Das Tumorsuppressorgen p53 kodiert
einen Transkriptionsfaktor, der aktiviert wird, wenn Zellen genotoxischem
Streß,
wie z.B. γ- oder UV-Bestrahlung, Hypoxie, oder zytotoxischen
Substanzen ausgesetzt werden. In Abwesenheit solcher Stressoren
ist das p53-Protein in normalen Zellen in sehr geringer Konzentration vorhanden
und besitzt eine sehr kurze Halbwertzeit. Ein hoher Umsatz des Proteins
wird durch proteosomale Degradation im Zytoplasma aufrecht erhalten
(R Honda, H Yasuda, Oncogene, 19, 1473-1476, 2000). Unter Einwirkung
von Stressoren wird das p53-Protein schnell stabilisiert und akkumuliert
im Zellkern, wo es durch Transaktivierung oder Repression von bestimmten
Genen, den p53-Zielgenen, Kontrolle über den Zellzyklus ausübt (G Fulci,
N Ishii, VanMeir EG, Brain Pathol, 8, 599-613, 1998). Der Arrest
des Zellzykluses oder der Apoptose sind zwei wichtige mögliche funktionelle
Folgen einer Aktivierung des p53-vermittelten Signalweges.
Der Zellzyklusarrest und damit ein
verlängertes
Intervall zwischen Zellteilungen bilden die Grundlage, die es der
zellulären
Reparaturmaschinerie erlaubt, Schäden der DNA, die durch Stressfaktoren
(z.B. Bestrahlung) verursacht wurden, zu korrigieren und damit zu
verhindern, daß diese
unerwünschten
Veränderungen der
DNA im Genom kumulieren und in folgenden Zellgenerationen propagiert
werden (DP Lane, Nature, 358, 15-16,
1992; AJ Levine, Cell, 88, 323-331, 1997; KM Ryan, AC Phillips,
KH Vousden, Curr. Opin. Cell Biol., 13, 332-337, 2001). Ein Bestandteil
dieses Mechanismus ist die Elimination von Zellen mit nicht-reparablen DNA-Veränderungen
durch den programmierten Zelltod, die Apoptose. In diesem Sinne
ist eine der wesentlichen Funktionen des p53-Proteins das Erkennen
von DNA-Schäden
und damit die Aufrechterhaltung der Integrität des gesamten Genoms. Am deutlichsten
konnte diese Funktion des p53-Proteins als "Guardian of the Genome"
(DP Lane, Nature, 358, 15-16, 1992) in p53-Knockout-Mäusen ge zeigt
werden, die zunächst
eine normale Entwicklung durchlaufen und einen normalen Phenotyp
zeigen. Allerdings zeigen diese Tiere eine deutlich höhere Frequenz
und ein früheres
Auftreten spontaner und induzierter maligner Tumore. Ganz ähnlich prädisponieren
Mutationen der Keimzelllinie beim Menschen, das sog. Li-Fraumeni-Syndrom,
zum Auftreten multipler maligner Tumore in ungewöhnlich jungem Lebensalter in
den betroffenen Familien (M Hisada, JE Garber, CY Fung, JF Fraumeni
Jr., FP Li, J Natl. Cancer Inst., 90, 606-611, 1998; KE Nichols,
D Malkin, JE Garber, JF Fraumeni Jr., FP LI, Cancer Epidemiol. Biomarkers
Prev., 10, 83-87, 2001). Dieser Zusammenhang zwischen Krebsentstehung
und funktioneller Inaktivierung des Tumorsuppressors p53 ist zweifelsfrei
nachgewiesen. In menschlichen Tumoren ist p53 das am häufigsten
mutierte Gen mit Mutationsraten um 50% in den verschiedenen Tumorentitäten (SP
Hussain, CC Harris, Mutat. Res. 428, 22-23, 1999). Die Mehrzahl
der häufig
gefundenen Mutationen liegt in der DNA-Bindungsdomaine des Proteins
(sog. Hot-Spot-Mutationen), die die Fähigkeit des Proteins bestimmt,
spezifisch DNA-Regionen
innerhalb der Promotersequenzen von Zielgenen zu binden, was die
Grundvoraussetzung zur Aktivierung dieser Gene darstellt (Y Cho,
Gorina S, PD Jeffrey, NP Pavletich, Science, 265, 346-355, 1994;
T Soussi, C Beroud, Nature Rev. Cancer, 1, 233-240, 2001). Die direkte
Konsequenz dieser Hot-Spot-Mutationen
ist demnach der Verlust der Transaktivierung der Zielgene, was einem
Funktionsverlust des mutierten Tumorsuppressors floss of function)
gleich kommt. Dieser Funktionsverlust ist eines der möglichen
Ergebnisse einer Mutation im p53-Gen. Allerdings ist auch ein Zugewinn einer
neuen (pathologischen) Funktion in mutierten p53-Formen, ein sog.
"gain of function", gezeigt worden, die mit einem erhöhten tumorigenen
Potential einhergeht. Zum Beispiel hat die p53-Mutante R175H die Fähigkeit verloren, das p21-Gen,
ein Zellzyklus- und p53-Zielgen, zu aktivieren, jedoch die Fähigkeit
neu gewonnen, das Multi-Drug-Resistance-Gene mdr2 zu aktivieren
(K-V Chin, U Kazumitsu, I Pastan, MM Gottesmann, Science, 255, 459-462,
1992). Eine erhöhte
Expression von mdr2 geht mit einer verminderten Ansprechrate von Tumoren
auf Chemotherapeutika und einer schlechteren Prognose der betroffenen
Tumorpatienten einher (J Sampath, D Sun, VJ Kidd, J Grenet, A Gandhi,
LH Shapiro, Q Wang, GP Zambetti, JD Schuetz, J. Biol. Chem., 39359-39367,
2001).
Eine funktionelle Inaktivierung von
p53 kann auch ohne Auftreten einer Mutation durch eine Vielzahl von
Mechanismen zustande kommen. In Neuroblastomzellen ist das nicht-mutierte
p53-Protein (Wildtyp) oft durch eine Sequestrierung des Proteins
in das Zytoplasma durch einen hyperaktiven Exportmechanismus aus dem
Zellkern funktionell inaktiviert (JM Stommel, ND Marchenko, GS Jimenez,
UM Moll, TJ Hope, GM Wahl, EMBO J., 18, 1660-1672, 1999). Ein anderer
Mechanismus ist in Tumoren mit einer Amplifikation des mdm2-Gens
aktiv (J Momand, D Jung, S Wilczynski, J Niland, Nucl. Acids Res.,
26, 3453-3459, 1998).
mdm2 ist ein physiologischer Gegenspieler von p53, der das N-terminale
Ende des p53-Proteins bindet und damit die Transkription blockiert.
Weiterhin fungiert mdm2 als eine E3-Ubiquitinligase, die durch Ubiquitinisierung
und Bereitstellung des p53-Proteins für die proteosomale Degradation
im Zytoplasma die Stabilität
des p53-Proteins negativ reguliert (M Haupt, A Maya, A Kazaz, M
Ohren, Nature, 387, 296-299, 1997).
Wegen seiner kritischen Rolle in
der Suppression der Tumorigenität
ist p53 ein äußerst wichtiges
molekulares Ziel, z.B. in der experimentellen und klinisch-pharmakologischen
Krebsforschung (KH Vousden, GF Woude, Nat. Cell Biol., 2, 178-180,
2000). Die Entwicklung zahlreicher Anti-Tumortherapien zielt deshalb
auf die Wiederherstellung der Funktion von p53 in Tumorzellen ab
und stellt derzeit ein sehr aktives und sich schnell entwickelndes
Forschungsgebiet dar. In Abhängigkeit
von den inaktivierenden Mechanismen werden verschiedene Strategien
verfolgt. Für
Tumore mit inaktivierenden Mutationen ist das mutierte Protein ein
mögliches
Ziel. Kleine basische Peptide können
in gewissem Rahmen in experimentellen Systemen die Wildtypfunktion
des Proteins wiederherstellen (G Selivanova, L Ryabchanko, E Jansson,
v Iotsova, KG Wilman, Mol. Cell. Biol., 19, 3395-3402, 1999). In
Tumoren mit funktionell inaktiviertem p53-Protein ohne nachweisbare
Mutationen kann unter Umständen
die Wildtypfunktion wiedererlangt werden, indem Moleküle beeinflußt werden, die
mit der p53-Wildtypfunktion
interferieren. Zum Beispiel kann die Zugabe von niedermolekularen
Peptiden, die eine mdm2-Bindungsstelle für p53 blockieren, p53 aus dem
inhibierenden mdm2-Komplex freisetzen und damit funktionell reaktivieren
(TR Hupp, DP Lane, KL Ball, Biochem. J., 352, 1-17, 2000). Zu diesem
Zeitpunkt ist- das mdm2-Protein der einzige bekannte zelluläre Faktor,
der direkt mit der p53-Funktion durch Inhibierung der Transaktivierung
interferiert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es daher, weitere, zur Wiederherstellung der p53-Funktion geeignete
Substanzen bereitzustellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
die Splicing-Variante humAS-p53 des humanen Wildtyp-p53-Proteins
(humNS-p53) gelöst,
die erstmals als Inhibitor des humanen p53-Proteins identifiziert
wurde.
