RU2354694C2 - Аллогенное противоопухолевое терапевтическое средство - Google Patents
Аллогенное противоопухолевое терапевтическое средство Download PDFInfo
- Publication number
- RU2354694C2 RU2354694C2 RU2006127428/13A RU2006127428A RU2354694C2 RU 2354694 C2 RU2354694 C2 RU 2354694C2 RU 2006127428/13 A RU2006127428/13 A RU 2006127428/13A RU 2006127428 A RU2006127428 A RU 2006127428A RU 2354694 C2 RU2354694 C2 RU 2354694C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tumor
- cells
- vaccine
- cancer
- cell
- Prior art date
Links
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 title claims description 26
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 59
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 42
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 63
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 58
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 47
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 46
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 45
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 45
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 claims description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 33
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 32
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 claims description 32
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 claims description 32
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 26
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 13
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 9
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 7
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 7
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 6
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 125000001369 canonical nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydropyrimidin-4-amine Chemical compound N=C1NCNC=C1 WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 8
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims 8
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical compound C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 39
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 38
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 28
- 230000004044 response Effects 0.000 description 28
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 10
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 6
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 238000004969 ion scattering spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 101100373494 Enterobacteria phage T4 y06G gene Proteins 0.000 description 1
- 108010069446 Fertilins Proteins 0.000 description 1
- 102000001133 Fertilins Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001014223 Homo sapiens MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- 102000005711 Keratin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010070507 Keratin-7 Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102100031520 MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 description 1
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710143177 Synaptonemal complex protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036234 Synaptonemal complex protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010047281 Ventricular arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000013043 cell viability test Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- CEAFGIULVYYEIQ-UHFFFAOYSA-K magnesium sodium triacetate Chemical compound [Na+].[Mg++].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O CEAFGIULVYYEIQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000037843 metastatic solid tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N n-(4-hydroxyphenyl)-2-(1,1,3-trioxo-1,2-benzothiazol-2-yl)acetamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CN1S(=O)(=O)C2=CC=CC=C2C1=O PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- MKNJJMHQBYVHRS-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[11-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)undecanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCCCCCN1C(=O)C=CC1=O MKNJJMHQBYVHRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000009121 systemic therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5152—Tumor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K2039/55527—Interleukins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к иммунологии и генетической инженерии. Предложена опухолевая клетка человека и вакцина на ее основе. Изобретение может быть использовано для терапевтического лечения опухолевых заболеваний. 6 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.
Description
Изобретение относится к вакцине на основе аллогенных опухолевых клеток для терапевтического лечения опухолевых заболеваний, а также к способу получения такой вакцины; а также к трансфицированным опухолевым клеткам человека для применения в качестве вакцины.
Наряду с общепринятыми способами лечения раковых заболеваний, такими как лучевая терапия и химиотерапия, которые с 1950-х годов являются единственной возможностью лечения для прогрессирующих и широко распространенных опухолевых заболеваний, иммунотерапия при метастазирующих опухолях является, по-видимому, новым обещающим успех подходом.
Иммунотерапия направлена на то, чтобы усилить природную иммунную реакцию против опухолевого заболевания посредством генно-инженерных модификаций, следовательно, повлиять на “внимание” иммунной системы против раковых клеток и, тем самым, на защитную реакцию таким образом, чтобы организм сам мог победить опухоль.
Поскольку некоторые злокачественные заболевания, такие как, например, почечно-клеточный рак на поздней стадии, являются, по-видимому, относительно чувствительными для иммунотерапевтических подходов, но системная терапия цитокинами, такими как IL-2 и IFN-альфа, сопровождается отчасти значительными побочными действиями, развивались другие иммунотерапевтические протоколы.
Большинство клинических исследований делают ставку на удаление опухоли, последующую трансфекцию ex vivo опухолевых клеток терапевтическим геном, облучение популяции опухолевых клеток и последующую повторную имплантацию модифицированных теперь опухолевых клеток. Посредством этого вакцинирования опухолевыми клетками противоопухолевая реакция может быть повышена в зависимости от трансфицированного терапевтического гена в различной степени.
На основе этого подхода, а также на основе результатов экспериментов с животными был разрешен ряд клинических исследований фазы I и II (Finke et al., 1997; Wittig et al., 2001).
Однако первые результаты с трансфицированными единственными генами показали, наряду с хорошей переносимостью терапии, лишь в немногих случаях частичные или полные ремиссии.
В одной мышиной модели рака ободочной кишки перенос гена CD40L/CD154 смог произвести индукцию цитокинов, ликвидацию опухоли и создание иммунитета (Sun et al., 2000).
Авторы настоящей заявки смогли показать, что перенос экспрессионных плазмид для интерлейкина 7 (IL-7) человека в опухолевые клетки приводит к повышенной чувствительности к эффекторным клеткам иммунной системы, особенно при аутологичном переносе (Finke et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 260-268). Авторы смогли также показать, что после трансфекции двух терапевтических генов (IL-7, GM-CSF) в аутологичные опухолевые клетки удалось у половины пациентов избежать клинически значимой реакции (WO 02/060476).
Из патента США 5681562 известно, что можно инъецировать пациентам с определенными раковыми заболеваниями клетки, которые трансфицированы кодирующей цитокины ДНК или РНК. Иммунная система пациента должна стимулироваться, таким образом, против антигенов опухолей. В этом патентном описании описаны опыты, в которых фибробласты мышей трансфицировали ретровирусными векторами, кодирующими IL-2. Описан также опыт in vivo, в котором испытывали эффективность этой обработки в мышиной модели рака толстой кишки. Мыши, которым инъецировали подкожно (s.c.) трансфицированные фибробласты, развивали явно замедленный рост опухоли в сравнении с контрольными группами. В опытах in vitro с трансфицированными фибробластами человека мог быть также определен явно повышенный уровень экспрессии IL-2. Наряду с отсутствующими клиническими результатами, которые выходят за пределы мышиной модели, используемые в качестве экспрессирующего вектора вирусные векторы считаются мало предпочтительными. Вследствие нестабильности аттенуированного вакцинного штамма нельзя исключить обратное превращение в вирулентный штамм, кроме того, сами вирусные компоненты могут действовать иммуногенно, что ведет к снижению их эффективности иммунной системой пациента. Эти выборочные риски в значительной степени препятствуют их широкому применению в качестве генотерапевтического вектора.
Многочисленные публикации показывают, что наилучшие терапевтические результаты достигаются комбинацией генов цитокинов с фактором роста GM-CSF (Paillard, 1998, Hum. Gene Ther. 9: 2457-2458; Schadendorf et al., 1995, J. Mol. Med. 73: 473-477). Значение GM-CSF при вакцинировании опухолевым антигеном обнаруживалось также в повышении клинической и иммунологической противоопухолевой реакции при вакцинировании пептидами (Jäger et al., 1996). Очевидно, при этом существенную роль играет активирование антигенпредставляющих клеток, а также стимуляция популяции эффекторных клеток.
Однако до сих пор неясно, какие гены цитокинов в комбинации с иммуногенной композицией с GM-CSF вызывают самую эффективную противоопухолевую иммунную реакцию.
В экспериментах на мышах оказалось, что вакцинация экспрессионными конструкциями, кодирующими IL-7, вызывает противоопухолевое действие (Miller et al., 1993, Blood 18: 3686-3694; Murphy et al., 1993, J. Clin. Invest. 92: 1918-1924). Известно также, что инкубирование CTL с IL-7 или IL-7-трансфицированными клетками приводит к регрессу опухоли у мышей (Jicha et al., 1991; Hock et al., 1993), а трансфекция IL-7 и В7.1/CD80 индуцирует CD28+CD25+ Т-клеточный инфильтрат и иммунитет (Cayeux et al., 1995).
До сих пор не получены терапевтические эффекты, даже в мышиной модели.
Кроме того, при попытках стимуляции иммунных реакций посредством генотерапии последовательностями плазмидной ДНК или олигонуклеотидными последовательностями наблюдали, что определенные последовательности нуклеиновых кислот, которые обнаруживают Cog-мотив (Cog = неметилированный динуклеотид цитозин-гуанозин), могут иметь огромное иммуностимуляторное действие (Schmidt-Wolf et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 185-189). Иммуностимуляторные последовательности нуклеиновых кислот (ISS) применяли по этой причине уже давно в качестве адъювантов в протоколах иммунизации на основе ДНК против инфекционных возбудителей (Sato et al., 1996, Science 273: 352-354). В экспериментах с мышами оказалось, что обогащение CpG-богатыми ДНК-последовательностями приводит к сильной активации В-клеток и индуцирует экспрессию определенных цитокинов, например, IL-6 и GM-CSF. В мышиной модели удалось также показать, что иммунизация CpG-олигодезоксирибонуклеотидами (ODN) вместе со слитым белком за три дня перед инокуляцией опухоли может подавлять рост опухоли у мыши (Liu et al., 1998). Учение о применении и получении иммуностимуляторных, CpG-содержащих ISS всеобъемлющим образом обсуждается в WO 98/18810.
