CN111303295A - 一种重组嵌合膜蛋白细胞株及其应用 - Google Patents

一种重组嵌合膜蛋白细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组嵌合膜蛋白细胞株及其应用，具体地，本发明提供一种嵌合SIRPα蛋白受体，包括细胞外结构域、任选的绞链区、跨膜结构域、和细胞内结构域；其中，所述细胞外结构域包括SIRPα胞外结构域。本发明还提供了工程细胞株，该细胞株的基因组中整合有表达外源的嵌合SIRPα蛋白受体(CSR分子)的表达盒，并且，所述细胞株不表达CD47。本发明的细胞株可用于筛选针对CD47或SIRPα特异性分子药物，并且具有稳定性好、靶点特异性高等特点。

Description

一种重组嵌合膜蛋白细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组嵌合膜蛋白细胞株及其应用。
背景技术
SIRPα是信号调节蛋白家族(signal regulatory proteins,SIRPs)中典型的抑制性受体，可与体内广泛存在的跨膜糖蛋白CD47相互作用，传递抑制性信号。
由于CD47广泛表达于多种肿瘤细胞，肿瘤细胞可通过CD47-SIRPa信号通路逃逸巨噬细胞的免疫监视。因此通过CD47抗体或受体阻断CD47与SIRPa的结合可以激活巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用，以及DC细胞的抗原递呈作用。
近年来针对CD47靶点药物的开发越来越得到医药研发领域的重视，有关其在细胞水平上的生物学活性分析又是必不可少的。传统的分析方法通过淋巴细胞分离液从人的外周血分离外周血单个核细胞(PBMC)，进一步采用磁珠分选方式获取单核细胞，再通过长时间的刺激、培养使其分化为巨噬细胞，才能将其用于研究CD47靶向药促进吞噬肿瘤细胞能力的检测。该方法可操作性低、周期长、成本高、通量低、且不能用于今后药物的放行检测。
因此，本领域迫切需要开发一种重组嵌合膜蛋白细胞株，用于筛选针对CD47或SIRPα特异性分子药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组嵌合膜蛋白细胞株，用于筛选针对CD47或SIRPα特异性分子药物。
本发明的第一方面，提供了一种嵌合SIRPα蛋白受体，所述嵌合SIRPα蛋白受体包括细胞外结构域、任选的绞链区、跨膜结构域、和细胞内结构域；其中，所述细胞外结构域包括SIRPα胞外结构域。
在另一优选例中，所述嵌合SIRPα蛋白受体(CSR)包含从N端到C端的SIRPα胞外结构域、绞链区、跨膜结构域、和细胞内结构域。
在另一优选例中，所述细胞内结构域包括CD28的胞浆信号传导序列、和/或CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述细胞内结构域还包括共刺激信号传导区。
在另一优选例中，所述嵌合SIRPα蛋白受体具有式I结构：
L-Z1-H-Z2-Z2’-Z3 (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为无或信号肽序列；
Z1为SIRPα胞外结构域；
H为无或铰链区；
Z2为跨膜结构域；
Z2’为CD28的胞浆信号传导序列或任选的共刺激信号传导区；
Z3为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述SIRPα胞外结构域选自下组：
(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白；
(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或
(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上(较佳地≥95％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中，编码所述SIRPα胞外结构域的核苷酸序列选自下组：
(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％、≥90％、≥95％或≥98％)，且具有与CD47结合活性的多核苷酸；
(c)如SEQ ID NO:3所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-6个)核苷酸，且具有与CD47(尤其是人CD47)结合活性的多核苷酸。
在另一优选例中，所述SIRPα胞外结构域为人源。
在另一优选例中，所述SIRPα胞外结构域靶向或结合于人CD47蛋白。
在另一优选例中，所述的铰链区选自下组的一种或多种蛋白：CD8α、CD28、CD137、IgG1或其组合。
在另一优选例中，所述的绞链区为选自下组的蛋白的绞链区：CD8α。
在另一优选例中，所述的跨膜结构域为选自下组的一种或多种蛋白的跨膜结构域：CD28、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述跨膜结构域为CD28来源的跨膜结构域。
在另一优选例中，所述共刺激信号传导区为衍生自或包括选自下组分子的活性肽段：CD28、4-1BB、OX40、或其组合。
在另一优选例中，所述共刺激信号传导区包括CD28来源的共刺激信号传导区(或共刺激信号分子)。
在另一优选例中，所述CD28的跨膜区及共刺激信号传导区选自下组：