Beschreibung der Erfindung:
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
wurde überraschenderweise
erstmals ein neuer Inhibitor des Wildtyp-p53-Proteins in normalen
sowie in tumorösen
Zellen des Menschen experimentell nachgewiesen. Dieser Inhibitor
wurde als eine Splicing-Variante
(humAS-p53) des humanen Wildtyp-p53-Proteins (humNSp53) identifiziert.
Die Sequenz von humNS-p53 ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Bei der
Angabe "SEQ ID NO:" handelt es sich um die jeweiligen Sequenzkennzahlen
im Sequenzprotokoll gemäß WIPO Standard
ST.25.
Eine alternative Splicing-Form von
NS-p53 wurde bereits in murinen Systemen nachgewiesen, wo ein alternatives
Splicing des Transkripts zwischen den Exons 10 und 11 erfolgt und
in einem verkürzten
p53-Protein resultiert (D Wolf, N Harris, N Goldfinger, V Rotter,
Mol. Cell. Biol., 5, 127-132, 1985). Diese murine Splicing-Form
des Proteins (mAS-p53) unterscheidet sich von der normalen Splice-Form
in Mäusen
(mNS-p53) durch das Fehlen von 17 C-terminalen Aminosäuren. Diese
Splicing-Form des p53 scheint auf Mauszellen beschränkt zu sein.
Trotz zahlreicher Untersuchungen konnten dieses bzw. ein homologes
Protein in anderen Spezies, einschließlich des Menschen, bislang
nicht nachgewiesen werden (vgl. K Will, G Warnecke, S Bergmann,
W Deppert, Nucl. Acids. Res. 23, 4023-4028, 1995; M Laverdiere, J Beaudoin,
A Lavigueur, Nucl. Acids. Res., 28, 1489-1497, 2000).
In menschlichen Zellen konnte mittels
PCR zwar ein von der murinen Form abweichendes Splicing-Transkript
(humAS-p53) nachgewiesen werden, das die in SEQ ID NO: 2 beschriebene
Sequenz aufweist, und das durch eine Insertion eines neuen Exon
9I zwischen Exon 9 und Exon 10 entsteht (JM Flaman, F Waridel, A
Estreicher, A Vannier, JM Limacher, D Gilbert, R Iggo, T Frebourg,
Oncogene, 12, 813-818, 1996).
Ein Translationsprodukt des Splicing-Transkripts
wurde in menschlichen Zellen bislang weder isoliert noch nachgewiesen,
und aus diesem Grund hat die humane Splicing-Variante humASp53 im
Stand der Technik wenig Beachtung gefunden. Da die humAS-p53-cDNA
ursprünglich
in einem hefebasierenden funktionellen Transkriptionsassay (Yeast
Functional Assay) identifiziert wurde, blieben zusätzlich Zweifel,
ob die humAS-p53-cDNA
nicht ein Rekombinationsprodukt aus der Hefepropagierung hätte sein
können.
Weiterhin war nur ein Transkript des humAS-p53 durch RT-PCR, nicht
aber das entsprechende Protein in humanen Zellen nachgewiesen worden.
Aus diesen Gründen
blieb bislang unklar, ob überhaupt
eine Translation des endogenen alternativen Transkripts in Zellen
in vivo stattfindet. Die auf RT-PCR basierenden Untersuchungen führten zu
der Schlußfolgerung,
daß humAS-p53-Transkripte
nur in ruhenden (quiescent) Zellen vorkommen und dieses Transkript
in Tumorzellen demnach keine Rolle spielt (JM Flaman, F Waridel,
A Estreicher, A Vannier, JM Limacher, D Gilbert, R Iggo, T Frebourg,
Oncogene, 12, 813-818, 1996).
Überraschenderweise
wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung nun erstmals das Protein humRS-p53
nachgewiesen, das die in SEQ ID NO:4 dargestellte Aminosäuresequenz
aufweist und damit um 52 Aminosäuren
kürzer
ist als das normale p53-Protein
(humNS-p53), jedoch 10 neue Aminosäuren am Cterminalen Ende besitzt.
Gegenstand der Erfindung ist daher
das Protein mit der in SEQ ID NO:4 dargestellten Sequenz. Bis zur
Splicing Site (Aminosäure
330) des humAS-p53 Proteins ist die Homologie zu humNS-p53 100%.
Die Aminosäuren
331-341 des humASp53 haben keine Homologie zu humNS-p53 oder zu
murinem AS-p53.
Ferner eingeschlossen sind Homologe
des humASp53, die im Bereich des Sequenzabschnitts von Aminosäureposition
331-341 eine Homologie von mehr als 70 %, vorzugsweise mindestens
90 und am meisten bevorzugt 95 %, aufweisen, sowie Derivate und
Fragmente des Proteins, die dieselbe oder im wesentlichen die gleiche
physiologische Wirkung wie die Variante humAS-p53 haben. Unter Derivaten
werden vorliegend Verbindungen verstanden, bei denen einzelne Aminosäuren modifiziert
sind und sich somit von den natürlicherweise
vorkommenden Aminosäuren
unterscheiden.
Die Erfindung betrifft ferner eine
Nukleinsäure,
die für
ein oben genanntes Protein, ein Homologes oder Fragment kodiert.
Erfindungsgemäß eingeschlossen
sind Vektoren, die eines oder mehrere der genannten Nukleinsäuremoleküle enthalten,
ein schließlich
eines Vektors, der die in SEQ ID NO:1 dargestellte Sequenz des humAS-p53
einschließt.
Bei dem Vektor handelt es sich vorzugsweise um einen Expressionsvektor.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen,
vorzugsweise isolierte und/oder kultivierte Wirtszellen, die mit einem
zuvor genannten Vektor transformiert sind, wobei es sich insbesondere
um Wirtszellen handelt, die die erfindungsgemäßen Proteine exprimieren. Die
Wirtszellen liegen gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung in Form einer Expressionskultur vor, wobei eukaryontische
Zellen, wie z.B. menschliche und Säugetierzellen (z.B. für Knock-Out-
oder Knock-In-Modelle) und Insektenzellen für die Expression von rekombinanten
Proteinen (Baculovirale Konstrukte), bevorzugt sind.
Die Erfindung betrifft schließlich ein
Verfahren zur Herstellung der genannten Proteine, bei dem man die
Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression des
Proteins geeignet sind. Entsprechende Protokolle sind dem Fachmann
wohlbekannt. Vorzugsweise werden die Proteine anschließend vor
der weiteren Verwendung isoliert und gegebenenfalls weiter aufgereinigt.
Mit den so erhaltenen Proteinen lassen sich nach bekannten Verfahren
Antikörper
erzeugen, wobei es möglich
ist, solche Antikörper
zu isolieren, die spezifisch an das oder die erfindungsgemäßen Proteine
wie im Anhang aufgelistet, nicht aber an das humane p53-Protein
binden. Bei den Antikörpern
kann es sich um polyklonale oder monoklonale Antikörper handeln, und
dem Fachmann sind die Verfahren zu deren Erzeugung geläufig.
Wie erwähnt wurde im Rahmen der vorliegenden
Erfindung erstmals gezeigt, daß das
humAS-p53-Transkript mit der in SEQ ID NO:4 beschriebenen Sequenz
auch in proliferierenden Zellen vorkommt. Der Nachweis erfolgte
durch konventionelle und quantitative RT-PCR-Analyse. Gesamt-RNA-Proben von
kultivier ten menschlichen nicht-neoplastischen Zellen und Tumorzellen
wurden mit Hilfe spezifischer Primer auf die Expression des humAS-p53-Transkripts
hin untersucht (1).
Zusätzlich
wurde RNA aus Biopsien menschlicher Hirntumore und normaler Hirnsubstanz
analysiert. Diese Untersuchungen zeigen, dass humAS-p53 sowohl in
normalen Zellen als auch in hochproliferativen Zellen aus Tumoren
exprimiert wird (1).
Diese Daten stehen im Widerspruch zu einer früheren Beobachtung, die dieses
Transkript nur in Zellen aus ruhendem Gewebe (quiescent cells) detektieren
konnte und daher keine Bedeutung für neoplastische Gewebe postulierte
(JM Flaman, F Waridel, A Estreicher, A Vannier, JM Limacher, D Gilbert,
R Iggo, T Frebourg, Oncogene, 12, 813-818, 1996). Weitere RT-PCR-Daten zeigen, dass
generell das humA5-p53-Transkript in deutlich geringerer Konzentration
vorliegt als das humNS-p53-Transkript.
