggg tctattctac tgggtcaaac 1980
gtgtttcaaa caagagcagg atgccttatc ggagcagaac acgtgaacaa ctcatacgaa 2040
tgcgatatcc ctatcggagc aggaatctgc gcatcatacc aaacacaaac aaactcacct 2100
agaagagcaa gatcagtggc atcacaatca atcatcgcat acacaatgtc acttggagca 2160
gagaattctg tggcatacag taacaactca attgcaatcc ctacaaactt tacaatctca 2220
gtgacaacag agattctgcc ggtttctatg acaaagacct ctgtggattg cacaatgtac 2280
atctgcggag attcaacaga atgctcaaac cttcttcttc aatacggatc attctgtacc 2340
caacttaaca gagcacttac aggaatcgca gtggaacaag ataagaatac tcaagaagtg 2400
tttgcacaag tgaaacaaat ctacaagaca cctcccataa aagatttcgg tggtttcaat 2460
ttctcccaga ttctgccaga cccatcaaag ccatcgaagc gaagtttcat tgaggattta 2520
ttgttcaaca aagtgacact tgcagatgca ggatttatca aacaatacgg agattgctta 2580
ggtgatattg cggcacgaga tcttatctgc gcacagaagt ttaacggcct gaccgtattg 2640
cctcctcttc ttacagatga aatgatcgca caatacacat cagcacttct tgcagggacg 2700
attacatctg gatggacttt cggcgccggt gccgccttac agatcccttt cgctatgcaa 2760
atggcataca gatttaacgg aatcggagtg acacagaatg tcctttacga gaatcagaaa 2820
ctaattgcaa accaatttaa ctcagcaatc ggaaagattc aggattcact ttcatcaaca 2880
gcatcagcac ttggaaagct gcaggatgtg gtgaaccaga atgcccaagc acttaacaca 2940
cttgtgaaac aactttcatc aaactttgga gcaatctctt cggtattaaa tgacatcctt 3000
tcaagacttg ataaagtgga agcagaagtg cagattgacc gtctaattac gggaagactt 3060
caatcacttc aaacatacgt tactcagcag ctcattagag cagcagaaat cagagcatca 3120
gcaaaccttg cagcaacaaa gatgagtgaa tgcgtgcttg gacaatcaaa gcgagttgat 3180
ttctgtggca agggctacca tcttatgtca tttcctcaat cagcacctca cggagtggtg 3240
tttcttcacg tgacatacgt gcctgcacaa gagaagaatt tcacaacagc acctgcaatc 3300
tgccacgatg gaaaggccca tttccctcgc gagggagtgt ttgtgtcaaa cggaacacac 3360
tggtttgtga cacaaagaaa cttctatgag cctcaaatca tcacaacaga taacacattt 3420
gtgtcaggaa actgcgatgt ggtgatcgga atagtaaaca acacagtcta tgaccctctt 3480
caacctgaac ttgattcatt taaagaagaa cttgataaat atttcaagaa tcatacctca 3540
cctgatgtgg atctcggtga catatcgggc atcaacgcat cagtggtgaa catccagaag 3600
gaaatcgacc gactcaatga ggtggcaaag aatctaaacg aatcacttat cgatcttcaa 3660
gaacttggaa agtattga 3678
<210> 8
<211> 3840
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 含有编码IgE信号肽的核苷酸序列与SEQ ID NO: 4的核苷酸序列
<400> 8
atggattgga catggatctt attcttagta gcagcagcaa caagagtgca ctcatcacaa 60
tgcgtgaacc ttacaacaag aacacaactt cctcctgcat acacaaactc atttacaaga 120
ggtgtgtact atcccgacaa agtgtttaga tcttccgtcc tccatagcac acaagatcta 180
tttctccctt tcttctctaa cgtgacatgg tttcacgcaa tccacgtgtc aggaacaaac 240
ggaacaaagc gcttcgataa ccctgtgctt cctttcaatg acggagtgta ctttgcatca 300
acagagaaga gcaatatcat cagaggatgg atctttggaa caacattgga cagcaagact 360
cagtcacttc ttatagtaaa taatgccacg aacgtggtga tcaaagtgtg cgagttccag 420
ttctgtaatg acccattcct tggggtatat taccacaaga acaacaagtc atggatggaa 480
tcagaattta gggtttattc gtcggctaac aactgcacat ttgaatacgt gtcacaacct 540
ttcctgatgg acttggaggg taagcagggg aatttcaaaa acctgcggga atttgtcttc 600
aaaaatatag acggttattt taagatttat tcaaagcata ctcctatcaa ccttgtgaga 660
gatcttcctc aaggattcag tgcccttgaa cctcttgtgg atcttcctat cggaatcaac 720
atcacaagat ttcaaacact tcttgcactt cacagatcat accttacacc tggagattca 780
tcttccggct ggactgcggg cgcggccgct tattacgtgg gataccttca acctagaaca 840
tttcttctta aatacaacga gaatggaact attactgatg ccgttgactg tgcacttgat 900
cctctttcag aaacaaagtg tacccttaaa tcatttacag tggagaaggg tatataccaa 960
acatcaaact ttagagtgca acctacagaa tcaatcgtga gatttcctaa catcacaaac 1020
ctttgccctt tcggcgaagt ctttaacgca acaagatttg catcagtgta cgcatggaac 1080
agaaagcgta tatcaaactg cgtggcagat tactcagtgc tttacaactc agcatcattc 1140
tccaccttta aatgctacgg agtgtcacct acaaagctga atgatctttg ctttacaaac 1200
gtgtacgcag attcatttgt gatcagagga gatgaagtga gacaaatcgc acctggacaa 1260
acaggaaaga ttgctgatta caactacaaa cttcctgatg atttcactgg gtgcgtgatc 1320
gcatggaact caaacaacct agactccaaa gttggaggta attataatta tctctatcgc 1380
ctgttccgaa agtcaaatct gaaacctttc gagcgagata tctcaacaga aatctaccaa 1440
gcaggatcaa caccttgcaa cggagtggaa ggatttaact gctactttcc tcttcaatca 1500
