CN114366821A - 一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，表面重组表达受体蛋白和报告蛋白。所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡利用细胞膜上呈递SIRPα受体阻断CD47/SIRPα抑制轴，增强抗原递呈，恢复巨噬细胞吞噬作用，获得较好的抗肿瘤效果。同时，细胞膜纳米囊泡的中空结构可以担载多种药物，运送至肿瘤部位，改善药物在肿瘤组织的蓄积，杀伤肿瘤细胞，获得较好的抗肿瘤效果，本发明对开发安全、高效的细胞膜纳米囊泡载药系统的研究具有重要意义。

Description

一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是现在非常多发的疾病，是由多基因突变、多因素引发、多阶段发展的多发病。为了生存和增殖，癌细胞通过多种抑制机制抵抗宿主抗肿瘤免疫反应，传统化疗药物在临床使用过程中产生的严重毒副作用和肿瘤细胞的多重耐药性等问题严重限制了它们在肿瘤治疗中的应用。
信号调节蛋白α(signal regulatory protein-α，SIRPα)，也被称为CD172a或SHPS-1，是属于免疫球蛋白超家族中的一种膜蛋白，是在巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞等髓系细胞上表达的抑制性受体分子。CD47/SIRPα轴介导的“别吃我”信号通路，在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。多种实体肿瘤细胞通过高水平表达CD47配体，与巨噬细胞表面的SIRPα受体特异性结合后，通过SIRPα胞内ITIMs结构域招募SHP-1、SHP-2等抑制分子，阻止myosin-IIA在巨噬细胞突触内聚集而抑制巨噬细胞的吞噬作用。因此，肿瘤细胞通过劫持CD47/SIRPα信号轴，逃避巨噬细胞吞噬及肿瘤相关抗原递呈，从而逃避免疫系统监视与杀伤。研究显示，通过阻断CD47/SIRPα信号轴重新激活巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用，增强肿瘤抗原递呈，引发机体抗肿瘤免疫反应，杀伤肿瘤细胞。因此，开发一种有效阻断肿瘤细胞免疫检查点抑制轴的药物，对恢复机体抗肿瘤免疫的药物递送系统变得尤为重要。
细胞膜纳米囊泡是一种用细胞膜制备的模拟细胞外囊泡结构的纳米载体，具有适宜的尺寸和独特的结构。其固有的稳定性、良好的生物相容性、低免疫原性、低毒性、高生物屏障渗透性以及装载多种物质的能力，使细胞膜纳米囊泡成为药物递送的理想载体。因为其不仅可以进行靶向修饰，还可以装载基因治疗药物以及小分子药物等。然而目前还没有抗肿瘤作用的细胞膜纳米囊泡的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，可高效递送SIRPα蛋白至肿瘤部位，并与肿瘤细胞表面的CD47配体结合，从而阻断肿瘤细胞与体内巨噬细胞之间的CD47/SIRPα信号轴，恢复巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，增强肿瘤抗原递呈及T细胞激活，达到良好的抗肿瘤效果。
本发明提供了一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，所述细胞膜纳米囊泡的表面重组表达SIRPα受体和报告蛋白。
优选的，所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡的粒径为50～200nm。
优选的，所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡的细胞膜的细胞来源为HEK293T、DC2.4、ELD-1、BMDC、jurkat、RAW264.7、P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l细胞中的一种或几种；
优选的，细胞膜纳米囊泡表达的受体蛋白选自小鼠或人来源的SIRPα、TIM3、Lag3、TIGIT、VISTA、NKG2A、MerTk中的一种或几种。
优选的，所述报告蛋白包括荧光蛋白。
优选的，所述SIRPα受体的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供了所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：
1)构建表达受体蛋白和报告蛋白的融合基因的重组质粒；
2)将步骤1)中所述重组质粒转染真核细胞，得到稳定表达受体和报告蛋白的细胞；
3)匀浆并收集步骤2)中所述稳定表达受体和报告蛋白的细胞的细胞膜，所述细胞膜经重悬后反复通过1μm、0.4μm和0.2μm聚碳酸酯膜，获得表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡。