Um die Expressionsprofile von humAS-p53
genauer zu untersuchen, wurden die Transkripte von humAS-p53 und
humNS-p53 mit Hilfe einer quantitativen RT-PCR (real time QRT-PCR)
in kultivierten normalen Astrozyten, Gliomzellkulturen, sowie in
normaler Hirnsubstanz und einem Spektrum von glialen Tumoren unterschiedlicher
Malignitätsgrade
untersucht. Diese Untersuchungen bestätigten die oben dargestellten RT-PCR-Daten
und zeigen, daß das
humAS-p53-Transkript in allen Proben in geringerer Konzentration
als das humNS-p53-Transkript vorliegt. Allerdings existiert ein
breites Spektrum an Expressionsprofilen, wenn die Expressionrate
von humAS-p53/ humNS-p53 betrachtet wird. Unter den anaplastischen
und malignen Hirntumoren fanden sich Biopsien mit deutlich erhöhter humASp53/humNS-p53
Expressionsrate. Diese Experimente zeigen weiterhin, daß die humAS-p53/humNS-p53
Expression offenbar in einem koordinierten Verhältnis zur Expression des humNS-p53
steht. Es fand sich eine inverse Korrelation der humASp53/humNS-p53-Rate
zur Expression von humNS-p53.
Damit findet sich erstmals ein Hinweis,
daß die
Expression von humAS-p53 nicht einfach ein Nebenprodukt der humNS-p53-Transkription darstellt,
sondern offenbar einer spezifischen Regulation unterliegt (vgl. 11).
Zur weiteren Charakterisierung des
humAS-p53-Transkripts wurde der Transkriptionsstart untersucht. Es
wurde nachgewiesen, daß der
Leserahmen (reading frame) des Gens gewahrt bleibt und daß die Initiation der
Transkription der beiden Transkripte humAS-p53 und humNS-p53 am
selben Codon beginnt. Zur Klonierung des humAS-p53-Transkripts wurde
die SMART-Technologie
(Switching Mechanism At 5'-end of RNA-Transcript, Clontech) verwendet,
die eine Amplifikation der 5'-Enden der cDNA und damit eine Klonierung des
humAS-p53-Transkripts aufgrund der spezifischen, vom humNS-p53-Transkript
abweichenden 5'-Enden erlaubt. Die Sequenzanalyse der klonierten
cDNA zeigt, dass der Leserahmen des Gens in diesem Transkript gewahrt
bleibt und daß die
Translation des humAS-p53- und des humNS-p53-Transkripts in Proteinen
mit identischem Nterminalen, aber abweichendem C-terminalen Ende
resultiert (2a und 2b). Die humAS-p53-cDNA wurde
in den pCDNA3.1-Vektor
(Invitrogen) kloniert, der eine Expression des Proteins in Säugetierzellen und
zusätzlich
eine in vitro-Translation
der klonierten cDNA erlaubt. Die auf Grundlage der Sequenzanalyse vorhergesagte
Proteinstruktur des erfindungsgemäßen humAS-p53-Proteins wurde
in einer Western-Blot-Analyse
durch p53-Antikörper
bestätigt,
die spezifisch verschiedene bekannte Domänen des Wildtyp-p53-Proteins
erkennen. Dabei wurden der panspezifische Antikörper DO-1 gegen den N-Terminus von humNS-p53
und der für
das C-terminale Ende des humNS-p53 spezifische Antikörper PAb421
verwendet. Wie erwartet werden die Proteine humNS-p53 und auch humAS-p53
von dem N-terminalen Antikörper
D0-1 erkannt, humAS-p53 aber nicht vom Antikörper PAb421, was auf ein Fehlen
der C-terminalen üomäne hinweist. Identische
Ergebnisse wurden mit dem in vitro-translatierten Protein erzielt
(2c und 2d).
Weiterhin wurde mit Hilfe eines synthetischen
Oligopeptids (DQTSFQKENC) mit Homologie für das C-terminale Ende des
humAS-p53-Proteins ein erfindungsgemäßer polyklonaler Kaninchenantikörper hergestellt,
der spezifisch das humAS-p53-Protein
mit der in SEQ ID NO:4 beschriebenen Aminosäurensequenz, nicht aber das
humNS-p53-Protein erkennt. Die Spezifität des erfindungsgemäßen Antikörpers (DQT-10)
wurde zunächst
im Western-Blot analysiert, wobei rekombinantes humAS-p53-Protein verwendet
wurde, das entweder aus transienter Expression in humanen Zellen
oder aus in vitro-Translation in Kaninchenretikulozyten-Lysaten
stammt. Diese Experimente zeigen, das der Antikörper DQT-10 spezifisch mit
rekombinantem humAS-p53-Protein reagiert, nicht aber mit humNS-p53-Protein
(3). Damit erlaubt dieser
erfindungsgemäße Antikörper erstmals
im Immunoblot eine Unterscheidung der beiden humanen p53-Formen
humNS-p53 und humAS-p53, die Resultat eines alternativen RNA-Splicing-Prozesses
sind.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen spezifischen
Antikörpers
DQT-10 gegen das
humAS-p53-Protein wurde eine Auswahl von Tumorzelllinien häufiger humaner
Malignome auf die Expression des endogenen humAS-p53-Proteins hin
untersucht. Eine Immunpräzipitation
wurde mit dem DQT-10-Antikörper
in Lysaten dieser Zelllinien durchgeführt, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse mit DO-1-
oder PAb421-Antikörpern.
Diese Daten zeigen, daß das
erfindungsgemäße humAS-p53-Protein
in Lysaten von Tumorzellen unterschiedlicher Gewebeherkunft nachweisbar
ist (4). Zu diesen Geweben
gehören
häufige
menschliche Malignome, wie Mamma-Karzinome, Hepatozelluläre-Karzinome,
Melanome, maligne Gliome und andere.
Der Einsatz des erfindungsgemäßen spezifischen
polyklonalen Antikörpers
DQT-10 gegen das erfindungsgemäße Protein
humASp53 und die Klonierung der humAS-p53-cDNA erlauben eine Aufklärung verschiedener
funktioneller Aspekte des humAS-p53-Proteins, das offenbar in der Modulation
der p53-abhängigen
Transaktivierung von Genen eine große Rolle spielt:
- 1. Eine Immunfärbung
mit dem DO-1-Antikörper
erlaubt die Untersuchung der subzellulären Verteilung des erfindungsgemäßen humAS-p53-Proteins
in p53-defizienten Zelllinien (z.B. SAOS-2-Zellen) nach transienter
Transfektion mit humAS-p53-Protein: Es zeigte sich, daß sich sowohl
das humAS-p53- als auch das humNS-p53-Protein 4 Stunden nach Transfektion
im Zellkern als nukleäres
Protein nachweisen lassen (5).
Dies war insofern unerwartet, weil dem humAS-p53-Protein zwei von
drei wichtigen Signaldomänen
fehlen (nuclear localization signals, NLS, vergleiche Rbb.2a), die
den Import des humNS-p53-Proteins in den Zellkern determinieren
(JM Stommel, ND Marchenko, GS Jimenez, UM Moll, TJ Hope, GM Wahl, EMBO
J., 18, 1660-1672, 1999). Eine Lokalisation des erfindungsgemäßen humAS-p53-Proteins als nukleäres Protein
im Zellkern ist eine der Voraussetzungen für eine potentielle modulierende
Wirkung des humAS-p53 auf die p53-vermittelte Transaktivierung von
Genen.
- 2. Das erfindungsgemäße humAS-p53-Protein
aktiviert weder p21 noch mdm2, die als Ziel einer Transaktivierung
durch den Tumorsuppressor humNS-p53 identifiziert worden sind. Es
wurden zwei unabhängige experimentelle
Systeme verwendet, um die p53-abhängige Transaktivierung der
Zielgene mdm2 und p21 zu untersuchen. Im ersten System wurde entweder
humAS-p53- oder humNS-p53-cDNA transient in der p53-negativen Zelllinie
SAOS-2 exprimiert und die Expression von mdm2- und p21-Protein im
Western-Blot mit spezifischen Antikörpern analysiert. Die Expression
sowohl von mdm2 als auch von p21 wird erwartungsgemäß durch
eine Transaktivierung ausgehend vom transient exprimierten humNS-p53-Protein
induziert, während
durch das erfindungsgemäße humAS-p53-Protein
die Expression von keinem dieser beiden Gene induziert wird (6a).