(A)具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；
(C)将SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
在另一优选例中，所述CD3ζ的胞浆信号传导序列选自下组：
(A)具有SEQ ID NO.:7所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQ ID NO.:7所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；
(C)将SEQ ID NO.:7中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
在另一优选例中，所述嵌合SIRPα蛋白受体包括SIRPα胞外结构域、CD8 alpha的绞链区、CD28的跨膜区及共刺激信号传导区、以CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述嵌合SIRPα蛋白受体还包括前导序列(信号肽)。
在另一优选例中，所述前导肽选自人SIRPa的膜外端信号肽。
在另一优选例中，所述信号肽序列如SEQ ID NO.:1中第1－30位所示。
在另一优选例中，所述信号肽序列如SEQ ID NO.:5所示。
在另一优选例中，所述嵌合SIRPα蛋白受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述编码嵌合SIRPα蛋白受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合SIRPα蛋白受体。
在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
在另一优选例中，所述核酸分子还包括编码前导序列(信号肽)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
本发明第三方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述细胞为Jurkat细胞、NK细胞、或T细胞。
本发明第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的嵌合SIRPα蛋白受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞。
本发明第六方面提供了本发明第一方面所述的嵌合SIRPα蛋白受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用于制备筛选抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物的细胞株。
本发明第七方面提供了一种工程细胞株，所述细胞株为哺乳动物的免疫细胞，并且所述细胞株的基因组中整合有表达外源的嵌合SIRPα蛋白受体(CSR分子)的表达盒，并且，所述细胞株不表达CD47。
在另一优选例中，所述外源的CSR分子具有式I结构：
L-Z1-H-Z2-Z2’-Z3 (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为无或信号肽序列；
Z1为SIRPα胞外结构域；
H为无或铰链区；
Z2为跨膜结构域；
Z2’为CD28的胞浆信号传导序列或任选的共刺激信号传导区；
Z3为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述L为选自下组的蛋白的信号肽：选自人SIRPa的膜外端信号肽。
在另一优选例中，所述信号肽序列如SEQ ID NO.:1中第1－30位所示。
在另一优选例中，所述SIRPα胞外结构域的氨基酸序列选自下组：
(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白；
(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或
(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上(较佳地≥95％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中，编码所述SIRPα胞外结构域的核苷酸序列选自下组：
(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％、≥90％、≥95％或≥98％)，且具有与CD47结合活性的多核苷酸；
(c)如SEQ ID NO:3所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-6个)核苷酸，且具有与CD47(尤其是人CD47)结合活性的多核苷酸。
在另一优选例中，所述SIRPα胞外结构域为人源。
在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8α、CD28、CD137、IgG1、或其组合。
在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的绞链区：CD8α。
在另一优选例中，所述的Z2或Z2’为选自下组的蛋白的跨膜结构域或共刺激信号传导区：CD28、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述Z2或Z2’包括CD28来源的跨膜结构域或共刺激信号传导区。
