CN112680424A - 一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法。所述方法包括：将A型流感病毒神经氨酸酶的信号肽及跨膜区氨基酸序列替换人转铁蛋白受体的跨膜区，将目的基因优化合成基因序列；所述基因序列经EcoRI和NotI双酶切获得带有酶切位点的目的片段，利用EcoRI和NotI双酶切昆虫细胞表达载体pFastBac1，纯化回收酶切后的目的片段和线性化载体，并通过T4DNA连接酶进行连接反应，得连接产物；所述连接产物转化至DH10Bac感受态细胞，经抗性蓝白斑筛选、分离，得重组杆状病毒穿梭载体reBacmid‑hTfR；将reBacmid‑hTfR转染Sf9昆虫细胞，经三次细胞传代培养，得重组杆状病毒。所述重组杆状病毒复制过程中能够在细胞膜表面表达hTfR，并保持其抗原性与可溶性，可用于后续研制其抗体及生物学功能。

Description

一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法。

背景技术

人转铁蛋白受体(human transferrin receptor，hTfR)，又称为CD71分子，是一种广泛分布于人体组织或细胞的跨膜糖蛋白，其功能是通过与转铁蛋白(transferrin，Tf)的特异性结合来参与和介导铁的吸收，在细胞的生长、增殖以及分化过程中发挥了重要作用。人转铁蛋白受体基因位于第3号染色体上(3q26)，基因组全长约31kb，包含19个外显子和18个内含子，转录后形成的mRNA长约5kb，其中位于5’端的外显子1不参与蛋白质编码，外显子2～19编码蛋白，编码生成一个含有760个氨基酸残基的单体，人转铁蛋白受体是由两个相同的亚基通过二硫键结合而形成的同源二聚。人转铁蛋白受体几乎在人体所有正常细胞均有低水平表达，而在基底上皮细胞、肠上皮细胞及肿瘤细胞等高增殖率的细胞中，人转铁蛋白受体表达水平较高，在恶性肿瘤细胞中的表达最高可达正常细胞的100倍。在肿瘤细胞表面高表达，具有内吞特性，在人类肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，使其成为运载胞毒药物治疗癌症的热点靶标。目前以转铁蛋白受体为靶点的肿瘤靶向治疗研究备受关注，能够有效递呈治疗药物人胞，包括化疗药物、细胞毒蛋白、大分子复合物等；从而产生胞毒效应，在患者体内及体外的一系列恶性肿瘤中引起生长抑制，诱导凋亡。有研究表明，可以从胎盘中提取转铁蛋白受体，但提取量相对较少，且与胎盘的新鲜程度有较大关联。因此，研发一种体外高效表达具有天然结构的人转铁蛋白受体的方法，对深入研究以转铁蛋白受体为靶点的生物学研究是十分必要的。

体外基因表达系统包括原核表达系统和真核表达系统，原核表达系统主要以大肠杆菌为生物反应器获得重组蛋白质，其优点是操作简单、周期短、成本较低，但是其不足之处亦不能忽视，如由于大肠杆菌内缺少相应的修饰酶不能对表达产物进行相应的转录后加工、修饰，容易产生缺乏天然构象的包涵体。真核表达系统包括CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。当前，昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们关注。昆虫细胞表达系统用杆状病毒做载体，可高效表达外源基因，到目前为止已有几百个包括动植物、病毒、细菌、真菌的基因在昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达。这个表达体系的主要特点是可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配。因此是表达有生物活性的蛋白质的理想载体。

发明内容

为此，本发明提供一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，以达到体外高效表达具有天然结构的人转铁蛋白受体的效果。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，所述方法包括：

步骤一、利用A型流感病毒神经氨酸酶的信号肽及跨膜区氨基酸序列替换人转铁蛋白受体前88氨基酸，得到人转铁蛋白受体蛋白，同时将编码该人转铁蛋白受体蛋白的目的基因送公司优化并合成基因序列，得hTfR基因；

步骤二、所述目的基因序列经过EcoRI和NotI双酶切获得带有酶切位点的目的片段，利用EcoRI和NotI双酶切昆虫细胞表达载体pFastBac1，并分别纯化回收、酶切后的目的片段和线性化载体，对目的片段和线性化载体通过T4 DNA连接酶进行连接反应，得连接产物pFastBac1-hTfR转移载体；