Из WO 00/04918 известна трансфекция опухолевых клеток генами, кодирующими, например, интерферон-гамма и GM-CSF. В качестве экспрессирующих векторов использовали плазмиды. Этот документ излагает концепцию лечения опухолевых заболеваний с использованием иммунотерапии. Убедительные in vivo или in vitro данные или клинические результаты, которые подтверждают эффективность рассматриваемой вакцины, не представлены. Следует отметить, что эти векторы на основе плазмид не являются безоговорочно пригодными для использования в генотерапии человека, так как они, наряду с терапевтическими последовательностями, несут генетические функциональные единицы, которые необходимы для их репликации. Наряду с этим, они обнаруживают гены устойчивости к антибиотикам, которые являются необходимыми для их отбора. Следовательно, происходит длительная экспрессия терапевтически нежелательных белков млекопитающих или бактерий.
Несмотря на многолетние исследования и многообещающие подходы, до сих пор не удалось разработать эффективную иммунотерапию против опухолевых заболеваний посредством применения иммуногенных веществ.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение вакцины в качестве лекарственного средства для лечения связанных с цитокинами заболеваний, таких как, например, раковые заболевания, которая является специфически и эффективно применимой и, в частности, приводит к индукции опухолеспецифических иммунных ответов. Далее, должен быть разработан соответствующий способ получения подобной вакцины.
Эта задача решается признаками самостоятельных пунктов формулы изобретения.
В контексте изобретения следующие выражения и аббревиатуры обозначают:
| аллогенные | из генетически отличающегося индивидуума того же самого вида (species) в противоположность "аутологичным" (собственным (гомологичным) клеткам) |
| АРС | антигенпредставляющие клетки |
| В7.1/CD80 | кластер дифференцировки 80 |
| CD40L/CD154 | лиганд кластера дифференцировки 40 |
| DC | дендритные клетки |
| dSLIM | иммуномодулирующие олигодезоксирибонуклеотиды с двойной структурой стебель-петля |
| GM-CSF | гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор |
| IL-7 | интерлейкин-7 |
| ISS | иммуностимуляторные последовательности нуклеиновых кислот |
| MIDGE | минимизированный иммунологически определенный экспрессирующий вектор гена (MIDGE® является зарегистрированным товарным знаком Mologen AG) |
| ODN | олигодезоксирибонуклеотид |
| ТАА | ассоциированный с опухолью антиген (опухолеспецифический антиген) |
Далее, ряд общих понятий должны пониматься следующим образом.
Трансфицированные клетки, в контексте изобретения, являются аллогенными опухолевыми клетками человека, которые были обработаны ex vivo в соответствии с изобретением кодирующими экспрессирующими векторами и вследствие этой обработки экспрессируют кодирующие цитокин и костимуляторный фактор последовательности и применяются в качестве иммунотерапевтического средства при опухолевых заболеваниях.
В контексте изобретения термин костимуляторный фактор и/или цитокин относится как к природно встречающимся костимуляторным факторам и/или цитокинам, так и ко всем модификациям, мутантам или производным костимуляторных факторов и/или цитокинов, полученным способами рекомбинации костимуляторным факторам и/или цитокинам, которые содержат модификации аминокислот, такие как инверсии, делеции, вставки, присоединения и т.д., пока имеется в наличии по меньшей мере часть существенных функций костимуляторных факторов и/или цитокинов дикого типа. Такие костимуляторные факторы и/или цитокины могут также включать в себя необычные аминокислоты и/или модификации, такие как алкилирование, окисление, модификацию тиолом, денатурацию и олигомеризацию и т.п. В связи с изобретением костимуляторные факторы и/или цитокины могут быть, в частности, белками, пептидами и/или слитыми пептидами, которые, наряду с другими белками, пептидами или их частями, содержат костимуляторные факторы и/или цитокины в целом виде или в частичном виде. В следующем варианте осуществления изобретения костимуляторные факторы и/или цитокины являются укороченными формами природно встречающихся костимуляторных факторов и/или цитокинов.
Все вышеуказанные костимуляторные факторы, которые пригодны для модуляции реакции иммунной системы, являются в контексте изобретения иммуногенными веществами. Таким образом, вакцина по изобретению представляет собой, в контексте изобретения, иммуногенную композицию, так как она содержит комбинацию иммуногенных веществ. Опухолевые клетки отличаются от нормальных клеток, среди прочего, измененной экспрессией белков клеточной поверхности. Прежде всего, экспрессия опухолеспецифических антигенов (ТАА) делает теоретически возможными узнавание и уничтожение этих клеток иммунной системой. Однако часто иммунная система пациентов является супрессированной, так что ей не удается узнать измененные клетки.
Эта проблема решается обеспечением вакцины для лечения пациентов с определенными опухолевыми заболеваниями, причем эта вакцина состоит из опухолевых клеток другого пациента (аллогенных клеток), и эти опухолевые клетки были предварительно трансфицированы ex vivo экспрессионными конструкциями, кодирующими интерлейкин-7 (IL-7), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор GM-CSF и костимуляторные факторы CD40L/CD154 и В7.1/CD80. В следующем варианте осуществления изобретение относится к соответствующей вакцине, причем эти опухолевые клетки предварительно были трансфицированы ex vivo экспрессионными конструкциями, кодирующими интерлейкин-7 (IL-7), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор GM-CSF и костимуляторный фактор CD40L/CD154.
В случае используемых опухолевых клеток речь может идти о таких клетках, которые происходят от пациентов с картиной заболевания, подобной картине заболевания подлежащего лечению пациента, или о таких клетках, которые происходят от пациентов с картиной заболевания иной, чем картина заболевания подлежащего лечению пациента.
Комбинация компонентов (иммуногенных веществ) вакцины должна гарантировать, что производятся все три стадии каскада сигнала, которые в принципе необходимы для индукции специфической иммунной реакции. Эти три стадии включают в себя презентирование антигена, костимуляцию и обеспечение подходящей локальной среды.
Экспрессия GM-CSF и CD40L/CD154 должна вызывать локальный рекрутинг и активацию антигенпредставляющих клеток (АРС), а также дендритных клеток (DC). Следствием является усиленная презентация ТАА (опухолеспецифического антигена).
Экспрессия В7.1/CD80 приводит к повышению костимуляторной активности. Благодаря этому антигенность ТАА усиливается и повышается количество активированных против ТАА Т-лимфоцитов.
Экспрессия IL-7 дополнительно индуцирует пролиферацию опухолеспецифических Т-лимфоцитов.
Вакцина по изобретению приводит посредством этого в месте применения к высокой концентрации растворимых, усиливающих пролиферацию цитокинов и костимуляторных молекул в сопряжении с ТАА на поверхности опухолевых клеток, которая приводит к активации и пролиферации опухолеспецифических Т-клеток. АРС и DC также "привлекаются" к месту применения.
Экспрессионные конструкции существуют в виде плазмиды, но предпочтительно являются также минимизированными иммунологически определенными конструкциями экспрессии генов. При этом речь идет о линейной двухцепочечной, ковалентно замкнутой экспрессионной кассете, которая состоит только из промотора CMV, интрона, кодирующей ген последовательности и последовательности полиаденилирования. Эта экспрессионная кассета на обоих концах двойной цепи ковалентно замкнута короткой петлей одноцепочечных нуклеозидных остатков. Эти ковалентно замкнутые минимизированные ДНК-конструкции в дальнейшем описании обозначаются как MIDGE-векторы (MIDGE: минимизированный иммунологически определенный экспрессирующий вектор гена); см. ЕР 0941318 В1. MIDGE-конструкции имеют преимущество, заключающееся в том, что с ними можно избежать структур, которые не являются существенными для терапевтического действия, что, наконец, устраняет недостатки традиционных переносчиков генов.
Обеспечение локальной среды, которая является пермиссивной для индукции специфической иммунной реакции, гарантируется использованием адъюванта в форме иммуностимуляторных последовательностей нуклеиновых кислот (ISS). Для этой цели в соответствии с изобретением предусматривается, что вакцина дополнительно включает в себя иммуномодулирующие олигодезоксирибонуклеотиды в качестве адъюванта. Предпочтительным при этом является иммуномодулирующий олигодезоксирибонуклеотид, который
а) включает в себя последовательность с очередностью оснований N1N2CGN3N4, причем N1N2 является элементом, выбранным из группы, состоящей из GT, GG, GA, AT или AA, N3N4 является элементом, выбранным из группы, состоящей из СТ или ТТ, а также С обозначает дезоксицитозин, G обозначает дезоксигуанозин, А обозначает дезоксиаденозин и Т обозначает дезокситимидин,
b) и включает в себя дезоксирибонуклеиновую кислоту с кольцевой цепью с по меньшей мере частично комплементарной, антипараллельной последовательностью оснований и образован в форме гантели.