在另一优选例中，所述CSR分子的氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示。
在另一优选例中，所述编码CSR分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
在另一优选例中，所述不表达CD47指与野生型细胞株相比，所述细胞株中的CD47的表达量降低了≥80％，较佳地，≥90％，更佳地，为100％。
在另一优选例中，所述的细胞株是T淋巴细胞系。
在另一优选例中，所述的细胞株是Jurkat细胞或其衍生细胞。
在另一优选例中，所述的细胞株是Jurkat细胞。
在另一优选例中，所述工程细胞株具有选自下组的一个或多个特性：
(a)代次稳定性好；
(b)可诱导凋亡。
本发明第八方面提供了一种试剂盒，包括本发明第七方面所述的工程细胞株。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书。
本发明第九方面提供了一种筛选抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物的方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物和外源的CD47蛋白的存在下，培养本发明第一方面所述的细胞株一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的所述细胞株的凋亡水平V1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的所述细胞株的凋亡水平V1；和
(b)将上一步骤所检测的V1、V2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物；
其中，如果V1显著低于V2，则表示所述测试化合物是抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物。
在另一优选例中，所述“显著低于”指V1/V2≤1/2，较佳地，≤1/3，更佳地，≤1/4。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述方法包括步骤(c)，将步骤(b)中所确定的潜在治疗剂施用于非人哺乳动物模型，从而测定其对所述动物模型的CD47诱导的细胞凋亡的影响。
在另一优选例中，所述细胞凋亡水平包括细胞死亡、或细胞凋亡的比例。
在另一优选例中，所述候选药物为针对CD47或SIRPα的特异性分子药物。
在另一优选例中，所述候选药物选自下组：单克隆抗体、基因重组蛋白、靶向性小分子药物、或其组合。
本发明第十方面提供了一种本发明第七方面所述的工程细胞株的用途，用于制备筛选抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物的试剂或试剂盒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了CSR结构示意图。
图2 CSR核苷酸及氨基酸序列。
图3显示了Jurkat-CD47KO单克隆细胞株CD47蛋白及基因组水平分析。
图4显示了Jurkat-CSR单克隆细胞株CSR分子表达检测。A.CSR表达；B.不同代次细胞CD47及CSR表达。
图5显示了Jurkat-CSR与CD47-Fc特异性结合检测。
图6显示了CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡结果。其中，A.CCK-8检测法；B.Annexin V/7-AAD法。
图7显示了不同接种密度和共培养时间对CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡的影响。
图8显示了CD47抗体/SIRPα抑制Jurkat-CSR细胞死亡活性检测结果。
图9显示了CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞活化标志物和FasL配体表达变化检测结果。
图10显示了FasL抗体阻断CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，本发明意外开发一种嵌合SIRPα蛋白受体(CSR)，包括细胞外结构域、任选的绞链区、跨膜结构域、和细胞内结构域；其中，所述细胞外结构域包括SIRPα胞外结构，并且通过大量筛选，意外地筛出一株重组嵌合膜蛋白细胞株(Jurkat-CSR细胞株)，所述细胞株的基因组整合有表达外源的CSR分子的表达盒，并且，所述细胞株不表达CD47。本发明的细胞株可用于筛选针对CD47或SIRPα特异性分子药物，并且具有稳定性好、靶点特异性高等特点。在此基础上，本发明人完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
CD47
CD47也是一种穿膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，在包括红细胞在内的几乎所有细胞表面表达。CD47的配体包括黏附因子(integrins)、凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin-1)、以及信号调节蛋白(SIRPs)。CD47具有多种生物学功能，包括细胞迁移、T细胞、树突状细胞活化、轴突发育等。除此之外，CD47通过与SIRP相互作用可抑制巨噬细胞的吞噬活性。CD47以这种方式传递一种所谓的“别吃我”("Don't eat me")信号，可以保护血细胞等正常细胞不被巨噬细胞所吞噬。