步骤三、将所述连接产物pFastBac1-hTfR转移载体转化至DH10Bac感受态细胞，经抗性蓝白斑筛选、分离，得到重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-hTfR；

步骤四、将所述重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-hTfR转染Sf9昆虫细胞，经三次细胞传代培养，即得可表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒。

进一步的，所述步骤一中，所述杆状病毒包含A型流感病毒神经氨酸酶的信号肽和跨膜区。

进一步的，所述A型流感病毒为H1N1。

进一步的，所述人转铁蛋白受体核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，所述编码该人转铁蛋白受体蛋白的目的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

进一步的，所述步骤二连接反应的条件是16℃连接1h。

进一步的，所述跨膜区氨基酸序列为A型流感病毒神经氨酸酶的信号肽及跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO:4的第1-27位所示。

进一步的，所述人转铁蛋白受体前88氨基酸序列如SEQ ID NO:1的第1-88位所示。

进一步的，所述步骤二中，连接反应体系为T4 DNA连接酶1μL，10*Buffer 1μL，载体1μL，目的基因7μL。

DH5α感受态细胞是采用大肠杆菌DH5α菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测，转化效率可达10⁸个转化子/μg质粒DNA，-70℃保存3个月转化效率可保持在90％以上。

dd H₂O是指双蒸水。

本发明具有如下优点：

本发明的重组蛋白质，包含A型流感病毒神经氨酸酶的信号肽及跨膜区，因此其能够较好的表达在细胞膜表面。

本发明的重组杆状病毒，利用杆状病毒的递呈作用，在昆虫细胞中能成功表达出hTfR重组蛋白质，所述昆虫细胞中表的hTfR重组蛋白质，由于翻译后的准确修饰和正确折叠，保持了其抗原性与可溶性，并能够表达在细胞膜表面，可用于后续研制其抗体及生物学功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明提供的一种原始人转铁蛋白受体胞内区、跨膜区和胞外区序列分析；

其中，1为胞内区，2为跨膜区，3是胞外区。

图2为本发明提供的pFastBac1-hTFR质粒双酶切鉴定结果；

Mark为Trans 5K DNA Marker，pFastBac1载体为4755bp，目的片段大小为2100bp；

其中，M为DNA分子量标准；1为pFastBac1-hTfR载体的双酶切产物。

图3为本发明提供的蓝白斑筛选含重组杆状病毒质粒的PCR鉴定结果；

其中，M为DNA分子量标准，1为白色菌落提取的重组杆状病毒质粒DNA扩增产物，2为蓝色菌落提取的重组杆状病毒质粒DNA扩增产物，3为空白对照。

图4为本发明提供的接毒细胞/正常细胞上清提取杆状病毒基因组DNA后进行PCR验证；为保证实验准确性，重复做两次本实验，PCR验证结果；

其中，M为DNA分子量标准，1为接毒细胞上清液，2为空白对照细胞上清液。

图5为本发明提供的接毒细胞转铁蛋白受体表达IFA检测明场结果。

图6为本发明提供的接毒细胞转铁蛋白受体表达IFA检测DAPI染色结果。

图7为本发明提供的接毒细胞转铁蛋白受体表达IFA检测兔抗hTfR单抗结果。

图8为本发明提供的正常细胞转铁蛋白受体表达IFA检测明场结果。

图9为本发明提供的正常细胞转铁蛋白受体表达IFA检测DAPI染色结果。

图10为本发明提供的正常细胞转铁蛋白受体表达IFA检测兔抗hTfR单抗结果。

图11为本发明提供的接毒细胞转铁蛋白受体表达Western Blot鉴定；

其中，M为蛋白Mark，1为正常Sf9细胞裂解液，2为接毒Sf9细胞裂解液。

图12为本发明提供的正常细胞转铁蛋白受体表达Western blot鉴定；

其中，M为蛋白Mark，1为正常Sf9细胞裂解液，2为接毒Sf9细胞裂解液。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料