CpG-мотивы ISS (см. фиг.2а) обусловливают повышение активности NK-клеток и макрофагов, а также сильную стимуляцию клеточной Th1-реакции. Они действуют посредством этого в качестве иммуномодуляторов и делают возможной и усиливают опухолеспецифическую иммунную реакцию. Предпочтительно используют ковалентно замкнутые ISS с длиной 30 п.н., которые описаны в WO 01/07055. Эти конструкции в дальнейшем будут называться dSLIM (иммуномодулирующие олигодезоксирибонуклеотиды с двойной структурой стебель-петля).
Последовательность с очередностью оснований N1N2CGN3N4 расположена в одноцепочечной области этого олигодезоксирибонуклеотида и включает в себя 40-200 нуклеотидов (см. фиг.2b).
Объектом изобретения является также способ получения вышеописанной вакцины для лечения пациентов с опухолевыми заболеваниями, в котором опухолевые клетки генетически неидентичного (гетерологичного) донора того же самого вида (аллогенного) трансфицируют ex vivo молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими
а) интерлейкин-7 (IL-7), гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), CD40L/CD154 и В7.1/CD80, или
b) интерлейкин-7, гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и CD40L/CD154,
и затем переводят в пригодную для применения фармацевтическую композицию. Уже описанные выше иммуномодулирующие олигодезоксирибонуклеотиды включают в себя кольцевую цепь дезоксирибонуклеиновой кислоты с частично комплементарной, антипараллельной последовательностью оснований и образованы в форме гантели. Они являются также компонентом для использования в качестве адъюванта в указанном способе.
Таким образом, в соответствии с изобретением предусматривается, что одна аллогенная опухолевая клетка включает в себя по меньшей мере три, предпочтительно четыре молекулы нуклеиновой кислоты, которые вместе кодируют костимуляторные факторы В7.1/CD80 и CD40L/CD154 и цитокины интерлейкин-7 и GM-CSF.
Поэтому предметом изобретения являются также соответственно трансфицированные, аллогенные опухолевые клетки человека, которые были ex vivo трансфицированы молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими
а) интерлейкин-7 (IL-7), гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), CD40L/CD154 и В7.1/CD80, или
b) интерлейкин-7, гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и CD40L/CD154,
и обнаруживают соответствующие экспрессионные конструкции. Эти опухолевые клетки обнаруживают экспрессионные конструкции в форме плазмиды или также в виде линейной двухцепочечной, ковалентно замкнутой экспрессионной кассеты, которая состоит только из промотора CMV, интрона, кодирующей последовательности гена и последовательности полиаденилирования, которая на обоих концах двойной цепи ковалентно замкнута короткой петлей одноцепочечных нуклеозидных остатков. Предпочтительно речь идет при этом об аллогенной опухолевой клетке клеточной линии почечно-клеточного рака.
Как в случае самой вакцины, так и в случае способа по изобретению предусматривается, что молекулы нуклеиновых кислот находятся в одной или нескольких экспрессионных конструкциях. Таким образом, речь может идти об экспрессионной конструкции ДНК для экспрессии множественных генов,
- состоящей из двухцепочечных областей, которые содержат линейную экспрессионную кассету, которая обнаруживает по меньшей мере одну промоторную последовательность и одну кодирующую последовательность,
- причем эти двухцепочечные области связаны друг с другом одноцепочечными ДНК или некодирующими двухцепочечными ДНК,
- и эти экспрессионные кассеты на концах, на которых они не связаны с другими экспрессионными кассетами через одноцепочечные ДНК или некодирующие двухцепочечные ДНК, защищены против расщепления экзонуклеазами.
Подобная экспрессионная конструкция ДНК для экспрессии множественных генов уже описана в РСТ/DE03/02478. Таким образом, несколько нуклеиновых кислот, которые являются предметом вакцины по изобретению, могут быть связаны в единой экспрессионной конструкции.
В одном особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулой нуклеиновой кислоты является ДНК, в частности, кДНК или геномная ДНК. Само собой разумеется, может быть также предпочтительным, чтобы этой молекулой нуклеиновой кислоты была РНК.
Аллогенные опухолевые клетки происходят от пациентов с колоректальным раком, мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легкого, раком предстательной железы, раком молочной железы, раком яичника, а также злокачественной меланомой.
В рамках изобретения используется, в частности, клеточная линия почечно-клеточного рака, которая является особенно подходящей для получения вакцины по изобретению. Предпочтительная клеточная линия почечно-клеточного рака была депонирована в DSMZ (Немецкой Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур GmbH) в виде жизнеспособной культуры под номером DSM ACC 2635. В клетки этой клеточной линии почечно-клеточного рака с использованием по существу известных способов трансфекции биологического, химического и/или физического типа вводят экспрессионные ДНК-конструкции, которые приводят в этих клетках к экспрессии желаемых генов. К трансфицированным таким образом аллогенным клеткам добавляют адъювант, предпочтительно ISS, особенно предпочтительно dSLIM (см. выше). После радиоактивного облучения трансфицированных аллогенных опухолевых клеток гамма-излучением вакцину изобретения применяют для пациентов с опухолевым заболеванием.
Организм для взятия клеток, в отличие от терапии аутологичными клетками, не является организмом, который сам должен лечиться лекарственным средством. Применение аллогенных клеток имеет, с одной стороны, преимущество однократной характеристики и надежного размножения клеток, с другой стороны, аллогенный стимул рассматривается как дополнительное благоприятное адъювантное воздействие.
Подлежащие обработке клетки могут происходить из единственного (гетерологичного) организма или могут объединяться (в пул) из нескольких организмов с той же самой картиной заболевания.
Таким образом, изобретение относится к комбинации из трех или четырех нуклеиновых кислот, которые кодируют два цитокина и один или два костимуляторных фактора.
В качестве дополнительных иммуномодуляторов могут быть использованы ISS, предпочтительно dSLIM.
В экспериментах на культурах клеток в первичных клеточных линиях после трансфекции удалось обнаружить трижды или четырежды положительные клетки (см. фиг.1). Термины "трижды" или "четырежды" положительные обозначают в этой связи, что высокий процент клеток со всеми тремя или четырьмя генами, кодирующими GM-CSF, IL-7, CD40L/CD154 и В7.1/CD80, одновременно успешно трансфицировался, и эти три или четыре гена затем экспрессировались этими клетками. В используемой клеточной линии рака ободочной кишки можно было определить 14,4% всех клеток в качестве четырежды положительных клеток с использованием FACS-анализа (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции). Далее удалось установить, что независимо от гена 20,3% клеток были трансфицированы одним геном после электропорации; с тремя различными генами были успешно трансфицированы еще 19,9% клеток. Было установлено, что процентная доля успешно трансфицированных клеток рака ободочной кишки после четырехкратной трансфекции экспрессионными конструкциями, кодирующими CD40L/CD154, GM-CSF, В7.1/CD80 и IL-7, составляет 14,4% этих клеток. Согласно этому, 14,4% клеток были трансфицированы четырьмя различными генами и были способны успешно экспрессировать их. В целом, 69,4% всех клеток были трансфицированы одним или несколькими из этих генов.
Трансфекция несколькими генами является преимуществом, так как экспрессируемые таким образом цитокины и костимуляторные факторы экспрессируются в тесной пространственной близости друг к другу в эффекторных органах иммунной системы. Эта пространственная близость является важной, так как костимуляторные сигналы дают эффективное усиление только в связи с антигенами.
Для трансфекции могут использоваться по существу известные биологические, химические и/или физические способы, например, трансфекция при помощи баллистического переноса (ЕР 0686697), трансфекция с использованием поликатионов, трансфекция с использованием осаждения фосфатом кальция, микроинъекция, слияние протопластов, слияние липосом, вирусные системы трансфекции, липофекция и/или электропорация in vivo и/или in vitro. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения трансфекция происходит посредством электропорации.
Дополнительными предпочтительными способами являются такие способы трансфекции, как опосредованный рецептором перенос генов. При этом, например, экспрессионные ДНК-конструкции, которые кодируют по меньшей мере один, предпочтительно два, костимуляторных фактора и два цитокина, ковалентно связаны с олигопептидом, который является предпочтительно последовательностью ядерной локализации (сигналом ядерной локализации = NLS) из вакуолизирующего обезьяньего вируса SV-40.
С использованием другого, частично синтетически полученного пептида можно дополнительно повысить эффективность трансфекции. Эти способы пригодны особенно для клеткоспецифического переноса генов in vivo с использованием внутривенного введения.
Полученная в соответствии со способом по изобретению вакцина из модифицированных аллогенных опухолевых клеток обнаруживает поразительные действия. Предпочтительно могут быть устранены недостаточности в иммунной системе имеющих опухоль пациентов и одновременно усилена имеющаяся внутренняя иммунная реакция на опухолеспецифические антигены.
Кроме того, эта вакцина может быть использована для пациентов, опухоль которых была удалена, в качестве адъювантной терапии для улучшения и восстановления их иммунной реакции против остаточных опухолевых клеток или для уменьшения оставшейся опухолевой массы. Открывается перспектива для пациентов с хирургически удаленной первичной опухолью без видимых метастазов, которые могли бы пролиферировать вследствие дополнительной опухолеспецифической терапии, уменьшающей скорость рецидивов.