研究发现，除正常组织细胞表达CD47以外，许多肿瘤细胞过度表达CD47，并通过与巨噬细胞表面的SIRP相结合而阻止巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，这被视为肿瘤逃避机体免疫监视的一种机制。高表达CD47的肿瘤细胞包括急性髓样白血病细胞(AML)、慢性髓样白血病细胞(CML)、急性淋巴细胞白血病细胞(ALL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、大肠癌、乳腺癌、胰腺癌等等。
本发明的研究表明，用具有阻断CD47-SIRPα结合活性的CD47-特异性抗体给荷瘤小鼠注射，可以显著抑制肿瘤在小鼠体内的生长。
嵌合SIRPα蛋白受体
本发明提供了包括细胞外结构域、任选的绞链区、跨膜结构域、和细胞内结构域的嵌合SIRPα蛋白受体。胞外结构域包括SIRPα胞外结构域。细胞内结构域包括任选的共刺激信号传导区和胞浆信号传导序列(包括CD28的胞浆信号传导序列、和/或CD3ζ的胞浆信号传导序列)。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在胞外结构域和跨膜结构域之间，或在胞内结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述嵌合SIRPα蛋白受体的氨基酸序列如SEQID NO.:1所示。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述编码嵌合SIRPα蛋白受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
如本文所用，术语“嵌合SIRPα蛋白受体”还包括具有上述活性的SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述嵌合SIRPα蛋白受体的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
Figure BDA0001900870770000101
本发明还提供本发明嵌合SIRPα蛋白受体的类似物。这些类似物与SEQ ID NO:1所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
绞链区和跨膜结构域
对于绞链区和跨膜结构域(跨膜区)，嵌合SIRPα蛋白受体可被设计以包括融合至胞外结构域的绞链区和跨膜结构域。
优选地，本发明的嵌合SIRPα蛋白受体中的绞链区为CD8α的绞链区。
在一个实施方式中，使用天然与嵌合SIRPα蛋白受体中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))。
在另一优选例中，所述跨膜结构域为CD28的跨膜区。
胞内结构域
本发明的嵌合SIRPα蛋白受体的胞内结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已表达嵌合SIRPα蛋白受体的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个优选实施方式中，本发明的嵌合SIRPα蛋白受体中的胞内结构域被设计以包括CD3ζ的信号传导结构域。
在本发明的一个优选的实施方式中，CD3ζ的胞浆信号传导序列如SEQ ID NO:7所示。
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明的嵌合SIRPα蛋白受体还可包括CD28的胞浆信号传导序列。
在另一个实施方式中，所述胞内结构域还包括共刺激信号传导区，优选地，共刺激信号传导区为CD28的胞内信号结构域。
在一优选实施方式中，所述嵌合SIRPα蛋白受体包括CD28的穿膜区及共刺激信号传导区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
载体
本发明包括包含嵌合SIRPα蛋白受体序列的DNA构建体。编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的嵌合SIRPα蛋白受体DNA的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常通过可操作地连接编码嵌合SIRPα蛋白受体多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码嵌合SIRPα蛋白受体的天然或合成核酸的表达。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
这些载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
Jurkat-CSR工程细胞株
在本发明中，首次建立了能表达外源的CSR分子的表达盒，并且同时不表达CD47的Jurkat-CSR工程细胞株。
本发明的细胞株能与CD47蛋白特异性结合，结合后一定时间内可以启动信号传导并通过细胞间的FasL(CD95L)和Fas(CD95)的结合，启动活化诱导细胞死亡机制(Activation-induced cell death,AICD)，诱导细胞发生死亡。而加入CD47抗体或者SIRPa重组蛋白则可以抑制CD47对Jurkat-CSR细胞的活化，阻止细胞死亡的发生。
