CN114807229A - 细胞膜、纳米疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医疗领域，尤其涉及细胞膜、纳米疫苗及其制备方法和应用。本发明提供了细胞膜，上述细胞膜不包括CD47信号分子和包括CRT信号分子。本发明提供的一种双生物工程化细胞膜包裹纳米疫苗能够有效担载抗原和佐剂、促进抗原提呈细胞的内吞和活化，最终实现高效特异性抗肿瘤免疫响应，在肿瘤临床治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

细胞膜、纳米疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医疗领域，尤其涉及细胞膜、纳米疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤疫苗通过诱导抗肿瘤特异性免疫反应，促进免疫系统识别和清除肿瘤细胞，在临床实践中取得了良好的进展。
近年来，科学家筛选出了许多肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigens,TSAs)并组装在肿瘤疫苗中。然而，由于个体间肿瘤抗原表位的多样性，个体化疫苗表现出独特的优势。此外，肿瘤细胞的突变率往往较高，这可能导致一个或多个抗原位点的丢失，因此，设计直接针对多表位的疫苗是具有潜在前景。患者自体肿瘤全细胞抗原提供了独特的优势，避免了复杂抗原筛选和制造过程的时间滞后问题，能够诱导抗原提呈细胞加工和呈递大量的肿瘤抗原，刺激强大的多克隆T细胞响应，防止肿瘤免疫逃逸。
全肿瘤细胞膜拥有完整的细胞膜蛋白抗原，能够产生针对多种肿瘤抗原的抗肿瘤免疫应答。然而，肿瘤细胞通过高表达免疫抑制分子来下调其免疫原性，从而能够逃避免疫监视。导致提取的肿瘤细胞膜表面抗原不能被抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APCs)有效识别和内吞，最终难以有效地呈现给T细胞。因此，提高APCs对疫苗的识别和吞噬能力是研制有效肿瘤疫苗的关键。CD47是一种在多种肿瘤细胞表面过表达的跨膜蛋白，它可以与髓系细胞中的信号调节蛋白α(SIRPα)结合，发出“别吃我”信号，避免被免疫系统清除。阻断该通路可促进APCs对肿瘤细胞的摄取，有利于肿瘤抗原的呈递。最近，制药公司开发了抑制CD47-SIRPα免疫检查点通路的抗体。然而，根据临床资料，CD47抗体仍可能引起全身性的副作用，包括红细胞的积累或清除。因此，需要一种更安全、更有效的阻断CD47的方法来提高肿瘤相关抗原的免疫原性。
另外，仅仅阻断该信号并不能有效促进免疫系统识别膜表面的多种抗原。主要原因是抗原提呈细胞也需要一个“吃我”的信号来进行吞噬。临床前研究发现，蒽环类或紫杉类化疗药物不仅能发挥其原有的抗肿瘤作用，还能通过诱导免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD)来释放大量免疫刺激信号。这些信号可促进肿瘤相关抗原被吞噬细胞内吞，刺激宿主产生抗肿瘤免疫应答。ICD典型的生化特征是钙网蛋白(CRT)的细胞膜易位、高迁移率组蛋白1(HMGB1)和三磷酸腺苷(ATP)的释放。尤其值得注意的是，易位的CRT可与DCs表面的受体相互作用，发出“吃我”信号，促进抗原吞噬，从而激活自然免疫和适应性免疫。然而，应用蒽环类或紫杉醇类化疗药物在临床实践中并未产生持久的免疫反应。不可忽视的问题是化疗诱导的ICD伴随着大量ATP的释放，这些ATP被外切酶进一步代谢为腺苷(ADO)。ADO是一种免疫抑制代谢产物，可与免疫细胞表面的ADO 2A受体结合，限制细胞毒性淋巴细胞的激活，抑制自然杀伤细胞的成熟，从而损害抗肿瘤免疫反应。此外，在肿瘤细胞ICD晚期，细胞破裂并释放钾离子到细胞外间隙。在正常情况下，钾离子在细胞内浓度较高，而不是在细胞外。钾离子水平的升高可降低T细胞的活性和抗肿瘤作用。因此，如何利用ICD效应产生免疫促进信号，同时避免一系列免疫抑制信号成为一个挑战。