Дополнительные предпочтительные варианты осуществления изобретения составляют зависимые пункты формулы изобретения и описание. Изобретение, в том числе неожиданное действие лекарственного средства по изобретению (в качестве вакцины для терапии рака), а также способ по изобретению будут описаны далее более подробно с использованием фигур и примеров осуществления.
Фиг.1 показывает интенсивности FACS четырежды трансфицированных клеток рака ободочной кишки человека. Трансфекцию выполняли электропорацией экспрессирующими векторами, кодирующими CD40L/CD154, GM-CSF, В7.1/CD80 и IL-7.
Фиг.2а и b показывают схемы иммуномодуляторов (dSLIM): гантелеобразную структуру в каждом случае с тремя схематически изображенными CG-мотивами в шпилечных структурах петель; в них I обозначает петлю и II обозначает стебель.
Для обнаружения продуктов генов использовали антитела, с которыми связаны четыре различных флуоресцентных красителя, обозначенных на фиг.1 как CD80-FITC, hGMCSF-PE, IL7-PerCP и CD154-APC.
Клеточный сортер с возбуждением флуоресценции (FACS) узнает эти окрашивания в четырех различных каналах. На абсциссе они обозначены как FL1-H, FL2-H, FL3-H и FL4-H. Экспоненты на абсциссе показывают относительную интенсивность флуоресценции. На ординате даны числа, которые соответствуют приблизительно количеству измеренных клеток. Оценка осуществляется посредством так называемой установки дискриминирующих окон в клеточном сортере, что означает, что считаются только клетки, которые проходят через определенный энергетический порт.
В таблице 1 представлена процентная доля успешно трансфицированных аллогенных клеток рака почки после трехкратной трансфекции экспрессионными конструкциями, кодирующими CD40L/CD154, GM-CSF и IL-7, или четырехкратной трансфекции экспрессирующими конструкциями, кодирующими CD40L/CD154, GM-CSF, В7.1/CD80 и IL-7.
| Таблица 1 | ||
| Кодирующий ген | Трехкратная трансфекция экспрессирующими конструкциями, кодирующими CD40L/CD154, GM-CSF и IL-7 | Четырехкратная трансфекция экспрессирующими конструкциями, кодирующими CD40L/CD154, GM-CSF,В7.1/CD80 и IL-7 |
| Доля трансфицированных клеток (1 измерение) | Доля трансфицированных клеток (2 измерения) | |
| В7.1/CD80 | --- | 66,3-87,6% |
| CD40L/CD154 | 60,8% | 21,6-29,5% |
| IL-7 | 21,7 нг в 1×106 клетках | 14,9-38,2 нг в 1×106 клетках |
| GM-CSF | 698,9 нг в 1×106 клетках | 370,6-1567,2 нг в 1×106 клетках |
Трансфекцию костимуляторных факторов В7.1/CD80 или CD40L/CD154 обнаруживали по окрашиванию клеток флуоресцентно меченными антителами; степень трансфекции цитокинами IL-7 или GM-CSF обнаруживали по концентрации цитокинов в среде культуры клеток.
Вакцину по изобретению, состоящую из аллогенных, трансфицированных ex vivo клеток, вводили пациентам с метастазирующими солидными опухолями с интервалом 7-10 дней в форме 4 циклов инъекций, состоящих в каждом отдельном случае из 2 инъекций. Эти клетки были предварительно трансфицированы вектором экспрессии, кодирующим IL-7, GM-CSF, CD40L/CD154 и/или B7.1/CD80, и сразу же после этого смешаны с иммуностимуляторными последовательностями (ISS). Две первые инъекции выполняли в день 1 в типичные места вакцинации в коже (интрадермально) сбоку на левом и правом плече, в день 7 (до 10) в типичные места вакцинации интрадермально на передней стороне левого и правого бедра, в день 14 (до 20) подкожно на приблизительно 30 мм слева и справа от пупка и в день 21 (до 30) опять в плечи, но подкожно.
Все пациенты находились к началу лечения в поздней фазе заболевания. Для оценки клинического успеха имели силу следующие формулировки в соответствии с Всемирной организацией здравоохранения (1979): частичной реакцией (частичным ответом, PR) называют уменьшение поддающегося учету опухолевого очага на более чем 50%, в последние четыре недели, а также подавление новых опухолевых очагов. Под стабильным ходом заболевания (стабильное заболевание, SD) понимают сохранение прежнего состояния. Смешанная реакция (MR) обозначает смешанную реакцию, например, прогрессирование метастазирования и уменьшение метастазов в другом месте. Полная реакция (CR) обозначает полный регресс опухолевых очагов.
Далее изобретение должно объясняться более подробно при помощи примеров, но без ограничения изобретения этими примерами.
Вакцинация
Пациент мужского пола, имеющий мелкоклеточный рак легкого, получал с интервалом 7 дней четыре следующие одна за другой вакцинации вакциной изобретения. Аллогенную линию клеток рака почки обрабатывали предварительно, как описано выше. Контроль экспрессии выполняли спустя 24 часа после трансфекции. Контроль экспрессии костимуляторных факторов В7.1/CD80 или CD40L/CD154 выполняли окрашиванием клеток флуоресцентно меченными антителами и последующим измерением с использованием проточной цитометрии. Определение экспрессии цитокинов IL-7 и GM-CSF выполняли измерением концентрации в среде культуры клеток с использованием ELISA.
"Успешно трансфицированные" обозначает: живые положительные клетки. Результаты трансфекции представлены в таблице 1. Процентная доля успешно трансфицированных В7.1/CD80 клеток составляла 66,3-87,6%. Доля трансфицированных CD40L/CD154 клеток составляла 21,6-29,5%. Концентрация цитокина IL-7 составляла в 1×106 клетках 14,9-38,2 нг. Концентрация GM-CSF составляла в 1×106 клетках 370,6-1567,2 нг.
В случае трансфекции для трехкратной вакцинации экспрессирующими конструкциями, кодирующими CD40L/CD154, GM-CSF и IL-7, процентная доля успешно трансфицированных CD40L/CD154 клеток составляла 60,8%. Концентрация цитокина IL-7 составляла в 1×106 клетках 21,7 нг. Концентрация GM-CSF составляла в 1×106 клетках 698,9 нг.
Лечение метастазирующих опухолевых заболеваний
Выбор пациентов: были выбраны пациенты с колоректальным раком, мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легкого, раком предстательной железы, раком молочной железы, раком яичника и почечно-клеточным раком, а также злокачественной меланомой, в возрасте 18-70 лет и с индексом Karnofsky 70-100. Критериями исключения были: предыдущее лечение цитокинами или предыдущая химиотерапия, которые проводились за менее чем 28 дней перед этим, показатели креатина более 265 микромоль/л, показатели билирубина более 51 микромоль/л, некомпенсированная сердечная недостаточность, вентрикулярные аритмии, тяжелые психиатрические заболевания, активный гепатит А, В или С, ВИЧ-инфекция.
Лечение: наряду с анамнезом, определяли следующие параметры перед началом лечения: физическое обследование, гематологию (гемоглобин, гематокрит, лейкоциты и тромбоциты), химические показатели крови и анализ мочи. Брали кровь для определения иммунного статуса. Кожные тесты DHT (аллергии задержанного типа) проводили с использованием мультитеста Merieux (Leimen, Germany). Получали рентгеновские снимки верхней части туловища, а также компьютерные томографии верхней части туловища и живота. Пациенты получали четыре подкожные инъекции по меньшей мере 8×106-1,4×107 клеток с использованием предварительно обработанных ex vivo опухолевых клеток. Всеобъемлющие иммунологические исследования, гематологические исследования и черновые клинические исследования (физическое обследование, ультразвуковое исследование и исследование подчревной области, при необходимости) повторяли в дни 14, 28 и 56. Полное клиническое и иммунологическое исследование, сравнимое с проведенным в начале исследованием при отборе, имело место в день 84.
| Таблица 2 | ||
| Характеристика пациентов | ||
| Пациенты | 54 | |
| Пол | Мужской | 29 |
| Женский | 25 | |
| Диагноз | рак толстой кишки | 24 |
| рак молочной железы | 9 | |
| почечно-клеточный рак | 18 | |
| немелкоклеточный рак легкого | 3 | |
| Введенное количество клеток | средняя величина | 8×106-1,4×107 |
| Таблица 3 Результаты лечения |
|||
| Диагноз | Число пациентов | CR/PR/MR/SD vs PD | Результат |
| Рак толстой кишки | 24 | 6/2/2/5 vs.2 | 15/25 |
| Рак молочной железы | 9 | 3/1/1/2 vs.2 | 7/9 |
| Немелкоклеточный | 3 | 1/-/1/1 vs. - | 3/3 |
| Рак легкого | |||
| Почечно-клеточный рак | 18 | 7/1/1/5 vs.4 | 14/18 |
| CR полное обращение (полное реагирование, CR) | |||
| PR частичная реакция (частичное реагирование, PR) | |||
| MR смешанная реакция (смешанное реагирование, MR) | |||
| SD стабильное течение (стабильное заболевание, SD) | |||
| PD прогрессирующее течение (прогрессирующее заболевание, PD) | |||
Коэффициенты реакции опухолей подразделяли на категории с использованием системы RECIST (Критерии Оценки Реагирования в Солидных Опухолях). Возможными результатами являются полная реакция (полная реакция, CR, полное обращение всех опухолей), частичное реагирование (частичное реагирование, CR) и смешанное реагирование, MR, обращение поддающихся учету опухолевых очагов на более чем 50% в последних четырех неделях, а также подавление новых опухолевых очагов), стабильное заболевание (стабильное заболевание, SD, между 30%-ным уменьшением и 20%-ным увеличением суммы измерений повреждений) и прогрессирующее заболевание (прогрессирующее заболевание, PD, повышение суммы величин повреждений на более чем 20%, или появление новых повреждений).