在本发明中，首次发现该嵌合蛋白细胞株可以用来检测CD47/SIRPα阻断剂的细胞生物学活性功能，用于CD47或者SIRPα特异性分子药物(单克隆抗体、基因重组蛋白、靶向性小分子药物等)的筛选。
在本发明中，还包括源自本发明的Jurkat-CSR工程细胞株的传代的或衍生的细胞株。优选地，本发明包括由本发明的Jurkat-CSR工程细胞株经1-50代传代而获得的细胞株(即传代的或衍生的细胞株)。
在另一优选例中，所述的传代的或衍生的细胞株与本发明的Jurkat-CSR工程细胞株具有相同的16s rRNA。
构建Jurkat-CSR工程细胞株的方法
本发明提供了构建Jurkat-CSR工程细胞株的方法。
在一优选实施方式中，细胞株构建包括如下步骤：
1)CSR过表达慢病毒包装；
2)Jurkat细胞CD47基因敲除，制备Jurkat-CD47KO细胞；
3)CSR慢病毒感染Jurkat-CD47KO细胞，筛选Jurkat-CSR细胞；
4)Jurkat-CSR细胞功能鉴定。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明通过基因工程技术手段改造的Jurkat-CD47KO-CSR细胞可以用来检测CD47/SIRPα阻断剂的细胞生物学活性功能，并用于CD47或者SIRPα特异性分子药物(单克隆抗体、基因重组蛋白、靶向性小分子药物等)的筛选以及功能评价。
(2)本发明的工程细胞株具有非常好的代次稳定性、非常高的靶点特异性等特性。
(3)本发明首次开发了嵌合SIRPα受体蛋白(CSR)，它是一种新型基因重组膜蛋白，可以表达在Jurkat-CD47KO细胞膜上，与CD47特异性地结合并因此传递刺激信号，激活Jurkat-CSR细胞。
(4)本发明的Jurkat-CD47KO-CSR细胞能够很好的用于CD47靶点药物的筛选、功能分析及放行检测，且具有操作简单、周期短、成本低、易重复等优点。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实验材料及方法
1、嵌合SIRPa受体(CSR)基因合成
CSR的DNA编码序列由常州基宇生物科技有限公司合成(Project ID:188232-2)，合成好的序列由该公司亚克隆至pUC57载体。
2、CSR过表达慢病毒包装
委托上海生博生物医药科技有限公司进行CSR过表达慢病毒包装。合同编号为TPV6。
3、Jurkat细胞CD47基因敲除
利用CRISPR-Cas9技术，设计靶向识别CD47编码框序列引物，构建CD47敲除质粒(pX330-GFP-CD47)。通过电转的方式将质粒导入至Jurkat细胞(中国科学院细胞库，Cat#TCHU123)。流式细胞术(Fluorescence Activating Cell Sorter,FACS)检测绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)强度评价转染。待细胞活率恢复后通过PE anti-CD47抗体(Biolegend,Cat#323108)，进行FACS检测CD47表达。利用流式分选技术分选CD47阴性的Jurkat细胞。将分选的阴性细胞利用有限稀释法(Limiting Dilution Analysis,LDA)进行亚克隆铺板，通过检测CD47表达筛选阴性单克隆，并在基因水平上验证单克隆CD47编码框(Opening Reading Frame,OFR)发生移码突变。选定最佳亚克隆放大培养保存及用作后续CSR分子过表达。
4、Jurkat-CSR稳定细胞株构建
4.1过表达CSR慢病毒感染Jurkat-CD47KO细胞
Jurkat-CD47KO细胞(5×106/ml,100μl)分别与20μl、30μl的过表达CSR慢病毒在37℃，5％CO2培养箱孵育30min，加入1ml完全培养基和5.5μl 1mg/ml polybrene(Sigma,Cat#H9268)于6孔板培养。感染后第2天利用FACS检测CSR分子表达，检测抗体为PE anti-SIRPα(Biolegend,Cat#323806)。采用梯度加压法提高抗生素Puromycin(Thermo FisherScientific,Cat#A1113803)的浓度对感染慢病毒Jurkat-CD47KO细胞进行加压筛选。
4.2 Jurkat-CSR单克隆细胞株筛选
利用有限稀释法对Puromycin浓度达到1μg/ml多克隆进行亚克隆。按照每孔2个细胞，96孔板共铺5块板。待单克隆生长至一定大小时取出一部分细胞进行FACS检测CSR分子表达。根据表达丰度及均一性选取细胞株，将其放大培养、冻存及进行后续细胞实验。
5、Jurkat-CSR细胞株功能分析
5.1 Jurkat-CSR细胞CD47分子表达检测
通过FACS技术检测Jurkat-CSR细胞表面CD47分子，检测抗体PE anti-CD47(Biolegend,Cat#323108)。按照1×106/ml，100μl细胞与5μl抗体混匀，孵育45min。1％BSA-PBS清洗一次。200μl重悬细胞进行FACS分析。
5.2 Jurkat-CSR细胞CSR分子表达检测
通过FACS技术检测Jurkat-CSR细胞表面CSR分子，检测抗体PE anti-SIRPα(Biolegend,Cat#323806)。按照1×106/ml，100μl细胞与5μl抗体混匀，孵育45min。1％BSA-PBS清洗一次。200μl重悬细胞进行FACS分析。
5.3 Jurkat-CSR细胞传代稳定考察
Jurkat-CSR细胞按照2-3天传代一次，连续传代30代后FACS检测CSR和CD47分子的表达变化.