综上所述，通过合适的方法阻断CD47通路并诱导ICD是一种有希望提高肿瘤细胞免疫原性的方法，有望成为肿瘤临床免疫治疗的新策略。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了细胞膜、纳米疫苗及其制备方法和应用。本发明提供的一种双生物工程化细胞膜包裹纳米疫苗能够有效担载抗原和佐剂、促进抗原提呈细胞的内吞和活化，最终实现高效特异性抗肿瘤免疫响应，在肿瘤临床治疗领域具有广泛的应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了细胞膜，上述细胞膜不包括CD47信号分子和包括CRT信号分子。
本发明提供了上述细胞膜的制备方法，包括以下步骤：
S1：取CD47基因敲除质粒转染肿瘤细胞，细胞分选后，获得CD47敲除肿瘤细胞系；
S2：取上述CD47敲除肿瘤细胞系与化疗药物混合，获得细胞；
S3：提取上述细胞的细胞膜，获得上述细胞膜。
本发明提供了纳米疫苗，上述纳米疫苗包括上述细胞膜和/或上述制备方法制得的细胞膜，和纳米佐剂；
所述纳米佐剂包括：阳离子载体和核酸佐剂。
在本发明的一些实施方案中，上述纳米疫苗中所述细胞膜与所述纳米佐剂的质量比为1：(1～10)。
在本发明的一些实施方案中，上述纳米疫苗中所述阳离子载体包括聚乙烯亚胺、壳聚糖或聚β氨脂中的一种或多种；所述核酸佐剂包括寡脱氧核苷酸和/或环鸟甘酸-腺苷酸。
在本发明的一些实施方案中，上述纳米疫苗中所述阳离子为聚乙烯亚胺；所述核酸佐剂为脱氧核苷酸。
本发明提供了上述纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1：取CD47基因敲除质粒转染肿瘤细胞，细胞分选后，获得CD47敲除肿瘤细胞系；
S2：取上述CD47敲除肿瘤细胞系与化疗药物混合，获得细胞；
S3：提取上述细胞的细胞膜，获得上述细胞膜；
S4：取上述阳离子载体和上述核酸佐剂混合，获得上述纳米佐剂；
S5：取上述细胞膜与上述纳米佐剂混合，获得上述纳米疫苗。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述转染的时间为40～50h。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述肿瘤细胞的数量为20～50万个。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述细胞分选的次数不少于3次。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述化疗药物包括蒽环类药物，所述化疗药物的终浓度为2～4μM。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中上述蒽环类药物包括米托蒽醌和/或多柔比星。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中上述蒽环类药物为米托蒽醌。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中上述获得所述细胞膜之前还包括步骤：用挤出器挤出，次数不少于11次。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S4中上述阳离子载体与所述核酸佐剂的质量比为1:(1～3)。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S4中上述阳离子载体和上述核酸佐剂通过静电复合作用结合。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S4中上述聚乙烯亚胺的浓度为1mg/mL；上述脱氧核苷酸的浓度为200μg/mL。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S4中上述聚乙烯亚胺的分子量为2.5kDa，体积为50～200μL。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S4中上述寡脱氧核苷酸的序列如SEQID NO:1所示。
本发明提供了上述细胞膜和/或上述制备方法制得的细胞膜、上述纳米疫苗和/或上述制备方法制得的纳米疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。