Все 54 пациента находились к началу лечения в далеко зашедшей фазе заболевания. 24 пациента имели рак толстой кишки, девять пациентов имели рак молочной железы, 18 пациентов имели почечно-клеточный рак и три пациента имели немелкоклеточный рак легкого (в отношении характеристики пациентов см. Таблицу 2).
Все пациенты хорошо переносили лечение, и не было никаких нежелательных побочных действий.
В целом из 54 пациентов 39 пациентов обнаружили клинически значимую реакцию (72%). В группе пациентов, которые имели немелкоклеточный рак легкого, коэффициент реакции на объект изобретения составлял даже 100%. Это означает, что у одного пациента было зарегистрировано стабильное течение (SD) после лечения, один пациент обнаруживал смешанную реакцию (смешанное реагирование, MR) и у одного пациента наблюдали полное обращение (полное реагирование, CR) опухолевых очагов. Ни у одного из этих трех пациентов не было прогрессирования заболевания после лечения (прогрессирующего заболевания, PD).
В группе пациентов с диагнозом почечно-клеточного рака также имелись впечатляющие успехи. При этом заболевания почечно-клеточного рака среди неоплазий относятся к группе неоплазий с очень плохими перспективами излечения. В целом из 18 лечившихся пациентов 14 продемонстрировали клинически значимые реакции. Это составляет 78% пациентов. При этом у 7 пациентов дело дошло до полного обращения заболевания (полное реагирование, CR), а у пяти пациентов до стабильного течения заболевания (стабильное заболевание, 3D). Таким образом, у этих пяти пациентов удалось задержать прогрессирование заболевания. Один пациент обнаружил после лечения частичную реакцию (частичное реагирование, PR) и один пациент - смешанную реакцию (смешанное реагирование, MR). Четыре пациента не обнаружили никакой реакции на лечение и пришлось поставить диагноз прогрессирующего течения (прогрессирующее заболевание, PD).
Подобным образом достойные внимания результаты проявились при раке молочной железы. Здесь 7 из общего числа 9 пациентов обнаружили клинически значимую реакцию. У трех пациентов дело дошло до полного обращения опухолевых очагов (полное реагирование, CR). Два пациента обнаружили стабильное течение заболевания, один пациент показал частичную реакцию (частичное реагирование, PR) и один пациент смешанную реакцию (смешанное реагирование, MR). Два пациента не обнаруживали никакой реакции на это лечение и пришлось констатировать прогрессирующее течение (прогрессирующее заболевание, PD).
Раковые заболевания толстой кишки представляют 2-е наиболее частое раковое заболевание женщин, а также 3-е самое частое раковое заболевание мужчин. 63% пациентов показали реагирование на лечение при помощи предмета данного изобретения. У шести пациентов удалось диагностировать полное обращение (обратное развитие) опухолей (полное реагирование, CR), у пяти стабильное течение заболевания (стабильное заболевание, SD), у двух пациентов частичную реакцию (частичное реагирование, PR) и также у двух пациентов смешанную реакцию (смешанное реагирование, MR). У девяти из 24 пациентов это лечение не вызывало реакции (прогрессирующее заболевание, PD).
В целом, пятнадцать из всех пациентов (27%) после этого лечения показали прогрессирование заболевания (прогрессирующее заболевание).
Эти результаты показывают, что лечение опухолевых заболеваний в далеко зашедшей стадии предметом этого изобретения приводит к измеримым клиническим результатам.
В свете ожидаемых обстоятельств при лежащем в основе заболевании эти результаты демонстрируют впечатляющую эффективность этого лечения. Вакцинация могла бы быть многообещающей именно у пациентов в начальной стадии опухолевого заболевания.
Минимизированные иммунологически определенные конструкции для экспрессии генов (MIDGE)
Ковалентно замкнутые минимизированные экспрессирующие ДНК-векторы использовали для трансфекции опухолевых клеток. Эти экспрессирующие векторы служили для экспрессии интерлейкина-7 (IL-7) человека, гранулоцитарного-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (GM-CSF), костимуляторных факторов B7.1/CD80 и CD40L/CD154. MIDGE-векторы синтезировали в соответствии с предписанием SOP и в лаборатории, соответствующей классу В с последующим контролем качества.
Кодирующие последовательности для IL-7 (NCBI Acc. Nr.: J04156), GM-CSF (NCBI Acc. Nr.: M11220), B7.1/CD80 (NCBI Acc. Nr.: AF177937) и CD40L/CD154 (NCBI Acc. Nr.: S49008), взятые из банка данных (www.ncbi.nlm.nih.qov) Национального Центра Информации Биотехнологии) вставляли в плазмиду рМОК, и они служили в качестве исходных конструкций для получения MIDGE-векторов. Плазмида рМОК имеет, наряду с сильным "немедленно ранним промотором" из вируса CMV, интрон и последовательность полиаденилирования из вируса SV40 (MOLOGEN, Berlin). Плазмиду рМОК, кодирующую IL-7, полностью расщепляли в течение ночи рестрикционным ферментом (рестриктазой) Есо311. Посредством рестрикционного расщепления получали два фрагмента ДНК. Один из них состоял из гена устойчивости к канамицину, а также других необходимых для размножения этой плазмиды в бактериях последовательностей. Другой фрагмент состоял из последовательностей, которые должны были стать компонентами MIDGE-ДНК: усиленного промотора CMV, химерного интрона, последовательности гена для IL-7 и последовательности полиаденилирования из SV40. С использованием фермента Т4-ДНК-лигазы 5'-фосфорилированные подобные шпилькам олигодезоксирибонуклеотиды (TIB-MolBiol, Berlin, ODN 1=SEQ ID NO: 5 из WO 03/031469 A2 (Mologen et al.) без модифицированного основания X) и ODN 2=SEQ ID NO: 6 из WO 03/031469 A2 (Mologen et al.)) в присутствии рестриктазы Есо311 лигировали в течение ночи при 37°С с MIDGE-ДНК-образующим ДНК-фрагментом. В этом отношении делается ссылка на изображение и последовательности олигонуклеотидов (ODN), показанные в WO 03/031469 A2 (Mologen et al.). Реакцию останавливали нагреванием до 70°С. Полученную смесь нуклеиновых кислот обрабатывали ферментом Т7-ДНК-полимеразой. MIDGE-ДНК очищали анионообменной хроматографией и осаждали изопропанолом (см. ЕР 0941318 B1).
Получение векторов, кодирующих GM-CSF, B7.1/CD80 и CD40L/CD154, происходило аналогичным образом.
Получение NLS-связанного MIDGE
Для получения NLS-MIDGE делается ссылка на изображение и последовательности олигонуклеотидов (ODN), показанные в WO 03/031469 А2 (Mologen et al.). NLS-пептид (SEQ ID NO: 4 из WO 03/031469 А2 (Mologen et al.)) сначала связывают с ODN. Для этого используют обеспеченный в петле шпильки ODN 1 с модифицированным в отношении аминокислоты дезокси-урацилом (XT), а также немодифицированный ODN 2 из WO 03/031469 А2 (Mologen et al.).
Сначала этот аминомодифицированный олигонуклеотид ODN 1 (0,1 мМ) активируют сульфо-KMUS (5 мМ) в ЗФР при комнатной температуре. Спустя 120 минут реакцию останавливают 50 мМ Трис-(гидроксиметил)аминометаном и активированный ODN 1 получают после осаждения этанолом (300 мМ NaOAc pH 5,2, 5,5 мМ MgCl2, 70% этанол), центрифугирования и одного промывания 70% этанолом. Полученный таким образом ODN 1 (0,1 мМ) растворяют в ЗФР и подвергают взаимодействию с NLS-пептидом (0,2 мМ) в течение одного часа при комнатной температуре. Реакционную смесь исследуют электрофорезом на геле (3%) и окрашиванием бромидом этидия. Образовавшийся NLS-связанный ODN 1 очищают при помощи ВЭЖХ и используют с ODN 2 для синтеза MIDGE-NLS-конструкций, как описано ранее.