In einem zweiten
Ansatz wurde ein erfindungsgemäßer und
hochsensitiver Reporterassay eingesetzt. Hierbei wird ein Reportergen,
bevorzugt wird der Einsatz von Glucuronidase (GUS) oder dem „green
fluorescent protein" (GFP), besonders bevorzugt wird der Einsatz
von beispielsweise Luciferase, ß-Galactosidase und Cloramphenicoltransferase
CAT, unter die Kontrolle des mdm2- oder des p21-Promoters gestellt,
um eine mögliche
transaktivierende Wirkung des erfindungsgemäßen humAS-p53-Proteins zu untersuchen. Parallel
zu diesem Reportergen-Promoterkonstrukt werden die Zellen mit Vektoren
transient transfiziert, die humNS-p53 oder humAS-p53 exprimieren.
Eine Transaktivierung des Promoters durch das transient kotransfizierte
Protein ist durch eine Expression des Reportergens nachweisbar.
Per erfindungsgemäße Reporterassay
zeigt in Übereinstimmung
mit den Ergebnissen der Western-Blot-Analyse zur endogenen mdm2-
und p21-Induktion (6a)
keine Aktivierung der beiden getesteten Promotoren durch das erfindungsgemäße humAS-p53-Protein
im Gegensatz zu einer Aktivierung beider Promotoren durch das humNS-p53-Protein
(6b). Daraus wird geschlußfolgert,
dass zumindest in Bezug auf mdm2 und p21, die beide Zielgene einer
p53-vermittelten Transaktivierung sind, das humAS-p53- im Gegensatz
zum Wildtypprotein keine transaktivierende Wirkung hat. Diese Ergebnisse
schließen
allerdings nicht aus, daß durch das
humAS-p53-Protein ein anderes, von den bekannten p53-Zielgenen unabhängiges Spektrum
an Genen transaktiviert wird.
- 3. Die Wechselwirkung des erfindungsgemäßen humAS-p53-Proteins mit Nukleinsäuren, insbesondere
mit DNA, wurde mit einem „Electrophoretic
Mobility Shift Assay" (EMSA) untersucht. Als spezifisches DNA-Substrat
wird bevorzugt ein Polynukleotid und besonders bevorzugt ein Oligonukleotid
eingesetzt, das bekannte p53-Bindungsmotive kodiert, in diesem Fall
ein p53-Bindungsmotiv des p21-Promoters,
an welches das humNS-p53-Protein bekannterma ßen bindet. Dieses Experiment
zeigt, dass ausschließlich das
humNS-p53-, nicht aber das humAS-p53-Protein an das Oligonukleotid
bindet. Daraus ist ersichtlich, dass das humAS-p53-Protein nicht
dieselben DNA-Bindungseigenschaften
wie das Wildtypprotein besitzt (7).
Es
wurde weiterhin gezeigt, daß das
humAS-p53-Protein die spezifische Bindung von humNS-p53-Protein an
solche Promoterregionen hemmt (8).
In transienten Transfektions.-Experimenten mit einem Konstrukt aus
Luciferase als Reportergen unter der Kontrolle des p21-Promoters
konnte gezeigt werden, daß in
p53-negativen SAOS-2-Zellen die Transaktivierung des p21-Promoters
durch das humNS-p53-Protein deutlich
vermindert ist, wenn das humAS-p53-Protein in diesen Zellen koexprimiert
wird (siehe 6b). Analog
zu diesen Ergebnissen zeigte sich in LNZ-308-Zellen, die das humNS-p53-Protein unter
der Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promoters exprimieren
(M Albertoni, Doktorarbeit, Faculte des Sciences, Universität Lausanne,
2001), daß eine
Koexpression des humAS-p53-Proteins
die vom humNS-p53-Protein vermittelte Transaktivierung inhibiert.
Diese Daten zeigen auch, daß die
Inhibition der Transaktivierung kein zelltyp-abhängiges Phänomen, sondern eine intrinsische
Eigenschaft des humASp53-Proteins ist.
- 4. Durch eine Aktivierung der Transkription von spezifischen
Genen, den sogenannten p53-Zielgenen, wird die Zellzykluskontrolle
durch das humNS-p53-Protein ausgeübt. Die Fähigkeit dieses Proteins zur
Transaktivierung anderer Gene wird durch eine Vielzahl von modulierenden
Faktoren beeinflußt,
von denen die post-translationelle Modifikation des humNS-p53-Proteins
und die Interaktion mit anderen Proteinen am besten charakterisiert
sind. Protein-Protein-Interaktionen
können
die p53-vermittelte Transaktivierung fördern, z.B. durch das Protein
ref-1, oder in hibieren, z.B. durch das Protein mdm2. Die Bindung
des p53-Proteins an spezifische Promoterregionen (p53-response elements)
dieser Zielgene ist die Voraussetzung für die transaktivierende Wirkung.
Eine Modulation dieser DNA-Bindung beeinflußt deshalb zwangsläufig die Transaktivierung.
Zu den Proteinen, die mit humNS-p53 wechselwirken, gehören die
beiden humanen Protein p63 und p73.
- 5. Die Funktion des humNS-p53 wird in Zellen durch die Splicing-Variante
humAS-p53 unterdrückt.
Das Zellwachstum sowie die Fähigkeit,
in Kolonien auszuwachsen, wurde in Zellen untersucht, die transient
mit humAS-p53 und/oder humNS-p53 transfiziert wurden (Colony Formation
Assay). Die transiente Expression von humNS-p53 verursachte erwartungsgemäß eine Wachstumshemmung
und eine Herabsetzung der Koloniezahl. SAOS-2 Zellen, die transient
humAS-p53 exprimieren, zeigten eine im Vergleich zur Gruppe, die mit
dem Kontrollvektor transfiziert wurde, eine etwas verringerte Kolonienzahl.
Mit humNS-p53 und humRS-p53 transfizierte Zellen dagegen zeigten
eine Verminderung der Kolonienzahl auf 38% der Kontrollgruppe. Dieser
Wert lag jedoch um ein Vielfaches über der Kolonienzahl der Zellen,
die humNS-p53 allein exprimieren. Diese Daten zeigen, daß die Wachstumshemmung
durch humNS-p53 durch Koexpression von humAS-p53 teilweise aufgehoben
wird (Rbb. 9). Damit ist humAS-p53 auf funktioneller Ebene ein physiologischer
Antagonist der p53-Funktion. Damit ist es dem mdm2-Protein ähnlich,
dem einzigen bislang bekanntem Inhibitor mit einer direkter Wirkung
auf die p53-vermittelte
Transaktivierung.
Die vorliegende Erfindung betrifft
daher unter anderem ferner ein Verfahren zur Identifizierung von
Genen, die von p53 transaktiviert werden, bei dem man
- a) oben genannte Wirtszellen, die Zellen einer p53- negativen Zelllinie
sind, transient transfiziert,
- b) ein zu untersuchendes Gen durch ein Reportergen ersetzt,
das unter die Kontrolle des Promoters des ersetzten Gens gestellt
wird,
- c) das in Stufe. b) erhaltene Promotor-Reportergen-Konstrukt in die
Wirtszellen kotransfiziert,
- d) die Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die zur Genexpression
geeignet sind, und man
- e) gegebenenfalls die Expression des Reportergens nachweist,
wobei
das zu untersuchende Gen als ein von p53 transaktiviertes Gen identifiert
wird, wenn man in Stufe e) eine Expression des Reportergens nachweist.
Das verwendete Reportergen kodiert
beispielsweise für
Luciferase (luc), Glucuronidase (GUS), "green fluorescent protein"
(GFP), β-Galactosidase oder Cloramphenicoltransferase CAT.
Eingeschlossen ist ferner ein Verfahren
zur in vitro-Untersuchung
der Wechselwirkung eines erfindungsgemäßen Proteins mit einer Nukleinsäure, bei
dem man
- a) die zu untersuchende Nukleinsäuresequenz
radioaktiv markiert, man sie
- b) mit dem Protein in Kontakt bringt, man
- c) die Mischung aus Stufe c) auf ein Gel aufträgt und man
- d) eine Gelelektrophorese durchführt,
wobei eine Wechselwirkung
des Proteins mit der zu untersuchenden Nukleinsäure vorliegt, wenn sich das Laufverhalten
der Nukleinsäure
im Vergleich zu einer Probe ohne zugegebenes Protein als Vergleichsprobe verändert.
Das vorliegende Verfahren (Electomobility
Shft Assay. EMSA) erlaubt Untersuchungen von Doppelstrang-DNA von
Sequenzen zwischen 25-300bp die entweder synthetischen Oligonucleotiden
oder natürlichen
DNA-Fragmenten entsprechen können.