DH10Bac感受态细胞沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室保存

昆虫细胞表达载体pFastBac1沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室保存

Sf9昆虫细胞 沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室保存

E.coil DH5α感受态细胞 北京全式金生物技术有限公司

PrimerSTAR Max DNA Polymerase TaKaRa公司

限制性内切酶Not I和EcoR I TaKaRa公司

T4 DNA连接酶 TaKaRa公司

DNA纯化试剂盒 TaKaRa公司

小型提质粒抽提试剂盒 TaKaRa公司

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 天根公司

SF900II无血清培养基 美国Gibco公司

胎牛血清 BI公司

青链霉素(双抗) 北京迈晨生物技术公司

LipoInsect^TM转染试剂 碧云天公司

杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒 碧云天公司

5×SDS-PAGE上样缓冲液 碧云天公司

碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗兔IgG(H+L) 碧云天公司

BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒 碧云天公司

甘氨酸 北京酷来搏科技有限公司

牛血清白蛋白Ⅴ(BSA) 索来宝公司

Alexa Flour@488goat anti-rabbit Ig(H+L) 上海Invitrogen公司

ProLong^TM Gold Antifade Mountant with DAPI Thermon Fisher公司

CD71兔源单抗 Cell Signaling公司

DNA标准Mark 北京全式金公司

PageRuler^TM Prestained Protein Ladder Thermo Fisher公司

实施例1含hTfR基因重组杆状病毒的构建

步骤一、hTfR基因优化与合成

根据GenBank(登录号：NM_001128148)的hTfR基因序列(SEQ ID NO:1)、转录氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，确定其胞内区、跨膜区和胞外区，如图1，由生物信息学在线软件分析(TMHMM-2.0)分析得知，该蛋白质属于Ⅱ型跨膜蛋白质，其中1-88位氨基酸残基(aa)位于细胞内，89-760位氨基酸残基位于细胞外。

为了有利于人转铁蛋白受体表达在Sf9细胞膜表面，选择A型流感病毒[InfluenzaA virus(A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))]神经氨酸酶(Gene ID:ABD77678.1)的信号肽及跨膜区氨基酸序列(1-27aa)替换人转铁蛋白受体前88aa，得到替换后的人转铁蛋白受体氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，同时将目的基因送生工生物工程(上海)股份有限公司优化并合成基因序列如SEQ ID NO:4所示，得到的目的基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成质粒pUC57-hTfR。

步骤二、pFastBac1-hTfR转移载体的构建

用EcoRI和NotI双酶切含有目的基因的合成质粒pUC57-hTfR和pFastBac1载体，并用DNA纯化试剂盒分别纯化回收目的片段和线性化的pFastBac1载体，将纯化后的目的片段与载体通过T4 DNA连接酶，16℃连接1h，得到pFastBac1-hTfR转移载体，连接反应体系如表1所示。

表1连接反应体系

总体积	10μL
		T4 DNA连接酶	1μL
10*Buffer	1μL
		载体	1μL
目的基因	7μL

将连接产物pFastBac1-hTfR转移载体转化到DH5α感受态细胞中，取200μL菌液涂布Amp⁺LB固体培养板，37℃恒温培养箱培养12h，从LB琼脂培养皿上挑取形状规则单一菌落至含Amp⁺抗性的LB液体培养基中，于37℃培养12h。经菌液PCR鉴定后阳性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并抽提测序正确的阳性菌落的质粒，用EcoRI和NotI双酶切验证，结果得到与预期相符的两条目的条带，如图2。表明pFastBac1-hTfR转移载体构建成功。

步骤三、重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-hTfR的构建与鉴定

将步骤二的反应产物pFastBac1-hTfR转移载体转化到DH10Bac感受态细胞，涂布在X-gal三抗性琼脂平板，于37℃恒温培养48-72h，通过蓝白斑筛选，挑取含重组杆状病毒质粒的白色克隆菌到三抗LB液体培养基中培养，并用杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒抽提重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-hTfR；

随后用Bac to Bac杆状病毒载体通用引物进行PCR分析重组杆状病毒质粒DNA，如表2，结果蓝色菌落提取的重组杆状病毒质粒DNA的扩增产物大小约为300bp，白色菌落提取的重组杆状病毒质粒DNA的扩增产物约为4600bp，如图3。

表2重组杆状病毒质粒DNA的PCR反应体系

总体积	50μL
		Primer Star MIX	25μL
pUC/M13-F	1μL
		pUC/M13-R	1μL
重组杆状病毒质粒DNA	1μL
		dd H<sub>2</sub>O	22μL