Двухцепочечные иммуномодуляторные олигодезоксинуклеотиды (dSLIM)
Двухцепочечные иммуномодуляторные олигодезоксинуклеотиды являются молекулами с CG-последовательностями. Для этого линейные олигодезоксинуклеотиды (ODN) ковалентно замыкают при помощи нуклеотидной петли, так что они защищены от деградации экзонуклеазами. При этом образуются гантелеобразные молекулы, которые называют dSLIM, "иммуномодулятором с двойной структурой стебель-петля" (см. фиг.2). Иммуномодулирующее действие основано на неспецифическом активировании иммунной системы неметилированными CG-последовательностями, которые связываются с toll-подобными рецепторами (toll=ген Drosophyla (и соответствующий белок-рецептор), прим. переводчика)). Каждая петля dSLIM содержит три неметилированных CG-мотива.
Двухцепочечные иммуномодуляторы dSLIM типа ISS30 получали согласно (SOP) с последующим контролем качества в лаборатории класса В. Для этого одноцепочечные шпилькообразные, 5'-фосфорилированные олигодезоксирибонуклеотиды (ODN) лигируют Т4-ДНК-лигазой. После расщепления остаточных продуктов Т7-полимеразой и хроматографической очистки ODN концентрировали осаждением этанолом и ацетатом натрия-магния и растворяли в ЗФР. Точный способ представлен в WO 01/070055. Фиг.2b показывает такой dSLIM.
Характеристика аллогенной линии опухолевых клеток
Используемая клеточная линия происходит из первичного печеночно-клеточного рака пациентки. Из этих первичных клеток была установлена клеточная линия, которая была депонирована в DSMZ (Немецкой Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур GmbH) в виде жизнеспособной культуры под номером DSM ACC2635. В соответствии со способом-скринингом из установленных первичных культур пациентки с опухолью определяли такие клетки, которые служили в качестве исходного материала для получения банка исходных клеток. Эта клеточная популяция должна отличаться стабильной экспрессией ТАА, постоянной и хорошей скоростью деления, а также по возможности однородным поведением роста. Должно также гарантироваться отсутствие вирусного и бактериального загрязнения.
Клеточную линию почечно-клеточного рака испытывали в имеющей сертификат лаборатории, и она была отрицательной в отношении вируса ВИЧ, вирусов гепатита В и С. Ее характеризовали также в отношении HLA-типа, экспрессии ТАА и высвобождения цитокинов. Для этой цели использовали различные способы, такие как ELISA для определения цитокинов, например: TNF-альфа, IL-6, GM-CSF и IL-7. Кроме того, были разработаны внутриклеточные FACS-анализы и анализы ОТ-ПЦР реального времени.
После трансфекции клетки испытывали на экспрессию поверхностных антигенов, молекул трансдукции сигналов и репортерных генов. Эта клеточная линия отличалась следующими иммунологическими показателями специфических маркеров клеточной поверхности:
| ЕрСАМ: | положительная |
| Her-2/neu: | отрицательная |
| Цитокератин 7+8: | положительная |
| HLA-A1: | положительная |
| HLA-A2: | положительная |
| Фибробласты: | отрицательная |
Определение опухолеспецифических антигенов:
| PRAME: | положительная | SCP-1: | положительная |
| MAGE-4: | отрицательная | Фертилин-бета: | отрицательная |
| MAGE-3: | отрицательная | RAGE-1: | положительная |
| MAGE-1: | отрицательная | G250: | положительная |
Электропорация
Для переноса генов ex vivo в клеточное ядро опухолевых клеток и контрольных клеток предпочтительно использовали способ электропорации. Опухолевые клетки отделяют раствором трипсин/ЭДТА от культурального сосуда и доводят до плотности 1-1,5×107 клеток на 600 мкл среды (без ФТС) или ЗФР. Эти 600 мкл суспензии клеток смешивают в каждом случае с 5-10 мкг экспрессирующего вектора, переносят в охлажденные кюветы для электропорации (Eurogentec) и электропорируют при напряжении 300 В и емкости 1050 микрофарад в приборе для электропорации Easyject (EquiBio).
После этого клетки переносят в свежую среду (5-20 мл) и инкубируют в термостате для клеточных культур (5% СО2, 37°С, насыщенная влажность) в течение 24 часов. Затем следует измерение поверхностных молекул (CD40L/CD154 и B7.1/CD80) и цитокинов (GM-CSF и IL-7) с использованием проточной цитометрии с четырьмя красителями. Проводят также контроль количества клеток и жизнеспособности.
Сразу же после переноса генов опухолевые клетки покрывают 10 мл предварительно подогретой среды для суспензии клеток и переносят осторожным пипетированием в центрифужные пробирки на 15 мл. После осаждения клеток при 300×g и 4°С в течение 5 минут их суспендируют в среде. Опять сохраняют аликвоты для тестов на стерильность, тестов на восстановление клеток и жизнеспособность клеток, для FACS-анализов и для определения экспрессии цитокинов. Эффективность трансфекции определяли, как описано (Foa et al., 1994, Nat. Immun. 13: 65-75)).
Эту суспензию трансфицированных клеток опять сушили, помещали в 1,5 мл среды для замораживания (80% ФТС, 10% ДМСО, 10% суспензионная среда) и в виде порций клеток 8×106-1,4×107 сохраняли в заделанных пробирках для замораживания на 2 мл. Эти пробирки хранили при -80°С (1°С/мин) в жидком азоте.
Дополнение вакцины по изобретению
После осторожного оттаивания пробирок для замораживания количество клеток еще раз определяли и сохраняли аликвоту для тестов на стерильность. После осторожного многократного промывания клеток полученный осадок клеток ресуспендировали в забуференной фосфатом среде Дульбекко (DPBS (ДЗФР), Camprex Kat. Nr.: 17-512F)). На каждую исходную смесь к суспензии добавляли 500 ммкрограммов адъюванта dSLIM. Эту дополненную вакцину переносили в стерильный, не содержащий эндотоксинов реакционный сосуд. По 750 микролитров этой исходной смеси оттягивали при помощи канюли в шприцы.
Перед применением производили пятикратное облучение шприцов гамма-излучением, что соответствовало общей дозе 150 гамма-квантов.
Получение лимфоцитов
Периферические моноциты крови (РВМС) получали из гепаринизированной периферической крови с использованием Lymphoprep (GIBCO, Karlsruhe) при помощи центрифугирования в градиенте плотности. Эти клетки промывали дважды ЗФР и лиофилизировали в жидком азоте в присутствии более чем 20% ФТС для ELISPOT и анализов на цитотоксичность.
Статистический анализ
Использовали подходящий парный и непарный критерий Уилкоксона для анализа статистической значимости. Показатель р<0,05 рассматривается как значимый.
Claims (26)
1. Опухолевая клетка человека для применения в качестве вакцины для лечения опухолевых заболеваний, которая была ех vivo трансфицирована молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими интерлейкин-7 (IL-7), гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), CD40L/CD154 и В7.1/CD80 и обнаруживает после трансфекции соответствующие экспрессионные конструкции.
2. Опухолевая клетка человека для применения в качестве вакцины для лечения опухолевых заболеваний, которая была ех vivo трансфицирована молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими интерлейкин-7 (IL-7), гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), CD40L/CD154, и обнаруживает после трансфекции соответствующие экспрессионные конструкции.
3. Опухолевая клетка человека по п.1 или 2, где этой экспрессионной конструкцией является
а) плазмида или
b) линейная двухцепочечная ковалентно связанная экспрессионная кассета, которая состоит только из одного промотора CMV, одного интрона, кодирующей последовательности гена и одной последовательности полиаденилирования, которая на обоих концах этой двойной цепи ковалентно замкнута посредством короткой петли одноцепочечных нуклеозидных остатков.
а) плазмида или
b) линейная двухцепочечная ковалентно связанная экспрессионная кассета, которая состоит только из одного промотора CMV, одного интрона, кодирующей последовательности гена и одной последовательности полиаденилирования, которая на обоих концах этой двойной цепи ковалентно замкнута посредством короткой петли одноцепочечных нуклеозидных остатков.
4. Опухолевая клетка человека по п.1 или 2, представляющая собой аллогенную опухолевую клетку клеточной линии почечно-клеточного рака.
5. Опухолевая клетка человека по п.4, представляющая собой опухолевую клетку клеточной линии почечно-клеточного рака, которая депонирована под номером DSM АСС 2635 при DSMZ.
6. Вакцина для лечения пациентов с опухолевыми заболеваниями, содержащая в фармацевтически переносимом носителе и в эффективном количестве опухолевые клетки генетически не идентичного (гетерологичного) донора того же самого вида (аллогенные), причем эти опухолевые клетки представляют собой клетки по п.1.
7. Вакцина для лечения пациентов с опухолевыми заболеваниями, содержащая в фармацевтически переносимом носителе и в эффективном количестве опухолевые клетки генетически не идентичного (гетерологичного) донора того же самого вида (аллогенные), причем эти опухолевые клетки представляют собой клетки по п.2.
