WO2004016788A1 - Splicing-variante des humanen p53-proteins und deren verwendung zur herstellung pharmazeutischer präparate zur behandlung von tumorerkrankungen - Google Patents

Splicing-variante des humanen p53-proteins und deren verwendung zur herstellung pharmazeutischer präparate zur behandlung von tumorerkrankungen Download PDF

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WO2004016788A1
WO2004016788A1 PCT/EP2003/008442 EP0308442W WO2004016788A1 WO 2004016788 A1 WO2004016788 A1 WO 2004016788A1 EP 0308442 W EP0308442 W EP 0308442W WO 2004016788 A1 WO2004016788 A1 WO 2004016788A1
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protein
humas
nucleic acid
interaction
humns
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PCT/EP2003/008442
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Alf Giese
Ella L. Kim
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Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the protein humAS-p53, which is a splicing variant of the human wild-type p53 protein and which strongly inhibits the transactivation of genes mediated by the wild-type protein.
  • the invention further relates to methods for identifying substances which influence the interaction of the tumor suppressor humNS-p53 and its homologues p63 and p73 with the splicing variant humAS-p53, and the use of these substances for the production of pharmaceutical preparations for the treatment of tumor diseases or influencing p53 -dependent functions in non-neoplastic cells.
  • the tumor suppressor gene p53 encodes a transcription factor that is activated when cells are genotoxically stressed, e.g. exposed to ⁇ or UN radiation, hypoxia, or cytotoxic substances. In the absence of such stressors, the p53 protein is present in normal cells in a very low concentration and has a very short half-life. A high conversion of the protein is maintained by proteosomal degradation in the cytoplasm (R Honda, H Yasuda, Oncogene, 19, 1473-1476, 2000).
  • the p53 protein Under the influence of stressors, the p53 protein is quickly stabilized and accumulates in the cell nucleus, where it exerts control over the cell cycle by transactivating or repression of certain genes, the p53 target genes (G Fulci, ⁇ Ishii, VanMeir EG, Brain Pathol, 8 , 599-613, 1998). Arresting the cell cycle or apoptosis are two important possible functional consequences of activating the p53-mediated signaling pathway.
  • the cell cycle arrest and thus an extended interval between cell divisions form the basis which allows the cellular repair machinery to correct damage to the DNA caused by stress factors (for example radiation) and thus to prevent these undesirable changes in the DNA from accumulating in the genome and propagated in the following cell generations (DP Lane, Nature, 358, 15-16, 1992; AJ Levine, Cell, 88, 323-331, 1997; KM Ryan, AC Phillips, KH Vousden, Curr. Opin. Cell Biol., 13, 332-337, 2001).
  • stress factors for example radiation
  • hot-spot mutations determines the ability of the protein to specifically bind DNA regions within the promoter sequences of target genes, which is the basic prerequisite for activating these genes (Y Cho, Gorina S, PD Jeffrey, NP Pavletich, Science, 265, 346-355, 1994; T Soussi, C Beroud, Nature Rev. Cancer, 1, 233-240, 2001).
  • the direct consequence of these hot spot mutations is therefore the loss of transactivation of the target genes, which is equivalent to a loss of function of the mutant tumor suppressor (loss of function). This loss of function is one of the possible results of a mutation in the p53 gene.
  • a gain of a new (pathological) function in mutated p53 forms has been shown, which is associated with an increased tumorigenic potential.
  • the p53 mutant R175H has lost the ability to activate the p21 gene, a cell cycle and p53 target gene, but has regained the ability to activate the multi-drug resistance gene mdr2 (KV Chin, U Kazumitsu, I Pastan, MM Gottesmann, Science, 255, 459-462, 1992).
  • Functional inactivation of p53 can occur without a mutation by a variety of mechanisms.
  • the non-mutated p53 protein wild type
  • Another mechanism is active in tumors with amplification of the mdm2 gene (J Momand, D Jung, S Wilczynski, J Niland, Nucl. Acids Res., 26, 3453-3459, 1998).
  • mdm2 is a physiological antagonist of p53, which binds the N-terminal end of the p53 protein and thus blocks transcription.
  • mdm2 acts as an E3 ubiquitin ligase, which negatively regulates the stability of the p53 protein by ubiquitinization and provision of the p53 protein for proteosomal degradation in the cytoplasm (M Haupt, A Maya, A Kazaz, M Ohr, Nature, 387, 296 -299, 1997).
  • p53 is an extremely important molecular target, for example in experimental and clinical-pharmacological cancer research (KH Vousden, GF Woude, Nat. Cell Biol., 2, 178-180, 2000).
  • the development of numerous anti-tumor therapies is therefore aimed at restoring the function of p53 in tumor cells and is currently a very active and rapidly developing field of research.
  • various strategies are pursued.
  • the mutated protein is a possible target for tumors with inactivating mutations.
  • Small basic peptides can to some extent be found in experimental systems restore the wild-type function of the protein (G Selivanova, L Ryabchanko, E Jansson, V Iotsova, KG Wil an, Mol. Cell. Biol., 19, 3395-3402, 1999).
  • the wild type function can be regained under certain circumstances by influencing molecules which interfere with the p53 wild type function.
  • the addition of low molecular weight peptides that block an mdm2 binding site for p53 can release p53 from the inhibiting mdm2 complex and thus reactivate it functionally (TR Hupp, DP Lane, KL Ball, Biochem. J., 352, 1-17 , 2000).
  • the mdm.2 protein is the only known cellular factor that interferes directly with the p53 function by inhibiting transactivation.
  • the object of the present invention is therefore to provide further substances suitable for restoring the p53 function.
  • the object is achieved according to the invention by the splicing variant humAS-p53 of the human wild-type p53 protein (humNS-p53), which was identified for the first time as an inhibitor of the human p53 protein.
  • a new inhibitor of the wild-type p53 protein was surprisingly first experimentally detected in normal and in tumor cells in humans.
  • This inhibitor was identified as a splicing variant (humAS-p53) of the wild-type human p53 protein (humNS-p53).
  • the sequence of humNS-p53 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the statement "SEQ ID NO:” is the respective sequence key figures in the sequence listing WIPO Standard ST.25.
  • NS-p53 An alternative splicing form of NS-p53 has already been detected in murine systems, where the transcript is alternatively spliced between exons 10 and 11 and results in a truncated p53 protein (D Wolf, N Harris, N Goldfinger, V Rotter, Mol. Cell. Biol., 5, 127-132, 1985).
  • This murine splicing form of the protein (mAS-p53) differs from the normal splice form in mice (mNS-p53) in that it lacks 17 C-terminal amino acids.
  • This splicing form of p53 appears to be restricted to mouse cells.
  • this or a homologous protein has not yet been detected in other species, including humans (cf.
  • splicing transcript deviating from the murine form could be detected in human cells, which has the sequence described in SEQ ID NO: 2, and this by inserting a new exon 91 between exon 9 and exon 10 arises (JM Flaman, F Waridel, A Estrei ⁇ her, A Vannier, JM Limacher, D Gilbert, R Iggo, T Frevier, Oncogene, 12, 813-818, 1996).
  • a translation product of the splicing transcript has so far not been isolated or detected in human cells, and for this reason the human splicing variant humASp53 has received little attention in the prior art. Since the humAS-p53 cDNA was originally identified in a yeast-based functional transcription assay (yeast functional assay), there remained additional doubts as to whether the humAS-p53 cDNA could not have been a recombination product from yeast propagation. Furthermore, only a transcript of the humAS-p53 was detected by RT-PCR, but not the corresponding protein in human cells. For these reasons, stayed So far it is unclear whether a translation of the endogenous alternative transcript takes place in cells in vivo.
  • the protein humAS-p53 which has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and was thus 52 amino acids shorter than the normal p53 protein (humNS-p53), but 10 new amino acids, was now detected for the first time at the C-terminal end.
  • the invention therefore relates to the protein with the sequence shown in SEQ ID NO :.
  • the homology to humNS-p53 is 100%.
  • Amino acids 331-341 of humASp53 have no homology to humNS-p53 or murine AS-p53.
  • homologs of humASp53 that have more than 70%, preferably at least 90%, and most preferably 95% homology in the region of the amino acid position 331-341, and derivatives and fragments of the protein that are the same or substantially the same have the same physiological effect as the humAS-p53 variant.
  • derivatives are understood to mean compounds in which individual amino acids are modified and thus differ from the naturally occurring amino acids.
  • the invention further relates to a nucleic acid which codes for an above-mentioned protein, a homologue or fragment.
  • vectors are included which contain one or more of the mentioned nucleic acid molecules, a finally a vector that includes the sequence of the humAS-p53 shown in SEQ ID NO: 1.
  • the vector is preferably an expression vector.
  • the invention also relates to host cells, preferably isolated and / or cultivated host cells, which have been transformed with a vector mentioned above, in particular being host cells which express the proteins according to the invention.
  • the host cells are in the form of an expression culture, eukaryotic cells, such as e.g. human and mammalian cells (e.g. for knock-out or knock-in models) and insect cells for the expression of recombinant proteins
  • the invention relates to a process for the production of said proteins, in which the host cells are cultivated under conditions which are suitable for the expression of the protein. Appropriate protocols are well known to those skilled in the art.
  • the proteins are then preferably isolated before further use and, if appropriate, further purified.
  • the proteins obtained in this way can be used to produce antibodies by known processes, it being possible to isolate those antibodies which specifically bind to the protein (s) according to the invention as listed in the appendix but do not bind to the human p53 protein.
  • the antibodies can be polyclonal or monoclonal antibodies and those skilled in the art are familiar with the methods of generating them.
  • the humAS-p53 transcript with the sequence described in SEQ ID NO: 4 also occurs in proliferating cells.
  • the detection was carried out by conventional and quantitative RT-PCR analysis.
  • Total RNA samples from cultivated Human non-neoplastic cells and tumor cells were examined for the expression of the humAS-p53 transcript using specific primers (Fig. 1).
  • RNA from biopsies of human brain tumors and normal brain matter was analyzed. These studies show that humAS-p53 is expressed in tumors both in normal cells and in highly proliferative cells (Fig. 1).
  • humAS-p53 In order to examine the expression profiles of humAS-p53 in more detail, the transcripts of humAS-p53 and humNS-p53 were analyzed with the aid of quantitative RT-PCR (real time QRT-PCR) in cultured normal astrocytes, glioma cell cultures, as well as in normal brain matter and a spectrum of glial tumors of different degrees of malignancy. These studies confirmed the RT-PCR data presented above and show that the humAS-p53 transcript is present in all samples in a lower concentration than the humNS-p53 transcript. However, there is a wide range of expression profiles when considering the expression rate of humAS-p53 / humNS-p53.
  • the transcription start was investigated for further characterization of the humAS-p53 transcript. It has been demonstrated that the reading frame of the gene is preserved and that the initiation of the transcription of the two transcripts humAS-p53 and humNS-p53 begins at the same codon.
  • SMART technology Switchching Mechanism At 5 'end of RNA transcript, Clontech
  • pan-specific antibody DO-1 against the N-terminus of humNS-p53 and the antibody PAb421 specific for the C-terminal end of the humNS-p53 were used.
  • the proteins humNS-p53 and also humAS-p53 are recognized by the N-terminal antibody DO-1, but humAS-p53 is not recognized by the antibody PAb421, which indicates an absence of the C-terminal domain.
  • Identical results were achieved with the in vitro-translated protein (Fig.2c and 2d).
  • DQTSFQKENC synthetic oligopeptide
  • DQT-io The specificity of the antibody according to the invention was first analyzed in a Western blot, using recombinant humAS-p53 protein, either from transient expression in human cells or from in vitro translation in rabbit reticulocyte lysates comes.
  • this antibody allows a distinction in the immunoblot between the two human p53 forms humNS-p53 and humAS-p53, which are the result of an alternative RNA splicing process.
  • humAS-p53 protein With the help of the specific antibody DQT-10 according to the invention against the humAS-p53 protein, a selection of tumor cell lines of common human malignancies was examined for the expression of the endogenous humAS-p53 protein. Immunoprecipitation was performed on the DQT-10 antibody in lysates of these cell lines, followed by Western blot analysis with DO-1 or PAb421 antibodies. These data show that the humAS-p53 protein according to the invention can be detected in lysates of tumor cells of different tissue origin (Fig. 4). These tissues include common human malignancies such as breast carcinoma, hepatocellular carcinoma, melanoma, malignant glioma and others.
  • humAS-p53 and the humNS-p53 protein can be detected as a nuclear protein in the cell nucleus 4 hours after transfection (Fig. 5). This was unexpected because the humAS-p53 protein lacks two of three important signal domains (nuclear localization signals, NLS, see Fig.2a), which determine the import of the humNS-p53 protein into the cell nucleus (JM Stommel, ND Marchenko , GS Jimenez, UM Moll, TJ Hope, GM Wahl, EMBO J., 18, 1660-1672, 1999). Localization of the humAS-p53 protein according to the invention as a nuclear protein in the cell nucleus is one of the prerequisites for a potential modulating effect of the humAS-p53 on the p53-mediated transactivation of genes.
  • the humAS-p53 protein according to the invention activates neither p21 nor mdm2 which have been identified as the target of a transactivation by the tumor suppressor humNS-p53.
  • Two independent experimental systems were used to investigate the p53-dependent transactivation of the target genes mdm.2 and p21.
  • either humAS-p53 or humNS-p53 cDNA was transiently expressed in the p53-negative cell line SAOS-2 and the expression of mdm.2 and p21 protein was analyzed in a Western blot with specific antibodies.