tacggatttc aacctacaaa cggagtggga taccaacctt acagagtggt ggtgctttca 1560
tttgaacttc ttcacgcacc tgcaacagtg tgcggaccta agaagtctac gaaccttgtg 1620
aagaataagt gcgtgaactt taacttcaat ggtttgacgg gtactggagt gcttacagaa 1680
tcaaacaaga agttcttacc tttccagcag tttggacgtg acatagctga cactactgac 1740
gcggtccgag accctcaaac acttgaaatc cttgatatca caccttgctc atttggagga 1800
gtgtcagtga tcacacctgg aacaaacaca tcaaaccaag tggcagtgct ttaccaagat 1860
gtgaactgca cagaagtgcc tgtggcaatc cacgcagatc aacttacacc tacatggagg 1920
gtctattcta ctgggtcaaa cgtgtttcaa acaagagcag gatgccttat cggagcagaa 1980
cacgtgaaca actcatacga atgcgatatc cctatcggag caggaatctg cgcatcatac 2040
caaacacaaa caaactcacc tagaagagca agatcagtgg catcacaatc aatcatcgca 2100
tacacaatgt cacttggagc agagaattct gtggcataca gtaacaactc aattgcaatc 2160
cctacaaact ttacaatctc agtgacaaca gagattctgc cggtttctat gacaaagacc 2220
tctgtggatt gcacaatgta catctgcgga gattcaacag aatgctcaaa ccttcttctt 2280
caatacggat cattctgtac ccaacttaac agagcactta caggaatcgc agtggaacaa 2340
gataagaata ctcaagaagt gtttgcacaa gtgaaacaaa tctacaagac acctcccata 2400
aaagatttcg gtggtttcaa tttctcccag attctgccag acccatcaaa gccatcgaag 2460
cgaagtttca ttgaggattt attgttcaac aaagtgacac ttgcagatgc aggatttatc 2520
aaacaatacg gagattgctt aggtgatatt gcggcacgag atcttatctg cgcacagaag 2580
tttaacggcc tgaccgtatt gcctcctctt cttacagatg aaatgatcgc acaatacaca 2640
tcagcacttc ttgcagggac gattacatct ggatggactt tcggcgccgg tgccgcctta 2700
cagatccctt tcgctatgca aatggcatac agatttaacg gaatcggagt gacacagaat 2760
gtcctttacg agaatcagaa actaattgca aaccaattta actcagcaat cggaaagatt 2820
caggattcac tttcatcaac agcatcagca cttggaaagc tgcaggatgt ggtgaaccag 2880
aatgcccaag cacttaacac acttgtgaaa caactttcat caaactttgg agcaatctct 2940
tcggtattaa atgacatcct ttcaagactt gataaagtgg aagcagaagt gcagattgac 3000
cgtctaatta cgggaagact tcaatcactt caaacatacg ttactcagca gctcattaga 3060
gcagcagaaa tcagagcatc agcaaacctt gcagcaacaa agatgagtga atgcgtgctt 3120
ggacaatcaa agcgagttga tttctgtggc aagggctacc atcttatgtc atttcctcaa 3180
tcagcacctc acggagtggt gtttcttcac gtgacatacg tgcctgcaca agagaagaat 3240
ttcacaacag cacctgcaat ctgccacgat ggaaaggccc atttccctcg cgagggagtg 3300
tttgtgtcaa acggaacaca ctggtttgtg acacaaagaa acttctatga gcctcaaatc 3360
atcacaacag ataacacatt tgtgtcagga aactgcgatg tggtgatcgg aatagtaaac 3420
aacacagtct atgaccctct tcaacctgaa cttgattcat ttaaagaaga acttgataaa 3480
tatttcaaga atcatacctc acctgatgtg gatctcggtg acatatcggg catcaacgca 3540
tcagtggtga acatccagaa ggaaatcgac cgactcaatg aggtggcaaa gaatctaaac 3600
gaatcactta tcgatcttca agaacttgga aagtatgagc aatacatcaa atggccttgg 3660
tacatctggc ttggatttat cgcaggactt atcgcaatcg tgatggtgac aatcatgctt 3720
tgctgcatga catcatgttg ttcctgtttg aagggatgtt gttcttgtgg ctcttgctgc 3780
aaatttgatg aagatgattc agaacctgtg cttaaaggag tgaaacttca ctacacatga 3840
<210> 9
<211> 3639
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 含有编码IgE信号肽的核苷酸序列与SEQ ID NO: 5的核苷酸序列
<400> 9
atggattgga catggatctt attcttagta gcagcagcaa caagagtgca ctcatcacaa 60
tgcgtgaacc ttacaacaag aacacaactt cctcctgcat acacaaactc atttacaaga 120
ggtgtgtact atcccgacaa agtgtttaga tcttccgtcc tccatagcac acaagatcta 180
tttctccctt tcttctctaa cgtgacatgg tttcacgcaa tccacgtgtc aggaacaaac 240
ggaacaaagc gcttcgataa ccctgtgctt cctttcaatg acggagtgta ctttgcatca 300
acagagaaga gcaatatcat cagaggatgg atctttggaa caacattgga cagcaagact 360
cagtcacttc ttatagtaaa taatgccacg aacgtggtga tcaaagtgtg cgagttccag 420
ttctgtaatg acccattcct tggggtatat taccacaaga acaacaagtc atggatggaa 480
tcagaattta gggtttattc gtcggctaac aactgcacat ttgaatacgt gtcacaacct 540
ttcctgatgg acttggaggg taagcagggg aatttcaaaa acctgcggga atttgtcttc 600
aaaaatatag acggttattt taagatttat tcaaagcata ctcctatcaa ccttgtgaga 660
gatcttcctc aaggattcag tgcccttgaa cctcttgtgg atcttcctat cggaatcaac 720
atcacaagat ttcaaacact tcttgcactt cacagatcat accttacacc tggagattca 780
tcttccggct ggactgcggg cgcggccgct tattacgtgg gataccttca acctagaaca 840
tttcttctta aatacaacga gaatggaact attactgatg ccgttgactg tgcacttgat 900
cctctttcag aaacaaagtg tacccttaaa tcatttacag tggagaaggg tatataccaa 960