优选的，步骤3)中所述匀浆用缓冲液为含以下浓度成分的水溶液：0.25M蔗糖、1mMEDTA和20mM Hepes-NaOH，所述缓冲液的pH值为7.0～7.4。
优选的，步骤3)中通过1μm、0.4μm和0.2μm聚碳酸酯膜的次数分别为15～20次。
本发明提供了所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡或所述制备方法制备得到的表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡在制备抗肿瘤的药物中的应用。
本发明提供了一种阻断CD47/SIRPα抑制轴的试剂在制备提高巨噬细胞免疫反应的药物中的应用，所述阻断CD47/SIRPα抑制轴的试剂包括所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡或所述制备方法制备得到的表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡。
本发明提供了一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，所述细胞膜纳米囊泡的表面重组表达受体蛋白和报告蛋白。在本发明实施例中，表达SIRPα-荧光蛋白的细胞膜纳米囊泡可以高效递送SIRPα蛋白至肿瘤部位，使SIRPα蛋白与肿瘤细胞表面的CD47配体结合，从而阻断肿瘤细胞与体内巨噬细胞之间的CD47/SIRPα信号轴，恢复巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，增强肿瘤抗原递呈及T细胞激活，达到良好的抗肿瘤效果。对表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡进行性能测试，结果表明，表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡不仅具有良好的生物相容性，而且易被肿瘤细胞内吞，具有较好的细胞摄取效率；并且表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡与CD47抗体竞争性结合肿瘤细胞的CD47分子，结合后的肿瘤细胞容易被巨噬细胞吞噬，从而提高了机体对肿瘤细胞的免疫反应。可见，本发明提供的表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡阻断CD47/SIRPα抑制轴，增强抗原递呈，恢复巨噬细胞吞噬作用，获得较好的抗肿瘤效果。同时，细胞膜纳米囊泡可担载多种药物，运送至肿瘤部位，改善药物在肿瘤组织的蓄积，杀伤肿瘤细胞，获得较好的抗肿瘤效果，本发明对开发安全、高效的细胞膜纳米囊泡载药系统的研究具有重要意义。
附图说明
图1为质粒pLenti-C-mGFP与质粒pCMV6-SIRPα双酶切结果；图中M：DNA分子量标准；图中1：pLenti-C-mGFP质粒；图中2：pCMV6-SIRPα质粒；
图2为重组质粒pLenti-SIRPα-GFP的测序结果；
图3为稳定表达SIRPα-GFP的HEK293T细胞系；
图4为Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP蛋白表达电泳图；
图5和6为制备的表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡的粒径表征图；
图7为表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡的细胞存活率图；
图8为表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡的细胞内吞的共聚焦图像；
图9为表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡与CD47共定位情况；
图10为巨噬细胞吞噬成像；
图11为利用HEK293T、RAW264.7及B16F10细胞构建的稳定表达SIRPα-GFP的细胞系；
图12为免疫印迹技术研究HEK293T、RAW264.7及B16F10三种稳定表达细胞系中SIRPα蛋白水平；
图13为HEK293T、RAW264.7及B16F10三种稳定表达细胞系制备的SIRPα细胞膜纳米囊泡的体内抗肿瘤效果。
具体实施方式
本发明提供了一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，所述细胞膜纳米囊泡的表面重组表达受体蛋白和报告蛋白。
在本发明中，所述细胞膜纳米囊泡中表达的受体蛋白选择小鼠或人来源的SIRPα、TIM3、Lag3、TIGIT、VISTA、NKG2A、MerTk中的一种或几种。在本发明实施例中，以SIRPα受体为例加以说明细胞膜纳米囊泡的特性。所述SIRPα受体的作用是与肿瘤细胞的CD47有效结合，阻断CD47/SIRPα抑制轴，恢复巨噬细胞吞噬作用，达到良好的肿瘤治疗效果。所述SIRPα受体的编码基因序列优选如SEQ ID NO：1所示。所述报告蛋白的作用是在建立细胞系过程中方便进行筛选及鉴定。所述报告蛋白优选包括荧光蛋白。本发明对所述荧光蛋白的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的荧光蛋白的种类即可，例如GFP、RFP或Cherry等荧光蛋白均可。在本发明实施例中，所述报告蛋白以GFP为例加以说明。