5.4 Jurkat-CSR细胞与CD47特异性结合检测
重组人CD47-Fc蛋白(Sino,Cat#12283-H02H)2倍梯度稀释16个点，最高浓度2μg/μl，Jurkat-CSR细胞密度调整为1×106/ml。100μl细胞分别与100μl CD47-Fc重组蛋白稀释液混匀，孵育45min，1％BSA-PBS清洗一次。加入100μl 500倍稀释的FITC Anti-Human IgG(Fc)抗体(Sigma,Cat#F9512)二抗，孵育45min。1％BSA-PBS清洗一次。200μl重悬细胞进行FACS分析。同时设置阴性对照组，阴性蛋白为VEGFR1-Fc(ImmuneOnco,In house)。
5.5 CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡检测
重组人CD47-Fc蛋白(Sino,Cat#12283-H02H)稀释至0.4μg/ml，2倍梯度稀释10个浓度，Jurkat-CSR细胞密度调整为5×105/ml，各100μl混匀，37℃，5％CO2培养箱孵育24小时。采用CCK-8细胞毒性活性检测试剂盒(Dojindo,Cat#CK04)，酶标仪读取每孔450nm波长下吸光度值，评价细胞生长情况。同时采用Annexin V/7-AAD法细胞凋亡检测试剂盒(BD,Cat#559763)分析不同浓度下Jurkat-CSR细胞死亡、凋亡比例。
6、CD47-SIRPα阻断活性分析
6.1 CD47诱导Jurkat-CSR细胞死亡密度、浓度、共培养时间优化
采用单因素实验法分别对Jurkat-CSR细胞接种密度，CD47-Fc浓度，两者共培养时间进行优化，确定CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡最佳反应条件。
6.2 CD47抗体/SIRPα抑制Jurkat-CSR细胞死亡活性分析
重组人CD47-Fc蛋白(Sino,Cat#12283-H02H)稀释至0.2μg/ml，CD47抗体/SIRPα0.4μg/ml，2倍梯度稀释10个浓度，各50μl混匀，室温孵育45min。Jurkat-CSR细胞密度调整为5×105/ml，100μl加入上述混合液，混匀，37℃，5％CO2培养箱孵育20小时。每孔加入20μlCCK-8试剂，混匀后至于37℃,5％CO2培养箱继续孵育4h。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。利用下面公司计算CD47抗体/SIRPα不同浓度下抑制细胞死亡比例。
Figure BDA0001900870770000181
7、CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡机制研究
7.1 CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞活化标志物和FasL配体表达分析
Primer 5.0软件设计引物，序列见下表。收集不同时间点(0H、3H、8H、24H)CD47-Fc蛋白刺激的Jurkat-CSR细胞，RNAiso Plus(Takara,Cat#9108)试剂提取RNA，提取完成后立即采用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara,Cat#6210A)进行RT-PCR合成cDNA。利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche,Cat#04913850001)检测试剂和实时荧光定量PCR仪(Roche，
Figure BDA0001900870770000183
96)通过相对定量法检测不同时间点CD69、IL-2、IFN-γ和FasL表达水平变化。
Figure BDA0001900870770000182
7.2 CD47-Fc通过Fas/FasL信号通路诱导Jurkat-CSR细胞死亡
1640完全培养基将CD47-Fc稀释至0.2μg/ml，Jurkat-CSR细胞密度调整为1×106/ml，各取50μl加入至96孔板，加入anti-FasL抗体(Biolegend,Cat#306406)10μl，同时设置只有Jurkat-CSR和Jurkat-CSR/CD47-Fc对照组，每组2个复孔，37℃，5％CO2培养箱孵育6h。孵育结束后采用Annexin V/7-AAD法细胞凋亡检测试剂盒(BD,Cat#559763)不同组Jurkat-CSR细胞死亡、凋亡比例。
实施例1 CSR表达载体构建
CSR的设计结构如图1所示，由SIRPα的膜外端、CD8alpha绞链区、CD28的穿膜区及胞内区、以及CD3z的信号传导区等所组成。CSR的基因编码序列由1797个核苷酸组成(图2A)，其中信号肽编码序列90个核苷酸(1-90)、SIRPαECD 1029个核苷酸(91-1119)、CD8alpha绞链区135个核苷酸(1120-1254)、CD28的穿膜区及胞内区204个核苷酸(1255-1458)、CD3z的信号传导区336个核苷酸(1459-1794)。相应的氨基酸序列如图2B所示。
实施例2 Jurkat-CD47KO单克隆细胞株蛋白水平和基因水平验证
利用FACS技术检测Jurkat-CD47KO单克隆细胞株CD47表达，选定了Jurkat-CD47KO-4B2作为工具细胞，用作后续CSR分子表达。结果显示4B2细胞膜上CD47蛋白已经检测不到，基因水平检测结果显示CD47编码框发生移码突变，相应的检测结果见图3A和图3B所示。
实施例3 Jurkat-CSR单克隆细胞株表达水平检测
利用FACS技术检测Jurkat-CD47KO-CSR(简写为Jurkat-CSR)单克隆细胞株CSR表达，图4A结果显示5F12细胞株表达丰度和均一性最为理想，因此选定其用作后续细胞功能实验研究的细胞株。
同时，按照2-3天传代一次，连续传代30代后，通过FACS检测CSR和CD47分子的表达变化，发现细胞株稳定性非常好，第一代和第三十代的细胞对CD47及CSR的表达完全一致(图4B)
实施例4 Jurkat-CSR细胞与CD47蛋白特异性结合检测
利用FACS技术检测CD47-Fc蛋白与Jurkat-CSR细胞结合，图5结果显示CD47-Fc能够与细胞特异性结合，且具有浓度依赖性，而对照蛋白VEGFR1-Fc则不能够与细胞结合。
实施例5 CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡检测
图6A结果显示采用CCK-8法检测细胞毒性，CD47-Fc与Jurkat-CSR细胞共培养24小时，能够诱导细胞死亡，且具有浓度依赖性。
图6B结果显示采用Annexin V/7-AAD法检测细胞凋亡，CD47-Fc与Jurkat-CSR细胞共培养24小时，能够诱导细胞凋亡，且具有浓度依赖性(表1)。
表1
Figure BDA0001900870770000201
实施例6 CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡实验条件优化
通过单因素实验，确定了CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡最佳的细胞接种密度，CD47-Fc浓度，共培养时间。图7A结果显示细胞密度从1×105/ml增加至4×105/ml，CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡比例越高。图7B结果显示虽然共培养时间48小时诱导死亡的比例比24小时要略高，但是48小时后对照孔细胞生长较快，密度甚高，且48小时延长了检测时间。因此最终确定了细胞接种密度为5×105/ml，每孔100μl，CD47-Fc工作浓度为0.1μg/ml，共培养24小时。
实施例7 CD47抗体/SIRPα抑制Jurkat-CSR细胞死亡活性分析
图8结果显示，CD47抗体/SIRPα能够通过封闭CD47-SIRPα信号通路，从而抑制CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞的死亡，且具有明显的浓度剂量依赖关系。
实施例8 CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞活化标志物和FasL配体表达分析
图9结果显示，CD47-Fc与Jurkat-CSR细胞共培养后能够显著上调IFN-γ、IL-2、CD69和FasL的表达。IFN-γ和IL-2的表达水平上调了近100倍，CD69的表达上调了约10倍，FasL的表达水平上调达到了500倍。
实施例9 FasL抗体阻断CD47-Fc诱导Jurkat-CSR细胞死亡