本发明提供了细胞膜，上述细胞膜不包括CD47信号分子和包括CRT信号分子。本发明提供的一种双生物工程化细胞膜包裹纳米疫苗能够有效担载抗原和佐剂、促进抗原提呈细胞的内吞和活化，最终实现高效特异性抗肿瘤免疫响应，在肿瘤临床治疗领域具有广泛的应用前景。
具体实施方式
本发明公开了细胞膜、纳米疫苗及其制备方法和应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供了一种双生物工程化的细胞膜及其包裹的纳米疫苗，包括双功能化细胞膜和纳米佐剂。
所述纳米疫苗通过CD47KO/CRT双生物工程化细胞膜和纳米佐剂混合，用挤出器通过400nm膜挤出11次之后获得。
所述CD47KO/CRT双生物工程化细胞膜和纳米佐剂混合的质量比为1:1～10。
所述CD47KO/CRT双功能化细胞膜一方面去除了肿瘤细胞表面“别吃我”信号CD47分子，另一方面诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，促使钙网蛋白(CRT)膜转位，在细胞膜上获得“吃我”信号分子CRT；最后通过常规细胞膜提取技术，获得CD47KO/CRT双生物工程化细胞膜。
本发明提供了一种上述技术方案所述CD47KO/CRT双生物工程化细胞膜的制备方法，包括以下步骤：
a)将肿瘤细胞(B16F10细胞或其它类型肿瘤细胞)接种在细胞培养皿中，培养至细胞汇合度为70％；所述肿瘤细胞的数量为5～100万；
b)选用商品化基因转染试剂GoldenTran-S和CD47基因敲除质粒，按照转染试剂说明书进行基因敲除实验，24～72h后，利用CD47荧光抗体进行细胞分选，收集CD47阴性肿瘤细胞；
c)继续培养基因编辑一次的肿瘤细胞3～5天，进行二轮基因编辑实验和细胞分选，肿瘤细胞系经过三轮细胞分选得到CD47敲除肿瘤细胞系(CD47KO-B16F10)；
d)诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡：培养CD47KO肿瘤细胞，在细胞生长到90％的汇合度时，将米托蒽醌二盐酸盐加入培养基中，使最终浓度为1～5μM。在培养箱中孵育24小时后，收集细胞准备提取细胞膜；
e)细胞膜使用MinuteTM质膜蛋白和细胞组分分离试剂盒SM-005提取：将提取出来的细胞膜用BCA蛋白试剂盒定量至终浓度为0.2mg/mL；
f)将细胞膜溶液用挤出器通过400nm膜连续挤出11次，最终获得CD47KO/CRT双生物工程化细胞膜。
优选地，所述步骤a)中肿瘤细胞数量为20～50万。
优选地，所述步骤b)中基因敲除实验时间为40～50h。
优选地，所述步骤d)中米托蒽醌二盐酸盐的终浓度为2～4μM。
所述纳米佐剂是阳离子载体与核酸佐剂通过静电复合作用制备。
所述阳离子载体可以是聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖(CS)、聚β氨脂等的任何一种。
所述核酸佐剂可以是寡脱氧核苷酸(CpG)和环鸟甘酸-腺苷酸(cGAMP)等的任何一种。
本发明提供了一种上述技术方案所述纳米佐剂的制备方法，包括以下步骤：
a)将PEI和CpG分别溶解在超纯水中，浓度分别为1mg/mL和200μg/mL；
b)取1mL的CpG溶液到1.5mL离心管中，滴入10～500微升的PEI溶液，迅速盖上盖子涡旋30秒，得到了PEI/CpG纳米颗粒。
优选地，所述步骤a)中PEI的分子量为2.5kDa，未甲基化CpG的核苷酸序列为5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’。
优选地，所述步骤b)中PEI溶液的体积为50～200微升。
本发明细胞系的构建，细胞膜、纳米佐剂和纳米疫苗的制备以及验证试验中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 CD47基因敲除小鼠黑色素瘤B16F10细胞系的构建