步骤四、重组杆状病毒毒株的获取

将2μL步骤三所制得的重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-hTfR和5μL脂质体加到100μL无血清SF900 II培养基中，轻轻混匀，室温静置5min。将混合液转染处于对数生长期的Sf9昆虫细胞，设置空白对照组。27℃培养72h后，收集上清培养液，此为第一代重组杆状病毒毒株。收集上清培养液后，继续经三次细胞传代培养后获得高效价重组杆状病毒毒株。

实施例2hTfR融合蛋白质在Sf9细胞中的表达与鉴定

1.检测reBacmid-hTfR转染Sf9昆虫细胞

通过基因组DNA提取试剂盒提实施例1所获得的三次细胞传代培养的上清液中杆状病毒基因组DNA，并用pUC/M13-F/R特异性引物进行PCR验证，结果如图4所示。由PCR验证可见reBacmid-hTfR成功转染Sf9昆虫细胞。

2.hTfR融合蛋白质的分析

2.1间接免疫荧光检测

Sf9昆虫细胞以1*10⁶的密度铺12孔板，经重组杆状病毒毒株感染后培养72h，小心弃去上层培养液后，用冷PBS洗三次，细胞晾干15-30s后，用4％多聚甲醛室温，固定15min，再用冷PBS洗三次，然后用封闭液(含1％BSA和22.52mg/ml甘氨酸的PBST)37℃封闭1h，接着用兔源hTfR单克隆抗体为一抗(稀释液为1％BSA的PBST)，37℃孵育1h后，PBST洗三次，用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(H+L)作为二抗(稀释液为1％BSA的PBST)，37℃孵育1h，PBST洗三次，PBS洗三次，晾干3min后，滴加含有DAPI和抗荧光淬灭剂的ProLong^TM GoldAntifade Mountant with DAPI，用指甲油封片后，在正置荧光显微镜观察。结果发现感染组细胞表面能够检测到明显的绿色荧光如图5、图6、图7所示，而对照组则无荧光现象如图8、图9、图10所示，表明重组杆状病毒感染Sf9细胞过程中成功表达hTfR重组蛋白质质。

2.2Western blot检测hTfR重组蛋白质

Sf9昆虫细胞以1*10⁶的密度铺12孔板，经重组杆状病毒株感染后培养72h，小心弃去上层培养液后，用PBS洗三次，经细胞裂解液裂解细胞后，12000rpm离心10min后取上清，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，煮13min，待样品冷却到室温后进行SDS-PAGE和Westernblot分析。用含1％BSA和22.52mg/mL甘氨酸的PBST作为封闭液，用兔源hTfR单克隆抗体为一抗，碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)为二抗对目的蛋白进行鉴定。结果表明，感染重组杆状病毒的细胞裂解液上清中能够在80kDa处有明显的特异条带见图11，而正常细胞裂解液上清无条带见图12。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法

<130> GG20877710A

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5012

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agagcgtcgg gatatcgggt ggcggctcgg gacggaggac gcgctagtgt tcttctgtgt 60

ggcagttcag aatgatggat caagctagat cagcattctc taacttgttt ggtggagaac 120

cattgtcata tacccggttc agcctggctc ggcaagtaga tggcgataac agtcatgtgg 180

agatgaaact tgctgtagat gaagaagaaa atgctgacaa taacacaaag gccaatgtca 240

caaaaccaaa aaggtgtagt ggaagtatct gctatgggac tattgctgtg atcgtctttt 300

tcttgattgg atttatgatt ggctacttgg gctattgtaa aggggtagaa ccaaaaactg 360

agtgtgagag actggcagga accgagtctc cagtgaggga ggagccagga gaggacttcc 420

ctgcagcacg tcgcttatat tgggatgacc tgaagagaaa gttgtcggag aaactggaca 480

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ctggatctca aaaagatgaa aatcttgcgt tgtatgttga aaatcaattt cgtgaattta 600