  • a reporter gene is preferred, the use of glucuronidase (GUS) or the “green fluorescent protein” (GFP) is preferred, the use of, for example, luciferase, ⁇ -galactosidase and cloramphenicol transferase CAT is preferred, under the control of the mdm2 or of the p21 promoter in order to investigate a possible transactivating effect of the humAS-p53 protein according to the invention
  • the cells are transiently transfected with vectors which express humNS-p53 or humAS-p53
  • the transiently co-transfected protein can be detected by expression of the reporter gene
  • the reporter assay according to the invention shows, in accordance with the results of the Western blot analysis for endogenous mdm2 and p21 induction (FIG.
  • humAS-p53 protein The interaction of the humAS-p53 protein according to the invention with nucleic acids, in particular with DNA, was investigated using an “Electrophoretic Mobility Shift Assay” (EMSA).
  • a polynucleotide and particularly preferably an oligonucleotide are preferably used as the specific DNA substrate, encodes the known p53 binding motif, in this case a p53 binding motif of the p21 promoter to which the humNS p53 protein is known to eating binds.
  • This experiment shows that only the humNS-p53 but not the humAS-p53 protein binds to the oligonucleotide. It can be seen from this that the humAS-p53 protein does not have the same DNA binding properties as the wild type protein (Fig. 7).
  • humAS-p53 protein inhibits the specific binding of humNS-p53 protein to such promoter regions (FIG. 8).
  • transient transfection experiments with a construct from luciferase as reporter gene under the control of the p21 promoter, it could be shown that in p53-negative SAOS-2 cells the transactivation of the p21 promoter by the humNS-p53 protein was significantly reduced is when the humAS-p53 protein is co-expressed in these cells (see Fig. 6b).
  • the cell cycle control is carried out by the humNS-p53 protein.
  • the ability of this protein to transactivate other genes is affected by a variety of modulating factors, the best of which are the post-translational modification of the humNS-p53 protein and the interaction with other proteins. Protein-protein interactions can promote p53-mediated transactivation, eg through the protein ref-1, or in hibieren, for example by the protein mdm2.
  • the binding of the p53 protein to specific promoter regions (p53 response elements) of these target genes is the prerequisite for the transactivating effect. Modulation of this DNA binding therefore necessarily affects the transactivation.
  • the proteins that interact with humNS-p53 include the two human proteins p63 and p73.
  • the function of the humNS-p53 is suppressed in cells by the splicing variant humAS-p53.
  • Cell growth and the ability to grow out in colonies were examined in cells transiently transfected with humAS-p53 and / or humNS-p53 (Colony Formation Assay).
  • the transient expression of humNS-p53 caused an inhibition of growth and a reduction in the number of colonies.
  • SAOS-2 cells that transiently express humAS-p53 showed a slightly reduced number of colonies compared to the group that was transfected with the control vector.
  • cells transfected with humNS-p53 and humAS-p53 showed a reduction in the number of colonies to 38% of the control group.
  • the present invention therefore also relates, inter alia, to a method for identifying genes which are transactivated by p53, in which
  • a gene to be examined is replaced by a reporter gene which is placed under the control of the promoter of the replaced gene,
  • step b) co-transfecting the promoter-reporter gene construct obtained in step b) into the host cells
  • the host cells are cultivated under conditions which are suitable for gene expression, and man
  • the gene to be investigated is identified as a gene transactivated by p53 if an expression of the reporter gene is detected in step e).
  • the reporter gene used codes, for example, for luciferase (luc), glucuronidase (GUS), "green fluorescent protein” (GFP), ⁇ -galactosidase or cloramphenicol transferase CAT.
  • step c) the mixture from step c) is applied to a gel and one
  • EMSA Electromobility Shft Assay.
  • the invention also relates to a method for identifying substances which are suitable for influencing the interaction of a protein according to the invention with the human protein p53, p63 or p73, in which
  • markings are selected such that an interaction of the labeled proteins from stages a) and b) is detectable and distinguishable from the isolated, labeled proteins by changing the detection signal (s)
  • the substance to be examined is a substance influencing the interaction if the marker signal (s) measured in stage e) differs from the marker signal (s) measured in stage c).
  • the above-mentioned method can be carried out, for example, by the markers in stages a) and b) being different fluorescent dyes, a reporter dye and a quencher dye being used in each case, which upon interaction of the proteins in stage c) result in a fluorescent dye.
  • Resonance transfer FRET; see Heid et al., Genome Res. 6 (1996) 986-994).
  • screening methods since they can be used to use a large number of potential active ingredients, e.g. from existing substance libraries, their properties can be examined as to whether they influence the interaction between the human proteins p53, 63 and / or p73 and the splicing variant according to the invention.
  • the method for identifying substances which are suitable for influencing the interaction of a protein according to the invention with the human protein p53, p63 or p73 can be carried out if a binding assay is carried out by either
  • the substance to be examined being a substance influencing the interaction, if the marking on the microtiter plates is no longer detectable after adding the substance to be examined and carrying out corresponding washing steps.
  • the invention further relates to the use of a substance which influences the interaction of a protein according to the invention with the human protein p53, p63 or p73, for producing a pharmaceutical composition for the treatment of tumor diseases or influencing p53-dependent functions in non-neoplastic cells.
  • a method for producing a pharmaceutical composition for the treatment of tumor diseases or influencing p53-dependent functions is in non-neoplastic cells included, in which an above-mentioned method for identifying substances which are suitable for influencing the interaction of a protein according to the invention with the human protein p53, p63 or p73 is carried out and the substance which is used as a this interaction-influencing substance is identified, formulated with suitable auxiliaries and / or carriers to form a pharmaceutical composition.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition which contains a substance obtainable or identified by an abovementioned screening method and pharmaceutically acceptable auxiliaries and / or carriers.
  • the protein humAS-p53 according to the invention is characterized in that, for the first time, its transcript is detectable in proliferative cells in addition to the already known occurrence in human normal, resting cells.
  • the humAS-p53 protein was surprisingly detected for the first time in the context of the present invention both in cultured tumor cell lines and in biopsies of the most common human malignant tumors.
  • the expression of humAS-p53 appears to be generally higher in tumor cell lines or tumor biopsies than in normal cells or non-neoplastic tissues.
  • humAS-p53 Various properties of the humAS-p53 indicate an oncogenic function of this protein in tumor cells:
  • humAS-p53 allows tumor cells to overcome the growth-inhibiting effect of the wild type protein humNS-p53 (Fig. 9).
  • humAs-p53 inhibits the transactivation of genes by humNS-p53, which is an essential prerequisite for the control function of the humNS-p53 in the cell cycle and during proliferation (Fig. 6).
  • humAS-p53 inhibits the DNA binding of humNS-p53, which is a prerequisite for the regulation of the transcription of genes that are transactivated by humNS-p53 (Fig. 7).
  • the humAS-p53 protein according to the invention represents a new possibility for the development of substances which interact e.g. influence the humAS-p53 with the humNS-p53 protein and its homologues p63 and p73 and restore their physiological function. Such substances represent a new class of pharmacological anti-tumor modulators.
  • a direct search for such substances that could suppress the oncogenic potential of the humAS-p53 protein is by directly measuring these specific biological parameters of the humAs-p53 function based on the above Observations (1-3) possible.
  • the following parameters can be used for a screening according to the invention:
  • HTS high throughput screening
  • humAs-p53 has all the prerequisites for a physiological inhibitor of these proteins:
  • l.humAS-p53 contains a DNA binding domain which also allows interaction with these proteins
  • humAS-p53 has no C-terminus and no oligomerization domain, which has an inhibiting effect on the interaction with p63 or p73 as in the case of humNS-p53.
  • the protein according to the invention is thus a new molecular target for modulating the transactivation of genes, which is mediated by the humNS-p53 protein and plays an important role in the genesis and progression of tumors.
  • This protein was first detected in healthy and proliferating cells. It is a splicing variant of the wild type protein humNS-p53 and inhibits its transactivating effect, as could be demonstrated in a method according to the invention with the aid of reporter genes.
  • the humAS-p53 (ASmt-p53) is also mutated in many human tumors.
  • the functional consequences of the interaction of the mutant proteins of ASmt-p53 and NSmt-p53 are so far unknown.
  • modulators of the interaction of As-p53 and NS-p53 could also interfere with the function of some mutated p53 proteins (gain of function) and have a therapeutically useful effect.
  • Restitution of the p53 function in tumors without a p53 mutation could therapeutically lead to a reduced growth rate, sensitize these tumors to apoptosis and apoptosis-inducing chemotherapy drugs, and improve radiation sensitivity.
  • RNA was isolated from normal human astrocytes with the Poly (A) Pure Kit (Ambion).
  • the humAS-p53 cDNA was determined by J2apid Amplification of cDNA Shds (RACE) using the SMART TM RAC ⁇ cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories, Inc.) according to the manufacturer's instructions
  • the synthesized cDNA was purified on a gel and then cloned into the expression vector pcDNA3.1 / CT-GFP-TOPO using a GFP Fusion TOPO TA expression kit (Invitrogen).
  • the cloned product was paired with primers specific for humAS-p53 (E9fw + E9- (i) rev and E2fw + E9- (i) rev) or panspecific for humAS-p53 and humNS-p53 (E9fw + ElOrev and E2fw + ElOrev)
  • the integrity of the transition of the TA cloning sequence and the 5 'end of the humAS p53 cDNA was confirmed by sequencing with a vector-specific primer (pCDNAfw).
  • E9fw 5 '-ggagaatatttcacccttc-3' (SEQ ID 0: 7)
  • RNA was isolated from cell cultures and from tissue from normal brain and brain tumors. A subconfluent 100 mm petri dish was used for cultured cells. After washing the cultures in PBS, the cells were lysed with 1 ml of TriStar and 0.2 ml of chloroform was added. After centrifugation took place the precipitation of the total RNA with 0.5 ml isopropanol, then the RNA pellets were taken up in 20 ⁇ l DEPC-H 2 0. For the total RNA extraction from tumors or brain tissue, 100 mg of tissue was used and lysed under identical conditions, but additionally treated with a glass homogenizer.
  • cDNA was synthesized with 0.2 ug random primers using 5 ug total RNA from each sample using a Ready-To-Go TM kit (Pharmacia Biotech).
  • the primer sequences for humAS-p53 (E9fw + E9- (i) rev)) and humNS-p53 (E9fw + ElOrev) were selected after sequence analysis for the specific RNA sections.
  • the PCR amplification was carried out with 1 ⁇ l product of the RT reaction, 2 ⁇ M of the respective primer (10 ⁇ M), 2 ⁇ l dNTP (2.5 ⁇ M) and 0.1 ⁇ l AmpliTaq Gold Poly erase (Röche) in PCR buffer in a final volume of 20 ul.
  • the reaction was carried out with a temperature profile of 95 ° C. for 10 minutes, 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 2 minutes, 40 cycles for humAS-P53 and 35 cycles for humNS-P53, 25 cycles for the amplification of the "housekeeping gene" ß-actin.
  • the analysis of the PCR product was carried out on agarose gels (2%) after ethidium bromide staining.
  • Polyclonal antiserum against humAS-p53 was prepared by immunizing a rabbit against a synthetic oligopepdid (DQTSFQKENC) with an amino acid sequence specific for the splicing region (Innovagen AB, Sweden). The specificity of the antiserum against the synthetic peptide was characterized in the ELISA using the specific peptide and random peptides as a negative control.
  • a “TNT TM T7 Complete Reticulocyte Lysate System” (Promega) was used for the in vitro translation of pCDNA-ASp53 and pCDNA-wtp53.
  • the reaction was carried out in 2 ⁇ l reaction buffer, 2 ⁇ l amino acid mix, 1 ⁇ l RNAse inhibitor RNAsin, 25 ⁇ l
  • Rabbit reticulocyte lysate with 2 ⁇ g of the pCDNA-ASp53 or pCDNA-wtp53 plasmid was carried out in a water bath for 2 h at 30 ° C.
  • the reaction products were immediately used in immunoprecipitation or Western blot experiments.
  • luciferase reporter gene assay 2 ⁇ 10 s Cells were placed in 6-well dishes and used after 24 h incubation transiently with 1.0 ⁇ g of the reporter plasmid and 0.1 ⁇ g of the p53-expressing plasmid, with the exception of the titration experiments in which increasing DNA concentrations were used as shown in the figures.
  • the dishes washed with PB ⁇ were coated with lysis buffer (25 mM tri-phosphate pH7, 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% Triton X-100) and the cell layer was obtained on ice with a cell scraper and incubated for 20 min.
  • the lysates were clarified by centrifugation at 13,000 rpm, the protein concentration was determined and "Luciferase Assay Mix" (Promega) was added.
  • the luciferase activity was determined in a luminometer.
  • Sub-confluent cell cultures were washed with cold PBS and dissolved with the cell scraper. After centrifugation, the cell pellets were immediately in lysis buffer (50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% NP40) with 5 ⁇ g / ml aprotinin, 5 ⁇ g / ml leupeptin, 5 ⁇ g / ml pepstatin A, and 5 ⁇ g / ml Pefabloc added. After 30 min incubation on ice, the lysate was sonicated for 10 sec, then centrifuged for 25 min at 13,000 rpm.
  • lysis buffer 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% NP40
  • the supernatants were obtained, the protein concentration was determined using the "BCA Protein Assay Reagent Kit” (Pierce) and the protein concentration of the samples was adjusted.
  • the lysates were dissolved in "SDS-polyacrylamide gel electrophoresis loading buffer” (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 ), 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, and 0.002% bromophenol blue) and incubated at 95 ° C for 5 min.
  • the samples (30-100 ⁇ g) were separated on 10% SDS-PAGE and transferred to polyvinylide fluoride membranes (Millipore) by electro transfer.