图10结果显示，加入FasL抗体，阻断了CD47-Fc诱导Jurkat-CSR的细胞死亡，提示Jurkat-CSR细胞死亡是通过上调FasL的表达，与Fas相互识别，通过Fas触发细胞内部的凋亡程序，使Jurkat-CSR细胞发生程序性细胞死亡。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司
<120> 一种重组嵌合膜蛋白细胞株及其应用
<130> P2018-1821
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser
85 90 95
Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp
180 185 190
Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile
195 200 205
His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln
210 215 220
Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg
225 230 235 240
Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu
245 250 255
Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys
260 265 270
Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu
275 280 285
Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn
290 295 300
Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser
305 310 315 320
Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly
325 330 335
Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu
355 360 365
Arg Asn Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
370 375 380
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
385 390 395 400
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe
405 410 415
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
420 425 430
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
435 440 445
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
450 455 460
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
465 470 475 480
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr
485 490 495
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
500 505 510
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
515 520 525
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
530 535 540
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
545 550 555 560
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
565 570 575
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
580 585 590
Pro Pro Arg
595
<210> 2
<211> 340
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg
115 120 125
Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe
130 135 140
Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu
145 150 155 160
Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr
165 170 175
Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His
180 185 190
Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro
195 200 205
Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr
210 215 220
Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val
225 230 235 240
Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp
245 250 255
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr
260 265 270
Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn
275 280 285
Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His
290 295 300
Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala
305 310 315 320
His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser
325 330 335
Asn Glu Arg Asn
340
<210> 3
<211> 1110
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60
gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 120
aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg gccattctgc actgcactgt gacctccctg 180
atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac cagcccggga attaatctac 240
aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagagtccac aaagagagaa 300
aacatggact tttccatcag catcagtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360
tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac acggagttta agtctggagc aggcactgag 420
ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca 480
cctcagcaca cagtgagctt cacctgcgag tcccacggct tctcacccag agacatcacc 540
ctgaaatggt tcaaaaatgg gaatgagctc tcagacttcc agaccaacgt ggaccccgta 600
ggagagagcg tgtcctacag catccacagc acagccaagg tggtgctgac ccgcgaggac 660