Hier verwendet werden Sequenzen, die eine Bindungsstelle für p53 erkennen
lassen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung von
Substanzen, die geeignet sind, die Wechselwirkung eines erfindungsgemäßen Proteins
mit dem humanen Protein p53, p63 oder p73 zu beeinflussen, bei dem
man
- a) das erfindungsgemäße Protein markiert,
- b) humanes Protein p53, p63 oder p73 markiert,
- c) die markierten Proteine von Stufe a) und Stufe b) miteinander
in Kontakt bringt und eine Messung zur Bestimmung des/der Markersignals/Markersignale
durchführt,
wobei
die Markierungen so gewählt
sind, daß eine
Wechselwirkung der markierten Proteine von Stufe a) und b) nachweisbar
und von den isolierten, markierten Proteinen durch Änderung
des/der Detektionssignals/Detektionssignale unterscheidbar ist,
man - d) die Mischung von Stufe c) mit einer
zu untersuchenden Substanz in Kontakt bringt und man
- e) eine weitere Messung zur Bestimmung des/der Marker signals/Markersignale
durchführt,
wobei
die zu untersuchende Substanz eine die Wechselwirkung beeinflussende
Substanz ist, wenn sich das(die) in Stufe e) gemessene(n) Markersignal(e)
von dem(den) in Stufe c) gemessenen Markersignal(en) unterscheidet.
Das vorstehend genannte Verfahren
kann beispielsweise durchgeführt
werden, indem die Marker in den Stufen a) und b) unterschiedliche
Fluoreszenzfarbstoffe sind, wobei man jeweils einen Reporterfarbstoff und
einen Quencherfarbstoff verwendet, die bei Wechselwirkung der Proteine
in Stufe c) zu einem Fluoreszenz-Resonanz-Transfer (FRET; vgl. Heid
et a1., Genome Res. 6 (1996) 986-994) führen.
Die oben beschriebenen Verfahren
werden nachfolgend auch als "Screening-Verfahren" bezeichnet, da
mit deren Hilfe eine Vielzahl von potentiellen Wirkstoffen, z.B.
aus bestehenden Substanz-Bibliotheken, auf ihre Eigenschaft hin
untersucht werden können,
ob sie die Wechselwirkung zwischen den humanen Proteinen p53, 63
und/oder p73 und der erfindungsgemäßen Splicing-Variante beeinflussen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform
kann man das Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die geeignet
sind, die Wechselwirkung eines erfindungsgemäßen Proteins mit dem humanen
Protein p53, p63 oder p73 zu beeinflussen, durchführen, wenn
man einen Bindungsassay durchführt,
indem man entweder
- a) das erfindungsgemäße Protein
oder
- b) das humane Protein p53, p63 oder p73 auf einer Mikrotiterplatte
immobilisiert,
- c) das jeweils andere Protein markiert und es mit dem immobilisierten
Protein in Kontakt bringt, wobei man das Vorliegen einer Wechselwirkung
zwischen den in a) und b) genannten Proteinen nach Durchführung entsprechender
Waschschritte durch Nachweis der Markierung bestätigt, man
- d) die Proteine mit der zu untersuchenden Substanz in Kontakt
bringt,
wobei die zu untersuchende Substanz eine die Wechselwirkung
beeinflussende Substanz ist, wenn die Markierung nach Zugabe der
zu untersuchenden Substanz und Durchführung entsprechender Waschschritte
auf den Mikrotiterplatten nicht mehr nachweisbar ist.
Die Erfindung betrifft ferner die
Verwendung einer Substanz, die die Wechselwirkung eines erfindungsgemäßen Proteins
mit dem humanen Protein p53, p63 oder p73 beeinflußt, zur
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
von Tumorerkrankungen oder Beeinflussung p53 abhängiger Funktionen in nicht-neoplastischen
Zellen.
Im Hinblick auf nicht-neoplastische
Zellen weisen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltener.
Daten darauf hin, daß AS-p53
durch die Wechselwirkung mit NS-p53 eine Onkogenepotenz hat. Eine
antagonistische Wirkung von AS-p53 auf die physiologischen p53-Funktionen
könnte
demnach einen beschleunigten Zellzyklus in normalen Zellen zur Folge
haben, d.h. eine höhere
Wachstumsrate, wobei nach Einwirkung DNAschädigender Noxen durch mangelnden
Zellzyklusarrest eine verminderte Zeitspanne zur DNA Reparatur zur
Verfügung
stünde,
mit der möglichen
Folge, daß es
zu einer Kumulation von DNA Schäden
kommt.
In diesem Zusammenhang ist ein Verfahren
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
von Tumorerkrankungen oder Beeinflussung p53-abhängiger Funktionen in nicht-neoplastischen
Zellen eingeschlossen, bei dem man ein oben genanntes Verfahren
zur Identifizierung von Substanzen, die geeignet sind, die Wechselwirkung
eines erfingungsgemäßen Proteins
mit dem humanen Protein p53, p63 oder p73 zu beeinflussen, durchführt und
man die Substanz, die als eine diese Wechselwirkung beeinflussende
Substanz identifiziert ist, mit geeigneten Hilfs- und/oder Trägerstoffen
zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.
Demgemäß betrifft die Erfindung ferner
eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine nach einem oben genannten
Screening-Verfahren erhältliche
bzw. identifizierte Substanz und pharmazeutisch verträgliche Hilfs-
und/oder Trägerstoffe
enthält.
Zusammenfassung
der wesentlichen Vorteile der Erfindung:
Das erfindungsgemäße Protein humAS-p53 zeichnet
sich dadurch aus, daß sein
Transkript erstmals neben dem schon bekannten Vorkommen in humanen
normalen, ruhenden Zellen auch in proliferativen Zellen nachweisbar
ist. Bislang fanden sich im Stand der Technik keine Berichte über die
Expression von humAS-p53 in kultivierten Tumorzellen oder Tumorbiopsien.
Neben dem RNA-Transkript konnte das humAS-p53-Protein im Rahmen
der vorliegenden Erfindung überraschenderweise
erstmals sowohl in kultivierten Tumorzelllinien, als auch in Biopsien
der häufigsten
menschlichen malignen Tumore nachgewiesen werden. Die Expression des
humAS-p53 scheint in Tumorzelllinien oder Tumorbiopsien generell
höher als
in normalen Zellen oder nicht neoplastischen Geweben zu sein. Diese
Daten weisen auf die Bedeutung von humAS-p53 für neoplastische Zellen hin,
da die Expression von humAS-p53 und humNS-p53 koordiniert und nicht
zufällig
ist.
Ein Protein mit einem inhibitorischen
Effekt auf die Wirkung eines so bedeutenden Tumorsuppressorgens
wie dem humNS-p53 liegt Idealerweise in gesunden Zellen in geringen
physiologischen intrazellulären Konzentrationen
vor. Dies konnte für
das humAS-p53-Protein beobachtet werden.
Verschiedene Eigenschaften des humAS-p53
deuten auf eine onkogene Funktion dieses Proteins in Tumorzellen
hin:
- 1. Eine Überexpression von humAS-p53
erlaubt es Tumorzellen, die wachstumsinhibierende Wirkung des Wildtypproteins
humNB-p53 zu überwinden
(9).
- 2. humAs-p53 inhibiert die Transaktivierung von Genen durch
humNS-p53, die eine essentielle Voraussetzung für die Ausübung der Kontrollfunktion des
humNS-p53 im Zellzyklus und während
der Proliferation ist (6).
- 3. humAS-p53 inhibiert die DNA-Bindung von humNS-p53, was eine
Voraussetzung für
die Regulation der Transkription von Genen ist, die durch humNS-p53
transaktiviert werden (7).
Die Mechanismen, die zur Inaktivierung
von humNS-p53 und damit zum Verlust der Wachstumskontrolle trotz
eines intakten humNS-p53-Proteins führen, sind bislang weitestgehend
unbekannt. In diesem Zusammenhang und im Hinblick auf eine mögliche Entschlüsselung
wichtiger Domänen
für die
Bindung des humAS-p53-Proteins an andere Proteine stellt das erfindungsgemäße humAS-p53-Protein
eine neue Möglichkeit zur
Entwicklung von Substanzen dar, die die Wechselwirkung z.B. des
humAS-p53- mit dem humNS-p53-Protein sowie dessen Homologen p63
und p73 beeinflussen und deren physiologische Funktion wiederherstellen. Solche
Substanzen stellen eine neue Klasse von pharmakologischen Anti-Tumormodulatoren
dar.
Eine direkte Suche nach solchen Substanzen,
die das onkogene Potential des humAS-p53-Proteins unterdrücken könnten, ist
durch eine direkte Messung dieser spezifischen biologischen Parameter
der humAs-p53 Funktion auf der Grundlage der obigen Beobachtungen
(1-3) möglich.
So sind folgende Parameter für
ein erfindungsgemäßes Screening
anwendbar:
- a. Messung der Wachstumsraten von
gentechnisch veränderten,
humAS-p53 stabil oder konditional überexprimierender Zellen (Colony
Formation Assay),
- b. Messung der Aktivität
von Promotor-Reportergenkonstrukten,
bei denen der Promoter von Genen stammt, die Ziel der p53-vermittelten
Transktivierung sind, in gentechnisch veränderten, humAS-53 stabil oder
konditional überexprimierender
Zellen,
- c. Messung der p53-spezifischen DNA-Bindungsaktivität in zellfreien
Systemen mit rekombinantem humAS-p53 in Verbindung mit einem rekombinanten
Proteine mit p53-Aktivität aus der
Gruppe humNS-p53, p63 oder p73.