将30万B16F10细胞接种在细胞培养皿(直径60毫米)中，并添加4mL含有12％FBS的RPMI1640培养基，在含有5％CO2的37℃细胞培养箱中培养。当细胞长到70％汇合度时，开始基因敲除实验。将30μL的jetprime缓冲液、6μL基因转染试剂GoldenTran-S(长春金传科技有限公司)和4μL的CD47敲除质粒(CRISPR/Cas9基因敲除CD47基因的pX458载体，购自上海吉玛制药技术有限公司，sgRNA序列如SEQ ID NO:2所示：sgCD47-1:TTGGCGGCGGCGCTGTTGCT)依次加入200μL离心管中，室温孵育10分钟。将细胞培养皿中的培养基换成无血清培养基，然后加入复合物，轻轻摇晃10秒。在细胞培养箱中孵育6小时后，将无血清培养基更换为含有15％胎牛血清的1640培养基。每24小时更换一次细胞培养基。经过两天的细胞培养后，即可进行细胞分选。细胞分选前，细胞用胰蛋白酶-EDTA(0.05％)消化，然后用PE抗鼠染色CD47，经过三轮细胞分选得到CD47敲除细胞系CD47KO-B16F10。
实施例2 CD47KO/CRT双生物工程化B16F10细胞系的构建
通过体外诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡的方法来构建CD47KO/CRT双生物工程化B16F10细胞系：首先，将实施例1利用基因编辑技术获得的CD47KO-B16F10细胞培养在含有10％FBS的RPMI1640培养基中，并于37℃和5％CO2培养箱中孵育，在细胞生长到90％的汇合度时，将米托蒽醌二盐酸盐(MB1478，大连美伦生物技术有限公司)加入培养基中，终浓度为2μM。在培养箱中孵育24小时后，获得CD47KO/CRT双生物工程化B16F10细胞。
实施例3 CD47KO/CRT双生物工程化细胞膜的制备
使用MinuteTM质膜蛋白和细胞组分分离试剂盒SM-005对实施例2制备的CD47KO/CRT双生物工程化B16F10细胞的细胞膜进行提取。将提取出来的细胞膜用BCA蛋白试剂盒定量至终浓度为0.2mg/mL，将细胞膜溶液用脂质体挤出器(Nanoj-1，AVESTIN)通过400nm的膜连续挤出11次，得到CD47KO/CRT双生物工程化细胞膜囊泡。
实施例4 PEI/CpG纳米佐剂的制备
将CpG核酸佐剂溶解在超纯水中，定量至浓度为0.2mg/mL；称量PEI25k，用超纯水溶解浓度为终浓度1mg/mL。取1mL的CpG溶液到1.5mL离心管中，滴入200微升、100微升或66.7微升的PEI25k溶液，迅速盖上盖子涡旋30s，得到了PEI/CpG质量比为1:1、1:2和1:3的纳米颗粒。
实施例5纳米疫苗的制备
将实施例4制备的PEI/CpG质量比为1:2的纳米佐剂(CCNPs)和实施例3制备的CD47KO/CRT双生物工程化细胞膜囊泡(DBE)按照质量比为1:1、2:1、5:1和10:1的比例混合，用脂质体挤出器通过400nm的膜挤出11次，最终获得膜包裹的纳米疫苗。
实施例6 PEI/CpG纳米佐剂的粒径表征
对实施例4制备的PEI:CpG不同质量比条件下的粒径进行测试，结果参见表1。
表1实施例4的粒径测试结果
PEI/CpG(w/w) 粒径1(nm) 粒径2(nm) 粒径3(nm) 平均值(nm) 偏差
1:1 - - - - -
1:2 180.0 172.9 190.5 181.1 7.23
1:3 161.1 170.9 165.7 165.9 4.00
注：-表示未得到有效数据。
由以上测试结果可知，通过静电复合作用能够形成纳米佐剂，这有利于细胞膜对纳米佐剂的包裹作用。
实施例7纳米疫苗的粒径电位表征
对实施例3获得的双生物工程化细胞膜囊泡、实施例4获得的PEI/CpG质量比为1:2的纳米佐剂和实施例5纳米佐剂和细胞膜囊泡按照质量比1:1进行制备获得的纳米疫苗进行粒径和电位测试，结果参见表2和3。
表2实施例3、4和5的粒径测试结果
样品 粒径1(nm) 粒径2(nm) 粒径3(nm) 平均值(nm) 偏差
PEI/CpG纳米佐剂 180.0 172.9 190.5 181.1 7.23
细胞膜囊泡 263.6 285.4 279.6 276.2 9.22
纳米疫苗 173.3 176.4 202.3 184 13
表3实施例3、4和5的表面电位测试结果
样品 电位1(mV) 电位2(mV) 电位3(mV) 平均值(mV) 偏差
PEI/CpG纳米佐剂 -12.5 -14.5 -12.0 -13.0 1.08
细胞膜囊泡 -22.4 -27.3 -28 -25.9 2.49
纳米疫苗 -20.6 -24.3 -21.4 -22.1 1.59