acatcaaact ttagagtgca acctacagaa tcaatcgtga gatttcctaa catcacaaac 1020
ctttgccctt tcggcgaagt ctttaacgca acaagatttg catcagtgta cgcatggaac 1080
agaaagcgta tatcaaactg cgtggcagat tactcagtgc tttacaactc agcatcattc 1140
tccaccttta aatgctacgg agtgtcacct acaaagctga atgatctttg ctttacaaac 1200
gtgtacgcag attcatttgt gatcagagga gatgaagtga gacaaatcgc acctggacaa 1260
acaggaaaga ttgctgatta caactacaaa cttcctgatg atttcactgg gtgcgtgatc 1320
gcatggaact caaacaacct agactccaaa gttggaggta attataatta tctctatcgc 1380
ctgttccgaa agtcaaatct gaaacctttc gagcgagata tctcaacaga aatctaccaa 1440
gcaggatcaa caccttgcaa cggagtggaa ggatttaact gctactttcc tcttcaatca 1500
tacggatttc aacctacaaa cggagtggga taccaacctt acagagtggt ggtgctttca 1560
tttgaacttc ttcacgcacc tgcaacagtg tgcggaccta agaagtctac gaaccttgtg 1620
aagaataagt gcgtgaactt taacttcaat ggtttgacgg gtactggagt gcttacagaa 1680
tcaaacaaga agttcttacc tttccagcag tttggacgtg acatagctga cactactgac 1740
gcggtccgag accctcaaac acttgaaatc cttgatatca caccttgctc atttggagga 1800
gtgtcagtga tcacacctgg aacaaacaca tcaaaccaag tggcagtgct ttaccaagat 1860
gtgaactgca cagaagtgcc tgtggcaatc cacgcagatc aacttacacc tacatggagg 1920
gtctattcta ctgggtcaaa cgtgtttcaa acaagagcag gatgccttat cggagcagaa 1980
cacgtgaaca actcatacga atgcgatatc cctatcggag caggaatctg cgcatcatac 2040
caaacacaaa caaactcacc tagaagagca agatcagtgg catcacaatc aatcatcgca 2100
tacacaatgt cacttggagc agagaattct gtggcataca gtaacaactc aattgcaatc 2160
cctacaaact ttacaatctc agtgacaaca gagattctgc cggtttctat gacaaagacc 2220
tctgtggatt gcacaatgta catctgcgga gattcaacag aatgctcaaa ccttcttctt 2280
caatacggat cattctgtac ccaacttaac agagcactta caggaatcgc agtggaacaa 2340
gataagaata ctcaagaagt gtttgcacaa gtgaaacaaa tctacaagac acctcccata 2400
aaagatttcg gtggtttcaa tttctcccag attctgccag acccatcaaa gccatcgaag 2460
cgaagtttca ttgaggattt attgttcaac aaagtgacac ttgcagatgc aggatttatc 2520
aaacaatacg gagattgctt aggtgatatt gcggcacgag atcttatctg cgcacagaag 2580
tttaacggcc tgaccgtatt gcctcctctt cttacagatg aaatgatcgc acaatacaca 2640
tcagcacttc ttgcagggac gattacatct ggatggactt tcggcgccgg tgccgcctta 2700
cagatccctt tcgctatgca aatggcatac agatttaacg gaatcggagt gacacagaat 2760
gtcctttacg agaatcagaa actaattgca aaccaattta actcagcaat cggaaagatt 2820
caggattcac tttcatcaac agcatcagca cttggaaagc tgcaggatgt ggtgaaccag 2880
aatgcccaag cacttaacac acttgtgaaa caactttcat caaactttgg agcaatctct 2940
tcggtattaa atgacatcct ttcaagactt gataaagtgg aagcagaagt gcagattgac 3000
cgtctaatta cgggaagact tcaatcactt caaacatacg ttactcagca gctcattaga 3060
gcagcagaaa tcagagcatc agcaaacctt gcagcaacaa agatgagtga atgcgtgctt 3120
ggacaatcaa agcgagttga tttctgtggc aagggctacc atcttatgtc atttcctcaa 3180
tcagcacctc acggagtggt gtttcttcac gtgacatacg tgcctgcaca agagaagaat 3240
ttcacaacag cacctgcaat ctgccacgat ggaaaggccc atttccctcg cgagggagtg 3300
tttgtgtcaa acggaacaca ctggtttgtg acacaaagaa acttctatga gcctcaaatc 3360
atcacaacag ataacacatt tgtgtcagga aactgcgatg tggtgatcgg aatagtaaac 3420
aacacagtct atgaccctct tcaacctgaa cttgattcat ttaaagaaga acttgataaa 3480
tatttcaaga atcatacctc acctgatgtg gatctcggtg acatatcggg catcaacgca 3540
tcagtggtga acatccagaa ggaaatcgac cgactcaatg aggtggcaaa gaatctaaac 3600
gaatcactta tcgatcttca agaacttgga aagtattga 3639
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 天然Spike蛋白的信号肽的氨基酸序列
<400> 10
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HGF信号肽的氨基酸序列
<400> 11
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly
20 25 30
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> IgE信号肽的氨基酸序列
<400> 12
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
<210> 13
<211> 1225
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 13
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Ser
20 25 30
Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr
35 40 45
Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser
50 55 60
Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn
65 70 75 80
Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys
85 90 95
Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala
100 105 110
Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn
130 135 140
Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu
145 150 155 160
Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe
165 170 175
Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln
180 185 190
Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu
195 200 205
Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser
210 215 220
Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser
225 230 235 240
Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg
245 250 255
Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp
260 265 270
Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
275 280 285
Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile
290 295 300
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys
305 310 315 320
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
325 330 335
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
340 345 350
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
355 360 365
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
370 375 380
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
385 390 395 400
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
405 410 415
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
420 425 430
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
435 440 445
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
450 455 460
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
465 470 475 480
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
485 490 495
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
500 505 510
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
515 520 525
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
530 535 540
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
545 550 555 560
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys
565 570 575
Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr
580 585 590
Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro
595 600 605
Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser
610 615 620
Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro
625 630 635 640
Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser
645 650 655
Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala
660 665 670
Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly
675 680 685
Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
690 695 700
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
705 710 715 720
Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn
725 730 735
Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys
740 745 750
Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys
755 760 765
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
770 775 780
Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val
785 790 795 800
Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
805 810 815
Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser
820 825 830
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
835 840 845
Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala
850 855 860
Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
865 870 875 880
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
885 890 895
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
900 905 910
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
915 920 925
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
930 935 940
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
945 950 955 960
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
965 970 975
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
980 985 990
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
995 1000 1005
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
1010 1015 1020
Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg
1025 1030 1035
Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu
1040 1045 1050
Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu
1055 1060 1065
Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His
1070 1075 1080
Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro
1085 1090 1095
Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val
1100 1105 1110
Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe
1115 1120 1125
Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly
1130 1135 1140
Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp
1145 1150 1155
Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys
1160 1165 1170
Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile
1175 1180 1185
Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1190 1195 1200
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp
1205 1210 1215
Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr
1220 1225
<210> 14
<211> 1212
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 14
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro
20 25 30
Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val
35 40 45
Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe
50 55 60
Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn
65 70 75 80
Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val
85 90 95
Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn
115 120 125
Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp
130 135 140
Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu
145 150 155 160
Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr
165 170 175
Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe
180 185 190
Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys
195 200 205
Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln
210 215 220
Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn
225 230 235 240
Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr
245 250 255
Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr
260 265 270
Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn
275 280 285
Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu
290 295 300
Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln
305 310 315 320
Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro
325 330 335
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
340 345 350
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
355 360 365
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
370 375 380
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
385 390 395 400
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
405 410 415
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
420 425 430
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
435 440 445
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
450 455 460
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
465 470 475 480
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
485 490 495
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
500 505 510
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
515 520 525
Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys
530 535 540
Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu
545 550 555 560
Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala
565 570 575
Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp
580 585 590
Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr
595 600 605
Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr
610 615 620
Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg
625 630 635 640
Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu
645 650 655
Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile
660 665 670
Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg
675 680 685
Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser
690 695 700
Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile
705 710 715 720
Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser
725 730 735
Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser
740 745 750
Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln
755 760 765
Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr
770 775 780
Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile
785 790 795 800
Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser
805 810 815
Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val
820 825 830
Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly
835 840 845
Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu
850 855 860
Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr
865 870 875 880
Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala
885 890 895
Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe
900 905 910
Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu
915 920 925
Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu
930 935 940
Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln
945 950 955 960
Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe
965 970 975
Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys
980 985 990
Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln
995 1000 1005
Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu
1010 1015 1020
Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys
1025 1030 1035
Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr
1040 1045 1050
His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe
1055 1060 1065
Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr
1070 1075 1080
Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu
1085 1090 1095
Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg
1100 1105 1110
Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val
1115 1120 1125
Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val
1130 1135 1140
Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1145 1150 1155
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly
1160 1165 1170
Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu
1175 1180 1185
Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
1190 1195 1200
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr
1205 1210

Claims (12)

1.一种截短的Spike蛋白，其与野生的新型冠状病毒的Spike蛋白相比，C末端截短了67个氨基酸；
优选地，所述新型冠状病毒的Spike蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述截短的Spike蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种融合蛋白，其包含权利要求1的截短的Spike蛋白以及另外的多肽；
优选地，所述另外的多肽相对于所述截短的Spike蛋白是异源的；
优选地，所述另外的多肽任选地通过接头连接至所述截短的Spike蛋白的N端或C端；
优选地，所述另外的多肽选自标签、信号肽或导肽、可检测的标记(例如，荧光素酶(fluc)、绿色荧光蛋白(GFP))，或其任何组合；
优选地，所述信号肽选自Spike蛋白的天然信号肽、HGF(肝细胞生长因子)的天然信号肽和IgE(免疫球蛋白E)的天然信号肽；
优选地，所述信号肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，和SEQID NO:12；
优选地，所述融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。
3.一种核酸分子，其包含编码权利要求1的截短的Spike蛋白或者权利要求2的融合蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述编码截短的Spike蛋白或融合蛋白的核苷酸序列是根据宿主细胞(例如，人细胞)的密码子偏好性进行了密码子优化的或是未进行优化的；
优选地，所述核酸分子具有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7和SEQID NO:9。
4.一种载体，其包含权利要求3的核酸分子；
优选地，所述载体选自质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体；以及，病毒载体，例如逆转录酶病毒载体(例如慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体(如单纯疱疹病毒载体)、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体；
优选地，所述载体用于表达(例如在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达)所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白；
优选地，所述载体是用于基因治疗的载体，例如质粒，腺病毒载体，腺相关病毒载体，和慢病毒载体。
5.一种宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的核酸分子或根据权利要求4所述的载体；
优选地，所述宿主细胞选自原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)；
优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌DH5α细胞；或者所述宿主细胞是人细胞(例如，293T细胞)。
6.一种表达或产生权利要求1的截短的Spike蛋白或者权利要求2的融合蛋白的方法，所述方法包括，使用根据权利要求3所述的核酸分子或根据权利要求4所述的载体或根据权利要求5所述的宿主细胞；
优选地，所述方法包括，在允许蛋白表达的条件下，在宿主细胞中表达根据权利要求3所述的核酸分子或根据权利要求4所述的载体；以及任选地，回收宿主细胞中表达的截短的Spike蛋白或者融合蛋白。
7.根据权利要求3所述的核酸分子或根据权利要求4所述的载体或根据权利要求5所述的宿主细胞用于表达或产生所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白的用途；
例如，所述的核酸分子或载体用于在体外表达或产生所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白；