  • Protein detection was carried out by incubating the membranes with dilutions of the antibodies (DQT10 or p53-specific antibody) overnight at 4 ° C., incubating for 2 hours with the secondary antibody and subsequent ECL detection (Super Signal TM, Pierce).
  • p53 -specific anti bodies were DOl against the N-terminal end of the protein (amino acids 21-25), the antibodies Ab421 (aa 371-380) and Abl22 (aa 371-180) specific for the C-terminal end, as well as that for the DNA binding domain specific antibodies Ab240 (aa 213-217) were used.
  • Cells were obtained from subconfluent 10 cm culture dishes as for Western blot analysis, but in IP buffer (20 mM Tris pH8.0, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glycerol) ) with protease inhibitors (5 ⁇ g / ml aprotinin, 5 ⁇ g / ml leupeptin, 5 ⁇ g / ml pepstatin A, 5 ⁇ g / ml Pefabloc) and lysed on ice for 30 min, then treated with ultrasound for 10 sec and centrifuged. The protein was determined using the "BCA Protein Assay Reagent Kit" (Pierce).
  • 0.5 mg of protein in 700 ⁇ l of IP buffer was mixed with 70 ⁇ l of Protein A-Sepharose and incubated for 60 min at 4 ° C. while rotating. The supernatant was removed and 70 ⁇ l (corresponding to 10% volume) of antibody DQT10 were added After incubation at 4 ° C. overnight with rotating movement, 70 ⁇ l of protein A-Sepharose were again added and the mixture was incubated for 60 min at 4 ° C. After centrifugation, the pellet was washed three times in IP buffer and the samples used in the Western blot analysis.
  • oligonucleotides whose sequence encompasses the p53 binding site of the p21 promoter (5′-gctctgccGAACATGTCCCAACATGTTGccgctctg -3 ′) were labeled with T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs) and ⁇ - [ 32 P-ATP] and with 1 ⁇ g unlabeled complementary oligonucleotide hybridizes (5'-cagagcgg CAACATGTTG GGACATGTTC ggcagagc-3 '). The double-stranded DNA was purified on 8% polyacrylamide gels and used in EMSA experiments with protein synthesized in in vitro translation.
  • the DNA Binding was performed overnight at 4 ° C in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT and 20% glycerol. The binding reaction was added 2 ⁇ 10 4 cpm of DNA and 10 ⁇ l reticulocyte lysate, which had been preincubated with or without 1 ⁇ g of purified p53-specific antibodies for 30 min on ice.
  • SAOS-2 cells were transiently transfected with 2 ⁇ g each of pC-Asp53, pC-NS-p53, pC-DNA3.1 or pC-Asp53 and pC-NS-p53 as above.
  • pUC18 DNA was used to match the total amount of DNA in the transfection groups.
  • the vector contains a neomycin resistance gene which allows selection of transfected cells under neomycin. After 24 h of incubation, the transfected populations were seeded in 100 mm culture dishes in increasing cell density and 1 mg / ml G418 (neomycin) was added. Under these conditions, non-transfected (non-neomycin resistant) cells die progressively. After 3 weeks of incubation, the clonogenic adult colonies of the surviving clones were counted.
  • medulloblastomas D283, TE378, DAOy Epidermoid carcinoma A431, osteosarcoma SAOS-2, melanoma Mel6, MelHo, MU3; Breast carcinomas MB231, MCF7, hepatocellular carcinomas HepG2, Hep3b, HUH7.
  • the glioma cell line G-112 was transient with pC-ASp53 (lanes 1 and 3), with the empty vector pCDNA-3.1 (lanes 2 and 5) or with the vector pUC18 containing non-coding DNA (lane 3 and 6) transfected.
  • the lysates of the transfected cells were analyzed in a Western blot with the p53 specific antibody DO-1 (lanes 1-3) or PAb421 (lanes 4-6) were analyzed.
  • the arrows mark the position of the endogenous cellular humNS-p53 - or the recombinant humAS-p53 protein.
  • Figure 2d humNS-p53 and humAS-p53 protein was synthesized in vitro using a reticulocyte lysate transcription / translation system (Promega).
  • the proteins of the in vitro translation were Western blotted with the N-terminal p53 antibody DO-1 (aa 21-25), the antibody against the core domain pAb240 (aa 231-217) and the C-terminal antibody PAb421 (aa 371-380) analyzed.
  • the position of a 51.4 Kda marker for molecular weights was marked in lane "M".
  • the antibody DQT-10 generated against an oligopeptide of humAS-p53 specifically recognizes humAS-p53 (lanes 1 and 7), but not humNS-p53 (lanes 2 and 8).
  • the proteins in lanes 1-4 were synthesized by in vitro translation, the proteins in lanes 5 and 7 originate from the transient transfection of G-112 glioma cells with humAS-p53.
  • Lanes 6 and 8 show control lysates of G-112 cells transiently transfected with the empty control vector pcDNA3.1.
  • the cell line G-112 constitutively expresses a mutated p53 protein as a result of a known hot spot P53 mutation.
  • humAS-p53 protein in various human tumors. Lysates were prepared from established cell lines and immunoprecipitation was carried out with DQT-10 antibodies. The humAS-p53 protein immunoprecipitated by DQT-10 was detected in the Western blot with the p53-specific antibody DO-1. In each experiment, the p53 negative cell line SAOS-2 was included as a control.
  • G-112 G-168, U-87, U-251 (human ne glioblastoma lines), SAOS-2 (osteosarcoma), MCF7 (breast cancer), T47D (breast cancer), A431 (epidoid cancer), HuH7 and HepG2 (hepatocellular cancer).
  • humAS-p53 Subcellular distribution of the humAS-p53 after transient transfection.
  • the p53-negative cell line SAOS-2 was transfected with humAS-p53 and immunostained with the DO-1 antibody.
  • humAS-p53 appears in the nucleus of the cells four hours after transient transfection.
  • Figure 6a humAS p53 protein does not transactivate the known p53 target genes p21 and mdm2.
  • SAOS-2 cells were transiently transfected with pC-p53-DNA or with pC-AS-p53-DNA. The cellular lysates were analyzed in a Western blot with specific p53, p21 or mdm2 antibodies.
  • SAOS-2 cells were transfected with vectors expressing wild-type p53, mutant p53 273h, humAS-p53 and the activity of a luciferase reporter gene measured under the control of the p21 promoter.
  • the interaction of humAS-p53 and humNS-p53 was analyzed with the help of coexpression.
  • Elecrophoretic Mobility Shift Assays with in vitro synthesized humNS-p53 (1 and 3) and humAS-p53 protein
  • PAb421 can increase the sequence-specific binding of p53, whereas DO-1 antibodies only lead to a super Shift lead (TR Hupp, DP Lane, KL Ball, Biochem. J., 352, 1-17, 2000).
  • humAS-p53 The influence of humAS-p53 on the DNA binding of humNS-p53 in EMSA.
  • Experimental conditions identical to those in Fig. 7 were chosen. Oligonucleotides with a p53 binding site of the p21 promoter were incubated with humNS-p53 alone (1) or in the presence of humAS-p53 (lane 3). The specific complex of humNS-p53 and the DNA undergoes a super-shift after the addition of the antibody PAb421 (lane 4). Lane 2 shows DNA that was only incubated with humAS-p53.
  • Transient transfection of the p53-negative cell line SAOS-2 with humAS-p53, humNS-p53 and co-transfection with humAS-p53 and humNS-p53 In comparison to the control transfected with the empty vector, in contrast to the humAS-p53, humNS-p53 suppresses the growth of tumor colonies in the "Colony Formation Assay". Cotransfection of both p53 forms shows an inhibition of the humNS-p53-dependent growth suppression by humAS -p53.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Protein humAS-p53, das eine Splicing-Variante des humanen Wildtyp-p53­-Proteins ist und die durch das Wildtypprotein vermittelte Transaktivierung von Genen stark inhibiert. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Wechselwirkung des Tumorrepressors humNS-p53 und seiner Homologen p63 und p73 mit der Splicing-Variante humAS-p53 beeinflussen, sowie die Verwendung dieser Substanzen zur Herstellung pharmazeutischer Präparate zur Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt werden.

Description

Splicing-Variante des humanen p53-Proteins und deren Verwendung zur Hβrstelluncr pharmazeutischer
Präparate zur Behandlung von Tumorβrkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft das Protein humAS-p53, das eine Splicing-Variante des humanen Wildtyp-p53-Proteins ist und die durch das Wildtypprotein vermittelte Transaktivierung von Genen stark inhibiert. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Wechselwirkung des Tumorsupressors humNS-p53 und seiner Homologen p63 und p73 mit der Splicing-Variante humAS-p53 beeinflussen, sowie die Verwendung dieser Substanzen zur Herstellung pharmazeutischer Präparate zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Beeinflussung p53-abhängiger Funktionen in nicht-neoplastischen Zellen. Stand der Technik
Das Tumorsuppressorgen p53 kodiert einen Transkriptionsfak- tor, der aktiviert wird, wenn Zellen genotoxischem Streß, wie z.B. γ- oder UN-Bestrahlung, Hypoxie, oder zytotoxischen Substanzen ausgesetzt werden. In Abwesenheit solcher Stressoren ist das p53-Protein in normalen Zellen in sehr geringer Konzentration vorhanden und besitzt eine sehr kurze Halbwert- zeit. Ein hoher Umsatz des Proteins wird durch proteosomale Degradation im Zytoplasma aufrecht erhalten (R Honda, H Yasu- da, Oncogene, 19, 1473-1476, 2000). Unter Einwirkung von Stressoren wird das p53-Protein schnell stabilisiert und akkumuliert im Zellkern, wo es durch Transaktivierung oder Repression von bestimmten Genen, den p53-Zielgenen, Kontrolle über den Zellzyklus ausübt (G Fulci, Ν Ishii, VanMeir EG, Brain Pathol, 8, 599-613, 1998) . Der Arrest des Zellzykluses oder der Apoptose sind zwei wichtige mögliche funktioneile Folgen einer Aktivierung des p53-vermittelten Signalweges.
Der Zellzyklusarrest und damit ein verlängertes Intervall zwischen Zellteilungen bilden die Grundlage, die es der zellulären Reparaturmaschinerie erlaubt, Schäden der DNA, die durch Stressfaktoren (z.B. Bestrahlung) verursacht wurden, zu korrigieren und damit zu verhindern, daß diese unerwünschten Veränderungen der DNA im Genom kumulieren und in folgenden Zellgenerationen propagiert werden (DP Lane, Nature, 358, 15- 16, 1992; AJ Levine, Cell, 88, 323-331, 1997; KM Ryan, AC Phillips, KH Vousden, Curr. Opin. Cell Biol . , 13, 332-337, 2001) . Ein Bestandteil dieses Mechanismus ist die Elimination von Zellen mit nicht-reparablen DNA-Veränderungen durch den programmierten Zelltod, die Apoptose. In diesem Sinne ist eine der wesentlichen Funktionen des p53-Proteins das Erkennen von DNA-Schäden und damit die Aufrechterhaltung der Integrität des gesamten Genoms . Am deutlichsten konnte diese Funktion des p53 -Proteins als "Guardian of the Genome" (DP Lane, Nature, 358, 15-16, 1992) in p53 -Knockout-Mäusen ge- zeigt werden, die zunächst eine normale Entwicklung durchlaufen und einen normalen Phenotyp zeigen. Allerdings zeigen diese Tiere eine deutlich höhere Frequenz und ein früheres Auftreten spontaner und induzierter maligner Tumore. Ganz ähnlich prädisponieren Mutationen der Keimzelllinie beim Menschen, das sog. Li-Frumeni-Syndrom, zum Auftreten multipler maligner Tumore in ungewöhnlich jungem Lebensalter in den betroffenen Familien (M Hisada, JE Garber, CY Fung, JF Frau- meni Jr. , FP Li, J Natl. Cancer Inst., 90, 606-611, 1998; KE Nichols, D Malkin, JE Garber, JF Fraumeni Jr. , FP LI, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. , 10, 83-87, 2001). Dieser Zusammenhang zwischen Krebsentstehung und funktioneller Inaktivie- rung des Tumorsuppressors p53 ist zweifelsfrei nachgewiesen. In menschlichen Tumoren ist p53 das am häufigsten mutierte Gen mit Mutationsraten um 50% in den verschiedenen Tumorenti- täten (SP Hussain, CC Harris, Mutat. Res . 428, 22-23, 1999) . Die Mehrzahl der häufig gefundenen Mutationen liegt in der DNA-Bindungsdomaine des Proteins (sog. Hot-Spot-Mutationen) , die die Fähigkeit des Proteins bestimmt, spezifisch DNA- Regionen innerhalb der Promotersequenzen von Zielgenen zu binden, was die Grundvoraussetzung zur Aktivierung dieser Gene darstellt (Y Cho, Gorina S, PD Jeffrey, NP Pavletich, Science, 265, 346-355, 1994; T Soussi, C Beroud, Nature Rev. Cancer, 1, 233-240, 2001) . Die direkte Konsequenz dieser Hot- Spot-Mutationen ist demnach der Verlust der Transaktivierung der Zielgene, was einem Funktionsverlust des mutierten Tumor- suppressors (loss of function) gleich kommt. Dieser Funktionsverlust ist eines der möglichen Ergebnisse einer Mutation im p53-Gen. Allerdings ist auch ein Zugewinn einer neuen (pathologischen) Funktion in mutierten p53 -Formen, ein sog. "gain of function", gezeigt worden, die mit einem erhöhten tumorigenen Potential einhergeht. Zum Beispiel hat die p53- Mutante R175H die Fähigkeit verloren, das p21-Gen, ein Zellzyklus- und p53-Zielgen, zu aktivieren, jedoch die Fähigkeit neu gewonnen, das Multi-Drug-Resistance-Gene mdr2 zu aktivieren (K-V Chin, U Kazumitsu, I Pastan, MM Gottesmann, Science, 255, 459-462, 1992). Eine erhöhte Expression von mdr2 geht mit einer verminderten Ansprechrate von Tumoren auf Chemotherapeutika und einer schlechteren Prognose der betroffenen Tumorpatienten einher (J Sa path, D Sun, VJ Kidd, J Grenet, A Gandhi, LH Shapiro, Q Wang, GP Zambetti, JD Schuetz, J. Biol. Chem. , 39359-39367, 2001).