8. Вакцина по п.6, где кодирующие молекулы нуклеиновых кислот находятся в одной или нескольких экспрессионных конструкциях.
9. Вакцина по п.7, где кодирующие молекулы нуклеиновых кислот находятся в одной или нескольких экспрессионных конструкциях.
10. Вакцина по п.8, где этой экспрессионной конструкцией является
а) плазмида или
b) линейная двухцепочечная ковалентно связанная экспрессионная кассета, которая состоит только из одного промотора CMV, одного интрона, кодирующей последовательности гена и одной последовательности полиаденилирования, которая на обоих концах этой двойной цепи ковалентно замкнута посредством короткой петли одноцепочечных нуклеозидных остатков.
а) плазмида или
b) линейная двухцепочечная ковалентно связанная экспрессионная кассета, которая состоит только из одного промотора CMV, одного интрона, кодирующей последовательности гена и одной последовательности полиаденилирования, которая на обоих концах этой двойной цепи ковалентно замкнута посредством короткой петли одноцепочечных нуклеозидных остатков.
11. Вакцина по п.9, где этой экспрессионной конструкцией является
а) плазмида или
b) линейная двухцепочечная ковалентно связанная экспрессионная кассета, которая состоит только из одного промотора CMV, одного интрона, кодирующей последовательности гена и одной последовательности полиаденилирования, которая на обоих концах этой двойной цепи ковалентно замкнута посредством короткой петли одноцепочечных нуклеозидных остатков.
а) плазмида или
b) линейная двухцепочечная ковалентно связанная экспрессионная кассета, которая состоит только из одного промотора CMV, одного интрона, кодирующей последовательности гена и одной последовательности полиаденилирования, которая на обоих концах этой двойной цепи ковалентно замкнута посредством короткой петли одноцепочечных нуклеозидных остатков.
12. Вакцина по одному или нескольким из пп.6-11, причем эта вакцина включает в себя дополнительно иммуномодулирующие олигодезоксирибонуклеотиды в качестве адъюванта.
13. Вакцина по п.12, где этот иммуномодулирующий олигодезоксирибонуклеотид
а) включает в себя последовательность с очередностью оснований N1N2CGN3N4, причем N1N2 является элементом, выбранным из группы, состоящей из GT, GG, GA, АТ или АА, N3N4 является элементом, выбранным из группы, состоящей из СТ или ТТ, а также С обозначает дезоксицитозин, G обозначает дезоксигуанин, А обозначает дезоксиаденозин и Т обозначает дезокситимидин,
b) и последовательность с очередностью оснований N1N2CGN3N4 расположена в одноцепочечной области олигодезоксирибонуклеотида, который находится на концах двойной цепи ДНК гантелевидного олигодезоксирибонуклеотида.
а) включает в себя последовательность с очередностью оснований N1N2CGN3N4, причем N1N2 является элементом, выбранным из группы, состоящей из GT, GG, GA, АТ или АА, N3N4 является элементом, выбранным из группы, состоящей из СТ или ТТ, а также С обозначает дезоксицитозин, G обозначает дезоксигуанин, А обозначает дезоксиаденозин и Т обозначает дезокситимидин,
b) и последовательность с очередностью оснований N1N2CGN3N4 расположена в одноцепочечной области олигодезоксирибонуклеотида, который находится на концах двойной цепи ДНК гантелевидного олигодезоксирибонуклеотида.
14. Вакцина по п.13, где последовательность с очередностью оснований N1N2CGN3N4 расположена в одноцепочечной области этого олигодезоксирибонуклеотида и включает в себя 40-200 нуклеотидов.
15. Вакцина по п.6 или 7, где аллогенные опухолевые клетки выбраны из колоректального рака, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака яичника и почечно-клеточного рака, а также злокачественной меланомы.
16. Вакцина по п.6 или 7, где опухолевые клетки происходят из клеточной линии рака почки, которая депонирована под номером DSM АСС 2635 при DSMZ.
17. Способ получения вакцины по п.6 для лечения пациентов с опухолевыми заболеваниями, в котором опухолевые клетки генетически неидентичного (гетерологичного) донора того же самого вида (аллогенного) трансфицируют ех vivo молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими интерлейкин-7 (IL-7), гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), CD40L/CD154 и В7.1/CD80, и затем переводят в фармацевтическую композицию.
18. Способ получения вакцины по п.7 для лечения пациентов с опухолевыми заболеваниями, в котором опухолевые клетки генетически неидентичного (гетерологичного) донора того же самого вида (аллогенного) трансфицируют ех vivo молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими интерлейкин-7(IL-7), гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и CD40L/CD154, и затем переводят в фармацевтическую композицию.
19. Способ по п.17 или 18, в котором дополнительно используют иммуномодулирующие олигодезоксирибонуклеотиды в качестве адъюванта.
20. Способ по п.19, в котором иммуномодулирующий олигодезоксирибонуклеотид включает в себя последовательность с очередностью оснований N1N2CGN3N4, причем N1N2 является элементом, выбранным из группы, состоящей из GT, GG, GA, АТ или АА, N3N4 является элементом, выбранным из группы, состоящей из СТ или ТТ, а также С обозначает дезоксицитозин, G обозначает дезоксигуанин, А обозначает дезоксиаденозин и Т обозначает дезокситимидин.
21. Способ по п.20, в котором последовательность с очередностью оснований N1N2CGN3N4 расположена в одноцепочечной области этого олигодезоксирибонуклеотида и включает в себя 40-200 нуклеотидов.
22. Способ по п.17 или 18, в котором молекула нуклеиновой кислоты находится в одной или нескольких экспрессионных конструкциях.
23. Способ по п.17 или 18, отличающийся тем, что трансфекция происходит с использованием баллистического переноса, трансфекции с использованием поликатионов, трансфекции с использованием осаждения фосфатом кальция, микроинъекции, слияния протопластов, слияния липосом, вирусных систем трансфекции, липофекции и/или электропорации.
24. Способ по п.17 или 18, в котором аллогенные опухолевые клетки выбраны из колоректального рака, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака яичника и почечно-клеточного рака, а также злокачественной меланомы.
25. Способ по п.19, в котором опухолевые клетки происходят из нескольких пациентов с одной и той же картиной заболевания.
26. Способ по п.17 или 18, в котором используют опухолевые клетки клеточной линии рака почки, которая депонирована под номером DSM АСС 2635 при DSMZ.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DEPCT/DE03/04299 | 2003-12-30 | ||
| DE0304299 | 2003-12-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006127428A RU2006127428A (ru) | 2008-02-10 |
| RU2354694C2 true RU2354694C2 (ru) | 2009-05-10 |
Family
ID=34716109
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006127428/13A RU2354694C2 (ru) | 2003-12-30 | 2004-04-20 | Аллогенное противоопухолевое терапевтическое средство |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7635468B2 (ru) |
| EP (1) | EP1699480B1 (ru) |
| JP (1) | JP4945247B2 (ru) |
| CN (3) | CN102994515A (ru) |
| AT (1) | ATE512668T1 (ru) |
| BR (1) | BRPI0418157A (ru) |
| DK (1) | DK1699480T3 (ru) |
| ES (1) | ES2366694T3 (ru) |
| PL (1) | PL1699480T3 (ru) |
| PT (1) | PT1699480E (ru) |
| RU (1) | RU2354694C2 (ru) |
| WO (1) | WO2005063280A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2739073C2 (ru) * | 2014-04-07 | 2020-12-21 | Локон Фарма Аб | Новые медицинские агенты и их применение |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE512668T1 (de) * | 2003-12-30 | 2011-07-15 | Mologen Ag | Allogenes tumortherapeutikum |
| WO2006015560A1 (de) * | 2004-08-09 | 2006-02-16 | Mologen Ag | Immunmodulierendes mittel in verbindung mit chemotherapeutischen massnahmen |
| AU2006289514A1 (en) * | 2005-09-08 | 2007-03-15 | Mologen Ag | Functional in vitro immunoassay |
| MX2008014380A (es) * | 2006-05-11 | 2009-03-02 | Mologen Ag | Multimero para inmunoestimulacion. |
| CN101199862B (zh) * | 2007-12-19 | 2011-07-06 | 北京大学第三医院 | B7-1、cd40l质粒混合物 |