在本发明中，所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡的粒径优选为50～200nm，更优选为100～180nm，最优选为150nm。
在本发明中，所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡的细胞膜的细胞来源优选为正常体细胞或肿瘤细胞均可，例如HEK293T、DC2.4、ELD-1、BMDC、jurkat、RAW264.7、P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l细胞中的一种或几种。
本发明提供了所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：
1)构建表达受体蛋白和报告蛋白的融合基因的重组质粒；
2)将步骤1)中所述重组质粒转染真核细胞，得到稳定表达受体蛋白和报告蛋白的细胞；
3)匀浆并收集步骤2)中所述稳定表达受体蛋白和报告蛋白的细胞的细胞膜，所述细胞膜经重悬后反复通过1μm和0.4μm聚碳酸酯膜，获得表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡。
本发明首先构建表达受体蛋白和报告蛋白的融合基因的重组质粒。
在本发明中，所述重组质粒优选包括慢病毒重组质粒。在本发明实施例中，表达SIRPα受体和报告蛋白的融合基因的重组质粒的构建方法优选如下：
将质粒pLenti-C-mGFP和质粒pCMV6-SIRPα分别进行双酶切，将酶切后的SIRPα片段和酶切后的载体pLenti-mGFP片段进行连接，得到含有SIRPα片段的重组质粒。
在本发明中，所述双酶切所用的核酸内切酶优选为MluⅠ和SgfⅠ。双酶切体系为30μl：2μg pLenti-C-mGFP质粒或pCMV6-SIRPα质粒，3μL 10×酶切缓冲液，2μL限制性内切酶(各1μL)，双蒸水补充体积至30μL。所述酶切的条件优选为37℃酶切4h。所述双酶切后，优选进行核酸电泳后回收凝胶，分别回收酶切后的SIRPα片段和酶切后的载体片段pLenti-mGFP。所述连接的反应体系优选为30μl，载体pLenti-mGFP 5μl，SIRPα片段8μl，2×Buffer15μl，T4 DNA连接酶2μl。所述连接的反应体系优选为25℃连接1小时。
得到重组质粒后，本发明将所述重组质粒转染真核细胞，得到稳定表达受体和报告蛋白的细胞。
在本发明中，所述转染的方法，优选包括利用Lipofectamine 3000转染试剂完成，具体将2μg质粒DNA和10μL转染试剂分别用125μL Opti-MEM稀释后混合，室温静置15min，加入待转染的细胞中。所述转染后，优选进行细胞筛选。所述细胞筛选的方法优选为将融合度达到40～50％的转染细胞用浓度8mg·L-1嘌呤霉素的新鲜培养基筛选培养，每个2d更换嘌呤霉素的新鲜培养基，筛选培养持续6～8d。
在本发明中，筛选培养结束后，优选对细胞进行目标蛋白表达情况的验证。所述验证方法优选采用Western blotting法进行。本发明对所述Western blotting法的检测方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的Western blotting的操作方法即可。本发明实施例结果表明，相对分子质量83 000附近有清晰条带出现表明SIRPα-GFP融合蛋白成功表达在细胞表面。
得到稳定表达受体和报告蛋白的细胞后，本发明匀浆并收集所述稳定表达受体和报告蛋白的细胞的细胞膜，所述细胞膜经重悬后反复通过1μm和0.4μm聚碳酸酯膜，获得表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡。
在本发明中，匀浆前，优选将稳定表达受体和报告蛋白的细胞进行培养、消化和洗涤。所述培养优选词用含有10％FBS的DMEM培养基进行培养。所述消化优选采用胰蛋白酶消化收获细胞。消化后的细胞优选用冷PBS溶液洗涤，离心后收集细胞沉淀用匀浆用缓冲液重悬。所述匀浆用缓冲液为含以下浓度成分的水溶液：0.25M蔗糖、1mM EDTA和20mM Hepes-NaOH，所述缓冲液的pH值为7.4。所述匀浆优选匀浆器将细胞在冰上破碎至少50次。所述匀浆后，将匀浆液1000g离心去除沉淀，将上清液用100000g离心2h，将沉淀用PBS液洗涤，得到细胞膜沉淀。
在本发明中，所述重悬优选采用PBS液重悬细胞膜。通过1μm和0.4μm聚碳酸酯膜的次数分别为15～20次。为了获得粒径更小的细胞膜纳米囊泡时，优选通过0.22μm的聚碳酸酯膜，通过次数优选为15～20次。