例如，所述的核酸分子或载体用于在细胞内表达或产生所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白；
例如，所述的核酸分子或载体用于在体外、在细胞内表达或产生所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白。
8.一种药物组合物，其含有根据权利要求1所述的截短的Spike蛋白或者根据权利要求2所述的融合蛋白或根据权利要求3所述的核酸分子或根据权利要求4所述的载体，以及任选地，药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，所述药物组合物通过注射进行施用；
优选地，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂；
优选地，所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白或核酸分子或载体以有效量(例如预防或治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病的有效量)存在；
优选地，所述的药物组合物以单位剂量形式存在。
9.权利要求8的药物组合物，其中，所述药物组合物为疫苗；
优选地，所述药物组合物还包含佐剂；
优选地，所述药物组合物为蛋白疫苗，其含有权利要求1的截短的Spike蛋白或者权利要求2的融合蛋白；
优选地，所述药物组合物为核酸疫苗，其含有权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体；
优选地，所述核酸疫苗为DNA疫苗。
10.一种制备权利要求8的药物组合物的方法，所述方法包括将权利要求1的截短的Spike蛋白或者权利要求2的融合蛋白或权利要求3所述的核实分子或权利要求4所述的载体与佐剂混合。
11.根据权利要求1所述的截短的Spike蛋白或者根据权利要求2所述的融合蛋白或根据权利要求3所述的核酸分子或根据权利要求4所述的载体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在受试者中预防或治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病；
优选地，所述疾病为新型冠状病毒肺炎；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人；
优选地，所述药物组合物通过注射来进行施用；
优选地，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂；
优选地，所述药物组合物包含有效量(例如预防或治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病的有效量)的所述截短的Spike蛋白或者融合蛋白或核酸分子或载体；
优选地，所述的药物组合物以单位剂量形式存在；
优选地，所述药物组合物为疫苗；
优选地，所述药物组合物还包含佐剂；
优选地，所述药物组合物为蛋白疫苗，其含有如前所述的截短的Spike蛋白或者如前所述的融合蛋白；
优选地，所述药物组合物为核酸疫苗，其含有如前所述的核酸分子或如前所述的载体；
优选地，所述核酸疫苗为DNA疫苗。
12.一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含有权利要求1所述的截短的Spike蛋白或含有权利要求2的融合蛋白；或者，所述类病毒颗粒由权利要求1所述的Spike蛋白或权利要求2的融合蛋白组成。
CN202011025055.XA 2020-09-25 2020-09-25 一种新型冠状病毒疫苗及其应用 Active CN112266411B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011025055.XA CN112266411B (zh) 2020-09-25 2020-09-25 一种新型冠状病毒疫苗及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011025055.XA CN112266411B (zh) 2020-09-25 2020-09-25 一种新型冠状病毒疫苗及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112266411A true CN112266411A (zh) 2021-01-26
CN112266411B CN112266411B (zh) 2022-06-24

Family

ID=74348748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011025055.XA Active CN112266411B (zh) 2020-09-25 2020-09-25 一种新型冠状病毒疫苗及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112266411B (zh)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112920278A (zh) * 2021-02-18 2021-06-08 青岛硕景生物科技有限公司 一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用
CN112979829A (zh) * 2021-04-29 2021-06-18 诺未科技（北京）有限公司 融合蛋白及其在制备靶向新冠病毒sars-cov-2的疫苗中的应用
CN113151196A (zh) * 2021-02-03 2021-07-23 深圳市华药康明生物药业有限责任公司 重组痘苗病毒、痘苗病毒载体疫苗及其应用与制备方法
CN113293202A (zh) * 2021-07-02 2021-08-24 广东莱恩医药研究院有限公司 一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用
CN113292640A (zh) * 2021-06-18 2021-08-24 国药中生生物技术研究院有限公司 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
CN113563483A (zh) * 2021-08-09 2021-10-29 广州明药科技有限公司 噬菌体展示新冠病毒衣壳蛋白及应用
US11241493B2 (en) 2020-02-04 2022-02-08 Curevac Ag Coronavirus vaccine
CN114032217A (zh) * 2021-11-02 2022-02-11 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 基于dna载体和复制型痘苗病毒载体的新冠病毒复合型疫苗
CN114560916A (zh) * 2021-05-18 2022-05-31 深圳市因诺转化医学研究院 SARS-CoV-2编码蛋白来源的T细胞表位多肽KLLEQWNLV及其应用
US11389528B2 (en) 2020-06-10 2022-07-19 Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof
CN114807179A (zh) * 2022-06-01 2022-07-29 广州达博生物制品有限公司 一种新型冠状病毒肺炎疫苗的构建与应用
US11471525B2 (en) 2020-02-04 2022-10-18 Curevac Ag Coronavirus vaccine
US11547673B1 (en) 2020-04-22 2023-01-10 BioNTech SE Coronavirus vaccine
US11872280B2 (en) 2020-12-22 2024-01-16 CureVac SE RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1938420A (zh) * 2003-12-02 2007-03-28 巴斯德研究所 由sars相关联冠状病毒新病毒株的基因组编码的蛋白质和肽的用途
CN101370516A (zh) * 2006-01-19 2009-02-18 美国政府（由卫生和人类服务部国立卫生研究院的部长所代表） SARS-CoV刺突糖蛋白的可溶片段
CN111603557A (zh) * 2020-06-15 2020-09-01 苏州奥特铭医药科技有限公司 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1938420A (zh) * 2003-12-02 2007-03-28 巴斯德研究所 由sars相关联冠状病毒新病毒株的基因组编码的蛋白质和肽的用途
