KR101321284B1

KR101321284B1 - 프로게린 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 치료용 약학조성물 및 상기 프로게린 발현 억제제의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101321284B1
Application number: KR1020110024308A
Authority: KR
Inventors: 박범준; 하남출
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2011-03-18
Publication date: 2013-10-28
Also published as: KR20120106286A

Abstract

본 발명은 프로게린 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 치료용 약학조성물 및 상기 프로게린 발현 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상기 프로게린 발현 억제제는 프로게린 과발현에 의해 야기되는 질환, 특히 신장암, 백혈병, 전립선암, 조로증 등과 같은 노화된 개체에서 야기되는 질환의 치료 또는 예방에 효과적이며, 또한 노화 관련 질환 치료제 스크리닝 방법을 이용하면 예를들어 pVHL과 프로게린 간의 결합을 촉진하는 약물을 특이적으로 선별할 수 있어 신장암, 백혈병, 전립선암, 조로증 등과 같은 노화된 개체에서 야기되는 질환 치료제를 효과적으로 개발할 수 있다.

Description

프로게린 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 치료용 약학조성물 및 상기 프로게린 발현 억제제의 스크리닝 방법{Pharmaceutical composition for treating aging-related diseases comprising inhibitor of progerin and screening method thereof}

본 발명은 프로게린 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 치료용 약학조성물 및 상기 프로게린 발현 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

신장세포암(RCC)은 비뇨생식기에서 흔히 야기되는 악성종양으로서, 불규칙한 핵 형상을 나타내며, 이러한 핵 형상은 RCC 등급의 지표로서 이용되고 있다. 또한, 유전적 변이 없는 p53 불활성화와 방사선-저항성은 RCC의 특징으로 알려져 있다. 한편, pVHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein)은 RCC의 초기 단계에서 자주 변이가 발생된다. 그러나, 이러한 다형성 핵, p53 불활성화 및 방사선 저항성에 대한 분자적 기전은 아직 알려져 있지 않다.

암은 노화 관련 질환으로 잘 알려져 있으며, 또한 유전적 질환으로 알려져 있다. 노화된 개체에서 암에 대한 감수성이 높은 이유에 대한 연구가 있어 왔고, 일반적으로는 다단계 종양형성에 의한 것으로 설명되어 왔다. 악성 종양에 이르기 위하여, 정상세포는 많은 유전적 변이를 축적해야 한다. 따라서 암 형성은 오랜 기간을 필요로 한다. 그러나, 리-프라우메니증후군(Li-Fraumeni syndrome), 폰히펠린다우 증후군(Von Hippel Lindau syndrome), 가족성 선종성 결장(familial adenomatosis colis)과 같은 가족성 암 증후군을 고려하면, 종양 형성은 오랜 기간을 필요로 하지 않으며, 특정 조건 하에서는 재빨리 진행된다. 이에 관하여, 최근 강한 종양 억제제인 p53의 생리학적 기능이 노화 과정에서 감소된다는 흥미로운 보고가 있었다. p53은 게이트키퍼 종양 억제제이기 때문에 이의 기능 감소는 암의 발전을 촉진시킬 수 있다. 따라서 p53 기능을 억제할 수 있는 세포성 함유물 또는 유전자 발현 프로파일의 노화 관련 변화는 노화 개체에서 암 발생을 이해하는 데에 중요한 실마리가 될 것이다.

RCC는 잘 알려진 노화 관련 암으로서, 이의 발병은 어린 개체에서는 높지 않을지라도 노화 과정에서 명백하게 증가하였다. 또한, RCC는 핵막 불규칙성과 IR-처리에 대하여 저항성을 나타낸다. 그러나, IR-저항성에 대한 원인으로서 제안되어 온 p53의 유전적 변이는 매우 낮다. 이러한 특징은 RCC에서 p53 기능을 억제하는 새로운 기전이 있음을 의미한다.

그리고, RCC의 의미있는 유전적 이벤트는 pVHL의 흔한 변이이다. pVHL은 인간 암 증후군 폰히펠린다우 증후군(Von Hippel Lindau syndrome)로부터 동정되었을지라도, 이의 유전적 변이는 신장세포암에서 70%에 달하는 것으로 알려져 있다. E3 라이게이즈로서 pVHL은 HIF-1a를 분해하며 전사 활성을 차단한다. HIF-1a는 저산소증에 반응하여 VEGF, EPO 및 다른 pro-혈관신생 인자를 유도하기 때문에, HIF-1a의 활성화는 암의 진행 특히 종양-혈관신생 진행에 중요할 것이다. 그러나, 여러 종류의 고형암에서 HIF-1a는 종양의 내부 세포 덩어리에서 형성될 수 있는 저산소 조건의 형성을 통해 안정화 및 활성화되고, pVHL 결손 또는 기능 손실은 암 발생의 초기 단계에는 필수적이지 않은 것으로 보인다. 또한, 혈관신생은 암 발생의 후기 단계에서 필요하며 신장의 조직학적 특징은 잘 형성된 많은 혈관을 갖는다는 것이다. 따라서, 혈관신생을 얻기 위한 RCC의 초기 단계에서 pVHL 손실은 종양 형성에 중요하지 않다. pVHL 결손은 다른 종류의 침습적 암에서는 검출되지 않는다. 따라서, 이러한 특징은 pVHL의 새로운 종양 억제 역할이 존재하며 RCC-특이적 기능과 관련되는 것으로 보인다.