| GB2483462A (en) * | 2010-09-08 | 2012-03-14 | Mologen Ag | Use of a dumbbell-shaped DNA construct for the treatment of cancer through jet-injection administration |
| GB2523187A (en) | 2014-02-18 | 2015-08-19 | Mologen Ag | Covalently closed non-coding immunomodulatory DNA construct |
| ES2856844T3 (es) | 2014-12-31 | 2021-09-28 | Checkmate Pharmaceuticals Inc | Inmunoterapia antitumoral combinada |
| LU92821B1 (en) | 2015-09-09 | 2017-03-20 | Mologen Ag | Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides |
| GB2542425A (en) | 2015-09-21 | 2017-03-22 | Mologen Ag | Means for the treatment of HIV |
| WO2017173334A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Checkmate Pharmaceuticals, Inc. | Fc receptor-mediated drug delivery |
| US10731128B2 (en) | 2016-11-22 | 2020-08-04 | Alloplex Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for in vitro activation and expansion of serial killer T cell populations and passive immunization of a cancer patient with tumor cell killing cells |
| US11185586B2 (en) | 2016-11-22 | 2021-11-30 | Alloplex Biotherapeutics, Inc. | Allogeneic tumor cell vaccine |
| AU2017363256B2 (en) | 2016-11-22 | 2024-04-18 | Alloplex Biotherapeutics | Allogeneic tumor cell vaccine |
| EP3735264A1 (en) * | 2018-01-05 | 2020-11-11 | Rolf Jonas Andreas Nilsson | Endogenous tumor-derived circular rna and proteins thereof for use as vaccine |
| WO2020167240A1 (en) * | 2019-02-15 | 2020-08-20 | Rjan Holdng Ab | Autologous cancer tumour associated extrachromosomal circular dna for use as a therapeutic vaccine |
| US20210205428A1 (en) | 2019-12-03 | 2021-07-08 | Neuvogen, Inc. | Tumor cell vaccines |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5681562A (en) * | 1991-06-25 | 1997-10-28 | Sidney Kimmel Cancer Center | Lymphokine gene therapy of cancer |
| ATE322286T1 (de) * | 1991-10-04 | 2006-04-15 | Whitehead Biomedical Inst | Regulierung der systemischen immunantworten mittels zytokinen und antigenen |
| DE4416784A1 (de) | 1994-05-09 | 1995-11-30 | Soft Gene Gmbh | Methode zur Anreicherung von Zellen, die durch ballistischen Transfer modifiziert wurden |
| DE4431401A1 (de) * | 1994-08-24 | 1996-02-29 | Max Delbrueck Centrum | Lebendvakzine gegen Tumorerkrankungen |
| DE19648625A1 (de) | 1996-11-13 | 1998-05-14 | Soft Gene Gmbh | Mikroprojektil für das Einbringen von Substanzen in Zellen durch ballistischen Transfer |
| DE19746173A1 (de) * | 1997-10-18 | 1999-04-22 | Boehringer Ingelheim Int | Tumorvakzine |
| CN1100879C (zh) | 1998-02-23 | 2003-02-05 | 上海东方肝胆外科医院 | 多基因转染的细胞株及其构建方法 |
| DE19832840C1 (de) | 1998-07-21 | 2000-06-08 | Kerkmann Tucek Aida | Mittel zur Immuntherapie von Tumorerkrankungen |
| DE19935756A1 (de) | 1999-07-27 | 2001-02-08 | Mologen Forschungs Entwicklung | Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation |
| DE10290185D2 (de) * | 2001-01-31 | 2004-04-15 | Mologen Forschungs Entwicklung | Tumorvakzine |
| AU2002320079A1 (en) | 2001-06-11 | 2002-12-23 | Jeong-Im Sin | Vaccines, immunotherapeutics and methods of using the same |
| EP1432439B1 (de) | 2001-10-02 | 2005-12-07 | Mologen AG | Mittel zur verbesserung der immunantwort |
| US20050085433A1 (en) * | 2001-11-09 | 2005-04-21 | Claudia Breidenstein | Cellular vaccines comprising adjuvants |
| WO2003045428A2 (de) * | 2001-11-30 | 2003-06-05 | Medigene Aktiengesellschaft | Verwendung einer technisch veränderten zelle als vakzine zur behandlung einer tumorerkrankung |
| DE50306394D1 (de) | 2002-07-19 | 2007-03-15 | Mologen Ag | Dna-expressionskonstrukt zur multiplen genexpression |
| DE10234739A1 (de) | 2002-07-30 | 2004-02-12 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Splicing-Variante des humanen p53-Proteins und deren Verwendung zur Herstellung pharmazeutischer Präparate zur Behandlung von Tumorerkrankungen |
| ATE512668T1 (de) * | 2003-12-30 | 2011-07-15 | Mologen Ag | Allogenes tumortherapeutikum |
| US20060165668A1 (en) | 2004-12-10 | 2006-07-27 | Liu Linda N | Genetically modified tumor cells as cancer vaccines |
-
2004
- 2004-04-20 AT AT04728317T patent/ATE512668T1/de active
- 2004-04-20 ES ES04728317T patent/ES2366694T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-20 PT PT04728317T patent/PT1699480E/pt unknown
- 2004-04-20 BR BRPI0418157-3A patent/BRPI0418157A/pt active Search and Examination
- 2004-04-20 CN CN2012103165007A patent/CN102994515A/zh active Pending
- 2004-04-20 DK DK04728317.1T patent/DK1699480T3/da active
- 2004-04-20 JP JP2006545896A patent/JP4945247B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-20 WO PCT/DE2004/000859 patent/WO2005063280A1/de active Application Filing
- 2004-04-20 EP EP04728317A patent/EP1699480B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-20 RU RU2006127428/13A patent/RU2354694C2/ru active
- 2004-04-20 CN CN2012103159773A patent/CN103173460A/zh active Pending
- 2004-04-20 PL PL04728317T patent/PL1699480T3/pl unknown
- 2004-04-20 CN CNA2004800396643A patent/CN1921882A/zh active Pending
-
2006
- 2006-06-30 US US11/482,233 patent/US7635468B2/en active Active
-
2009
- 2009-11-09 US US12/614,985 patent/US9345754B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2739073C2 (ru) * | 2014-04-07 | 2020-12-21 | Локон Фарма Аб | Новые медицинские агенты и их применение |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2366694T3 (es) | 2011-10-24 |
| BRPI0418157A (pt) | 2007-04-17 |
| EP1699480A1 (de) | 2006-09-13 |
| US20070160587A1 (en) | 2007-07-12 |
| JP2007516985A (ja) | 2007-06-28 |
| CN1921882A (zh) | 2007-02-28 |
| DK1699480T3 (da) | 2011-10-10 |
| ATE512668T1 (de) | 2011-07-15 |
| US7635468B2 (en) | 2009-12-22 |
| PT1699480E (pt) | 2011-08-30 |
| WO2005063280A1 (de) | 2005-07-14 |
| EP1699480B1 (de) | 2011-06-15 |
| PL1699480T3 (pl) | 2011-11-30 |
| US20100297189A1 (en) | 2010-11-25 |
| RU2006127428A (ru) | 2008-02-10 |
| CN102994515A (zh) | 2013-03-27 |
| US9345754B2 (en) | 2016-05-24 |
| CN103173460A (zh) | 2013-06-26 |
| JP4945247B2 (ja) | 2012-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7635468B2 (en) | Allogeneic tumor therapeutic agent, a vaccine using allogeneic tumor cells for the therapeutic treatment of tumor diseases, and a method for the making of such a vaccine, and transfected human tumor cells for use as a vaccine | |
| JP7509504B2 (ja) | 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム | |
| CN102597222B (zh) | 用于增殖抗原特异性t细胞的方法 | |
| CN102258772B (zh) | 一种新的肿瘤树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其用途 | |
| CN109554353B (zh) | 分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途 | |
| EA016168B1 (ru) | Способ получения т-клеточной популяции и ее применение | |
| US6228640B1 (en) | Programmable antigen presenting cell of CD34 lineage | |
| EP1417300B1 (en) | Process for the maturation of dentritic cells and a vaccine | |
| US20140072596A1 (en) | Ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases | |
| US6977073B1 (en) | Method for stimulating an immune response | |
| CN116769723B (zh) | 一种gd2嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用 | |
| CN1446583A (zh) | 一种肿瘤免疫治疗及预防性疫苗的组成、制备、应用方案 | |
| Ramanathapuram et al. | α-Tocopheryl succinate sensitizes established tumors to vaccination with nonmatured dendritic cells | |
| CN116004538A (zh) | 一种搭载细胞内生成dsRNA的纳米囊泡、制备与应用 | |
| JP2012176994A (ja) | ＴＧＦβ阻害剤を発現する遺伝的に改変された細胞であって、肺癌細胞である細胞 | |
| Wang et al. | Effect of dendritic cell vaccine against a tongue squamous cell cancer cell line (Tca8113) in vivo and in vitro | |
| CN109790224A (zh) | Cacna1h衍生的肿瘤抗原多肽及其应用 | |
| CN110139875B (zh) | Col14a1衍生的肿瘤抗原多肽及其应用 | |
| MXPA06007495A (en) | Allogeneic tumor therapeutic agent | |
| WO2024102777A2 (en) | Compositions and method for expansion of embryonic stem cells | |
| CN116983406A (zh) | 人参皂苷脂质体用作肿瘤抗原的佐剂 | |
| CN117904054A (zh) | 新冠病毒SARS-CoV-2特异性T细胞及其应用 | |
| CN116966281A (zh) | 工程化t细胞荷载溶瘤病毒的方法和用途 | |
| CN115029789A (zh) | DC-SIGN的shRNA库的构建及其在原发性肝癌中的应用 | |
| JPWO2005083062A1 (ja) | 細胞ワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20210728 |