基于表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡能有效提高巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，本发明提供了所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡或所述制备方法制备得到的表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡在制备抗肿瘤的药物中的应用。
在本发明中，所述肿瘤包括黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胶质瘤、宫颈癌、前列腺癌、头颈癌等。本发明实施例中，以黑色素瘤细胞为肿瘤细胞代表说明，巨噬细胞的吞噬作用。所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡具有理想的生物相容性，并且易被肿瘤细胞内吞，具有较好的肿瘤细胞摄取效率，竞争性抑制肿瘤细胞与CD47抗体结合，提高巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，恢复机体对肿瘤细胞的免疫反应，获得较好的抗肿瘤效果。
本发明对所述药物的剂型和制备没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞膜囊泡药物的制备方法和剂型即可。
本发明提供了一种阻断CD47/SIRPα抑制轴的试剂在制备提高巨噬细胞免疫反应的药物中的应用，所述阻断CD47/SIRPα抑制轴的试剂包括所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡或所述制备方法制备得到的表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡。
下面结合实施例对本发明提供的一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
表达SIRPα的重组质粒的构建方法
根据质粒pLenti-C-mGFP和质粒pCMV6-SIRPα(购自Origene公司)均具有MluⅠ和SgfⅠ酶切位点，利用MluⅠ和SgfⅠ酶对质粒pLenti-C-mGFP和质粒pCMV6-SIRPα分别进行双酶切，双酶切体系为30μl：2μg pLenti-C-mGFP质粒或pCMV6-SIRPα质粒，3μL 10×酶切缓冲液，2μL限制性内切酶(各1μL)，双蒸水补充体积至30μL，37℃酶切4h，核酸电泳后回收凝胶，分别获得酶切后的SIRPα片段和酶切后的载体pLenti-mGFP，图1为质粒双酶切结果。将酶切产物回收后连接，体系为30μl，载体pLenti-mGFP 5μl，SIRPα片段8μl，2×Buffer 15μl，T4DNA连接酶2μl，25℃连接1小时，然后转化入DH5a大肠杆菌感受态，进行氯霉素抗性筛选挑选连接成功的菌株，挑取单克隆于含入氯霉素的LB管中，于37℃，转速160rpm的条件下摇菌过夜，进行测序。
图2为测序结果，与预期目标序列完全一致。这表明成功构建了表达SIRPα的重组质粒。
实施例2
将测序正确的pLenti-SIRPα-GFP质粒转化至DH5a大肠杆菌的感受态中，并将转化的大肠肝菌保存于甘油储存液，于-80℃保存菌液。
HEK293T细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。转染前1d，将对数生长期的HEK293T细胞以每孔1×106个细胞接种于6孔板中，使细胞在第2d达到70％～80％的融合度。第2d，从培养箱中取出6孔板培养的HEK293T细胞，吸除原有培养基，加入2mL PBS缓冲液清洗细胞2次后，换为Opti-MEM培养基培养。利用Lipofectamine 3000转染试剂，将2μg质粒DNA以及10μL转染试剂分别与125μL Opti-MEM混匀，之后将带有质粒DNA的混合物加入到带有转染试剂的管中，混匀后室温静置15min，加入到6孔板中HEK293T细胞培养基中。为了对转染后的HEK293T细胞进行筛选，转染48h后将细胞转移到10cm培养皿进行培养，使细胞在24h后达到40％～50％的融合度，更换为含有嘌呤霉素(浓度8mg·L-1)的新鲜培养基，每隔2d弃去原有培养基，用PBS缓冲液清洗2遍，更换含有嘌呤霉素(浓度8mg·L-1)的新鲜培养基，此步骤重复3次。图3为稳定表达SIRPα-GFP的HEK293T细胞系。
实施例3
已经筛选后的细胞，扩大培养后收集细胞，PBS缓冲液清洗2～3次，用RIPA裂解液冰上裂解60min，每隔10min颠倒混匀，之后将裂解物经12000g，4℃离心30min，留取上清进行蛋白定量以及Western blotting法验证。取30μg总蛋白经12％SDS-PAGE凝胶分离，25V恒压14min转移到PVDF膜上。PVDF膜用含有5％脱脂奶粉的TBST封闭液室温封闭2h，与稀释后的SIRPα一抗(1:1000稀释)及Actin一抗(1:1000稀释)在4℃摇床孵育过夜。过夜后的PVDF膜用TBST清洗3遍，每遍10min，再与羊抗鼠二抗(1:1000稀释)室温孵育2h，经TBST洗膜3次，每次10min。将膜放置于显影仪曝光板上，将特超敏ECL化学发光试剂盒(BeyoECL Star)中的A液和B液按1:1混合，覆盖到膜上，曝光30s，拍摄图像。
图4为Western blotting结果。由图4结果可知，细胞成功表达SIRPα蛋白。
实施例4
将HEK293T细胞以及稳定表达SIRPα-GFP的HEK293T细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。用胰蛋白酶消化收获细胞，通过以1000rpm离心将细胞用冷PBS洗涤3次。然后，用匀浆缓冲液悬浮细胞。之后，通过匀浆器将细胞在冰上破碎至少50次。将整个溶液以1000×g离心5min。然后，弃去沉淀物并将上清液以100,000×g离心2h。含有质膜的沉淀用PBS缓冲液洗涤3次。为了制备细胞膜纳米囊泡，将PBS缓冲液中的细胞膜通过1μm聚碳酸酯膜15次，然后再通过0.4μm聚碳酸酯膜15次，获得细胞膜纳米囊泡，对细胞膜纳米囊泡进行表征。采用动态光散射(DLS)法测定表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡的粒径，粒径结果如图5所示，纳米粒子直径约为188nm。
为了进一步验证粒径，使用透射电子显微镜拍摄冷冻TEM图像。TEM图像结果如图6，纳米囊泡为尺寸约为190nm的球形颗粒，与DLS测量结果一致。
实施例5
对表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡进行性能测试，具体如下：
(1)用MTT法检测细胞相容性。将DC细胞以5000个细胞/孔的密度接种于含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基的96孔板中，培养24小时后，加入不同浓度表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡(分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)各100μl，继续培养48小时后加入MTT试剂检测细胞存活率，所有实验一式三份进行。
结果如图7所示，在浓度高达100μg/mL浓度下，细胞活力仍超90％以上，显示出良好的生物相容性。
(2)将小鼠黑色素瘤B16F0细胞接种于含有玻璃片的24孔板内，培养24小时，表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡(100μg/mL)与B16F10黑色素瘤细胞一起孵育4小时，与SIRPα受体结合的GFP提供绿色荧光，其用作纳米囊泡的荧光标记信号。孵育4小时后，弃去培养液后，使用4％多聚甲醛固定，用DAPI染色液37℃染色10min，PBS洗涤三次后，进行激光共聚焦成像分析，结果如图8所示。
由图8可知，共孵育4h后纳米囊泡被肿瘤细胞内吞，具有较好的细胞摄取效率。
(3)将小鼠黑色素瘤B16F0细胞接种于12孔板内，培养24小时，加入CD47抗体预孵育4小时，弃去上清，向抗体孔及相同条件下的未加抗体孵育孔中分别加入表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡(100μg/mL)，在37℃的环境下孵育细胞4小时后，弃去培养液，消化细胞，用PBS洗涤后离心去上清，用PBS重悬，使用流式细胞仪测定绿色荧光阳性细胞。
如图9所示，CD47抗体与B16F10细胞预孵育后，与B16F10结合的细胞膜纳米囊泡显著降低。
(4)C57BL/6小鼠断颈处死后在75％酒精中浸泡5分钟，打开腹部皮肤喷洒酒精，将皮肤剥离至足部，用剪刀分离股骨与胫骨并置于无菌PBS中，继续去除骨外组织。剥离干净的股骨与胫骨置于75％酒精中浸泡1min，用无菌PBS冲洗五遍。剪断骨两端，用注射器吸取基础培养基，冲洗骨髓，直至骨头发白，用枪吹打悬液，使细胞尽量匀散，用75μm滤网过滤三次。1500rpm 10min离心后弃除上清再在沉淀中加入3倍沉淀体积的红细胞裂解液，室温裂解5min。1200rpm 5min离心获得骨髓细胞沉淀，用BMDM培养基(终浓度50ng/mL M-CSF的完全培养基)重悬，以～8×106/mL浓度接种细胞，培养三天后换为新的BMDM培养基，继续培养四天再次更换新的BMDM培养基。
如上所述制备骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)，直接在孔板中用AM染色，37℃30min，PBS清洗5遍；并用DiI染色消化后的B16F10细胞，PBS清洗5遍，去除染料残留。将染色后的B16F10细胞分别与aCD47(终浓度100μg/mL)及SIRPαNVs(终浓度100μg/mL)与巨噬细胞在无血清培养基中共培养，在37℃下孵育4小时后，胰蛋白酶消化5min除去未结合的B16F10细胞，通过共聚焦显微镜观察吞噬作用。
如图10所示，具有双阳信号的细胞代表了巨噬细胞的吞噬能力，可以看出，细胞膜纳米囊泡与CD47的结合导致了BMDM对黑色素瘤B16F10的吞噬作用。