aactcagcaa agtctggcgt gatcaacatt ttgttaagat tcaggtcaaa gacagcgctc 660

aaaactcggt gatcatagtt gataagaacg gtagacttgt ttacctggtg gagaatcctg 720

ggggttatgt ggcgtatagt aaggctgcaa cagttactgg taaactggtc catgctaatt 780

ttggtactaa aaaagatttt gaggatttat acactcctgt gaatggatct atagtgattg 840

tcagagcagg gaaaatcacc tttgcagaaa aggttgcaaa tgctgaaagc ttaaatgcaa 900

ttggtgtgtt gatatacatg gaccagacta aatttcccat tgttaacgca gaactttcat 960

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atcacactca gtttccacca tctcggtcat caggattgcc taatatacct gtccagacaa 1080

tctccagagc tgctgcagaa aagctgtttg ggaatatgga aggagactgt ccctctgact 1140

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tagacaatgc tgctttccct ttccttgcat attctggaat cccagcagtt tctttctgtt 1740

tttgcgagga cacagattat ccttatttgg gtaccaccat ggacacctat aaggaactga 1800

ttgagaggat tcctgagttg aacaaagtgg cacgagcagc tgcagaggtc gctggtcagt 1860

tcgtgattaa actaacccat gatgttgaat tgaacctgga ctatgagagg tacaacagcc 1920

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ttatcagtga cagagttcac tataaatggt gtttttttaa tagaatataa ttatcggaag 3300

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tagaaaacag ccgtcagcca aatgtaattg aataaagttg aagctaagat ttagagatga 3480

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cctaaatgca gtgaattgtg accaagttat aaatcaatgt cacttaaagg ctgtggtagt 3600

actcctgcaa aattttatag ctcagtttat ccaaggtgta actctaattc ccattttgca 3660

aaatttccag tacctttgtc acaatcctaa cacattatcg ggagcagtgt cttccataat 3720

gtataaagaa caaggtagtt tttacctacc acagtgtctg tatcggagac agtgatctcc 3780

atatgttaca ctaagggtgt aagtaattat cgggaacagt gtttcccata attttcttca 3840

tgcaatgaca tcttcaaagc ttgaagatcg ttagtatcta acatgtatcc caactcctat 3900

aattccctat cttttagttt tagttgcaga aacattttgt ggtcattaag cattgggtgg 3960

gtaaattcaa ccactgtaaa atgaaattac tacaaaattt gaaatttagc ttgggttttt 4020

gttaccttta tggtttctcc aggtcctcta cttaatgaga tagtagcata catttataat 4080

gtttgctatt gacaagtcat tttaacttta tcacattatt tgcatgttac ctcctataaa 4140

cttagtgcgg acaagtttta atccagaatt gaccttttga cttaaagcag agggactttg 4200

tatagaaggt ttgggggctg tggggaagga gagtcccctg aaggtctgac acgtctgcct 4260

acccattcgt ggtgatcaat taaatgtagg tatgaataag ttcgaagctc cgtgagtgaa 4320

ccatcattat aaacgtgatg atcagctgtt tgtcataggg cagttggaaa cggcctccta 4380

gggaaaagtt catagggtct cttcaggttc ttagtgtcac ttacctagat ttacagcctc 4440

acttgaatgt gtcactactc acagtctctt taatcttcag ttttatcttt aatctcctct 4500

tttatcttgg actgacattt agcgtagcta agtgaaaagg tcatagctga gattcctggt 4560

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ttagggttga gttacttcct atcaagccag tacgtgctaa caggctcaat attcctgaat 4740

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ccttttggag gtaaaggata aaatgaatga gttctgtcat gattcactat tctagaactt 4860