CN101370516A (zh) * 2006-01-19 2009-02-18 美国政府（由卫生和人类服务部国立卫生研究院的部长所代表） SARS-CoV刺突糖蛋白的可溶片段
CN111603557A (zh) * 2020-06-15 2020-09-01 苏州奥特铭医药科技有限公司 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11241493B2 (en) 2020-02-04 2022-02-08 Curevac Ag Coronavirus vaccine
US11964012B2 (en) 2020-02-04 2024-04-23 CureVac SE Coronavirus vaccine
US11596686B2 (en) 2020-02-04 2023-03-07 CureVac SE Coronavirus vaccine
US11576966B2 (en) 2020-02-04 2023-02-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
US11471525B2 (en) 2020-02-04 2022-10-18 Curevac Ag Coronavirus vaccine
US11964011B2 (en) 2020-02-04 2024-04-23 CureVac SE Coronavirus vaccine
US11925694B2 (en) 2020-04-22 2024-03-12 BioNTech SE Coronavirus vaccine
US11547673B1 (en) 2020-04-22 2023-01-10 BioNTech SE Coronavirus vaccine
US11389528B2 (en) 2020-06-10 2022-07-19 Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof
US11918643B2 (en) 2020-12-22 2024-03-05 CureVac SE RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants
US11872280B2 (en) 2020-12-22 2024-01-16 CureVac SE RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants
CN113151196A (zh) * 2021-02-03 2021-07-23 深圳市华药康明生物药业有限责任公司 重组痘苗病毒、痘苗病毒载体疫苗及其应用与制备方法
CN112920278A (zh) * 2021-02-18 2021-06-08 青岛硕景生物科技有限公司 一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用
CN112979829A (zh) * 2021-04-29 2021-06-18 诺未科技（北京）有限公司 融合蛋白及其在制备靶向新冠病毒sars-cov-2的疫苗中的应用
CN114560916A (zh) * 2021-05-18 2022-05-31 深圳市因诺转化医学研究院 SARS-CoV-2编码蛋白来源的T细胞表位多肽KLLEQWNLV及其应用
CN113292640A (zh) * 2021-06-18 2021-08-24 国药中生生物技术研究院有限公司 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
CN113292640B (zh) * 2021-06-18 2021-12-24 国药中生生物技术研究院有限公司 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
CN113293202A (zh) * 2021-07-02 2021-08-24 广东莱恩医药研究院有限公司 一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用
CN113293202B (zh) * 2021-07-02 2022-02-22 广东莱恩医药研究院有限公司 一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用
CN113563483B (zh) * 2021-08-09 2024-02-02 广州明药科技有限公司 噬菌体展示新冠病毒衣壳蛋白及应用
CN113563483A (zh) * 2021-08-09 2021-10-29 广州明药科技有限公司 噬菌体展示新冠病毒衣壳蛋白及应用
CN114032217A (zh) * 2021-11-02 2022-02-11 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 基于dna载体和复制型痘苗病毒载体的新冠病毒复合型疫苗
CN114807179A (zh) * 2022-06-01 2022-07-29 广州达博生物制品有限公司 一种新型冠状病毒肺炎疫苗的构建与应用
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
CN112266411B (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112266411B (zh) 一种新型冠状病毒疫苗及其应用
CN112481289B (zh) 一种转录环状rna的重组核酸分子及其在蛋白表达中的应用
EP1991560B1 (en) Peptide having cell membrane penetrating activity
CN113230395B (zh) 一种β冠状病毒抗原、β冠状病毒二联疫苗及其制备方法和应用
Loeken et al. Trans-activation of RNA polymerase II and III promoters by SV40 small t antigen
CN112575008B (zh) 编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子以及新型冠状病毒疫苗
CN113943373B (zh) 一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用
CN113736801B (zh) mRNA及包含其的新冠病毒mRNA疫苗
CN110950934B (zh) 一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用
CN112680424A (zh) 一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法
CN114560915B (zh) 一种改造的高滴度SARS-CoV-2假病毒
CN113293178A (zh) 基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法
WO2021206587A1 (en) Sars-cov-2 dna vaccine based on gene therapy dna vector gdtt1.8nas12
WO2012069657A1 (en) Identification of a human gyrovirus and applications.
CN113637695B (zh) 靶向刺激体液免疫和细胞免疫的新冠病毒mRNA疫苗
US20230391836A1 (en) Amino acid sequence that can destroy cells, and related nucleotide sequence and related uses thereof
CN113061168B (zh) 一种截短的发热伴血小板减少综合征病毒Gn蛋白及其应用
WO2022116528A1 (zh) 环状rna、包含环状rna的疫苗及用于检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒
Heider et al. Comparative investigation of the long non-coding MF genome region of wild-type and vaccine measles viruses
CN116549627A (zh) 基于腺病毒载体的广谱新冠疫苗及其应用
CN113880924A (zh) 一种SARS-CoV-2假病毒
CN115916804A (zh) 稳定的冠状病毒刺突蛋白融合蛋白
CN116555351A (zh) 一种核酸构建体
CN105968211B (zh) 一种重组抗病毒蛋白及其制备方法和应用
CN111778279B (zh) 一种HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant