CN114712496B - 一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗及制备方法和在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗及制备方法和在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用，涉及生物医药领域。细菌衍生外膜囊泡疫苗包括细菌衍生外膜囊泡和温敏型水凝胶，水凝胶包括有GM‑CSF，细菌衍生外膜囊泡包含有新抗原，编码所述肿瘤特异性抗原DNA片段的核苷酸序列如SEQ I D NO：1所示。本申请将OMDVs加载到含有GM‑CSF的温敏型水凝胶中，经皮下注射可以激活宿主免疫反应，而GM‑CSF的持续释放可以进一步招募树突状细胞来捕获肿瘤新抗原，并将抗原呈递给淋巴结中的初始T细胞，刺激活化肿瘤特异性CD4+和CD8+T细胞的增殖和分化，消除手术残留肿瘤与肺转移瘤。

Description

一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗及制备方法和在制 备癌症免疫治疗试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗及制备方法和在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用。
背景技术
近年来，肿瘤疫苗在癌症治疗中取得了巨大的成就，因此，临床上对不同种类的肿瘤疫苗进行了研究，其中包括细胞疫苗、核酸疫苗、蛋白多肽疫苗和基因工程疫苗等。然而，只有两种肿瘤疫苗被获批使用，大部分疫苗的研发在临床试验阶段终止。
目前，肿瘤疫苗仍存在靶向抗原的低抗原性和肿瘤异质性等问题，肿瘤免疫治疗被认为是癌症治疗的第四大支柱(与手术、放疗和化疗并列)，与传统的手术、化疗或放疗相比，免疫治疗更针对癌细胞，使患者有机会获得更高的反应率和更好的生活质量，甚至治愈疾病。目前的免疫疗法主要有：T细胞检查点抑制剂(如PD-1单抗药物Nivolumab)疗法，过继性T细胞疗法，嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)，T细胞受体嵌合型T细胞(TCR-T)疗法，它们在临床治疗中取得了显著的治疗效果。然而，这些免疫疗法都存在其一定的局限性。CAR-T细胞疗法虽在血液肿瘤中有较好的疗效，但其毒副作用也很明显，其中最显著的是引起细胞因子释放综合征(CRS)，此外还可能引起自身免疫性疾病。PD-1单抗药物在临床治疗中只有低于30％的响应率。
基于目前癌症免疫疗法的局限性，开发新型的癌症免疫疗法及平台有着迫切的临床需求。
发明内容
本发明提供了一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗及制备方法和在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用，以提供具有可胞内递送抗原、本身有自佐剂作用、易于进行基因工程重组改造、适于大分子呈递等特点的癌症免疫治疗疫苗，触发抗肿瘤免疫反应并预防肿瘤复发，消除手术残留肿瘤与肺转移瘤。
为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗，包括细菌衍生外膜囊泡和水凝胶，所述水凝胶包括有GM-CSF，所述细菌衍生外膜囊泡包含有新抗原，编码所述肿瘤特异性抗原DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为优选方案，所述新抗原为基因工程化细菌衍生外膜囊泡表达。
作为优选方案，还包括aPD-1抗体。
作为优选方案，aPD-1抗体的注射量为0.5-5mg/kg。
作为优选方案，所述水凝胶中GM-CSF浓度为5-50ng/mL。
作为优选方案，每150μL水凝胶中所述细菌衍生外膜囊泡的添加量为10-50μg。
作为优选方案，还包括水凝胶，所述水凝胶包括0.5-5wt％透明质酸、10-50wt％Pluronic F-127和余量的水。
为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用人工合成核酸构建编码肿瘤特异性抗原的DNA片段，重组到表达载体中，获得目的质粒，将目的质粒导入大肠杆菌中，获得重组菌，进行诱导表达，获得表达肿瘤特异性抗原的重组细胞；
(2)将重组细胞重悬于PBS溶液中，用冷HM裂解缓冲液悬浮并超声处理，离心后获得细菌衍生外膜囊泡；
(3)将GM-CSF、透明质酸和Pluronic F-127混合制得水凝胶，将细菌衍生外膜囊泡与水凝胶混合，制得疫苗。
作为优选方案，在步骤(2)中，离心步骤具体为：将重组细胞悬液在1000g离心收集上清，随后在3000g离心收集上清，随后在15000g离心收集沉淀，沉淀为细菌衍生外膜囊泡。
为了解决上述技术问题，本发明目的之三提供了一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用。
作为优选方案，所述细菌衍生外膜囊泡疫苗能够促进树突细胞的抗原识别和成熟。
作为优选方案，所述细菌衍生外膜囊泡疫苗能够使CD4+和CD8+T细胞增殖，触发抗肿瘤免疫反应并有效防止肿瘤复发。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
细菌外膜囊泡(OMVs)具有可胞内递送抗原、本身有自佐剂作用(其多成分可结合、激活免疫细胞)、可淋巴结迁移、易于进行基因工程重组改造、适于大分子呈递等特点，在肿瘤微环境中，树突状细胞的功能是受到抑制的，不能对肿瘤抗原进行有效的加工、递呈，将肿瘤抗原表达在OMVs上，有利于抗原有效的递送至DCs。本申请将细菌衍生外膜囊泡(outermembrane derived vesicles,OMDVs)加载到含有GM-CSF的温敏型水凝胶中，经皮下注射可以激活宿主免疫反应，水凝胶可以缓释放体系，减少细菌LPS对皮肤引起的刺激，而GM-CSF的持续释放可以进一步招募树突状细胞(DCs)来捕获肿瘤新抗原。成熟的树突细胞DC被LPS激活，然后将抗原呈递给淋巴结中的初始T细胞，分化成肿瘤特异性的CD4+和CD8+T细胞。随后，CD8+细胞毒性T细胞(CTL)将通过细胞毒性作用和细胞因子(如颗粒酶B、穿孔素等)的分泌识别并消除残留的肿瘤细胞。同时，CD4+T细胞在不同细胞因子环境的存在下被极化为Th细胞。此外，将Gel-OMDVs疫苗与PD-1检查点阻断抗体结合，以有效增强CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)细胞增殖，消除手术残留肿瘤与肺转移瘤。
附图说明
图1：为本发明实施例一的步骤(2)中激光共聚焦显微镜验证大肠杆菌突变型M33-M47融合蛋白GFP表达的结果；
图2：为本发明实施例一的步骤(3)中激光共聚焦显微镜观察OMDVs上GFP绿色荧光信号结果；
图3：为本发明实施例一的步骤(3)中透射电子显微镜观察细菌衍生外膜囊泡的形貌结果；
图4：为本发明实施例一的步骤(4)中Western Blot验证空白细菌及衍生囊泡，正常型M33-M47细菌及衍生囊泡和突变型M33-M47细菌及衍生囊泡关于GFP融合蛋白表达的结果；
图5：为本发明实施例二的步骤(2)中共聚焦显微镜观察BMDCs摄取OMDVs的结果；
图6：为本发明实施例二的步骤(3)中OMDVs在体外激活骨髓来源树突状细胞的成熟结果；
图7：为本发明实施例二的步骤(4)中Gel-OMDVs的体内激活腹股沟淋巴结中树突状细胞的成熟结果；
图8：为本发明实施例二的步骤(4)中检测注射区皮肤组织中CD11c细胞的免疫荧光分析结果；
图9：为本发明实施例三的步骤(3)中小鼠黑色素瘤术后模型验证细菌衍生外膜囊泡疫苗的结果【注：a-小鼠黑色素瘤术后模型验证细菌衍生外膜囊泡疫苗构建示意图；b-步骤(3)中各组小鼠不同时间段的肿瘤生物发光图像，n＝5；c-步骤(3)中各实验组小鼠随时间增加的单肿瘤体积变化；d-步骤(3)中各组小鼠统计的肿瘤生长曲线，n＝7；e-步骤(3)中第22天各组小鼠的肿瘤重量，n＝7；f-步骤(3)中各组小鼠的生存曲线结果，n＝10；NS:无显著性，*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.001，使用Tukey post-hoc检验d、e或长秩(Mantel-Cox)检验f的单向方差分析】；
图10：为本发明实施例三的步骤(4)中小鼠肿瘤免疫细胞流式检测结果【注：(a、b)-各实验组T细胞在残留肿瘤中的代表性流式细胞术图(a)和比值(b)(CD3+T细胞门控，n＝5)；(c、d)-各组肿瘤中CD8+Ki67+T细胞代表性流式细胞术图(c)和比值(d)(CD3+CD8+T细胞门控，n＝5)；(e、f)-各组肿瘤中CD8+CD69+T细胞代表性流式细胞术图(e)和比值(f)(CD3+CD8+T细胞门控，n＝5)；(g、h)-各组CD44+CD62L+T细胞浸润肿瘤的代表性流式细胞图(g)和比值(h)(CD3+CD8+T细胞门控，n＝5)；NS:无显著性，*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.001】；
图11：为本发明实施例三的步骤(4)中小鼠细胞因子检测的流式检测结果；【注：(a、b)-各实验组颗粒酶B在残留肿瘤中的代表性流式细胞术图(a)和比值(b)(CD3+T CD8+T细胞门控，n＝5)；(c、d)-各实验组的穿孔素在残留肿瘤中的代表性流式细胞术图(c)和比值(d)(CD3+CD8+T细胞门控，n＝5)；(e、f)-各实验组的IFN-γ在残留肿瘤中的代表性流式细胞术图(e)和比值(f)(CD3+CD8+T细胞门控，n＝5)；(g、h)-各实验组的TNF-α在残留肿瘤中的代表性流式细胞术图(g)和比值(h)(CD3+CD8+T细胞门控，n＝5)；NS:无显著性，*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.001】；
图12：为本发明实施例三的步骤(5)中小鼠CD4+CD8+T细胞浸润肿瘤的组织免疫荧光检测结果；
图13：为本发明实施例三的步骤(6)中黑色素瘤转移小鼠模型验证细菌衍生外膜囊泡疫苗的结果【注：a-黑色素瘤转移小鼠模型验证衍生细菌外膜囊泡疫苗构建示意图；b-步骤(6)中各组小鼠肺转移瘤的不同时间段肿瘤的生物发光图像，n＝5；c-步骤(6)中各组小鼠肺转移结节的代表性影像学表现；d-步骤(6)中各组小鼠肺转移病灶数统计结果，n＝5；e-步骤(6)中各组小鼠的生存曲线结果，n＝10；f-步骤(7)中各组小鼠的H&E染色肺切片结果；NS:无显著性，*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.001，使用Tukey post-hoc检验d或Long-Rank(Mantel-Cox)检验e的单向方差分析】。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
肿瘤抗原(tumor antigen)是指由肿瘤细胞产生的能够引起机体免疫应答的抗原物质，肿瘤抗原可以分为肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)和肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)，其中肿瘤特异性抗原又称为新抗原(neoantigen)，是指肿瘤细胞特有的或者只在某种肿瘤细胞中表达而其它正常细胞不表达的一类抗原。新抗原是癌细胞通过“非同义突变”产生的异常蛋白质。以新抗原为癌症免疫治疗的靶点，其特异性免疫反应不受中枢耐受和外周耐受的影响，引发真正的肿瘤特异性T细胞反应，从而防止对非恶性组织的“脱靶”损伤，增强肿瘤特异性免疫反应。
外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性细菌在正常的生长过程中以出芽的形式，向培养基中分泌释放的一种球形、脂质双层膜纳米结构，直径为20至250nm。因其为外膜成泡，所以OMVs的组成部分与亲本细菌相似，含有脂多糖(LPS)、外膜蛋白、脂质和核苷酸。此外，OMVs含有多种病原体相关分子模式(PAMPs)和病原体相关抗原，可以作为递送载体。除此之外，细菌的外膜囊泡还可以作为疫苗佐剂，引起抗原特异性T细胞的激活，从而特异性的杀死肿瘤细胞。
实施例一
一种展示新抗原的衍生细菌外膜囊泡疫苗，包括以下制备步骤：
(1)表达新抗原的质粒构建与扩增：
A、首先，在北京英茂盛业生物科技有限公司合成了编码Lpp-OmpA-GFP-M33-M47(新抗原)蛋白的DNA片段，其中新抗原野生型表位为(M33-缬氨酸；M47-丙氨酸)，突变表位为(M33-天冬氨酸；M47-甘氨酸)。通过基因重组技术，将Lpp-OmpA-GFP-M33-M47基因片段分别连接到pET21a载体中的NdeI和XholI位点之间，分别构建含突变型(SEQ ID NO：1)和野生型(SEQ ID NO：2)Lpp-OmpA-GFP-M33-M47蛋白DNA片段的目的质粒。
B、对上述含突变型Lpp-OmpA-GFP-M33-M47质粒进行扩增，步骤如下：
①将BL21(DE3)plysS感受态细胞置于冰上解冻，在超净台环境条件下加入500ng质粒，轻弹混匀，冰上静置30min；
②42℃，水浴热激50s，冰浴3min；
③在超净台加入500μL LB培养基，37℃，220rpm，摇床1.5h；
④吸100μL培养物涂布Amp平板培养基，在细菌培养箱培养12h；
⑤挑平板培养基上的单菌落至含有60μg/mL氨卞青霉素(Amp)的LB摇菌管，37℃，220rpm，摇床12h；
⑥每管吸200μL菌液，送到擎科生物科技有限公司进行碱基测序，剩余的菌液暂存4℃冰箱，使用T7通用引物对阳性菌落进行测序，T7:TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：3)，T7Ter：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQ ID NO：4)，表明工程重组细菌构建成功，测序结果与设计序列碱基序列一致，将剩余菌液用天根高纯度质粒小提试剂盒进行质粒提取，步骤按照说明书进行；提取的质粒测浓度和纯度，要求OD260/OD280>1.8，OD260/OD230>2，检测完毕后，质粒保存在-20℃备用。
(2)新抗原的诱导表达和验证：
A、对步骤(1)中测序正确的阳性菌落进行扩增，接种至250mL LB培养基中(Amp终浓度为100μg/mL)，220rpm，37℃过夜震荡培养；
B、第二天按照5％的比例将菌液转接至4瓶250mL LB新鲜培养基中，220rpm，37℃震荡培养至OD600＝0.6左右；
C、加入终浓度为1mM异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),16℃，220rpm震荡培养5-16h，诱导融合GFP的新抗原表达；
D、诱导后，通过5000g离心10分钟收集稳定表达融合GFP的新抗原的重组细菌。
E、激光共聚焦显微镜验证突变型M33-M47融合蛋白表达：
将步骤D获得的重组细菌离心收集，去除LB后，用PBS洗一次，然后用4％多聚甲醛室温固定15min，然后用PBS洗一次，加入1mL 1μg/mL的DAPI染液，室温避光孵育10min，PBS洗三次，每次5min，最后加20μL抗荧光淬灭封片剂，上机拍片，拍片结果如图1所示，重组大肠杆菌稳定表达融合GFP的新抗原。
(3)细菌衍生外膜囊泡(GFP-OMDVs)的制备与表征：
A、将步骤(2)获得的重组细菌重悬于冷PBS中并洗涤3次，然后用冷HM裂解缓冲液(0.25M蔗糖、1mM EDTA、20mM HEPES-NaOH、pH7.4和1.0mM蛋白酶抑制剂混合物)悬浮细胞；
B、将上述混合溶液转移到离心管中，在冰浴中超声破碎3分钟后，超声功率20％-40％，1000g离心5分钟，取上清，去沉淀；
C、将上清液以3000g离心5分钟，将上清液以15000g离心0.5-1小时，收集沉淀以获得OMDVs；
D、将OMDVs重新悬浮在冷HM裂解缓冲液中，依次通过0.8μm和0.22μm过滤器5-10次；
E、BCA测定定量计算滤液中OMDVs的总蛋白质浓度，最后将OMDVs保存在-80℃的HM裂解缓冲液中，获得OMDVs细菌衍生外膜囊泡溶液；
F、在共聚焦显微镜(Zeiss)上拍摄荧光图像以验证融合GFP的新抗原的表达：将步骤E获得的细菌衍生外膜囊泡(OMDVs)滴加10μL在玻片上，盖上盖玻片，四周加指甲油封片，室温避光晾片，然后在激光共聚焦显微镜下，目的质粒带有GFP指示蛋白，观察囊泡的GFP绿色荧光情况，如图2所示，共聚焦显微镜观察到在OMDVs上存在GFP绿色荧光信号。
G、用纳米粒度仪和Zeta分析仪检测细菌衍生外膜囊泡的粒径大小和zeta电位：动态光散射(DLS)分析表明OMDVs的平均直径约为120nm，zeta电位约为-12mV。
H、透射电子显微镜观察细菌衍生外膜囊泡的形貌：用镊子将铜网夹住后，加燕尾夹固定，防止铜网掉落，将镊子用胶带固定在冰上，滴加10μL步骤E的OMDVs细胞膜囊泡溶液，静置5min，用滤纸从铜网边缘吸走液体，反复滴加六次，然后滴加10μL 3％醋酸铀染色5min，用滤纸从边缘吸走液体；最后室温晾干铜网，用120kV透射电子显微镜观察囊泡的形貌和拍照，实验过程中与醋酸铀相关的枪头和滤纸等均要按照安全准则处理，细菌衍生外膜囊泡透视电镜结果如图3所示。
(4)Western Blot验证突变型M33-M47融合蛋白表达：
①配制浓度为10％的SDS-PAGE凝胶，每孔上样品20μL，样品分别为表达空白质粒的细菌(Blank)、表达正常M33-M47型质粒的重组细菌(Normal-M33-M47，表达正常M33-M47型质粒为含SEQ ID NO：2目的片段的质粒)、表达突变M33-M47型质粒的重组细菌(Mutation-M33-M47，表达突变M33-M47型质粒为含SEQ ID NO：1目的片段的质粒)、空白质粒的细菌衍生外膜囊泡(Blank-OMDV)、表达正常M33-M47型质粒的重组细菌衍生外膜囊泡(Normal-M33-M47-OMDV)和表达突变M33-M47型质粒的细菌衍生外膜囊泡(Mutation-M33-M47-OMDV)；细菌及细菌衍生外膜囊泡用PBS清洗两次后，加入1Xloadingbuffer煮沸15min,即为样品，电压70V，进行电泳；
②预先用甲醇活化PVDF膜，按黑板-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白板制作转膜“三明治”，将转膜槽置于冰中，恒流转膜，250mA，2h；
③配5％脱脂奶粉，室温封闭PVDF膜1h；
④剪膜，分别孵EGFP抗体和β-actin抗体，4℃，慢速摇床过夜；
⑤在摇床上用TBST洗膜三次，每次10min，室温孵育二抗，1h；
⑥在摇床上用TBST洗膜三次，每次10min；
⑦按1：1比例配置ECL发光液，机器曝光。
如图4所示，Westernblot结果显示，突变型Lpp-OmpA-GFP-M33-M47融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)plysS细胞和OMDVs中成功表达，且融合蛋白的分子量约为55kDa。
(5)Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs凝胶的制备：将透明质酸(HA，2wt％)和Pluronic F-127(25wt％)混合在一起加入到预冷的ddH2O中，制备HP温敏型水凝胶，其中含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的浓度是20ng/mL，每150μL水凝胶中步骤(3)获得GFP-OMDVs的添加量为25μg，将得到的混合物放在4℃冰箱里过夜直到里面的物质都溶解。
实施例二
突变型M33-M47OMDVs与树突状细胞在体内和体外的相互作用验证,树突细胞(DC)可以吞噬抗原将其呈递给T细胞，并进一步激活T细胞,作为主要的专职型抗原呈递细胞，DC在适应性免疫反应中发挥着至关重要的作用。在本申请中提取雌性C57BL/6小鼠的BMDCs用于评估OMDVs与抗原递呈细胞的相互作用。
(1)骨髓衍生树突细胞(BMDCs)的分离：
A、用颈椎脱臼法将C57BL/6小鼠(6周龄)处死，取出所有胫骨并将骨周围的肌肉组织用剪刀剔除；
B、将骨移至超净台内，在70％酒精中浸泡5min进行消毒灭菌，然后用无菌的PBS清洗2次；
C、将骨移入另一个盛有PBS的新培养皿中，将骨的两端剪去，将含有PBS的注射器的针头插入骨髓腔中反复冲洗出骨髓直至骨头全部变白；
D、将骨髓悬液转移到离心管中，用200目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织，1200rpm离心5分钟，弃上清；
E、将收获的细胞重悬在红细胞(RBC)裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)中,室温下孵育10分钟以消除红细胞；
F、调整细胞浓度至1×106个/mL，加至6孔板中，并在补充有10％FBS、1％青霉素-链霉素、10ng/mL IL-4和20ng/mL GMCSF的RPMI 1640中培养；
G、24h后小心去除上清中悬浮细胞，加入新鲜培养基继续进行培养。
(2)BMDCs摄取OMDVs：将BMDCs(1×106个/mL，1mL/孔)培养在六孔板中，加入实施例一步骤(3)中OMDVs(25微克)并孵育24h，随后用DAPI染色并通过共聚焦显微镜(蔡司，LSN880)分析BMDCs的吞噬作用，如图5所示，骨髓来源的树突状细胞可以吞噬细菌衍生外膜囊泡，说明将肿瘤抗原表达在OMDVs上，有利于抗原有效的递送至DCs。
(3)OMDVs的体外激活实验：
A、为了研究OMDVs在体外活化DC的能力，将细胞分为四组：PBS(#1)、空白-OMDVs(#2)、正常-M33-M47 OMDVs(#3)、突变-M33-M47 OMDVs(#4)，参照实施例一步骤(3)中细菌衍生外膜囊泡的制备方法获得；
B、将BMDCs(1×106个/mL)与不同实验组的OMDVs制剂(25μg)孵育12小时后，用PBS洗涤3次，用staining buffer重悬，取1×105个细胞，加入抗CD11c-APC、抗CD40-PE、抗CD80-FITC和抗CD86-PE抗体(Biolegend)，在冰上避光染色30分钟，1200rpm离心5分钟，staining buffer重悬，重复3次；
C、使用Beckman CytoFlex流式细胞仪对染色的细胞进行分选，检测共刺激标志物CD11c、CD40、CD80和CD86的表达，并使用FlowJo软件进行分析，以此来评估OMDVs是否可以促进BMDCs的成熟，如图6所示。
结果表明，与PBS对照组(#1)相比，其他三个处理组的成熟DC比例更高，表明OMDVs可以有效促进DC的成熟，其中突变-M33-M47 OMDVs(#4)组的DC成熟比例最高，成熟的DC可以增强抗原提呈能力，激活特异性T细胞的增殖。
(4)Gel-OMDVs的体内激活实验：
A、将6周大的雌性小鼠随机分成四组(n＝5)并接受不同的处理：Gel-PBS(150μL，20ng/mL GM-CSF，#1)，Gel-Blank-OMDVs(150μL,25μg OMDVs和20ng/mL GM-CSF，#2)，Gel-Normal-M33-M47 OMDVs(150μL，25μg OMDVs，20ng/mL GM-CSF，#3)，Gel-Mutation-M33-M47OMDVs(150μL、25μg OMDVs和20ng/mL GM-CSF，#4)，在背部左侧通过皮下注射注射不同组的OMDVs凝胶，参考实施例一中步骤(5)的制备方法。
B、为了评估树突细胞的募集和成熟情况，在处理72小时后用颈椎脱臼的方法处死小鼠，将小鼠制剂注射部位的皮肤剪下来，腹股沟淋巴结也从各组中收集，腹股沟淋巴结用于制备单细胞悬液，皮肤用于制备免疫荧光切片。
C、流式细胞荧光分选(FACS)：将用于制备腹股沟淋巴结单细胞悬液放入EP管中，加入含有2％FBS的PBS，用剪刀剪成碎片，再将组织碎片放到200目的细胞筛上轻轻地研磨，制备得到单细胞悬液；然后进行细胞计数，取1×105个细胞，用CD16/32室温封闭10min后，加入anti-CD11c-APC、抗CD40-PE、抗CD80-FITC和抗CD86-PE抗体按照1：100的体积对各组细胞在冰上避光染色30分钟，1200rpm离心5分钟，staining buffer重悬，重复3次，用流式分析仪进行检测，FlowJo进行分析，检测腹股沟淋巴结免疫系统的激活程度，检测结果如图7所示。
结果显示，与含有GM-CSF的Gel-PBS(#1)组相比，用Gel-OMDV(#2、#3和#4)处理的小鼠淋巴结中CD11c+CD40+和CD80+CD86+成熟DCs的数量显著升高，证明OMDVs在体内能有效地促进DCs的成熟。此外，值得注意的是，尽管Gel-Blank-OMDVs(#2)处理组和Gel-PBS组(#1)之间存在显著差异，但与Gel-Blank-OMDVs(#2)相比，Gel-M33-M47 OMDVs(#3)(#4)中成熟的CD11c+CD40+和CD80+CD86+DCs更高，这表明具有正常或突变新抗原的OMDVs可以更有效促进DC的抗原识别和成熟。
D、免疫荧光分析：将步骤B获得的皮肤组织用OCT进行包埋，放在-20℃的冰箱中直到OCT凝固，将冰冻切片机调整到8μm进行切片；将得到的切片室温放干1h，再用PBS浸泡15分钟去除包埋剂，用滤纸吸去上面的PBS；配置3％的BSA溶液封闭30分钟，用滤纸吸去封闭液，PBS浸泡15分钟，用滤纸吸去PBS；直接加一抗CD11c antibody在4℃冰箱里孵育过夜，一抗用1.5％的BSA配置；第二天用滤纸吸去一抗，再用PBS浸泡10分钟，重复3次，加二抗室温避光孵育2h；用滤纸吸去二抗，加DAPI染色15分钟，用PBS浸泡10分钟，重复3次，用滤纸吸去PBS；用荧光封片剂20μl封片，盖上盖玻片，4℃保存，24h内用共聚焦显微镜成像，结果如图8所示。
结果显示，与FACS分析结果相似，Gel-OMDVs(#2)(#3)(#4)治疗组皮肤CD11c+细胞的数量明显高于Gel-PBS(#1)组。以上结果表明含有GM-CSF的OMDVs在体外和体内均能引发强大的免疫反应。
实施例三
构建细菌衍生外膜囊泡治疗小鼠肿瘤模型，构建了B16F10-luc小鼠肿瘤术后模型，评估OMDVs凝胶疫苗是否能抑制手术后肿瘤复发。因为在肿瘤微环境中会发生免疫抑制导致CD8+T细胞的耗竭，这造成了肿瘤的免疫逃逸，并且大大降低了肿瘤免疫治疗的效果，而PD-1抗体能够阻断T细胞的PD-1免疫检查点，防止肿瘤微环境造成的T细胞耗竭。因此，在这次实验中，采用PD-1抗体来阻断CD8+CTL的PD-1检查点，进一步提高癌症免疫治疗的效率。
(1)建立了小鼠黑色素瘤术后模型研究OMDVs在体内的抗肿瘤治疗效果：
提前一天将6-8w龄的C57BL/6小鼠背部脱毛，第二天在背部右侧皮下注射106个鼠源黑色素瘤细胞B16-F10-Luciferase；一周后，等瘤的体积长到大约100mm3左右的时候，手术切除小鼠身上90％的瘤，剩余的肿瘤用于模拟临床治疗中由于手术未清理干净而残留下来的肿瘤组织,小鼠手术全程用异氟烷进行麻醉，手术的器械也都进行了消毒处理。
(2)然后所有的小鼠随机分成6组接受不同的处理：Gel-PBS(150μL，20ng/mL GM-CSF，#1)，Gel-Blank-OMDVs(150μL，25μg OMDVs和20ng/mL GM-CSF，#2)，Gel-Normal-M33-M47 OMDVs(150μL，25μg OMDVs，20ng/mL GM-CSF，#3)，Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs(150μL，25μg OMDVs和20ng/mL GM-CSF，#4)、aPD-1(Biolegend，114115，2.5mg/kg，#5)和Gel-Mutation-M33-M47OMDVs+aPD-1(150μL，25μg OMDVs和20ng/mL GM-CSF，2.5mg/kgaPD-1，#6)。
(3)第8天在背部左侧通过皮下注射凝胶，第10天aPD-1通过尾静脉注射，具体注射时间参考图9中a图；用小鼠活体成像系统记录肿瘤的生长情况，用生物发光监测肿瘤的生长和扩散，每隔1天用游标卡尺测量肿瘤的大小，用公式计算肿瘤的体积：长×宽2/2；当肿瘤体积大于1500mm3时，将小鼠进行安乐死，第22天实验结束后安乐死剩余的小鼠，并收集肿瘤和器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺。
结果如图9显示，与(#1)、(#2)、(#3)三组相比，用Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs+aPD-1(#6)处理的小鼠对肿瘤生长的抑制作用最好，(#4)组和(#5)组也显示出明显的抗肿瘤效应，表明Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs和PD-1抗体配合使用具有高效抑制肿瘤生长的治疗作用。
此外，根据步骤(3)的方式额外进行的小鼠存活率试验(n＝10)，小鼠生存率观察期为实验位50天，50天内当肿瘤体积大于1500mm3时，认为小鼠已经死亡，将小鼠进行安乐死，统计各组小鼠的存活率，用Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs+aPD-1(#6)处理的小鼠不仅表现出最强的抗肿瘤复发作用，而且还提高了小鼠存活率，用PBS(#1)处理的小鼠表现出较弱的抗肿瘤复发能力，并且在25天内全部死亡，(#2)、(#3)小鼠均在30天内死亡，用Gel-Mutation-M33-M47 OMDV+aPD-1(#6)处理的小鼠在肿瘤复发后35天之前也具有较高的存活率比例。
(4)小鼠肿瘤免疫细胞和细胞因子流式检测(FACS)：
为了进一步比较不同治疗方式对肿瘤的作用，采用流式细胞术检测肿瘤处的免疫相关细胞含量和细胞因子水平，分析浸润到复发肿瘤中的CD4+和CD8+T细胞群。CD4+T细胞又称为辅助T细胞，能够识别抗原肽-MHC II类复合物，通过分泌细胞因子辅助体液免疫和细胞免疫；CD8+T细胞又称为细胞毒性T细胞，能够识别抗原肽-MHC I类复合物，杀伤靶细胞。因为CD8+和CD4+T细胞在肿瘤免疫应答中发挥主要的作用，所以我们也进一步检测了肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8 T细胞的数量和增值情况。
按照步骤(3)中小鼠实验第22天结束后，颈椎脱臼处死小鼠，剥离小鼠背部皮下肿瘤，用PBS洗两次，去除血污；用滤纸吸干后，称重肿瘤，做好记录；称重后，将肿瘤置于70μm细胞筛网上，筛网下接着50mL离心管，全程冰上操作；加入含有2％FBS的PBS润湿后，轻轻研磨，过程不断加入含有2％FBS的PBS冲洗，得到单细胞悬液；将单细胞悬液置在4℃条件下，350g离心5min，去上清，然后加入2％FBS的PBS洗两次，用500μL 2％FBS的PBS重悬，分到1.5mL EP管中，进行下游实验。
下游流式步骤如下：
A、细胞表面分子检测：
①用2％FBS的PBS重悬每管细胞体积为30-50μL，加入流式抗体，4℃孵育30min；
②染色结束后，用2％FBS的PBS洗两次，加500μL 2％FBS的PBS重悬细胞，尽快上机检测。
B、细胞胞内分泌细胞因子检测：
①将肿瘤悬液接种于含有1640培养液的48孔板，1X的Cell Activation Cocktail(500X稀释)，每1mL1640培养基+2μL，然后将细胞在37℃培养箱培养孵育4-6h；
②去掉培养基后，用PBS洗两次，用2％FBS的PBS重悬每管细胞体积为30-50μL，加入表面分子流式抗体，4℃孵育30min；
③染色结束后，用2％FBS的PBS洗两次，用4％多聚甲醛室温避光孵育固定20min；
④4℃，350g，离心5min，去上清，加2％FBS的PBS洗两次；
⑤加0.2％Trixton-x100对固定后的细胞进行破膜，室温孵育20min，350g离心5min；
⑥用30-50μL 0.01％Trixton-x100重悬每管细胞，加入胞内流式抗体，4℃孵育30min；
⑦4℃，350g，离心5min，去上清，用2％FBS的PBS洗两次；
⑧500μL 2％FBS的PBS重悬固定染色后的细胞，尽快上机检测。
如图10的结果表明，用Gel-Mutation-M33-M47 OMDV+aPD-1(#6)处理的小鼠CD4+和CD8+T细胞数量显著增加。Ki-67是一种核蛋白，它是细胞增殖必须的，因此我们将它作为判断细胞增殖的标记物。此外，用Gel-Mutation-M33-M47 OMDV+aPD-1(#6)处理的小鼠复发肿瘤中CD8+T细胞的增殖也显著增加。Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs+aPD-1(#6)处理可以启动体内天然CD8+T细胞的活化，因此活化的CD8+CD69+T细胞的数量显著增加。此外，为了进一步评估Gel-OMDV制剂抗肿瘤能力的机制，还检测了记忆CD8+T(TCM)细胞，相比于对照组PBS(#1)，CD44+CD62L+TCM细胞群的数量在实验组Gel-Mutation-M33-M47 OMDV+aPD-1(#6)处理的小鼠中增加了10.3倍，表明OMDV联合治疗可以产生强大的免疫记忆效应，保护小鼠免于肿瘤复发。用Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs+aPD-1(#6)处理的小鼠复发肿瘤中CD4+T细胞的增殖显著增加。
颗粒酶B(Gzm B)和穿孔素能够杀死肿瘤细胞，Gzm B因其在癌症治疗中的应用而受到越来越多的关注。此外，IFN-γ和TNF-α在抗癌免疫治疗中也发挥重要作用。如图11的流式细胞术数据显示，在用Gel-Mutation-M33-M47OMDVs+aPD-1(#6)处理后，小鼠GzmB+CD8+T细胞和穿孔素+CD8+T细胞的比例明显增加，并且IFN-γ+CD8+T和TNF-α+CD8+T细胞的数量也明显升高。
(5)组织免疫荧光检测:
A、在步骤(3)中第22天实验结束后剥离小鼠肿瘤，用PBS洗两次，滤纸吸干水分，用OCT包埋后，置于-20℃冰箱冻到OCT凝固；
B、将冷冻切片机预冷，切片厚度调为6μm，进行切片，将切好的片子室温放置1-2h，再进行下游操作，防止脱片；
C、将恢复到室温的切片在PBS中浸泡15min，去除OCT，用滤纸吸走大部分水分，用免疫组化笔离肿瘤组织远一点画圈，避免边缘效应，加入100μL3％BSA配制的0.2％Trixton-x100室温孵育30min,吸走液体后，加入一抗，放于湿盒中，4℃过夜；
D、第二天，回收一抗，用PBS浸泡，在摇床上洗三次，每次10min，用滤纸吸走液体后，加入荧光二抗混合液，室温避光孵育1h，吸走二抗后，用PBS浸泡，在摇床上洗三次，每次10min，用滤纸吸走大部分水分后，加入终浓度为1μg/mL的DAPI染液，室温避光孵育15min，吸走染液后，用PBS浸泡，在摇床上洗三次，每次10min，吸走水分后，滴加防荧光淬灭剂封片，盖上盖玻片，用指甲油固定盖玻片四周，尽快用激光共聚焦显微镜观察和拍片，结果如图12所示。
与FACS分析相比，肿瘤组织切片中CD4+和CD8+T细胞的免疫染色也显示出相似的结果，如图12所示。上述结果表明，Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs联合aPD-1阻断剂可以触发抗肿瘤免疫反应并有效防止肿瘤复发。
(6)肺转移模型的建立：通过尾静脉静脉注射5×105B16F10-luc建立黑色素瘤转移小鼠模型，给药方式及周期参照图13中的a图。实验第六天检测转移瘤的大小及位置。实验结束后并用剪刀剪开小鼠的颈部，小心取下肺组织，用4％多聚甲醛固定然后记录肺上的转移病灶，检测结果如图13所示。
结果显示，接受Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs+aPD-1处理的小鼠只有很少的转移性肿瘤结节，并且在肺转移模型中取得了有效的抗肿瘤效应。将肺组织用4％多聚甲醛固定并计算转移结节的数量，结果表明用Gel-PBS(#1)、Gel-blank-OMDVs(#2)和Gel-Normal-M33-M47 OMDV(#3)处理的小鼠出现更多的肺转移结节。用Gel-Mutation-M33-M47 OMDV(#4)和aPD-1(#5)处理的小鼠相比前三组病灶转移数量较少，Gel-Mutation-M33-M47 OMDV+aPD-1(#6)处理的小鼠几乎没有肺转移病灶数。
此外，根据步骤(6)的方式额外进行的小鼠存活率试验(n＝10)，小鼠总计实验30天，统计各组小鼠的存活率。结果显示，用Gel-Mutation-M33-M47 OMDV+aPD-1(#6)处理的小鼠在30天之后的存活率高于其他5组。
(7)小鼠脏器苏木精和伊红(H&E)染色：
A、在步骤(6)中颈椎脱臼处死小鼠后，取小鼠肺组织，用PBS洗两次，然后用滤纸吸走水分，用4％多聚甲醛在4℃条件下固定24-72h，然后用75％乙醇脱水组织，石蜡包埋；
B、将石蜡切片机调节切片厚度至5μm，进行切片，将切片浸泡在二甲苯中脱蜡5min，重复3次，依次浸泡两次无水乙醇5min，95％乙醇5min,80％乙醇5min，70％乙醇5min，蒸馏水2min，梯度水化；
C、然后将切片放入苏木素工作液中染色5min,再用自来水洗，用1％的盐酸酒精分化数秒钟，自来水中止分化，将切片浸泡伊红染液1min，自来水洗，依次用70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、两次无水乙醇脱水，每次5min，用二甲苯透化5min，重复两次，最后用中性树胶封片，显微镜拍片，结果如图13所示。
H&E染色结果显示，用Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs(#4)和aPD-1(#5)处理的小鼠肺转移相比前三组较少，但是接受Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs+aPD-1(#6)处理的小鼠肺部仅有少量的转移病灶，说明Gel-Mutation-M33-M47 OMDVs+aPD-1(#6)在延迟肺转移方面表现出更好的治疗效果；同时显示OMDVs制剂对小鼠无毒副作用。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学﹒深圳、中山大学
<120> 一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗及制备方法和在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1415
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变M33-M47
<400> 1
atgaaagcta ctaaactggt actgggcgcg gtaatcctgg gttctactct gctggcaggt 60
tgctccagca acgctaaaat cgatcagggt atcaacccgt atgttggctt tgaaatgggt 120
tacgactggt taggtcgtat gccgtacaaa ggcagcgttg aaaacggtgc atacaaagct 180
cagggcgttc aactgaccgc taaactgggt tacccaatca ctgacgacct ggacatctac 240
actcgtctgg gtggcatggt atggcgtgca gacactaaat ccaacgttta tggtaaaaac 300
cacgacaccg gcgtttctcc ggtcttcgct ggcggtgttg agtacgcgat cactcctgaa 360
atcgctaccc gtctggaata ccagtggacc aacaacatcg gtgacgcaca caccatcggc 420
actcgtccgg acaacggtat ccctggtatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 480
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<212> DNA
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<220>
<223> 正常M33-M47
<400> 2
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gcggcggcgg cagcggtcga ggccatctcc tgggccgcct ggcggccatc gtggctaaac 1380
aggtactgct gggccggaag gtggtggtcg tacgc 1415
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 3
taatacgact cactataggg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T7Ter
<400> 4
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Claims (10)

1.一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗，其特征在于，包括细菌衍生外膜囊泡和水凝胶，所述水凝胶包括有GM-CSF，所述细菌衍生外膜囊泡包含有肿瘤特异性抗原，编码所述肿瘤特异性抗原DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗，其特征在于，还包括注射量0.5-5mg/kg的aPD-1抗体。
3.如权利要求1所述的一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗，其特征在于，所述水凝胶中GM-CSF浓度为5-50ng/mL。
4.如权利要求1所述的一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗，其特征在于，每150μL水凝胶中所述细菌衍生外膜囊泡的添加量为10-50μg。
5.如权利要求3所述的一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗，其特征在于，所述水凝胶还包括0.5-5wt％透明质酸、10-50wt％Pluronic F-127和余量的水。
6.一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求1-5任一所述的一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗，包括以下步骤：
(1)采用人工构建编码肿瘤突变型新抗原的DNA片段，重组到表达载体中，获得目的质粒，将目的质粒导入感受态大肠杆菌中，获得重组细菌，进行诱导表达，获得表达肿瘤特异性抗原的重组细胞；
(2)将重组细胞重悬于PBS溶液中，用冷HM裂解缓冲液悬浮并超声处理，离心后获得细菌衍生外膜囊泡；
(3)将GM-CSF、透明质酸和Pluronic F-127混合制得水凝胶，将细菌衍生外膜囊泡与水凝胶混合，制得疫苗。
7.如权利要求6所述的一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，离心步骤具体为：将重组细胞悬液在1000g离心收集上清，随后在3000g离心收集上清，随后在15000g离心收集沉淀，沉淀为细菌衍生外膜囊泡。
8.一种如权利要求1-5任一所述的展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用，其特征在于，所述细菌衍生外膜囊泡疫苗能够促进树突细胞的抗原识别和成熟。
10.如权利要求8所述的一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用，其特征在于，所述细菌衍生外膜囊泡疫苗能够增强CD8+细胞毒性T淋巴细胞的增殖，触发抗肿瘤免疫反应并预防肿瘤复发。
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