由以上测试结果可知，纳米疫苗能够形成带负电的纳米颗粒，这有利于纳米疫苗的体内稳定性和抗原提呈细胞的摄取。
实施例8纳米疫苗的内吞
骨髓来源的树枝状细胞(BMDCs)诱导成功后，按照5×105细胞/孔的密度接种于24孔培养板中，继续培养24小时。加入含有荧光标记的CpG佐剂(样品分别为：PBS、PEI/CpG-Cy5(纳米佐剂)、Normal/PEI/CpG-Cy5(正常肿瘤细胞膜包裹纳米佐剂)、CRT/CCNPs(CRT诱导肿瘤细胞膜包裹纳米佐剂)、CD47KO/CCNPs(CD47敲除肿瘤细胞膜包括纳米佐剂)和DBE/CCNPs(实施例5获得的CD47KO/CD47双生物工程化细胞膜包括纳米佐剂，DBE与CCNPs的质量比为1:1)，其中CpG-Cy5的用量为1微克/样，细胞膜/PEI/CpG-Cy5的质量比为1.5:0.5:1，继续培养4小时后，用流式细胞仪检测荧光佐剂的内吞效率。
表4不同细胞膜包裹纳米佐剂的内吞结果
Figure BDA0003666734310000091
Figure BDA0003666734310000101
MFI为平均荧光强度结果表明，本发明实施例5获得的双生物工程化肿瘤细胞膜包裹的纳米疫苗与无细胞膜包裹、正常肿瘤细胞膜包裹以及单生物工程化细胞膜包裹纳米疫苗相比，其内吞量均显著增加，有利于促进抗原及佐剂的内吞。
实施例9靶向纳米疫苗活化BMDC细胞
BMDCs细胞诱导成功后，按照5×105细胞/孔的密度接种于24孔培养板中，继续培养24小时。分别加入PBS、PEI/CpG、Normal膜/PEI/CpG、CRT/CCNPs、CD47KO/CCNPs和实施例5制备的DBE/CCNPs(质量比1:1)的纳米疫苗，其中CpG-Cy5的用量为1微克/样，细胞膜/PEI/CpG-Cy5的质量比为1.5:0.5:1，继续培养24小时后，用流式细胞仪检测BMDCs细胞的标签(CD11c)以及表面成熟分子表达(CD80和CD86)。
表5纳米疫苗诱导BMDC细胞成熟结果
Figure BDA0003666734310000102
实验结果表明，相比对照组，实施例5制备的双生物工程化细胞膜包裹纳米疫苗组DBE/CCNPs质量比为1:1，能够有效上调BMDCs细胞表面成熟分子CD80和CD86的表达，提高疫苗的效率。
实施例10纳米疫苗促进BMDCs细胞分泌免疫活化细胞因子
BMDCs细胞诱导成功后，按照5×105细胞/孔的密度接种于24孔培养板中，继续培养24小时。加入不同组分材料(分别为：PBS、PEI/CpG、Normal/PEI/CpG、CRT/CCNPs、CD47KO/CCNPs和实施例5制备的DBE/CCNPs的质量比为1:1的纳米疫苗，其中CpG-Cy5的用量为1微克/样，细胞膜/PEI/CpG-Cy5的质量比为1.5:0.5:1，继续培养24小时。取细胞悬液并离心，优选1500rpm离心10min，上清液用ELISA方法进行细胞因子检测。
表6实施例10中IL-6(pg/mL)分泌结果
分组 样品1 样品2 样品3 平均值 偏差
PBS 15.4 16.5 17 16.3 0.67
PEI/CpG 215 245.5 225.9 228.8 12.62
Normal/PEI/CpG 203.4 221.4 218.7 214.5 7.93
CRT/CCNPs 265.6 276.6 287 276.4 8.74
CD47KO/CCNPs 296.4 325.4 281.8 301.2 18.12
DBE/CCNPs 332.5 338.6 349.5 340.2 7.03
表7实施例10中IL-12p70(pg/mL)分泌结果
分组 样品1 样品2 样品3 平均值 偏差
PBS 6.5 6.2 7.4 6.7 0.51
PEI/CpG 62.3 65.6 73.7 67.2 4.79
Normal/PEI/CpG 50.5 52.5 57.8 53.6 3.08
CRT/CCNPs 156.3 157.7 169.9 161.2 6.11
CD47KO/CCNPs 105.4 111.3 115.4 110.7 4.1
DBE/CCNPs 254.6 270.5 278.3 267.8 9.86