Eine funktionelle Inaktivierung von p53 kann auch ohne Auftreten einer Mutation durch eine Vielzahl von Mechanismen zustande kommen. In Neuroblastomzeilen ist das nicht-mutierte p53-Protein (Wildtyp) oft durch eine Sequestrierung des Proteins in das Zytoplasma durch einen hyperaktiven Exportmechanismus aus dem Zellkern funktioneil inaktiviert (JM Stommel, ND Marchenko, GS Ji enez, UM Moll, TJ Hope, GM Wahl, EMBO J. , 18, 1660-1672, 1999) . Ein anderer Mechanismus ist in Tumoren mit einer Amplifikation des mdm2-Gens aktiv (J Momand, D Jung, S Wilczynski, J Niland, Nucl. Acids Res . , 26, 3453- 3459, 1998) . mdm2 ist ein physiologischer Gegenspieler von p53, der das N-terminale Ende des p53-Proteins bindet und damit die Transkription blockiert. Weiterhin fungiert mdm2 als eine E3-Ubiquitinligase, die durch Ubiquitinisierung und Bereitstellung des p53-Proteins für die proteosomale Degradation im Zytoplasma die Stabilität des p53 -Proteins negativ reguliert (M Haupt, A Maya, A Kazaz, M Ohren, Nature, 387, 296-299, 1997) .
Wegen seiner kritischen Rolle in der Suppression der Tumori- genität ist p53 ein äußerst wichtiges molekulares Ziel, z.B. in der experimentellen und klinisch-pharmakologischen Krebsforschung (KH Vousden, GF Woude, Nat. Cell Biol., 2, 178-180, 2000) . Die Entwicklung zahlreicher Anti- umortherapien zielt deshalb auf die Wiederherstellung der Funktion von p53 in Tumorzellen ab und stellt derzeit ein sehr aktives und sich schnell entwickelndes Forschungsgebiet dar. In Abhängigkeit von den inaktivierenden Mechanismen werden verschiedene Strategien verfolgt. Für Tumore mit inaktivierenden Mutationen ist das mutierte Protein ein mögliches Ziel. Kleine basische Peptide können in gewissem Rahmen in experimentellen Systemen die Wildtypfunktion des Proteins wiederherstellen (G Seliva- nova, L Ryabchanko, E Jansson, V Iotsova, KG Wil an, Mol. Cell. Biol., 19, 3395-3402, 1999). In Tumoren mit funktionell inaktiviertem p53 -Protein ohne nachweisbare Mutationen kann unter Umständen die Wildtypfunktion wiedererlangt werden, indem Moleküle beeinflußt werden, die mit der p53- Wildtypfunktion interferieren. Zum Beispiel kann die Zugabe von niedermolekularen Peptiden, die eine mdm2-Bindungsstelle für p53 blockieren, p53 aus dem inhibierenden mdm2-Komplex freisetzen und damit funktioneil reaktivieren (TR Hupp, DP Lane, KL Ball, Biochem. J., 352, 1-17, 2000) . Zu diesem Zeitpunkt ist das mdm.2-Protein der einzige bekannte zelluläre Faktor, der direkt mit der p53-Funktion durch Inhibierung der Transaktivierung interferiert .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, weitere, zur Wiederherstellung der p53 -Funktion geeignete Substanzen bereitzustellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Splicing-Variante humAS-p53 des humanen Wildtyp-p53 -Proteins (humNS-p53) gelöst, die erstmals als Inhibitor des humanen p53 -Proteins identifiziert wurde.
Beschreibung der Erfindung:
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise erstmals ein neuer Inhibitor des Wildtyp-p53-Proteins in normalen sowie in tumorösen Zellen des Menschen experimentell nachgewiesen. Dieser Inhibitor wurde als eine Splicing- Variante (humAS-p53) des humanen Wildtyp-p53 -Proteins (humNS- p53) identifiziert. Die Sequenz von humNS-p53 ist in SEQ ID NO:l dargestellt. Bei der Angabe "SEQ ID NO:" handelt es sich um die jeweiligen Sequenzkennzahlen im Sequenzprotokoll gemäß WIPO Standard ST.25.
Eine alternative Splicing-Form von NS-p53 wurde bereits in murinen Systemen nachgewiesen, wo ein alternatives Splicing des Transkripts zwischen den Exons 10 und 11 erfolgt und in einem verkürzten p53 -Protein resultiert (D Wolf, N Harris, N Goldfinger, V Rotter, Mol. Cell. Biol., 5, 127-132, 1985). Diese murine Splicing-Form des Proteins (mAS-p53) unterscheidet sich von der normalen Splice-Form in Mäusen (mNS-p53) durch das Fehlen von 17 C-terminalen Aminosäuren. Diese Splicing-Form des p53 scheint auf Mauszellen beschränkt zu sein. Trotz zahlreicher Untersuchungen konnten dieses bzw. ein homologes Protein in anderen Spezies, einschließlich des Menschen, bislang nicht nachgewiesen werden (vgl. K Will, G Warnecke, S Bergmann, W Deppert, Nucl. Acids . Res . 23, 4023- 4028, 1995; M Laverdiere, J Beaudoin, A Lavigueur, Nucl. Acids. Res., 28, 1489-1497, 2000).
In menschlichen Zellen konnte mittels PCR zwar ein von der murinen Form abweichendes Splicing-Transkript (humAS-p53) nachgewiesen werden, das die in SEQ ID NO: 2 beschriebene Sequenz aufweist, und das durch eine Insertion eines neuen Exon 91 zwischen Exon 9 und Exon 10 entsteht (JM Flaman, F Wari- del, A Estreiσher, A Vannier, JM Limacher, D Gilbert, R Iggo, T Frebourg, Oncogene, 12, 813-818, 1996).
Ein Translationsprodukt des Splicing-Transkripts wurde in menschlichen Zellen bislang weder isoliert noch nachgewiesen, und aus diesem Grund hat die humane Splicing-Variante humAS- p53 im Stand der Technik wenig Beachtung gefunden. Da die humAS-p53-cDNA ursprünglich in einem hefebasierenden funk io- nellen Transkriptionsassay (Yeast Functional Assay) identifiziert wurde, blieben zusätzlich Zweifel, ob die humAS-p53- cDNA nicht ein Rekombinationsprodukt aus der Hefepropagierung hätte sein können. Weiterhin war nur ein Transkript des humAS-p53 durch RT-PCR, nicht aber das entsprechende Protein in humanen Zellen nachgewiesen worden. Aus diesen Gründen blieb bislang unklar, ob überhaupt eine Translation des endogenen alternativen Transkripts in Zellen in vivo stattfindet . Die auf RT-PCR basierenden Untersuchungen führten zu der Schlußfolgerung, daß humAS-p53 -Transkripte nur in ruhenden (quiescent) Zellen vorkommen und dieses Transkript in Tumorzellen demnach keine Rolle spielt (JM Flaman, F Waridel, A Estreicher, A Vannier, JM Limacher, D Gilbert, R Iggo, T Fre- bourg, Oncogene, 12, 813-818, 1996) .
Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung nun erstmals das Protein humAS-p53 nachgewiesen, das die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist und damit um 52 Aminosäuren kürzer ist als das normale p53- Protein (humNS-p53) , jedoch 10 neue Aminosäuren am C- terminalen Ende besitzt.
Gegenstand der Erfindung ist daher das Protein mit der in SEQ ID NO: dargestellten Sequenz. Bis zur Splicing Site (Aminosäure 330) des humAS-p53 Proteins ist die Homologie zu humNS-p53 100%. Die Aminosäuren 331-341 des humASp53 haben keine Homologie zu humNS-p53 oder zu murinem AS-p53.
Ferner eingeschlossen sind Homologe des humASp53 , die im Bereich des Sequenzabschnitts von Aminosäureposition 331-341 eine Homologie von mehr als 70 %, vorzugsweise mindestens 90 % und am meisten bevorzugt 95 %, aufweisen, sowie Derivate und Fragmente des Proteins, die dieselbe oder im wesentlichen die gleiche physiologische Wirkung wie die Variante humAS-p53 haben. Unter Derivaten werden vorliegend Verbindungen verstanden, bei denen einzelne Aminosäuren modifiziert sind und sich somit von den natürlicherweise vorkommenden Aminosäuren unterscheiden.
Die Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäure, die für ein oben genanntes Protein, ein Homologes oder Fragment kodiert.- Erfindungsgemäß eingeschlossen sind Vektoren, die eines oder mehrere der genannten Nukleinsäuremoleküle enthalten, ein- schließlich eines Vektors, der die in SEQ ID NO:l dargestellte Sequenz des humAS-p53 einschließt. Bei dem Vektor handelt es sich vorzugsweise um einen Expressionsvektor.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, vorzugsweise isolierte und/oder kultivierte Wirtszellen, die mit einem zuvor genannten Vektor transformiert sind, wobei es sich insbesondere um Wirtszellen handelt, die die erfindungsgemäßen Proteine exprimieren. Die Wirtszellen liegen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, in Form einer Expressionskultur vor, wobei eukaryontische Zellen, wie z.B. menschliche und Säugetierzellen (z.B. für Knock-Out- oder Knock-In-Modelle) und Insektenzellen für die Expression von rekombinanten Proteinen
(Baculovirale Konstrukte), bevorzugt sind.
Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Herstellung der genannten Proteine, bei dem man die Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression des Proteins geeignet sind. Entsprechende Protokolle sind dem Fachmann wohlbekannt. Vorzugsweise werden die Proteine anschließend vor der weiteren Verwendung isoliert und gegebenenfalls weiter aufgereinigt . Mit den so erhaltenen Proteinen lassen sich nach bekannten Verfahren Antikörper erzeugen, wobei es möglich ist, solche Antikörper zu isolieren, die spezifisch an das oder die erfindungsgemäßen Proteine wie im Anhang aufgelistet, nicht aber an das humane p53 -Protein binden. Bei den Antikörpern kann es sich um polyklonale oder monoklonale Antikörper handeln, und dem Fachmann sind die Verfahren zu deren Erzeugung geläufig.
Wie erwähnt wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals gezeigt, daß das humAS-p53-Transkript mit der in SEQ ID NO: 4 beschriebenen Sequenz auch in proliferierenden Zellen vorkommt . Der Nachweis erfolgte durch konventionelle und quantitative RT-PCR-Analyse. Gesamt-RNA-Proben von kultivier- ten menschlichen nicht-neoplastischen Zellen und Tumorzellen wurden mit Hilfe spezifischer Primer auf die Expression des humAS-p53 -Transkripts hin untersucht (Abb. 1) . Zusätzlich wurde RNA aus Biopsien menschlicher Hirntumore und normaler Hirnsubstanz analysiert. Diese Untersuchungen zeigen, dass humAS-p53 sowohl in normalen Zellen als auch in hochprolife- rativen Zellen aus Tumoren exprimiert wird (Abb. 1) . Diese Daten stehen im Widerspruch zu einer früheren Beobachtung, die dieses Transkript nur in Zellen aus ruhendem Gewebe (quiescent cells) detektieren konnte und daher keine Bedeutung für neoplastische Gewebe postulierte (JM Flaman, F Wari- del, A Ξstreicher, A Vannier, JM Limacher, D Gilbert, R Iggo, T Frebourg, Oncogene, 12, 813-818, 1996) . Weitere RT-PCR- Daten zeigen, dass generell das humAS-p53-Transkript in deutlich geringerer Konzentration vorliegt als das humNS-p53- Transkript .
Um die Expressionsprofile von humAS-p53 genauer zu untersuchen, wurden die Transkripte von humAS-p53 und humNS-p53 mit Hilfe einer quantitativen RT-PCR (real time QRT-PCR) in kultivierten normalen Astrozyten, Gliomzellkulturen, sowie in normaler Hirnsubstanz und einem Spektrum von glialen Tumoren unterschiedlicher Malignitätsgrade untersucht. Diese Untersuchungen bestätigten die oben dargestellten RT-PCR-Daten und zeigen, daß das humAS-p53-Transkript in allen Proben in geringerer Konzentration als das humNS-p53 -Transkript vorliegt. Allerdings existiert ein breites Spektrum an Expressionsprofilen, wenn die Expressionrate von humAS-p53/ humNS-p53 betrachtet wird. Unter den anaplastischen und malignen Hirntumoren fanden sich Biopsien mit deutlich erhöhter humAS- p53/humNS-p53 Expressionsrate. Diese Experimente zeigen weiterhin, daß die humAS-p53/humNS-p53 Expression offenbar in einem koordinierten Verhältnis zur Expression des humNS-p53 steht. Es fand sich eine inverse Korrelation der humAS- p53/humNS-p53-Rate zur Expression von humNS-p53.
Damit findet sich erstmals ein Hinweis, daß die Expression von humAS-p53 nicht einfach ein Nebenprodukt der humNS-p53- Transkription darstellt, sondern offenbar einer spezifischen Regulation unterliegt (vgl. Abbildung 11) .