gttcactctc aagtcatctg cgaggtggcc cacgtcacct tgcaggggga ccctcttcgt 720
gggactgcca acttgtctga gaccatccga gttccaccca ccttggaggt tactcaacag 780
cccgtgaggg cagagaacca ggtgaatgtc acctgccagg tgaggaagtt ctacccccag 840
agactacagc tgacctggtt ggagaatgga aacgtgtccc ggacagaaac ggcctcaacc 900
gttacagaga acaaggatgg tacctacaac tggatgagct ggctcctggt gaatgtatct 960
gcccacaggg atgatgtgaa gctcacctgc caggtggagc atgacgggca gccagcggtc 1020
agcaaaagcc atgacctgaa ggtctcagcc cacccgaagg agcagggctc aaataccgcc 1080
gctgagaaca ctggatctaa tgaacggaac 1110
<210> 4
<211> 1785
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60
gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 120
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agactacagc tgacctggtt ggagaatgga aacgtgtccc ggacagaaac ggcctcaacc 900
gttacagaga acaaggatgg tacctacaac tggatgagct ggctcctggt gaatgtatct 960
gcccacaggg atgatgtgaa gctcacctgc caggtggagc atgacgggca gccagcggtc 1020
agcaaaagcc atgacctgaa ggtctcagcc cacccgaagg agcagggctc aaataccgcc 1080
gctgagaaca ctggatctaa tgaacggaac accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 1140
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 1200
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatttttg ggtgctggtg 1260
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tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc 1380
cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 1440
tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc gcagagcccc ccgcgtacca gcagggccag 1500
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1560
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1620
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1680
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1740
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1785
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly
20 25 30
<210> 6
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
cgggaaatcg tgcgtgac 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
ggaaggaagg ctggaagagt g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
acatggtgct actcttgctg 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
ctctctacct gcgtatcgtt t 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
gctacaactg gagcatttac tg 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
ctggtgagtt tgggattctt 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
gttactgcca ggacccat 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
agttccatta tccgctacat 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
ggttctggtt gccttggt 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
ttgagttgga cttgcctgtt 20

Claims (10)

1.一种嵌合SIRPα蛋白受体，其特征在于，所述嵌合SIRPα蛋白受体包括细胞外结构域、任选的绞链区、跨膜结构域、和细胞内结构域；其中，所述细胞外结构域包括SIRPα胞外结构域。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合SIRPα蛋白受体。
3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求3所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求2所述的核酸分子。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1所述的嵌合SIRPα蛋白受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、或权利要求4所述的细胞。
6.权利要求1所述的嵌合SIRPα蛋白受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、或权利要求4所述的细胞的用途，其特征在于，用于制备筛选抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物的细胞株。
7.一种工程细胞株，其特征在于，所述细胞株为哺乳动物的免疫细胞，并且所述细胞株的基因组中整合有表达外源的嵌合SIRPα蛋白受体(CSR分子)的表达盒，并且，所述细胞株不表达CD47。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述的工程细胞株。
9.一种筛选抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物和外源的CD47蛋白的存在下，培养权利要求1所述的细胞株一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的所述细胞株的凋亡水平V1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的所述细胞株的凋亡水平V1；和
(b)将上一步骤所检测的V1、V2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物；
其中，如果V1显著低于V2，则表示所述测试化合物是抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物。
10.一种权利要求7所述的工程细胞株的用途，其特征在于，用于制备筛选抑制CD47诱导的细胞凋亡的候选药物的试剂或试剂盒。
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