gcatgacctt tactgtgtta gctctttgaa tgttcttgaa attttagact ttctttgtaa 4920

acaaatgata tgtccttatc attgtataaa agctgttatg tgcaacagtg tggagattcc 4980

ttgtctgatt taataaaata cttaaacact ga 5012

<210> 2

<211> 760

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu

1 5 10 15

Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp

20 25 30

Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala

35 40 45

Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly

50 55 60

Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly

65 70 75 80

Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr

85 90 95

Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro

100 105 110

Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys

115 120 125

Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile

130 135 140

Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln

145 150 155 160

Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe

165 170 175

Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val

180 185 190

Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg

195 200 205

Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys

210 215 220

Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys

225 230 235 240

Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile

245 250 255

Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu

260 265 270

Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe

275 280 285

Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly

290 295 300

Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln

305 310 315 320

Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr

325 330 335

Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp

340 345 350

Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser

355 360 365

Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile

370 375 380

Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp

385 390 395 400

His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala

405 410 415

Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met

420 425 430

Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile

435 440 445

Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr

450 455 460

Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr

465 470 475 480

Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val

485 490 495

Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn

500 505 510

Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp

515 520 525

Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe

530 535 540

Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp

545 550 555 560

Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu

565 570 575

Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu

580 585 590

Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn

595 600 605

Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp

610 615 620

Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln

625 630 635 640

Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu

645 650 655

Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys

660 665 670

Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro

675 680 685

Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser

690 695 700

Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys

705 710 715 720

Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala

725 730 735

Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp

740 745 750

Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe

755 760

<210> 3

<211> 699

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val

1 5 10 15

Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Cys Lys Gly Val Glu

20 25 30

Pro Lys Thr Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg

35 40 45

Glu Glu Pro Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp

50 55 60

Asp Leu Lys Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr

65 70 75 80

Gly Thr Ile Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala

85 90 95

Gly Ser Gln Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe

100 105 110

Arg Glu Phe Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys

115 120 125

Ile Gln Val Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys

130 135 140

Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala

145 150 155 160

Tyr Ser Lys Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe

165 170 175

Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser

180 185 190

Ile Val Ile Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala

195 200 205

Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln

210 215 220

Thr Lys Phe Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala

225 230 235 240

His Leu Gly Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn

245 250 255

His Thr Gln Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro

260 265 270

Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met

275 280 285

Glu Gly Asp Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met

290 295 300

Val Thr Ser Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu

305 310 315 320

Lys Glu Ile Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val

325 330 335

Glu Pro Asp His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly

340 345 350

Pro Gly Ala Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu

355 360 365

Ala Gln Met Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser

370 375 380

Arg Ser Ile Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val

385 390 395 400

Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys

405 410 415

Ala Phe Thr Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn

420 425 430

Phe Lys Val Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr

435 440 445

Met Gln Asn Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp

450 455 460

Ser Asn Trp Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala

465 470 475 480

Phe Pro Phe Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe

485 490 495

Cys Glu Asp Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr

500 505 510

Lys Glu Leu Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala

515 520 525

Ala Ala Glu Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val

530 535 540

Glu Leu Asn Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe

545 550 555 560

Val Arg Asp Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu

565 570 575

Ser Leu Gln Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr

580 585 590

Ser Arg Leu Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe

595 600 605

Val Met Lys Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe

610 615 620

Leu Ser Pro Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe

625 630 635 640

Trp Gly Ser Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys

645 650 655

Leu Arg Lys Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn

660 665 670

Gln Leu Ala Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu

675 680 685

Ser Gly Asp Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe

690 695

<210> 4

<211> 2100

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atgaacccta accagaagat catcaccatc ggttctatct gcctggtggt gggactgatc 60