测试结果参见表6和7，细胞因子分泌的结果与BMDC细胞成熟实验结果一致。相比与其他对照组，双生物工程化细胞膜包裹纳米疫苗组DBE/CCNPs明显促进BMDCs细胞分泌免疫活化细胞因子IL-6和IL-12，说明本发明所述的纳米疫苗能够高效活化树突细胞。
实施例11纳米疫苗抗肿瘤作用研究
对6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠随机分成4组，每组5只小鼠。实验组分别为PBS、PEI/CpG、Normal/PEI/CpG和实施例5制备的DBE/CCNPs(质量比1:1)的纳米疫苗，其中膜蛋白为40μg，CpG为13.3μg。每隔一周皮下免疫一次，共免疫3次。最后一次免疫后第7天，将100μL的B16F10细胞(5×106cells/mL)注射到小鼠背部皮下，构建荷瘤小鼠模型，监测小鼠肿瘤生长情况。
表8肿瘤抑制率(％)结果
分组 鼠1 鼠2 鼠3 鼠4 鼠5 平均值 偏差
PBS -8.4 -6.8 2.3 5.5 7.4 0 6.44
PEI/CpG 8.5 16.8 31.6 28.9 28.7 22.9 8.83
Normal/PEI/CpG -0.1 6.5 12.4 10.3 6.9 7.2 4.25
DBE/CCNPs 56.4 55.7 83.2 57.8 80.9 66.8 12.49
实验结果表明，相比对照组，双生物工程化细胞膜包裹纳米疫苗组DBE/CCNPs取得了最佳肿瘤抑制率66.8％(PBS组作为对照，肿瘤抑制率看成0％)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院长春应用化学研究所
<120> 细胞膜、纳米疫苗及其制备方法和应用
<130> MP22006797
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttggcggcgg cgctgttgct 20

Claims (10)

1.细胞膜，其特征在于，所述细胞膜不包括CD47信号分子和包括CRT信号分子。
2.如权利要求1所述细胞膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取CD47基因敲除质粒转染肿瘤细胞，细胞分选后，获得CD47敲除肿瘤细胞系；
S2：取所述CD47敲除肿瘤细胞系与化疗药物混合，获得细胞；
S3：提取所述细胞的细胞膜，获得所述细胞膜。
3.纳米疫苗，其特征在于，所述纳米疫苗包括如权利要求1所述细胞膜和/或如权利要求2所述制备方法制得的细胞膜，和纳米佐剂；
所述纳米佐剂包括：阳离子载体和核酸佐剂。
4.如权利要求3所述的纳米疫苗，其特征在于，所述细胞膜与所述纳米佐剂的质量比为1：(1～10)。
5.如权利要求3或4所述的纳米疫苗，其特征在于，所述阳离子载体包括聚乙烯亚胺、壳聚糖或聚β氨脂中的一种或多种；所述核酸佐剂包括寡脱氧核苷酸和/或环鸟甘酸-腺苷酸。
6.如权利要求3至5任一项所述纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取CD47基因敲除质粒转染肿瘤细胞，细胞分选后，获得CD47敲除肿瘤细胞系；
S2：取所述CD47敲除肿瘤细胞系与化疗药物混合，获得细胞；
S3：提取所述细胞的细胞膜，获得所述细胞膜；
S4：取所述阳离子载体和所述核酸佐剂混合，获得所述纳米佐剂；
S5：取所述细胞膜与所述纳米佐剂混合，获得所述纳米疫苗。
7.如权利要求2或6所述的制备方法，其特征在于，S1中所述转染的时间为40～50h。
8.如权利要求2、6或7所述的制备方法，其特征在于，S2中所述化疗药物包括蒽环类药物，所述化疗药物的终浓度为2～4μM。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，S4中所述阳离子载体与所述核酸佐剂的质量比为1：(1～3)。
10.如权利要求1所述细胞膜和/或如权利要求2所述制备方法制得的细胞膜、如权利要求3至5任一项所述纳米疫苗和/或如权利要求6至9任一项所述制备方法制得的纳米疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。
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