Diese Parameter sind für ein erfindungsgemäßes Screening
im Format des High Throughput Screening (HTS) (Turconi, High Throughput
Screening 3: A supplement to drug discovery today, 1, 27-39, 2001)
geeignet und erlauben damit die Untersuchung einer hohen Zahl von
Kandidatensubstanzen in kurzer Zeit (10).
Basierend auf der funktionellen Ähnlichkeit
und Strukturhomologie von humNS-p53 bzw. humAS-p53 und p63 sowie
p73 wird ein solches erfindungsgemäßes Screening auf die Interaktion
von humAs-p53 mit den humNS-p53-homologen Proteinen p63 und p73
ausgedehnt. Aufgrund der vorliegenden Daten weist humAs-p53 alle
Voraussetzungen eines physiologischen Inhibitors dieser Proteine
auf:
- 1. humAS-p53 enthält eine DNA-Bindedomäne, die
eine Interaktion auch mit diesen Proteinen zulässt
- 2. humAS-p53 besitzt keinen C-Terminus und keine Oligomerisationsdomäne, die
inhibierend auf die Interaktion mit p63 oder p73 wie im falle von
humNS-p53 wirkt.
Das erfindungsgemäße Protein ist somit ein neues
molekulares Target für
eine Modulation der Transaktivierung von Genen, die durch das humNS-p53-Protein
vermittelt wird und eine wichtige Rolle in der Genese und Progression
von Tumoren spielt. Dieses Protein wurde erstmals in gesunden und
in proliferierenden Zellen nachgewiesen. Es ist eine Splicing-Variante des Wildtypproteins
humNS-p53 und inhibiert dessen transaktivierende Wirkung, wie in
einem erfindungsgemäßen Verfahren
mit Hilfe von Reportergenen nachgewiesen werden konnte.
Die Interaktion dieser beiden Proteine,
sowie die Interaktion des humAS-p53 mit den Homologen p63 und p73
des humNS-p53 stellen erstmals Screeningverfahren zur Verfügung, die
es erlauben, pharmakologische Modulatoren dieser Wechselwirkung
zu identifizieren. Diese Modulatoren bieten das Potential zur Entwicklung
eines pharmazeutischen Wirkstoffs zur Behandlung von solchen Krebserkrankungen
oder Beeinflussung p53 abhängiger
Funktionen in nicht-neoplastischen Zellen, denen keine Mutation
des humNS-p53-Proteins zugrunde liegt, in denen aber möglicherweise
eine funktionelle Inhibierung durch die Splicing-Variante humAS-p53
Ursache der gestörten
p53-Funktion ist.
In Systemen mit mutiertem p53, wie z.B. in vielen menschlichen Tumoren
ist ebenfalls das humAS-p53 mutiert (ASmt-p53). Die funktionellen
Konsequenzen der Interaktion der mutierten Proteine von ASmt-p53
und NSmt-p53 sind bislang unbekannt. Modulatoren der Interaktion
von As-p53 und NS-p53 könnten
aber ebenfalls mit der Funktion einiger mutierter p53 Proteine (Gain of
Function) interferieren und therapeutisch nutzbare Wirkung haben.
Eine Restitution der p53-Funktion in Tumoren ohne p53-Mutation könnte therapeutisch
eine verminderte Wachstumsrate bedingen, in diesen Tumoren eine
Sensibilisierung für
Apoptose und Apoptose-induzierende Chemotherapeutika bewirken sowie
die Strahlensensibilität
verbessern.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand
von Beispielen beschrieben.
Beispiele
Klonierung und Sequenzanalyse
des humAS-p53
Aus normalen menschlichen Astrozyten
wurde mit dem Poly(A)Pure Kit (Ambion) polyA+-RNA
isoliert. Die cDNA des humAS-p53 wurde durch Rapid Amplification
of cDNA Ends (RAGE) mit Hilfe des SMARTTM RAGE
cDNA Amplification-Kits (Clontech Laboratories, Inc.) nach den Angaben
des Herstellers synthetisiert. Die synthetisierte cDNA wurde auf
einem Gel aufgereinigt und dann mit einem GFP Fusion TOPO TA Expressions-Kit
(Invitrogen) in den Expressionsvektor pcDNA3.l/CT-GFP-TOPO kloniert.
Das klonierte Produkt wurde mit Primernpaaren, die spezifisch für humAS-p53
(E9fw + E9-(i)rev und E2fw + E9-(i)rev)
oder panspezifisch für
humAS-p53 und humNS-p53 waren (E9fw + ElOrev und E2fw + ElOrev)
charakterisiert. Die Integrität-des Überganges
der TA-Klonierungssequenz und des 5'-Endes der humAS-p53-cDNA wurde durch
Sequenzierung mit einem vektorspezifischen Primer (pCDNAfw) bestätigt.
PCR-Primer Sequenzen:
E9fw: 5'-ggagaatatttcacccttc-3' (SEQ
ID NO:7)
E9-(i)rev: 5'-ggcaaagtcatagaaccattttcatgctctc-3' (SEQ
ID NO:8)
E2fw: 5'-gggtcactgccatggagg-3' (SEQ ID NO:9)
ElOrev:
5'-tggagtgagccctgctccc-3' (SEQ 2D NO:10)
pCDNAfw: 5'-gggcggtaggcgtgtacggtgg-3'
(SEQ ID NO:11)
RT-PCR Detektion von humAS-p53
Für
die Analyse des humAS-p53 und humNS-p53-Transkripts wurde RNA aus
Zellkulturen und aus Gewebe von normalem Hirn und Hirntumoren isoliert.
Für kultivierte
Zellen wurde eine subkonfluente 100mm-Petrischale verwendet, nach
Waschen der Ku1-turen
in PBS wurden die Zellen mit lml TriStar lysiert und 0.2 ml Chloroform
hinzugegeben. Nach Zentrifugieren erfolgte die Fällung der Gesamt-RNA mit 0.5
ml Isopropanol, dann wurden die RNA-Pellets in 20 μl DEPC-H2O aufgenommen. Für die Gesamt-RNA-Extraktion aus
Tumoren oder Hirngewebe wurde 100 mg Gewebe verwendet und unter
identischen Bedingungen lysiert, jedoch zusätzlich mit einem Glashomogenisator
behandelt. cDNA wurde mit 0.2 μg
Random-Primern unter Einsatz von 5 μg Gesamt-RNA jeder Probe mit
Hilfe eines Ready-To-GoTM Kits (Pharmacia
Biotech) synthetisiert. Die Primersequenzen für humAS-p53 (E9fw + E9-(i)rev))
und humNS-p53 (E9fw + El0rev) wurden nach Sequenzanalyse für die spezifischen
RNA-Abschnitte gewählt. Die
PCR-Amplifikation erfolgte mit 1 μ1
Produkt der RT-Reaktion, 2 μM
der jeweiligen Primer (10 μM),
2 μ1 dNTP
(2.5 μM)
und 0.1 μ1
RmpliTaq Gold Polymerase (Roche) in PCR-Puffer in einem Endvolumen
von 20 μ1.
Die Reaktion wurde mit einem Temperaturprof il von 95 ° C 10 min,
94 ° C 1
min, 55°C
1 min, 72°C
2 min durchgeführt,
40 Zyklen für
humAS-p53 und 35 Zyklen für
humNS-P53, 25 Zyklen für
die Amplifikation des „Housekeeping
Gens" ß-Actin.
Die Analyse der PCR-Produkt erfolgte auf Agarosegelen (2 %) nach
Ethidiumbromidfärbung.
Entwicklung des AS-p53 Antikörpers
Polyklonales Antiserum gegen humAS-p53
wurde durch Immunisierung eines Kaninchens gegen ein synthetisches
Oligopepdid (DQTSFQKENC) mit einer für die Splicing Region spezifischen
Aminosäuresequenz
hergestellt (Innovagen AB, Sweden). Die Spezifität des Antiserums gegen das
synthetische Peptid wurde im ELISA charakterisiert unter Verwendung
des spezifischen Peptids und Zufallspeptiden als negative Kontrolle.
Immunfärbungen und subzelluläre Lokalisation
von humAS-p53
Für
die Proteindetektion in kultivierten SAOS-2 Zellen wurden 2⨯104 Zellen auf Glasplättchen am Boden einer 24er-Plastikkulturschale
ausgesät.