Zur weiteren Charakterisierung des humAS-p53-Transkripts wurde der Transkriptionsstart untersucht . Es wurde nachgewiesen, daß der Leserahmen (reading frame) des Gens gewahrt bleibt und daß die Initiation der Transkription der beiden Transkripte humAS-p53 und humNS-p53 am selben Codon beginnt. Zur Klonierung des humAS-p53-Transkripts wurde die SMART- Technologie (Switching Mechanism At 5 ' -end of RNA-Transcript, Clontech) verwendet, die eine Amplifikation der 5 ' -Enden der cDNA und damit eine Klonierung des humAS-p53-Transkripts aufgrund der spezifischen, vom humNS-p53-Transkript abweichenden 5 ' -Enden erlaubt. Die Sequenzanalyse der klonierten cDNA zeigt, dass der Leserahmen des Gens in diesem Transkript gewahrt bleibt und daß die Translation des humAS-p53- und des humNS-p53 -Transkripts in Proteinen mit identischem N- terminalen, aber abweichendem C-terminalen Ende resultiert (Abb.2a und 2b). Die humAS-p53-cDNA wurde in den pCDNA3.1- Vektor (Invitrogen) kloniert, der eine Expression des Proteins in Säugetierzellen und zusätzlich eine in vitro- Translation der klonierten cDNA erlaubt . Die auf Grundlage der Sequenzanalyse vorhergesagte Proteinstruktur des erfindungsgemäßen humAS-p53 -Proteins wurde in einer Western-Blot- Analyse durch p53-Antikörper bestätigt, die spezifisch verschiedene bekannte Domänen des Wildtyp-p53 -Proteins erkennen. Dabei wurden der panspezifische Antikörper DO-1 gegen den N- Terminus von humNS-p53 und der für das C-terminale Ende des humNS-p53 spezifische Antikörper PAb421 verwendet. Wie erwartet werden die Proteine humNS-p53 und auch humAS-p53 von dem N-terminalen Antikörper DO-1 erkannt, humAS-p53 aber nicht vom Antikörper PAb421, was auf ein Fehlen der C-terminalen Domäne hinweist. Identische Ergebnisse wurden mit dem in vi- tro-translatierten Protein erzielt (Abb.2c und 2d) .
Weiterhin wurde mit Hilfe eines synthetischen Oligopeptids (DQTSFQKENC) mit Homologie für das C-terminale Ende des humAS-p53 -Proteins ein erfindungsgemäßer polyklonaler Kaninchenantikörper hergestellt, der spezifisch das humAS-p53- Protein mit der in SEQ ID NO: 4 beschriebenen Aminosäurensequenz, nicht aber das humNS-p53-Protein erkennt. Die Spezifi- tät des erfindungsgemäßen Antikörpers (DQT-io) wurde zunächst im Western-Blot analysiert, wobei rekombinantes humAS-p53- Protein verwendet wurde, das entweder aus transienter Expression in humanen Zellen oder aus in vitro-Translation in Ka- ninchenretikulozyten-Lysaten stammt. Diese Experimente zeigen, das der Antikörper DQT-10 spezifisch mit rekombinantem humAS-p53-Protein reagiert, nicht aber mit humNS-p53 -Protein (Abb. 3) . Damit erlaubt dieser erfindungsgemäße Antikörper erstmals im Immunoblot eine Unterscheidung der beiden humanen p53-Formen humNS-p53 und humAS-p53, die Resultat eines alternativen RNA-Splicing-Prozesses sind.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen spezifischen Antikörpers DQT- 10 gegen das humAS-p53 -Protein wurde eine Auswahl von Tumorzelllinien häufiger humaner Malignome auf die Expression des endogenen humAS-p53 -Proteins hin untersucht. Eine Immunpräzi- pitation wurde mit dem DQT-10-Antikörper in Lysaten dieser Zelllinien durchgeführt, gefolgt von einer Western-Blot- Analyse mit DO-1- oder PAb421-Antikörpern. Diese Daten zeigen, daß das erfindungsgemäße humAS-p53-Protein in Lysaten von Tumorzellen unterschiedlicher Gewebeherkunft nachweisbar ist (Abb. 4) . Zu diesen Geweben gehören häufige menschliche Malignome, wie Mamma-Karzinome, Hepatozelluläre-Karzinome, Melanome, maligne Gliome und andere.
Der Einsatz des erfindungsgemäßen spezifischen polyklonalen Antikörpers DQT-10 gegen das erfindungsgemäße Protein humAS- p53 und die Klonierung der humAS-p53-cDNA erlauben eine Aufklärung verschiedener funktioneller Aspekte des humAS-p53- Proteins, das offenbar in der Modulation der p53 -abhängigen Transaktivierung von Genen eine große Rolle spielt : Eine Immunfärbung mit dem DO-1-Antikörper erlaubt die Untersuchung der subzellulären Verteilung des erfindungs- gemäßen humAS-p53-Proteins in p53-defizienten Zelllinien (z.B. SAOS-2-Zellen) nach transienter Transfektion mit humAS-p53 -Protein. Es zeigte sich, daß sich sowohl das humAS-p53- als auch das humNS-p53-Protein 4 Stunden nach Transfektion im Zellkern als nukleares Protein nachweisen lassen (Abb.5). Dies war insofern unerwartet, weil dem humAS-p53-Protein zwei von drei wichtigen Signaldomänen fehlen (nuclear localization Signals, NLS, vergleiche Abb.2a), die den Import des humNS-p53-Proteins in den Zellkern determinieren (JM Stommel, ND Marchenko, GS Ji- menez, UM Moll, TJ Hope, GM Wahl, EMBO J. , 18, 1660-1672, 1999) . Eine Lokalisation des erfindungsgemäßen humAS-p53- Proteins als nukleares Protein im Zellkern ist eine der Voraussetzungen für eine potentielle modulierende Wirkung des humAS-p53 auf die p53-vermittelte Transaktivierung von Genen.
Das erfindungsgemäße humAS-p53 -Protein aktiviert weder p21 noch mdm2, die als Ziel einer Transaktivierung durch den Tumorsuppressor humNS-p53 identifiziert worden sind. Es wurden zwei unabhängige experimentelle Systeme verwendet, um die p53-abhängige Transaktivierung der Zielgene mdm.2 und p21 zu untersuchen. Im ersten System wurde entweder humAS-p53- oder humNS-p53-cDNA transient in der p53-negativen Zelllinie SAOS-2 exprimiert und die Expression von mdm.2- und p21-Protein im Western-Blot mit spezifischen Antikörpern analysiert. Die Expression sowohl von mdm2 als auch von p21 wird erwartungsgemäß durch eine Transaktivierung ausgehend vom transient exprimierten humNS-p53 -Protein induziert, während durch das erfindungsgemäße humAS-p53 -Protein die Expression von keinem dieser beiden Gene induziert wird (Abb. 6a) . In einem zweiten Ansatz wurde ein erfindungsgemäßer und hochsensitiver Reporterassay eingesetzt. Hierbei wird ein Reportergen, bevorzugt wird der Einsatz von Glucuronidase (GUS) oder dem „green fluorescent protein" (GFP) , besonders bevorzugt wird der Einsatz von beispielsweise Luci- ferase, ß-Galactosidase und Cloramphenicoltransferase CAT, unter die Kontrolle des mdm2- oder des p21-Promoters gestellt, um eine mögliche transaktivierende Wirkung des erfindungsgemäßen humAS-p53 -Proteins zu untersuchen. Parallel zu diesem Reportergen-Promoterkonstrukt werden die Zellen mit Vektoren transient transfiziert, die humNS-p53 oder humAS-p53 exprimieren. Eine Transaktivierung des Promoters durch das transient kotransfizierte Protein ist durch eine Expression des Reportergens nachweisbar. Der erfindungsgemäße Reporterassay zeigt in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Western-Blot-Analyse zur endogenen mdm2- und p21-Induktion (Abb. 6a) keine Aktivierung der beiden getesteten Promotoren durch das erfindungsgemäße humAS-p53 -Protein im Gegensatz zu einer Aktivierung beider Promotoren durch das humNS-p53-Protein (Abb. 6b) . Daraus wird geschlußfolgert, dass zumindest in Bezug auf mdm2 und p21, die beide Zielgene einer p53-vermittelten Transaktivierung sind, das humAS-p53- im Gegensatz zum Wildtypprotein keine transaktivierende Wirkung hat . Diese Ergebnisse schließen allerdings nicht aus, daß durch das humAS-p53-Protein ein anderes, von den bekannten p53- Zielgenen unabhängiges Spektrum an Genen transaktiviert wird.
3. Die Wechselwirkung des erfindungsgemäßen humAS-p53- Proteins mit Nukleinsäuren, insbesondere mit DNA, wurde mit einem „Electrophoretic Mobility Shift Assay" (EMSA) untersucht. Als spezifisches DNA-Substrat wird bevorzugt ein Polynukleotid und besonders bevorzugt ein Oligonu- kleotid eingesetzt, das bekannte p53-Bindungsmotive kodiert, in diesem Fall ein p53-Bindungsmotiv des p21- Promoters, an welches das humNS-p53-Protein bekannterma- ßen bindet. Dieses Experiment zeigt, dass ausschließlich das humNS-p53-, nicht aber das humAS-p53-Protein an das Oligonukleotid bindet. Daraus ist ersichtlich, dass das humAS-p53 -Protein nicht dieselben DNA- Bindungseigenschaften wie das Wildtypprotein besitzt (Abb.7) .
Es wurde weiterhin gezeigt, daß das humAS-p53-Protein die spezifische Bindung von humNS-p53 -Protein an solche Promoterregionen hemmt (Abb. 8) . In transienten Transfekti- ons-Experimenten mit einem Konstrukt aus Luciferase als Reportergen unter der Kontrolle des p21-Promoters konnte gezeigt werden, daß in p53-negativen SAOS-2-Zellen die Transaktivierung des p21-Promoters durch das humNS-p53- Protein deutlich vermindert ist, wenn das humAS-p53- Protein in diesen Zellen koexprimiert wird (siehe Abb. 6b) . Analog zu diesen Ergebnissen zeigte sich in LNZ-308- Zellen, die das humNS-p53 -Protein unter der Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promoters exprimieren (M Albertoni, Doktorarbeit, Faculte des Sciences, Universität Lausanne, 2001) , daß eine Koexpression des humAS-p53- Proteins die vom humNS-p53 -Protein vermittelte Transaktivierung inhibiert. Diese Daten zeigen auch, daß die Inhibition der Transaktivierung kein zelltyp-abhängiges Phänomen, sondern eine intrinsische Eigenschaft des humAS- p53-Proteins ist.
4. Durch eine Aktivierung der Transkription von spezifischen Genen, den sogenannten p53-Zielgenen, wird die Zellzy- kluskontrolle durch das humNS-p53-Protein ausgeübt. Die Fähigkeit dieses Proteins zur Transaktivierung anderer Gene wird durch eine Vielzahl von modulierenden Faktoren beeinflußt, von denen die post-translationelle Modifikation des humNS-p53-Proteins und die Interaktion mit anderen Proteinen am besten charakterisiert sind. Protein- Protein-Interaktionen können die p53-vermittelte Transaktivierung fördern, z.B. durch das Protein ref-1, oder in- hibieren, z.B. durch das Protein mdm2. Die Bindung des p53-Proteins an spezifische Promoterregionen (p53- response elements) dieser Zielgene ist die Voraussetzung für die transaktivierende Wirkung. Eine Modulation dieser DNA-Bindung beeinflußt deshalb zwangsläufig die Transaktivierung. Zu den Proteinen, die mit humNS-p53 Wechsel- wirken, gehören die beiden humanen Protein p63 und p73.
5. Die Funktion des humNS-p53 wird in Zellen durch die Splicing-Variante humAS-p53 unterdrückt. Das Zellwachstum sowie die Fähigkeit, in Kolonien auszuwachsen, wurde in Zellen untersucht, die transient mit humAS-p53 und/oder humNS-p53 transfiziert wurden (Colony Formation Assay) . Die transiente Expression von humNS-p53 verursachte erwartungsgemäß eine Wachstumshemmung und eine Herabsetzung der Koloniezahl. SAOS-2 Zellen, die transient humAS-p53 exprimieren, zeigten eine im Vergleich zur Gruppe, die mit dem Kontrollvektor transfiziert wurde, eine etwas verringerte Kolonienzahl. Mit humNS-p53 und humAS-p53 transfizierte Zellen dagegen zeigten eine Verminderung der Kolonienzahl auf 38% der Kontrollgruppe. Dieser Wert lag jedoch um ein Vielfaches über der Kolonienzahl der Zellen, die humNS-p53 allein exprimieren. Diese Daten zeigen, daß die Wachstumshemmung durch humNS-p53 durch Koexpression von humAS-p53 teilweise aufgehoben wird (Abb. 9) . Damit ist humAS-p53 auf funktioneller Ebene ein physiologischer Antagonist der p53-Funktion. Damit ist es dem mdm2-Protein ähnlich, dem einzigen bislang bekanntem Inhibitor mit einer direkter Wirkung auf die p53- vermittelte Transaktivierung.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher unter anderem ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Genen, die von p53 transaktiviert werden, bei dem man
a) oben genannte Wirtszellen, die Zellen einer p53- negativen Zelllinie sind, transient transfiziert,
b) ein zu untersuchendes Gen durch ein Reportergen ersetzt, das unter die Kontrolle des Promoters des ersetzten Gens gestellt wird,
c) das in Stufe b) erhaltene Promotor-Reportergen- Konstrukt in die Wirtszellen kotransfiziert,
d) die Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die zur Genexpression geeignet sind, und man
e) gegebenenfalls die Expression des Reportergens nachweist,
wobei das zu untersuchende Gen als ein von p53 transaktiviertes Gen identifiert wird, wenn man in Stufe e) eine Expression des Reportergens nachweist.