由上述实施例结果可知，阻断肿瘤细胞免疫抑制轴可以恢复机体对肿瘤细胞的免疫反应，本发明以细胞膜为原料，制备细胞膜纳米囊泡，利用细胞膜上呈递SIRPα受体阻断CD47/SIRPα抑制轴，增强抗原递呈，恢复巨噬细胞吞噬作用，获得较好的抗肿瘤效果。同时，细胞膜纳米囊泡的中空结构可以担载多种药物，运送至肿瘤部位，改善药物在肿瘤组织的蓄积，杀伤肿瘤细胞，获得较好的抗肿瘤效果，本发明对开发安全、高效的细胞膜纳米囊泡载药系统的研究具有重要意义。
实施例6
表面展示有检查点蛋白的细胞膜纳米囊泡通过阻断体内免疫抑制反应，从而激活抗肿瘤免疫应答，达到治疗肿瘤的效果。以SIRPα细胞膜纳米囊泡为例，细胞膜表面的SIRPα受体与肿瘤细胞表面的CD47配体结合后，促进肿瘤细胞的吞噬，促进肿瘤抗原的加工递呈，活化衰竭的T细胞，发挥抗肿瘤功效。因此细胞膜表面的检查点蛋白(如SIRPα)表达水平对于抗肿瘤效果至关重要。从众多细胞系中选择能够高水平表达检查点蛋白的细胞系是影响抗肿瘤效果的重要因素。本发明按照实施例1～4的方法还对RAW264.7细胞系和B16F10进行转染试验，制备得到不同细胞膜来源的表达SIRPα受体的细胞膜纳米囊泡(B16F10@SIRPα和RAW264.7@SIRPα)。通过荧光蛋白成像和免疫印迹方法对上述制备的三种不同细胞膜囊泡上SIRPα表达水平进行测定。结果表明，利用HEK293T细胞和RAW264.7细胞制备的稳定表达细胞系SIRPα表达水平显著高于肿瘤细胞(如图11和图12所示)，
实施例7
细胞膜纳米囊泡RAW264.7@SIRPα和B16F10@SIRPα的抗肿瘤性能测试。体内肿瘤抑制效率是通过异体接种鼠源黑色素瘤B16F10的C57BL/6小鼠进行评估。6周龄的C57BL/6小鼠(15～20g)于右前腋下注射100μL悬浮1.0×106个B16F10细胞溶液。7天后肿瘤体积增长至50～80mm3时开始第一次给药，标记为第0天。将小鼠称重和测量瘤体积，并随机分为4组，每组6只：PBS组、HEK293T@SIRPα组、RAW264.7@SIRPα、B16F10@SIRPα组(2.5mg/kg，蛋白量)，分别在第0、3、6、9、12天实施尾静脉注射。通过测量肿瘤的体积和鼠的体重来评估治疗效果和治疗的安全性。肿瘤的体积通过以下公式I计算：
肿瘤体积(Vt)＝a×b2/2 公式I
其中，a、b分别为实体瘤块的长径和短径。
结果表明，利用两种正常细胞系制备的细胞膜囊泡HEK293T@SIRPα和RAW264.7@SIRPα在皮下黑色素瘤小鼠模型上显示出较肿瘤细胞系细胞膜囊泡(B16F10@SIRPα)更强的抗肿瘤效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 台州学院
<120> 一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagcccg ccggcccggc ccctggccgc ctagggccgc tgctgctctg cctgctgctc 60
tccgcgtcct gtttctgtac aggagccacg gggaaggaac tgaaggtgac tcagcctgag 120
aaatcagtgt ctgttgctgc tggggattcg accgttctga actgcacttt gacctccttg 180
ttgccggtgg gacccattag gtggtacaga ggagtagggc caagccggct gttgatctac 240
agtttcgcag gagaatacgt tcctcgaatt agaaatgttt cagatactac taagagaaac 300
aatatggact tttccatccg tatcagtaat gtcaccccag cagatgctgg catctactac 360
tgtgtgaagt tccagaaagg atcatcagag cctgacacag aaatacaatc tggaggggga 420
acagaggtct atgtactcgc caaaccttct ccaccggagg tatccggccc agcagacagg 480
ggcatacctg accagaaagt gaacttcacc tgcaagtctc atggcttctc tccccggaat 540
atcaccctga agtggttcaa agatgggcaa gaactccacc ccttggagac caccgtgaac 600
cctagtggaa agaatgtctc ctacaacatc tccagcacag tcagggtggt actaaactcc 660
atggatgtta attctaaggt catctgcgag gtagcccaca tcaccttgga tagaagccct 720
cttcgtggga ttgctaacct gtctaacttc atccgagttt cacccaccgt gaaggtcacc 780
caacagtccc cgacgtcaat gaaccaggtg aacctcacct gccgggctga gaggttctac 840