Nach Anheftung der Zellen und 24 h Inkubation wurde eine transiente
Transfektion mit pCDNA wtp53, pCDNA-humASp53, oder pCDNA-3.1 (0.2 μg/Napf) unter
Bedingungen durchgeführt,
die „Transience
Transfektion" beschreiben. Nach weiteren 38h Inkubation wurden die
Kulturen mit PBS gewaschen und in 95 % Ethanol/5 % Eisessig 15 min
bei -20°C
fixiert und anschließend
mit 3% Triton-X100 15 min permeabilisiert. Der p53-spezifische Antikörper D01
wurde für
30 min bei Raumtemperatur zugegeben, dann die Kulturen erneut gewaschen.
Die Detektion des Primärenantikörpers erfolgte
durch 30 min Inkubation mit Fluoreszein-thiozyanat (FITC) markiertem
Kanninchen-anti-Maus Antikörper
(DAKO). Die Auswertung und Fotodokumentation erfolgte mit einem
Zeiss Axiscope Fluoreszenzmikroskop.
In Vitro Translation
Für
die in vitro-Translation von pCDNA-ASp53 und pCDNA-wtp53 wurde ein „TNTTM" T7 Complete Reticulocyte Lysate System"
(Promega) verwendet. Die Reaktion wurde in 2 μ1 Reaktionspuffer, 2 μ1 Aminosäurenmix,
1 μ1 RNAse
Inhibitor RNAsin, 25 μ1
Kaninchen-Retikulozytenlysat mit 2 μg der pCDNA-ASp53 oder pCDNA-wtp53
Plasmid für
2 h bei 30°C
im Wasserbad durchgeführt.
Die Reaktionsprodukte wurden unmittelbar in Immunopräzipitations-
oder Western-Blot-Experimenten weiterverwendet.
Transiente Transfektion
und Luciferase-Reporter-Gen Assay
1.5⨯106 Zellen
wurden in 100 mm Kulturschalen ausgesät und transient mit 4 μg pCDNA-ASp53,
pCDNA-wtp53, pCDNA-3.1 oder pUC18 transfiziert unter Verwendung
von „Effectene
Transfection Reagent" (Quiagen) mit einem DNA/Effectene-Verhältnis von
1:5. Die Zellen wurden unter Standartkulturbedingungen bei 37°C in einer
5% CO2 Atmosphäre für 13 h inkubiert, dann zweimal
gewaschen und nach Mediumwechsel weitere 24 h inkubiert. Die Zellysate
wurden unmittelbar für
Immunoprezipitations- oder Western-Blot-Analysen verwendet.
Für
die Analyse im Luciferase-Reporter-Gen Assay wurden 2⨯105 Zellen in 6-well Schalen ausgebracht und
nach 24 h Inkubation transient mit 1.0 μg des Reporter-Plasmids und
0.1 μg des
p53-exprimierenden Plasmids verwendet, mit Ausnahme der Titrationsexperimente,
in denen ansteigende DNA-Konzentrationen
wie in den Abbildungen gezeigt verwendet wurden. Nach 38 h Inkubation
wurden die mit PBS gewaschenen Schalen mit Lysispuffer (25 mM Tri-Phosphat
pH7, 2 mM DTT, 10 Glycerol, 1 % Triton X-100) beschichtet und die
Zellschicht mit einem Zellschaber auf Eis gewonnen und 20 min inkubiert.
Die Lysate wurden durch Zentrifugation bei 13.000 rpm geklärt, die
Proteinkonzentration bestimmt und mit „Luciferase Assay Mix" (Promega)
versetzt. Die Bestimmung der Luciferaseaktivität erfolgte in einem Luminometer.
Western-Blot-Analyse
Subkonfluente Zellkulturen wurden
mit kaltem PBS gewaschen und mit dem Zellschaber gelöst. Nach Zentrifugation
wurden die Zellpellets sofort in Lysepuffer (50 mM HEPES (pH 7.5),
150 mM NaCl, 0.1 % NP40) mit 5 μg/ml
Aprotinin, 5 μg/ml
Leupeptin, 5 μg/ml
Pepstatin A, und 5 μg/ml
Pefabloc aufgenommen. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde das Lysat
10 sec ultraschallbehandelt, dann für 25 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.
Die Überstände wurden
gewonnen, die Proteinkonzentration mittels „BCA Protein Assay Reagent
Kit" (Pierce) bestimmt und die Proteinkonzentration der Proben angeglichen.
Die Lysate wurde in „SDS-Polyacrylamid
Gelelektrophorese Loading-Buffer" (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2
% SDS, 5 % 2-Mercaptoethanol,
10 % Glycerol, and 0.002 % Bromphenolblau) aufgenommen und bei 95°C für 5 min
inkubiert. Die Proben (30-100 μg) wurden
auf 10 % SDS-PAGE separiert und durch Elekrotransfer auf Polyvinylid-Fluorid-Membranen
(Millipore) übertragen.
Die Proteindetektion erfolgte durch Inkubation der Membranen mit
Verdünnungen
der Antikörper
(DQT10 oder p53-spezifischer Antikörper) über Nacht bei 4°C, Inkubation
für 2h
mit dem sekundären Antikörper und
anschließender
ECL-Detektion (Super
SignalTM, Pierce). Als p53-spezifische Anti körper wurden DO1
gegen das N-terminale Ende des Proteins (Aminosäuren 21-25), die für das C-terminale
Ende spezifischen Antikörper
Ab421 (aa 371-380) und Ab122 (aa 371-180), sowie der für die DNA-Bindungsdomäne spezifische
Antikörper
Ab240 (aa 213-217) verwendet.
Immunopräzipitation
Von subkonfluenten 10 cm Kulturschalen
wurden Zellen wie für
die Western Blot-Analyse gewonnen, aber in IP-Puffer (20 mM Tris
pH8.0, 1 mM EDTA, 0.5 % NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 10 Gylcerol)
mit Proteaseinhibitoren (5 μg/ml
Aprotinin, 5 μg/ml
Leupeptin, 5 μg/ml
Pepstatin A, 5 μg/ml
Pefabloc) aufgenommen und für
30 min auf Eis lysiert, dann für
10 sec unltraschallbehandelt und zentrifugiert. Die Proteinbestimmung
erfolgte mittels „BCA
Protein Assay Reagent Kit" (Pierce). 0.5 mg Protein in 700 μl IP-Puffer
wurden mit 70 μ1
Protein A-Sepharose versetzt und 60 min bei 4°C unter rotierender Bewegung
inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand gewonnen und 70 μl (entspr.
10 % Volumen) Antikörper
DQT10 hinzugegeben. Nach Inkubation bei 4°C über Nacht unter rotierender
Bewegung wurde erneut mit 70 μ1
Protein A-Sepharose versetzt
und 60 min bei 4°C
inkubiert. Nach Zentrifugation wurde das Pellet in IP-Puffer dreimal
gewaschen und die Proben in der Western-Blot-Analyse weiter verwendet.
Electrophoretic Mobility
Shift Assay (EMSA)
1 μg
Oligonucleotide deren Sequenz die p53-Bindungsstelle des p21-Promoters
umfasst (5'gctctgccGAACATGTCCCAACATGTTGccgctctg-3') wurden mit T4
Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs) und γ-[32P-ATP] markiert und mit 1 μg nichtmarkiertem
komplementärem
Oligonucleotid hybridisiert (5'-cagagcgg CAACATGTTG GGACATGTTC ggcagagc-3'). Die doppelsträngige DNA
wurde auf 8%-Polyacrylamidgelen gereinigt und in EMSA-Experimenten
mit in der in-vitro-Translation
synthetisierten Protein verwendet. Die DNA- Bindung wurde über Nacht bei 4°C in 50 mM
Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT und 20 % Glycerol
durchgeführt.
Der Bindungsreaktion wurden 2?10' c.p.m. der DNA und 10 μl Retikulozytenlysat
zugegeben, das zuvor mit oder ohne 1 μg gereinigten p53-spezifischen
Antikörpern
für 30
min auf Eis präinkubiert
wurde.
Colony Formation
Assay
SAOS-2 Zellen wurden transient mit
je 2 μg
pC-Asp53, pC-NSp53, pC-DNA3.1 oder pC-Asp53 und pC-NS-p53 wie oben
transfiziert. pUC18-DNA wurde verwendet, um die Gesamt-DNA-Menge
in den Transfektionsgruppen anzugleichen. Der Vektor enthält ein Neomycinresistenzgen,
das eine Selektion transfizierter Zellen unter Neomycin erlaubt.
Nach 24 h Inkubation wurden die transfizierten Populationen in 100
mm Kulturschalen in ansteigender Zelldichte ausgesät und 1
mg/ml G418 (Neomycin) zugegeben. Unter diesen Bedingungen sterben
nichttransfizierte (nicht-neomycinresistente) Zellen progredient
ab. Nach 3 Wochen Inkubation wurden die klonogen ausgewachsenen
Kolonien der überlebenden
Klone ausgezählt.