Das verwendete Reportergen kodiert beispielsweise für Lucife- rase (luc) , Glucuronidase (GUS) , "green fluorescent protein" (GFP) , ß-Galactosidase oder Cloramphenicoltransferase CAT.
Eingeschlossen ist ferner ein Verfahren zur in vitro- Untersuchung der Wechselwirkung eines erfindungsgemäßen Proteins mit einer Nukleinsäure, bei dem man
a) die zu untersuchende Nukleinsäuresequenz radioaktiv markiert, man sie
b) mit dem Protein in Kontakt bringt, man
c) die Mischung aus Stufe c) auf ein Gel aufträgt und man
d) eine Gelelektrophorese durchführt, wobei eine Wechselwirkung des Proteins mit der zu untersuchenden Nukleinsäure vorliegt, wenn sich das Laufverhalten der Nukleinsäure im Vergleich zu einer Probe ohne zugegebenes Protein als Vergleichsprobe verändert.
Das vorliegende Verfahren (Electomobility Shft Assay. EMSA) erlaubt Untersuchungen von Doppelstrang-DNA von Sequenzen zwischen 25-300bp die entweder synthetischen Oligonucleotiden oder natürlichen DNA-Fragmenten entsprechen können. Hier verwendet werden Sequenzen, die eine Bindungsstelle für p53 erkennen lassen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die geeignet sind, die Wechselwirkung eines erfindungsgemäßen Proteins mit dem humanen Protein p53, p63 oder p73 zu beeinflussen, bei dem man
a) das erfindungsgemäße Protein markiert,
b) humanes Protein p53 , p63 oder p73 markiert,
c) die markierten Proteine von Stufe a) und Stufe b) miteinander in Kontakt bringt und eine Messung zur Bestimmung des/der Markersignals/Markersignale durchführt,
wobei die Markierungen so gewählt sind, daß eine Wechselwirkung der markierten Proteine von Stufe a) und b) nachweisbar und von den isolierten, markierten Proteinen durch Änderung des/der Detektions- signals/Detektionssignale unterscheidbar ist, man
d) die Mischung von Stufe c) mit einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt bringt und man
e) eine weitere Messung zur Bestimmung des/der Marker- signals/Markersignale durchführt,
wobei die zu untersuchende Substanz eine die Wechselwirkung beeinflussende Substanz ist, wenn sich das (die) in Stufe e) gemessene (n) Markersignal (e) von dem (den) in Stufe c) gemessenen Markersignal (en) unterscheidet.
Das vorstehend genannte Verfahren kann beispielsweise durchge- ' führt werden, indem die Marker in den Stufen a) und b) unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe sind, wobei man jeweils einen Reporterfärbstoff und einen Quencherfarbstoff verwendet, die bei Wechselwirkung der Proteine in Stufe c) zu einem Fluoreszenz-Resonanz-Transfer (FRET; vgl. Heid et al . , Genome Res. 6 (1996) 986-994) führen.
Die oben beschriebenen Verfahren werden nachfolgend auch als "Screening-Verfahren" bezeichnet, da mit deren Hilfe eine Vielzahl von potentiellen Wirkstoffen, z.B. aus bestehenden Substanz-Bibliotheken, auf ihre Eigenschaft hin untersucht werden können, ob sie die Wechselwirkung zwischen den humanen Proteinen p53, 63 und/oder p73 und der erfindungsgemäßen Splicing-Variante beeinflussen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann man das Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die geeignet sind, die Wechselwirkung eines erfindungsgemäßen Proteins mit dem humanen Protein p53, p63 oder p73 zu beeinflussen, durchführen, wenn .man einen Bindungsassay durchführt, indem man entweder
a) das erfindungsgemäße Protein oder
b) das humane Protein p53 , p63 oder p73
auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert,
c) das jeweils andere Protein markiert und es mit dem immobilisierten Protein in Kontakt bringt, wobei man das Vorliegen einer Wechselwirkung zwischen den in a) und b) genannten Proteinen nach Durchführung entsprechender Waschschritte durch Nachweis der Markierung bestätigt, man
d) die Proteine mit der zu untersuchenden Substanz in Kontakt bringt,
wobei die zu untersuchende Substanz eine die Wechselwirkung beeinflussende Substanz ist, wenn die Markierung nach Zugabe der zu untersuchenden Substanz und Durchführung entsprechender Waschschritte auf den Mikrotiterplat- ten nicht mehr nachweisbar ist .
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Substanz, die die Wechselwirkung eines erfindungsgemäßen Proteins mit dem humanen Protein p53, p63 oder p73 beeinflußt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Beeinflussung p53 abhängiger Funktionen in nicht-neoplastischen Zellen.
Im Hinblick auf nicht-neoplastische Zellen weisen die im Rah- ' men der vorliegenden Erfindung erhaltenen Daten darauf hin, daß AS-p53 durch die Wechselwirkung mit NS-p53 eine Onkogene- potenz hat. Eine antagonistische Wirkung von AS-p53 auf die physiologischen p53-Funktionen könnte demnach einen beschleunigten Zeilzyklus in normalen Zellen zur Folge haben, d.h. eine höhere Wachstumsrate, wobei nach Einwirkung DNA- schädigender Noxen durch mangelnden ZeilZyklusarrest eine verminderte Zeitspanne zur DNA Reparatur zur Verfügung stünde, mit der möglichen Folge, daß es zu einer Kumulation von DNA Schäden kommt.
In diesem Zusammenhang ist ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Beeinflussung p53-abhängiger Funktionen in nicht-neoplastischen Zellen eingeschlossen, bei dem man ein oben genanntes Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die geeignet sind, die Wechselwirkung eines erfingungsgemä- ßen Proteins mit dem humanen Protein p53, p63 oder p73 zu beeinflussen, durchführt und man die Substanz, die als eine diese Wechselwirkung beeinflussende Substanz identifiziert ist, mit geeigneten Hilfs- und/oder Trägerstoffen zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.
Demgemäß betrifft die Erfindung ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine nach einem oben genannten Scree- ning-Verfahren erhältliche bzw. identifizierte Substanz und pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält.
Zusammenfassung der wesentlichen Vorteile der Erfindung:
Das erfindungsgemäße Protein humAS-p53 zeichnet sich dadurch aus, daß sein Transkript erstmals neben dem schon bekannten Vorkommen in humanen normalen, ruhenden Zellen auch in pro- liferativen Zellen nachweisbar ist. Bislang fanden sich im Stand der Technik keine Berichte über die Expression von hu- mAS-p53 in kultivierten Tumorzellen oder Tumorbiopsien. Neben dem RNA-Transkript konnte das humAS-p53-Protein im Rahmen der vorliegenden Erfindung überraschenderweise erstmals sowohl in kultivierten Tumorzelllinien, als auch in Biopsien der häufigsten menschlichen malignen Tumore nachgewiesen werden. Die Expression des humAS-p53 scheint in Tumorzelllinien oder Tumorbiopsien generell höher als in normalen Zellen oder nicht neoplastischen Geweben zu sein. Diese Daten weisen auf die Bedeutung von humAΞ-p53 für neoplastische Zellen hin, da die Expression von humAS-p53 und humNS-p53 koordiniert und nicht zufällig ist. Ein Protein mit einem inhibitorischen Effekt auf die Wirkung eines so bedeutenden Tumorsuppressorgens wie dem humNS-p53 liegt idealerweise in gesunden Zellen in geringen physiologischen intrazellulären Konzentrationen vor. Dies konnte für das humAS-p53 -Protein beobachtet werden.
Verschiedene Eigenschaften des humAS-p53 deuten auf eine on- kogene Funktion dieses Proteins in Tumorzellen hin:
l.Eine Überexpression von humAS-p53 erlaubt es Tumorzellen, die Wachstumsinhibierende Wirkung des Wildtypproteins humNS-p53 zu überwinden (Abb. 9) .
2.humAs-p53 inhibiert die Transaktivierung von Genen durch humNS-p53, die eine essentielle Voraussetzung für die Ausübung der Kontrollfunktion des humNS-p53 im Zellzyklus und während der Proliferation ist (Abb. 6) .
3.humAS-p53 inhibiert die DNA-Bindung von humNS-p53, was eine Voraussetzung für die Regulation der Transkription von Genen ist, die durch humNS-p53 transaktiviert werden (Abb .7 ) .
Die Mechanismen, die zur Inaktivierung von humNS-p53 und damit zum Verlust der Wachstumskontrolle trotz eines intakten humNS-p53-Proteins führen, sind bislang weitestgehend unbekannt. In diesem Zusammenhang und im Hinblick auf eine mögliche Entschlüsselung wichtiger Domänen für die Bindung des humAS-p53-Proteins an andere Proteine stellt das erfindungsgemäße humAS-p53-Protein eine neue Möglichkeit- zur Entwicklung von Substanzen dar, die die Wechselwirkung z.B. des hu- mAS-p53- mit dem humNS-p53 -Protein sowie dessen Homologen p63 und p73 beeinflussen und deren physiologische Funktion wiederherstellen. Solche Substanzen stellen eine neue Klasse von pharmakologischen Anti-Tumormodulatoren dar.
Eine direkte Suche nach solchen Substanzen, die das onkogene Potential des humAS-p53-Proteins unterdrücken könnten, ist durch eine direkte Messung dieser spezifischen biologischen Parameter der humAs-p53 Funktion auf der Grundlage der obigen Beobachtungen (1-3) möglich. So sind folgende Parameter für ein erfindungsgemäßes Screening anwendbar:
a. Messung der Wachstumsraten von gentechnisch veränderten, humAS-p53 stabil oder konditional überexprimierender Zellen (Colony Formation Assay) , b. Messung der Aktivität von Promotor- Reportergenkonstrukten, bei denen der Promoter von Genen stammt, die Ziel der p53 -vermittelten Transktivierung sind, in gentechnisch veränderten, humAS-53 stabil oder konditional überexprimierender Zellen, c. Messung der p53-spezifischen DNA-Bindungsaktivität in zellfreien Systemen mit rekombinantem humAS-p53 in Verbindung mit einem rekombinanten Proteine mit p53- Aktivität aus der Gruppe humNS-p53, p63 oder p73.
Diese Parameter sind für ein erfindungsgemäßes Screening im Format des High Throughput Screening (HTS) (Turconi, High Throughput Screening 3: A Supplement to drug discovery today, 1, 27-39, 2001) geeignet und erlauben damit die Untersuchung einer hohen Zahl von Kandidatensubstanzen in kurzer Zeit (Abb. 10) . Basierend auf der funktioneilen Ähnlichkeit und Strukturhomologie von humNS-p53 bzw. humAS-p53 und p63 sowie p73 wird ein solches erfindungsgemäßes Screening auf die Interaktion von humAs-p53 mit den humNS-p53 -homologen Proteinen p63 und p73 ausgedehnt . Aufgrund der vorliegenden Daten weist humAs-p53 alle Voraussetzungen eines physiologischen Inhibitors dieser Proteine auf:
l.humAS-p53 enthält eine DNA-Bindedomäne, die eine Interaktion auch mit diesen Proteinen zulässt
2.humAS-p53 besitzt keinen C-Terminus und keine Oligoraer- isationsdomäne, die inhibierend auf die Interaktion mit p63 oder p73 wie im falle von humNS-p53 wirkt.
Das erfindungsgemäße Protein ist somit ein neues molekulares Target für eine Modulation der Transaktivierung von Genen, die durch das humNS-p53-Protein vermittelt wird und eine wichtige Rolle in der Genese und Progression von Tumoren spielt. Dieses Protein wurde erstmals in gesunden und in proliferierenden Zellen nachgewiesen. Es ist eine Splicing- Variante des Wildtypproteins humNS-p53 und inhibiert dessen transaktivierende Wirkung, wie in einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Hilfe von Reportergenen nachgewiesen werden konnte .
Die Interaktion dieser beiden Proteine, sowie die Interaktion des humAS-p53 mit den Homologen p63 und p73 des humNS-p53 stellen erstmals Screeningverfahren zur Verfügung, die es erlauben, pharmakologische Modulatoren dieser Wechselwirkung zu identi izieren. Diese Modulatoren bieten das Potential zur Entwicklung eines pharmazeutischen Wirkstoffs zur Behandlung von solchen Krebserkrankungen oder Beeinflussung p53 abhängiger Funktionen in nicht-neoplastischen Zellen, denen keine Mutation des humNS-p53-Proteins zugrunde liegt, in denen aber möglicherweise eine funktioneile Inhibierung durch die Splicing-Variante humAS-p53 Ursache der gestörten p53- Funktion ist. In Systemen mit mutiertem p53, wie z.B. in vielen menschlichen Tumoren ist ebenfalls das humAS-p53 mutiert (ASmt-p53) . Die funktionellen Konsequenzen der Interaktion der mutierten Proteine von ASmt-p53 und NSmt-p53 sind bislang unbekannt. Modulatoren der Interaktion von As-p53 und NS-p53 könnten aber ebenfalls mit der Funktion einiger mutierter p53 Proteine (Gain of Function) interferieren und therapeutisch nutzbare Wirkung haben. Eine Restitution der p53-Funktion in Tumoren ohne p53 -Mutation könnte therapeutisch eine verminderte Wachstumsrate bedingen, in diesen Tumoren eine Sensibi- lisierung für Apoptose und Apoptose-induzierende Chemothera- peutika bewirken sowie die Strahlensensibilität verbessern.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben. Beispiele
Klonierung und Sequenzanalyse des humAS-p53
Aus normalen menschlichen Astrozyten wurde mit dem Po- ly (A) Pure Kit (Ambion) polyA+"RNA isoliert . Die cDNA des humAS-p53 wurde durch J2apid Amplification of cDNA Shds (RACE) mit Hilfe des SMART™ RACΞ cDNA Amplification-Kits (Clontech Laboratories, Inc.) nach den Angaben des Herstellers synthetisiert. Die synthetisierte cDNA wurde auf einem Gel aufgereinigt und dann mit einem GFP Fusion TOPO TA Expressions-Kit (Invitrogen) in den Expressionsvektor pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO kloniert. Das klonierte Produkt wurde mit Primernpaaren, die spezifisch für humAS-p53 (E9fw + E9-(i)rev und E2fw + E9- (i)rev ) oder panspezifisch für humAS-p53 und humNS-p53 waren (E9fw + ElOrev und E2fw + ElOrev) charakterisiert. Die Integrität des Überganges der TA-Klonierungssequenz und des 5'- Endes der humAS-p53-cDNA wurde durch Sequenzierung mit einem vektorspezifischen Primer (pCDNAfw) bestätigt.