cccgaggatc tccagctgat ctggctggag aatggaaacg tatcacggaa tgacacgccc 900
aagaatctca caaagaacac ggatgggacc tataattaca caagcttgtt cctggtgaac 960
tcatctgctc atagagagga cgtggtgttc acgtgccagg tgaagcacga ccaacagcca 1020
gcgatcaccc gaaaccatac cgtgctggga tttgcccact cgagtgatca agggagcatg 1080
caaaccttcc ctgataataa tgctacccac aactggaatg tcttcatcgg tgtgggcgtg 1140
gcgtgtgctt tgctcgtagt cctgctgatg gctgctctct acctcctccg gatcaaacag 1200
aagaaagcca aggggtcaac atcttccaca cggttgcacg agcccgagaa gaacgccagg 1260
gaaataaccc agatccagga cacaaatgac atcaacgaca tcacatacgc agacctgaat 1320
ctgcccaaag agaagaagcc cgcaccccgg gcccctgagc ctaacaacca cacagaatat 1380
gcaagcattg agacaggcaa agtgcctagg ccagaggata ccctcaccta tgctgacctg 1440
gacatggtcc acctcagccg ggcacagcca gcccccaagc ctgagccatc tttctcagag 1500
tatgctagtg tccaggtcca gaggaagtga 1530

Claims (10)

1.一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述细胞膜纳米囊泡的表面重组表达受体蛋白和报告蛋白。
2.根据权利要求1所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡的粒径为50～200nm。
3.根据权利要求1所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡的细胞膜的细胞来源为HEK293T、DC2.4、ELD-1、BMDC、jurkat、RAW264.7、P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l细胞中的一种或几种非肿瘤细胞；
所述细胞膜纳米囊泡中表达的受体蛋白选自小鼠或人来源的SIRPα、TIM3、Lag3、TIGIT、VISTA、NKG2A、MerTk中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述报告蛋白包括荧光蛋白。
5.根据权利要求1～4任意一项所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述SIRPα受体的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示。
6.权利要求1～5任意一项所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建表达受体蛋白和报告蛋白的融合基因的重组质粒；
2)将步骤1)中所述重组质粒转染真核细胞，将转染48h的细胞经抗性筛选和扩大培养，得到稳定表达受体和报告蛋白的细胞；
3)匀浆并收集步骤2)中所述稳定表达受体和报告蛋白的细胞的细胞膜组分，所述细胞膜经重悬后反复通过1μm、0.4μm和0.2μm聚碳酸酯膜，获得表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤3)中所述匀浆用缓冲液为含以下浓度成分的水溶液：0.25M蔗糖、1mM EDTA和20mM Hepes-NaOH，所述缓冲液的pH值为7.0～7.4。
8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤3)中通过1μm、0.4μm和0.2μm聚碳酸酯膜的次数分别为15～20次。
9.权利要求1～5任意一项所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡或权利要求6～8任意一项所述制备方法制备得到的表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡在制备抗肿瘤的药物中的应用。
10.一种阻断CD47/SIRPα抑制轴的试剂在制备提高巨噬细胞免疫反应的药物中的应用，所述阻断CD47/SIRPα抑制轴的试剂包括权利要求3～5任意一项所述表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡。
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