Legenden zu
den Abbildungen
1:
Analyse
des humNS-p53- (Bahnen 2, 5, 8, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32 und 38)
und humAS-p53-Transkripts (Bahnen 3, 6, 9, 12, 18, 21, 24, 27, 30,
33, 36 und 39) durch konventionelle RT-PCR. β-Actin wurde in jeder PCR-Reaktion
als Kontrolle für
die Integrität
der RNA-Proben mit amplifiziert (Bahnen 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22,
25, 28, 31, 34 und 37) . Die spezifischen PCR-Produkte wurden durch
Pfeile markiert. PCR-Produkte mit höherem Molekulargewicht als
humAS-p53 repräsentieren
Produkte aus der Amplifikation genomischer DNA. RNA wurde aus etablierten
Zelllinien verschiedener menschlicher Tumoren präpariert. Oben: Medulloblastome D283,
TE378, DAOy; Epidermoidkarzinom A431, Osteosarkom SAOS-2, Melanome
Me16, MelHo, MU3; Mamma-Karzinome MB231, MCF7, Hepatozelluläre- Karzinome
HepG2, Hep3b, HUH7. Unten: Analsyse von normalen Hirnproben, kultivierten
Astrozyten und Fibrobalsten, sowie Gewebeproben aus normaler Weißer Substanz
und Cortex (NB-w.m. und NB-cort) und fünf Biopsien maligner Gliome
(GBM).
2a:
Schematische
Darstellung der Molekülstruktur
und der funktionellen Domänen
in humNS-p53 und humAS-p53.
2b:
Sequenzvergleich
von humNS-p53 und humAS-p53. Die gestrichelte Linie zeigt 100% Homologie
mit der für NS-p53
kodierenden CDS an.
2c:
Die
Gliomzelllinie G-112 (mt p53) wurde transient mit pC-ASp53 (Bahn 1 und
3), mit dem leeren Vektor pCDNA-3.1 (Bahn 2 und 5) oder mit dem
Vektor pUC18, der nicht-kodierende DNA enthält, (Bahn 3 und 6) transfiziert.
Die Lysate der transfizierten Zellen wurden im Western-Blot mit
dem p53- spezifischen
Antikörper
DO-1 (Bahn 1-3) oder PAb421 (Bahn 4-6) analysiert. Die Pfeile markieren
die Position des endogenen zellulären humNS-p53- oder des rekombinanten
humAS-p53 Proteins.
2d:
humNS-p53-
und humAS-p53-Protein wurde in vitro mit Hilfe eines Retikulozytenlysat-Transkriptions/Translations
-Systems (Promega) synthetisiert. Die Proteine der in vitro-Translation wurden
im Western-Blot mit dem N-terminalen p53-Antikörper DΟ-1 (aa 21-25),
dem Antikörper
gegen die Core-Domäne pAb240
(aa 231-217) und dem C-terminalen Antikörper PAb421 (aa 371-380) analysiert.
In der Bahn "M" wurde die Position eines 51,4 Kda-Markers für Molekulargewichte
markiert.
3:
Der
gegen ein Oligopepdid des humAS-p53 generierte Antikörper DQT-10
erkennt spezifisch humAS-p53 (Bahn 1 und 7), nicht aber humNS-p53
(Bahn 2 und 8). Die Proteine in den Bahnen 1-4 wurden durch in vitro-Translation
synthetisiert, die Proteine der Bahnen 5 und 7 entstammen der transienten
Transfektion von G-112-Gliomzellen mit humAS-p53. Die Bahnen 6 und
8 zeigen als Kontrolle zelluläre
Lysate von transient mit dem leeren Kontrollvektor pcDNA3.1 transfizierten
G-112-Zellen. Die Zelllinie G-112 exprimiert konstitutiv ein mutiertes
p53-Protein in Folge
einer bekannten Hot-Spot-P53-Mutation.
4:
Nachweis
von humAS-p53-Protein in verschiedenen menschlichen Tumoren. von
etablierten Zelllinien wurden Lysate präpariert und eine Immunopräzipitation
mit DQT-10-Antikörpern
durchgeführt.
Das durch DQT-10 immunpräzipitierte
humAS-p53-Protein wurde im Western-Blot mit dem p53-spezifischen
Antikörper
DΟ-1 detektiert.
In jedem Experiment wurde die p53-negative Zelllinie SAOS-2 als
Kontrolle eingeschlossen. Gezeigt wird eine Auswahl von Zelllinien:
G-112, G-168, U-87, U-251 (huma ne Glioblastomlinien), SAOS-2 (Osteosarkom), MCF7
(Mamma-Karzinom),
T47D (Mamma-Karzinom), A431 (Epidermoidkarzinom), HuH7 und HepG2
(Hepatozelluläres-Karzinom).
5:
Subzelluläre Verteilung
des humAS-p53 nach transienter Transfektion. Die p53-negative Zelllinie
SAOS-2 wurde mit humASp53 transfiziert und eine Immunfärbung mit
dem DΟ-1 Antikörper
durchgeführt.
Wie humNS-p53 erscheint humAS-p53 vier Stunden nach transienter
Transfektion im Nucleus der Zellen.
6a:
humAS-p53-Protein
transaktiviert nicht die bekannten p53-Target-Gene p21 und mdm2. SAOS-2 Zellen
wurden transient mit pC-p53-DNA oder mit pC-AS-p53-DNA transfiziert.
Die zellulären
Lysate wurden im Western-Blot mit spezifischen p53-, p21-oder mdm2-Antikörpern analysiert.
6b:
Transaktivierung
des p21-Gens in transient transfizierten SAOS-2 Zellen. SAOS-2 Zellen
wurden mit Vektoren transfiziert, die Wildtyp p53, mutiertes p53
273h, humAS-p53 exprimieren und die Aktivität eines Luciferase-Reportergens
unter Kontrolle des p21-Promoters gemessen. Mit Hilfe von Koexpression
wurde die Wechselwirkung von humAS-p53 und humNS-p53 analysiert.
7:
Elecrophoretic
Mobility Shift Assays (EMSA) mit in nitrosynthetisiertem humNS-p53-
(1 und 3) und humAS-p53-Protein (4-6) unter Verwendung von Oligonukleotiden
mit einem p53-Bindemotiv
des p21-Promoters. Die Spezifität
der DNA Bindung wird bestätigt
durch einen Super-Shift des Protein/DNA-Komplexes nach Zugabe der p53-spezifischen
Antikörper
D0-1 (Bahn 2) oder PAb421 (Bahn 3). wie bereits in anderen Publikationen
gezeigt, kann PAb421 die sequenzspezifische Bindung von p53 steigern,
während
DO-1-Antikörper
nur zu einem Super- Shift
führen
(TR Hupp, DP Lane, KL Ball, Biochem. J., 352, 1-17., 2000).
8:
Der
Einfluß von
humAS-p53 auf die DNA-Bindung von humNS-p53 im EMSA. Es wurden identische
experimentelle Bedingungen wie in 7 gewählt. Oligonukleotide
mit einer p53-Bindungsstelle
des p21-Promoters wurden mit humNS-p53 allein (1) oder in Gegenwart
von humAS-p53 (Bahn 3) inkubiert. Der spezifische Komplex von humNS-p53
und der DNA erfährt
einen Super-Shift nach Zugabe der Antikörpers PAb421 (Bahn 4). Bahn
2 zeigt DNA, die nur mit humAS-p53 inkubiert wurde.
9:
Transiente
Transfektion der p53-negativen Zellinie SAOS-2 mit humAS-p53, humNS-p53
und Kotransfektion mit humAS-p53 und humNS-p53. Im Vergleich zur
der mit dem leeren Vektor transfizierten Kontrolle unterdrückt humNS-p53
im Gegensatz zum humAS-p53 das Wachstum von Tumorkolonien im „Colony
Formation Assay". Kotransfektion beider p53-Formen zeigt eine Inhibition
der humNS-p53-abhängigen
Wachstumsunterdrückung
durch humAS-p53.
10a:
Schematische
Darstellung eines HT-Screenings basierend auf der erfindungsgemäßen Inhibition
der humNS-p53-abhängigen
Wachstumsunterdrückung
durch humAs-p53.
10b:
Schematische
Darstellung eines HT-Screenings basierend auf der erfindungsgemäßen Inhibition
der DNA-Bindung von humNSp53 durch humAs-p53.
10c:
Schematische
Darstellung eines HT-Screenings basierend auf der erfindungsgemäßen Inhibition
der humNS-p53-abhängigen
Transaktivierung bekannter p53-abhängiger Target-Gene durch humAs-p53.
11:
Quantitative
RT-PCR Analyse der normalisierten Expression von NS-p53 und der
Expressionrate von AS-p53 / NS-p53 in Hirntumoren verschiedener
Grade und normalem Hirn. SEQUENZPROTOKOLL