PCR- Primer Sequenzen:
E9fw: 5' -ggagaatatttcacccttc-3' (SEQ ID 0:7)
E9- (i)rev: 5' -ggcaaagtcatagaaccattttcatgctctc-3 '
(SEQ ID NO: 8) E2fw: 5' -gggtcactgccatggagg-3' (SEQ ID O:9) ElOrev: 5' - tggagtgagccctgctccc-3 ' (SEQ ID NO:10) pCDNAfw: 5 ' - gggcggtaggcgtgtacggtgg-3 ' (SEQ ID NO: 11)
RT-PCR Detektion von humAS-p53
Für die Analyse des humAS-p53 und humNS-p53-Transkripts wurde RNA aus Zellkulturen und aus Gewebe von normalem Hirn und Hirntumoren isoliert. Für kultivierte Zellen wurde eine sub- konfluente lOOmm-Petrischale verwendet, nach Waschen der Kulturen in PBS wurden die Zellen mit 1ml TriStar lysiert und 0.2 ml Chloroform hinzugegeben. Nach Zentrifugieren erfolgte die Fällung der Gesamt-RNA mit 0.5 ml Isopropanol, dann wurden die RNA-Pellets in 20 μl DEPC-H20 aufgenommen. Für die Gesamt-RNA-Extraktion aus Tumoren oder Hirngewebe wurde 100 mg Gewebe verwendet und unter identischen Bedingungen ly- siert, jedoch zusätzlich mit einem Glashomogenisator behandelt. cDNA wurde mit 0.2 μg Random-Primern unter Einsatz von 5 μg Gesamt-RNA jeder Probe mit Hilfe eines Ready-To-Go™ Kits (Pharmacia Biotech) synthetisiert. Die Primersequenzen für humAS-p53 (E9fw + E9-(i)rev)) und humNS-p53 (E9fw + ElOrev) wurden nach Sequenzanalyse für die spezifischen RNA- Abschnitte gewählt. Die PCR-Amplifikation erfolgte mit 1 μl Produkt der RT-Reaktion, 2 μM der jeweiligen Primer (10 μM) , 2 μl dNTP (2.5 μM) und 0.1 μl AmpliTaq Gold Poly erase (Röche) in PCR-Puffer in einem Endvolumen von 20 μl. Die Reaktion wurde mit einem Temperaturprofil von 95 °C 10 min, 94°C 1 min, 55°C 1 min, 72°C 2 min durchgeführt, 40 Zyklen für hu- mAS-p53 und 35 Zyklen für humNS-P53, 25 Zyklen für die Ampli- fikation des „Housekeeping Gens" ß-Actin. Die Analyse der PCR-Produkt erfolgte auf Agarosegelen (2 %) nach Ethidiumbro- midfärbung.
Entwicklung des AS-p53 Antikörpers
Polyklonales Antiserum gegen humAS-p53 wurde durch Immunisierung eines Kaninchens gegen ein synthetisches Oligopepdid (DQTSFQKENC) mit einer für die Splicing Region spezifischen Aminosäuresequenz hergestellt (Innovagen AB, Sweden) . Die Spezifität des Antiserums gegen das synthetische Peptid wurde im ELISA charakterisiert unter Verwendung des spezifischen Peptids und Zufallspeptiden als negative Kontrolle.
Immunfärbungen und subzelluläre Lokalisation von humAS-p53
Für die Proteindetektion in kultivierten SAOS-2 Zellen wurden 2x104 Zellen auf Glasplättchen am Boden einer 24er- Plastikkulturschale ausgesät. Nach Anheftung der Zellen und 24 h Inkubation wurde eine transiente Transfektion mit pCDNA- wtp53, pCDNA-humASp53 , oder pCDNA-3.1 (0.2 μg/Napf) unter Bedingungen durchgeführt, die „ Transiente Transfektion" beschreiben. Nach weiteren 38h Inkubation wurden die Kulturen mit PBS gewaschen und in 95 % Ethanol/5 % Eisessig 15 min bei -20°C fixiert und anschließend mit 3% Triton-XIOO 15. min per- meabilisiert . Der p53-spezifische Antikörper DOl wurde für 30 min bei Raumtemperatur zugegeben, dann die Kulturen erneut gewaschen. Die Detektion des Primärenantikörpers erfolgte durch 30 min Inkubation mit Fluoreszein-thiozyanat (FITC) markiertem Kanninchen-anti-Maus Antikörper (DAKO) . Die Auswertung und Fotodokumentation erfolgte mit einem Zeiss Axis- cope Fluoreszenzmikroskop.
In Vitro Translation
Für die in vitro-Translation von pCDNA-ASp53 und pCDNA-wtp53 wurde ein „TNT™ T7 Complete Reticulocyte Lysate System" (Promega) verwendet. Die Reaktion wurde in 2 μl Reaktionspuffer, 2 μl Aminosäurenmix, 1 μl RNAse Inhibitor RNAsin, 25 μl Kaninσhen-Retikulozytenlysat mit 2 μg der pCDNA-ASp53 oder pCDNA-wtp53 Plasmid für 2 h bei 30°C im Wasserbad durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden unmittelbar in Immunoprä- zipitations- oder Western-Blot-Experimenten weiterverwendet.
Transiente Transfektion und Luciferase-Reporter-Gen Assay
1.5xlOs Zellen wurden in 100 mm Kulturschalen ausgesät und transient mit 4 μg pCDNA-ASp53, pCDNA-wtp53, pCDNA-3.1 oder pUC18 transfiziert unter Verwendung von „Effectene Transfec- tion Reagent" (Quiagen) mit einem DNA/Effectene-Verhältnis von 1:5. Die Zellen wurden unter Standartkulturbedingungen bei 37°C in einer 5% C02 Atmosphäre für 13 h inkubiert, dann zweimal gewaschen und nach Mediumwechsel weitere 24 h inkubiert. Die Zellysate wurden unmittelbar für Immunoprezipita- tions- oder Western-Blot-Analysen verwendet.
Für die Analyse im Luciferase-Reporter-Gen Assay wurden 2xlOs Zellen in 6-well Schalen ausgebracht und nach 24 h Inkubation transient mit 1.0 μg des Reporter-Plasmids und 0.1 μg des p53-exprimierenden Plasmids verwendet, mit Ausnahme der Titrationsexperimente, in denen ansteigende DNA- Konzentrationen wie in den Abbildungen gezeigt verwendet wurden. Nach 38 h Inkubation wurden die mit PBΞ gewaschenen Schalen mit Lysispuffer (25 mM Tri-Phosphat pH7, 2 mM DTT, 10 % Glycerol, 1 % Triton X-100) beschichtet und die Zellschicht mit einem Zellschaber auf Eis gewonnen und 20 min inkubiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation bei 13.000 rpm geklärt, die Proteihkonzentration bestimmt und mit „Luciferase Assay Mix" (Promega) versetzt. Die Bestimmung der Luciferase- aktivität erfolgte in einem Luminometer.
Western-Blot-Analyse
Subkonfluente Zellkulturen wurden mit kaltem PBS gewaschen und mit dem Zellschaber gelöst. Nach Zentrifugation wurden die Zellpellets sofort in Lysepuffer (50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1 % NP40) mit 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leu- peptin, 5 μg/ml Pepstatin A, und 5 μg/ml Pefabloc aufgenommen. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde das Lysat 10 sec ultraschallbehandelt, dann für 25 min bei 13.000 rpm zentri- fugiert. Die Überstände wurden gewonnen, die Proteihkonzentration mittels „BCA Protein Assay Reagent Kit" (Pierce) bestimmt und die Proteihkonzentration der Proben angeglichen. Die Lysate wurde in „SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese Loa- ding-Buffer" (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2 % SDS, 5 % 2- Mercaptoethanol , 10 % Glycerol, and 0.002 % Bromphenolblau) aufgenommen und bei 95°C für 5 min inkubiert. Die Proben (30- 100 μg) wurden auf 10 % SDS-PAGE separiert und durch Ele- krotransfer auf Polyvinylid-Fluorid-Membranen (Millipore) übertragen. Die Proteindetektion erfolgte durch Inkubation der Membranen mit Verdünnungen der Antikörper (DQT10 oder p53-spezifischer Antikörper) über Nacht bei 4°C, Inkubation für 2h mit dem sekundären Antikörper und anschließender ECL- Detektion (Super Signal™, Pierce) . Als p53 -spezifische Anti- körper wurden DOl gegen das N-terminale Ende des Proteins (Aminosäuren 21-25) , die für das C-terminale Ende spezifischen Antikörper Ab421 (aa 371-380) und Abl22 (aa 371-180) , sowie der für die DNA-Bindungsdomäne spezifische Antikörper Ab240 (aa 213-217) verwendet.
Immunopräzipitation
Von subkonfluenten 10 cm Kulturschalen wurden Zellen wie für die Western Blot-Analyse gewonnen, aber in IP-Puffer (20 mM Tris pH8.0, 1 mM EDTA, 0.5 % NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 10 % Gylcerol) mit Proteaseinhibitoren (5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin, 5 μg/ml Pepstatin A, 5 μg/ml Pefabloc) aufgenommen und für 30 min auf Eis lysiert, dann für 10 sec unltraschallbehandelt und zentrifugiert . Die Proteinbestimmung erfolgte mittels „BCA Protein Assay Reagent Kit" (Pierce) . 0.5 mg Protein in 700 μl IP-Puffer wurden mit 70 μl Protein A-Sepharose versetzt und 60 min bei 4°C unter rotierender Bewegung inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand gewonnen und 70 μl (entspr. 10 % Volumen) Antikörper DQT10 hinzugegeben. Nach Inkubation bei 4°C über Nacht unter rotierender Bewegung wurde erneut mit 70 μl Protein A- Sepharose versetzt und 60 min bei 4°C inkubiert. Nach Zentrifugation wurde das Pellet in IP-Puffer dreimal gewaschen und die Proben in der Western-Blot-Analyse weiter verwendet.
Electrophoretic Mohility Shift Assay (EMSA)
1 μg Oligonucleotide deren Sequenz die p53 -Bindungsstelle des p21-Promoters umfasst (5'- gctctgccGAACATGTCCCAACATGTTGccgctctg -3') wurden mit T4 Poly- nucleotid-Kinase (New England Biolabs) und γ- [32P-ATP] markiert und mit 1 μg nichtmarkiertem komplementärem Oligonucleo- tid hybridisiert (5'-cagagcgg CAACATGTTG GGACATGTTC ggcagagc- 3') . Die doppeisträngige DNA wurde auf 8 %-Polyacrylamidgelen gereinigt und in EMSA-Experimenten mit in der in-vitro- Translation synthetisierten Protein verwendet. Die DNA- Bindung wurde über Nacht bei 4°C in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT und 20 % Glycerol durchgeführt. Der Bindungsreaktion wurden 2xl04 c.p.m. der DNA und 10 μl Retikulozytenlysat zugegeben, das zuvor mit oder ohne 1 μg gereinigten p53-spezifischen Antikörpern für 30 min auf Eis präinkubiert wurde.
Colony Formation Assay
SAOS-2 Zellen wurden transient mit je 2 μg pC-Asp53 , pC-NS- p53, pC-DNA3.1 oder pC-Asp53 und pC-NS-p53 wie oben transfiziert. pUC18-DNA wurde verwendet, um die Gesamt-DNA-Menge in den Transfektionsgruppen anzugleichen. Der Vektor enthält ein Neomycinresistenzgen, das eine Selektion transfizierter Zellen unter Neomycin erlaubt. Nach 24 h Inkubation wurden die transfizierten Populationen in 100 mm Kulturschalen in ansteigender Zelldichte ausgesät und 1 mg/ml G418 (Neomycin) zugegeben. Unter diesen Bedingungen sterben nicht- transfizierte (nicht-neomycinresistente) Zellen progredient ab. Nach 3 Wochen Inkubation wurden die klonogen ausgewachsenen Kolonien der überlebenden Klone ausgezählt .
Legenden zu den Abbildungen
Abbildung 1:
Analyse des humNS-p53- (Bahnen 2, 5, 8, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32 und 38) und humAS-p53-Transkripts (Bahnen 3, 6, 9, 12, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 und 39) durch konventionelle RT- PCR. ß-Actin wurde in jeder PCR-Reaktion als Kontrolle für die Integrität der RNA-Proben mit amplifiziert (Bahnen 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34 und 37) . Die spezifischen PCR-Produkte wurden durch Pfeile markiert. PCR-Produkte mit höherem Molekulargewicht als humAS-p53 repräsentieren Produkte aus der Amplifikation genomischer DNA. RNA wurde aus etablierten Zelllinien verschiedener menschlicher Tumoren präpariert. Oben: Medulloblastome D283, TE378, DAOy; Epider- moidkarzinom A431, Osteosarkom SAOS-2, Melanome Mel6, MelHo, MU3; Mamma-Karzinome MB231, MCF7, Hepatozelluläre- Karzinome HepG2, Hep3b, HUH7. Unten: Analsyse von normalen Hirnproben, kultivierten Astrozyten und Fibrobalsten, sowie Gewebeproben aus normaler Weißer Substanz und Cortex (NB-w.m. und NB-cort) und fünf Biopsien maligner Gliome (GBM) .
Abbildung 2a:
Schematische Darstellung der Molekülstruktur und der funktio- nellen Domänen in humNS-p53 und humAS-p53.
Abbildung 2b:
Sequenzvergleich von humNS-p53 und humAS-p53. Die gestrichelte Linie zeigt 100% Homologie mit der für NS-p53 kodierenden CDS an.
Abbildung 2c :
Die Gliomzelllinie G-112 (mt p53) wurde transient mit pC- ASp53 (Bahn 1 und 3), mit dem leeren Vektor pCDNA-3.1 (Bahn 2 und 5) oder mit dem Vektor pUC18, der nicht-kodierende DNA enthält, (Bahn 3 und 6) transfiziert. Die Lysate der transfi- zierten Zellen wurden im Western-Blot mit dem p53- spezifischen Antikörper DO-1 ( Bahn 1- 3 ) oder PAb421 (Bahn 4 - 6 ) analysiert . Die Pfeile markieren die Position des endogenen zellulären humNS-p53 - oder des rekombinanten humAS-p53 Proteins .
Abbildung 2d: humNS-p53- und humAS-p53 -Protein wurde in vitro mit Hilfe eines Retikulozytenlysat-Transkriptions/Translations -Systems (Promega) synthetisiert. Die Proteine der in vitro- Translation wurden im Western-Blot mit dem N-terminalen p53- Antikörper DO-1 (aa 21-25) , dem Antikörper gegen die Core- Domäne pAb240 (aa 231-217) und dem C-terminalen Antikörper PAb421 (aa 371-380) analysiert. In der Bahn "M" wurde die Position eines 51,4 Kda-Markers für Molekulargewichte markiert .
Abbildung 3 :
Der gegen ein Oligopepdid des humAS-p53 generierte Antikörper DQT-10 erkennt spezifisch humAS-p53 (Bahn 1 und 7) , nicht aber humNS-p53 (Bahn 2 und 8) . Die Proteine in den Bahnen 1-4 wurden durch in vitro-Translation synthetisiert, die Proteine der Bahnen 5 und 7 entstammen der transienten Transfektion von G-112-Gliomzellen mit humAS-p53. Die Bahnen 6 und 8 zeigen als Kontrolle zelluläre Lysate von transient mit dem leeren Kontrollvektor pcDNA3.1 transfizierten G-112-Zellen. Die Zelllinie G-112 exprimiert konstitutiv ein mutiertes p53- Protein in Folge einer bekannten Hot-Spot-P53-Mutation.
Abbildung 4 :
Nachweis von humAS-p53-Protein in verschiedenen menschlichen Tumoren. Von etablierten Zelllinien wurden Lysate präpariert und eine Immunopräzipitation mit DQT-10-Antikörpern durchgeführt. Das durch DQT-10 immunpräzipitierte humAS-p53-Protein wurde im Western-Blot mit dem p53 -spezifischen Antikörper DO- 1 detektiert. In jedem Experiment wurde die p53 -negative Zelllinie SAOS-2 als Kontrolle eingeschlossen. Gezeigt wird eine Auswahl von Zelllinien: G-112, G-168, U-87, U-251 (huma- ne Glioblastomlinien) , SAOS-2 (Osteosarkom) , MCF7 (Mamma- Karzinom) , T47D (Mamma- arzinom) , A431 (Epider oidkarzinom) , HuH7 und HepG2 (Hepatozelluläres-Karzinom) .
Abbildung 5 :
Subzelluläre Verteilung des humAS-p53 nach transienter Transfektion. Die p53 -negative Zelllinie SAOS-2 wurde mit humAS- p53 transfiziert und eine Immunfärbung mit dem DO-1 Antikörper durchgeführt. Wie humNS-p53 erscheint humAS-p53 vier Stunden nach transienter Transfektion im Nucleus der Zellen.
Abbildung 6a: humAS-p53-Protein transaktiviert nicht die bekannten p53- Target-Gene p21 und mdm2. SAOS-2 Zellen wurden transient mit pC-p53-DNA oder mit pC-AS-p53-DNA transfiziert. Die zellulären Lysate wurden im Western-Blot mit spezifischen p53-, p21- oder mdm2-Antikörpern analysiert.
Abbildung 6b:
Transaktivierung des p21-Gens in transient transfizierten SAOS-2 Zellen. SAOS-2 Zellen wurden mit Vektoren transfiziert, die Wildtyp p53, mutiertes p53 273h, humAS-p53 exprimieren und die Aktivität eines Luciferase-Reportergens unter Kontrolle des p21-Promoters gemessen. Mit Hilfe von Koexpression wurde die Wechselwirkung von humAS-p53 und humNS-p53 analysiert.
Abbildung 7:
Elecrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) mit in vitro- synthetisiertem humNS-p53- (1 und 3) und humAS-p53 -Protein
(4-6) unter Verwendung von Oligonukleotiden mit einem p53- Bindemotiv des p21-Promoters . Die Spezifitat der DNA Bindung wird bestätigt durch einen Super-Shift des Protein/DNA- Komplexes nach Zugabe der p53-spezifischen Antikörper DO-1
(Bahn 2) oder PAb421 (Bahn 3) . Wie bereits in anderen Publikationen gezeigt, kann PAb421 die sequenzspezifische Bindung von p53 steigern, während DO-1-Antikörper nur zu einem Super- Shift führen (TR Hupp, DP Lane, KL Ball, Biochem. J., 352, 1- 17. , 2000) .
Abbildung 8 :
Der Einfluß von humAS-p53 auf die DNA-Bindung von humNS-p53 im EMSA. Es wurden identische experimentelle Bedingungen wie in Abb.7 gewählt. Oligonukleotide mit einer p53- Bindungsstelle des p21-Promoters wurden mit humNS-p53 allein (1) oder in Gegenwart von humAS-p53 (Bahn 3) inkubiert. Der spezifische Komplex von humNS-p53 und der DNA erfährt einen Super-Shift nach Zugabe der Antikörpers PAb421 (Bahn 4) . Bahn 2 zeigt DNA, die nur mit humAS-p53 inkubiert wurde.
Abbildung 9:
Transiente Transfektion der p53 -negativen Zellinie SAOS-2 mit humAS-p53, humNS-p53 und Kotransfektion mit humAS-p53 und humNS-p53. Im Vergleich zur der mit dem leeren Vektor trans- fizierten Kontrolle unterdrückt humNS-p53 im Gegensatz zum humAS-p53 das Wachstum von Tumorkolonien im „Colony Formation Assay". Kotransfektion beider p53 -Formen zeigt eine Inhibition der humNS-p53 -abhängigen Wachstumsunterdrückung durch humAS-p53.
Abbildung 10a:
Schematische Darstellung eines HT-Screenings basierend auf der erfindungsgemäßen Inhibition der humNS-p53 -abhängigen Wachstumsunterdrückung durch humAs-p53.
Abbildung 10b:
Schematische Darstellung eines HT-Screenings basierend auf der erfindungsgemäßen Inhibition der DNA-Bindung von humNS- p53 durch humAs-p53.
Abbildung 10c :
Schematische Darstellung eines HT-Screenings basierend auf der erfindungsgemäßen Inhibition der humNS-p53-abhängigen Transaktivierung bekannter p53 -abhängiger Target-Gene durch humAs-p53.
Abbildung 11:
Quantitative RT-PCR Analyse der normalisierten Expression von NS-p53 und der Expressionrate von AS-p53 / NS-p53 in Hirntumoren verschiedener Grade und normalem Hirn.

Claims

Patentansprüche
1. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Aminosäuresecruenz aufweist.
2. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Homologes, ein Derivat oder ein Fragment des Proteins nach Anspruch 1 ist.
3. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.
4. Nukleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Homologes, ein Derivat oder ein Fragment der Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Nukleinsäure- sequenz ist.
5. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein oder mehrere Nukleinsäuremolekül (e) enthält, das (die) für ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 kodiert (kodieren) .
6. Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül die in SEQ ID NO: 3 gezeigte Nukleinsäuresequenz aufweist .
7. Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Homologes, ein Derivat oder ein Fragment der Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Nuklein- säuresequenz ist.
8. Vektor nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Expressionsvektor ist.
9. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor nach den Ansprüchen 5 bis 8 transfiziert ist.
10. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Protein nach Anspruch 1 exprimiert.
11. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eukaryontische Wirtszellen nach Anspruch 9 oder 10 unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression des Proteins geeignet sind.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Proteine isoliert.
13. Antikörper, der spezifisch an das Protein nach Anspruch 1 oder 2 aber nicht an das humane p53-Protein bindet.
14. Antikörper nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er ein polyklonaler Antikörper ist.
15. Antikörper nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er ein monoklonaler Antikörper ist.
16. Verfahren zur Identifizierung von Genen, die von p53 transaktiviert werden, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) Wirtszellen nach Anspruch 9 oder 10, die Zellen einer p53 -negativen Zelllinie sind, transient transformiert ,
b) ein zu untersuchendes Gen durch ein Reportergen ersetzt, das unter die Kontrolle des Promoters des ersetzten Gens gestellt wird,
c) das in Stufe b) erhaltene Promotor-Reportergen- Konstrukt in die Wirtszellen kotransformiert,
d) die Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die zur Genexpression geeignet sind, und man
e) gegebenenfalls die Expression des Reportergens nach- weist,
wobei das zu untersuchende Gen als ein von p53 transaktiviertes Gen identifiert wird, wenn man in Stufe e) eine Expression des Reportergens nachweist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen für Luciferase (luc) , Glucuronidase (GUS) , "green fluorescent protein" (GFP) , ß-Galactosidase oder Cloramphenicoltransferase kodiert .
18. Verfahren zur in vitro-Untersuchung der Wechselwirkung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 mit einer Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die zu untersuchende Nukleinsäuresequenz radioaktiv markiert, man sie
b) mit dem Protein in Kontakt bringt, man
c) die Mischung aus Stufe c) auf ein Gel aufträgt und man
d) eine Gelelektrophorese durchführt,
wobei eine Wechselwirkung des Proteins mit der zu untersuchenden Nukleinsäure vorliegt, wenn sich das Laufverhalten der Nukleinsäure im Vergleich zu einer Probe ohne zugegebenes Protein als Vergleichsprobe verändert .
19. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die geeignet sind, die Wechselwirkung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 mit dem humanen Protein p53, p63 oder p73 zu beeinflussen, bei dem man
a) das Protein nach Anspruch 1 oder 2 markiert, b) humanes Protein p53, p63 oder p73 markiert,
c) die markierten Proteine von Stufe a) und Stufe b) miteinander in Kontakt bringt und eine Messung zur Bestimmung des/der Markersignals/Markersignale durchführt ,
wobei die Markierungen so gewählt sind, daß eine Wechselwirkung der markierten Proteine von Stufe a) und b) nachweisbar und von den isolierten, markierten Proteinen durch Änderung des/der Detektionssignals/Detektionssignale unterscheidbar ist, man
d) die Mischung von Stufe c) mit einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt bringt und man
e) eine weitere Messung zur Bestimmung des/der Markersignals/Markersignale durchführt,
wobei die zu untersuchende Substanz eine die Wechselwirkung beeinflussende Substanz ist, wenn sich das (die) in Stufe .e) gemessene (n) Markersignal (e) von dem(den) in Stufe c) gemessenen Markersignal (en) unterscheidet.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bindungsassay durchführt, indem man entweder
a) das Protein nach Anspruch 1 oder 2 oder
b) das humane Protein p53 , p63 oder p73 auf einer Mikro- titerplatte immobilisiert,
c) das jeweils andere Protein markiert und es mit dem immobilisierten Protein in Kontakt bringt, wobei man das Vorliegen einer Wechselwirkung zwischen den in a) und b) genannten Proteinen nach Durchführung entsprechender Waschschritte durch Nachweis der Markierung ' bestä- tigt, man
d) die Proteine mit der zu untersuchenden Substanz in Kontakt bringt,
wobei die zu untersuchende Substanz eine die Wechselwirkung beeinflussende Substanz ist, wenn die Markierung nach Zugabe der zu untersuchenden Substanz und Durchführung entsprechender Waschschritte auf den Mikrotiterplatten nicht mehr nachweisbar ist.
21. Verwendung einer Substanz, die die Wechselwirkung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 mit dem humanen Protein p53, p63 oder p73 beeinflußt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Beeinflussung p53-abhängiger Funktionen in nicht neoplastischen Zellen.
22. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Beeinflussung p53 -abhängiger Funktionen in nicht neoplastischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Verfahren nach den Ansprüchen 18 bis 20 durchführt und man die Substanz, die als eine die Wechselwirkung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 mit dem humanen Protein p53 , p63 oder p73 beeinflussende Substanz identifiziert ist, mit geeigneten Hilfs- und/oder Trägerstoffen zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert .
23. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 20 erhältliche Substanz und pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält.
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