tctctgatcc tgcagatcgg ctgcaagggt gtggagccca agaccgagtg cgagcgcctg 120

gccggcaccg agtctcccgt ccgcgaggag cccggtgagg acttccccgc tgctcgcaga 180

ttgtactggg acgacttgaa gcgtaagctg tccgagaagc tggactctac cgacttcacc 240

ggcaccatca agctgctgaa cgagaactct tacgtgcccc gcgaggctgg ttcccagaag 300

gacgaaaacc tggctctgta cgtggagaac cagttccgtg agttcaagct gtctaaggtc 360

tggcgcgacc agcacttcgt gaagatccag gtcaaggact ccgctcagaa ctccgtgatc 420

atcgtggaca agaacggtag gctggtgtac ctggtcgaga accccggcgg atacgtggcc 480

tactcaaagg ctgccactgt gactggcaag ctggtgcacg ctaacttcgg caccaagaag 540

gacttcgagg acctgtacac ccctgtgaac ggtagcatcg tgatcgtgcg tgctggaaag 600

attaccttcg ctgagaaggt ggctaacgct gagagcctga acgctatcgg cgtcctgatc 660

tacatggacc agaccaagtt ccctatcgtg aacgctgagc tgtctttctt cggtcacgcc 720

caccttggca ctggtgaccc ttacacccct ggtttcccat ccttcaacca cacccagttc 780

cctccttcac gtagctccgg tctgcctaac atcccagtgc agaccatcag ccgcgccgct 840

gctgagaagc tgttcggtaa catggaaggt gactgcccta gcgactggaa gaccgacagc 900

acctgcagga tggtgacctc cgagtccaag aacgtgaagc tgaccgtgtc aaacgtgctg 960

aaggagatca agatcctgaa catcttcggt gtgatcaagg gtttcgtgga acctgaccac 1020

tacgtggtgg tgggtgctca gcgcgacgct tggggtcctg gtgctgctaa gtccggtgtg 1080

ggtactgcgc tgttgctgaa gctggctcag atgttcagcg acatggtgct gaaggacggc 1140

ttccagcctt cccgctctat catcttcgct agctggtcag ctggtgactt cggttccgtg 1200

ggagctaccg agtggctgga gggttacctg agctccttgc acctgaaggc cttcacctac 1260

atcaacctgg acaaggctgt gctgggcact agcaacttca aggtgagcgc ttcccccctg 1320

ctgtacaccc tgatcgaaaa gacaatgcag aacgtgaagc accccgtgac cggtcagttc 1380

ctgtaccaag acagtaactg ggcctcaaag gtggagaagc tgactctgga caacgctgct 1440

ttccctttcc tggcctactc cggcatccct gccgtgtcct tctgcttctg cgaagacacc 1500

gactaccctt acctgggtac aactatggac acctacaagg agctgatcga gcgcatcccc 1560

gagttgaaca aggtggctcg cgccgctgct gaagtggccg gccagttcgt catcaagctc 1620

acccacgacg tggagctgaa cctggactac gagcgctaca actcccagct gctgagcttc 1680

gtccgcgacc tgaaccagta ccgcgctgac atcaaggaga tgggcctgag cctgcagtgg 1740

ttgtactccg ctcgcggtga cttcttccgt gctacctccc gcttgaccac cgacttcggt 1800

aacgctgaga agactgaccg tttcgtgatg aagaagctga acgaccgtgt gatgagggtc 1860

gagtaccact tcctgtcccc ttacgtgtcc cccaaggagt cccctttccg tcacgtgttc 1920

tggggaagcg gctctcacac cctgcctgcc ctgctggaga acctgaagct gcgtaagcaa 1980

aacaacggag ccttcaacga gaccctgttc cgcaaccagc tggctctggc tacctggacc 2040

atccagggtg ctgctaacgc tctgagcggt gacgtgtggg acatcgacaa cgagttctaa 2100

Claims (9)

1.一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤一、利用A型流感病毒神经氨酸酶的信号肽及跨膜区氨基酸序列替换人转铁蛋白受体前88氨基酸，得到人转铁蛋白受体蛋白，同时将编码该人转铁蛋白受体蛋白的目的基因送公司优化并合成基因序列，得hTfR基因；

步骤二、所述目的基因序列经过EcoRI和NotI双酶切获得带有酶切位点的目的片段，利用EcoRI和NotI双酶切昆虫细胞表达载体pFastBac1，并分别纯化回收、酶切后的目的片段和线性化载体，对目的片段和线性化载体通过T4 DNA连接酶进行连接反应，得连接产物pFastBac1-hTfR转移载体；

步骤三、将所述连接产物pFastBac1-hTfR转移载体转化至DH10Bac感受态细胞，经抗性蓝白斑筛选、分离，得到重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-hTfR；

步骤四、将所述重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-hTfR转染Sf9昆虫细胞，经三次细胞传代培养，即得可表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒。

2.根据权利要求1所述一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述杆状病毒包含A型流感病毒神经氨酸信号肽和跨膜区。

3.根据权利要求2所述一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述A型流感病毒为H1N1。

4.根据权利要求1所述一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述人转铁蛋白受体核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求1所述一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述编码该人转铁蛋白受体蛋白的目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.根据权利要求1所述一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤二连接反应的条件是16℃连接1h。

7.根据权利要求1所述一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述跨膜区氨基酸序列为A型流感病毒神经氨酸酶的信号肽及跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO:4的第1-27位所示。

8.根据权利要求1所述一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述人转铁蛋白受体前88氨基酸序列如SEQ ID NO:1的第1-88位所示。

9.根据权利要求1所述一种表达人转铁蛋白受体的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，连接反应体系为T4 DNA连接酶1μL，10*Buffer 1μL，载体1μL，目的基因7μL。

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