RCC의 발병은 노화 과정에서 극적으로 증가하며, p53의 기능이 유전적 변이 없이 감소되며, pVHL은 암 발생의 초기 단계에서 자주 변이를 일으킨다는 사실을 고려하여, 본 발명자들은 pVHL의 손실이 노화 관련 유전자 발현과 관련되며, 이는 p53 기능을 억제할 수 있다고 가설을 세웠다. 이러한 가설을 검증하기 위하여, 어린 나이에 노화 및 사망이 촉진되는 허친슨-길포드 조로증(Hutchinson-Gilford Syndrome; HGPS)에서의 핵 변성과 유사한 RCC의 핵막 불규칙성에 초점을 맞추었으며, HGPS 유발 유전자인 프로게린이 노화 세포에서 발현됨을 밝혀내었다.

이에, 본 발명자는 RCC의 특징과 프로게린의 상승된 발현 간의 상관관계를 규명한 결과, RCC의 핵막 불규칙성은 프로게린의 제거에 의해 개선되었으며, DNA 손상에 대한 p53 반응성은 프로게린 제거에 의해 복원되었고, 프로게린의 발현 증가와 p53의 불활성화는 pVHL 기능장애에 기인하였다. 또한, pVHL은 프로게린과 상호작용을 하며, 프로게린-유도 p14/ARF 불활성화를 차단하는 반면, 프로게린은 p14를 제거하여 p53의 불활성화 및 핵막 불규칙성을 초래하였으며, 프로게린 발현은 인간 백혈병 시료 및 이로부터 유래한 초대배양 세포주에서 검출되었기 때문에 이러한 결과로부터 프로게린 발현이 암 진행 특히, 노화된 개체에서의 암 진행에 중요한 역할을 수행함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 프로게린 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 프로게린 발현을 억제하는 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 관련 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로게린 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 프로게린 발현 억제제는 pVHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein)-프로게린 간의 결합 촉진제; 또는 안티센스 RNA, 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 이루어진 군에서 선택된 프로게린 발현에 대한 RNA 간섭을 중개하는 RNA에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

바람직하게는, 상기 프로게린 발현 억제제는 pVHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein) 및 프로게린 간의 결합을 촉진하여 프로게린과 p14 간의 결합을 억제함으로써 p53의 불활성화를 차단할 수 있다.

상기 노화 관련 질환은 암질환 및 조로증으로 이루어진 군에서 선택된 질환일 수 있으며, 상기 암질환은 신장암, 백혈병 또는 전립선암에서 선택된 암질환일 수 있고, 상기 조로증은 워너 증후군 또는 허친슨 길포드 증후군에서 선택된 조로증일 수 있다.

본 발명자들은 RCC 등의 노화 관련 질환에서 프로게린의 발현이 증가하며, 이렇게 증가된 프로게린 발현을 감소시키면 RCC의 특징인 핵막 불규칙성이 개선되며, 또한 DNA 손상에 따른 p53의 반응성이 프로게린 제거에 의해 다시 복원됨을 확인하였다. pVHL은 프로게린과 상호작용을 하여 프로게린 유도성 p14/ARF 불활성화를 차단하여 p14를 매개로 p53을 활성화시켜 종양 억제효과를 향상시켰다. 또한, 프로게린 발현은 인간 백혈병 시료 및 이로부터 유래한 초대배양 세포주에서 검출되었다. 따라서, 프로게린의 발현이 암 진행 특히, 노화된 개체에 있어서의 암 진행에서 중요한 역할을 수행함을 밝혀냈다.

그러므로, 프로게린의 발현을 억제하는 물질, 특히 pVHL과 프로게린의 결합을 촉진시키는 물질은 프로게린 과발현에 의해 야기되는 질환, 예를들어 RCC, 백혈병, 전립선암, 조로증 등과 같은 노화 관련 질환 치료를 위한 유망한 의약 타겟으로 될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학조성물 중 유효성분의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 투여경로, 질병의 정도, 질병의 종류 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　 따라서, 이러한 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 프로게린 발현을 억제하는 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 관련 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

보다 바람직하게는, 상기 스크리닝 방법은 pVHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein), 프로게린 및 후보약물을 반응하는 단계; 및 상기 반응물 중 프로게린 발현 수준을 분석하여 pVHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein)-프로게린 간의 결합을 촉진하여 프로게린과 p14 간의 결합을 억제하는 후보약물을 선별하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.

상기 노화 관련 질환은 신장암, 백혈병 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 암질환; 또는 워너 증후군 또는 허친슨 길포드 증후군에서 선택된 조로증 중 어느 질환일 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 프로게린 과발현에 의해 야기되는 질환, 특히 신장암, 백혈병, 전립선암, 조로증 등과 같은 노화된 개체에서 야기되는 질환의 치료 또는 예방에 효과적이며, 또한 노화 관련 질환 치료제 스크리닝 방법을 이용하면 예를들어 pVHL과 프로게린 간의 결합을 촉진하는 약물을 특이적으로 선별할 수 있어 신장암, 백혈병, 전립선암, 조로증 등과 같은 노화된 개체에서 야기되는 질환 치료제를 효과적으로 개발할 수 있다.

도 1은 RCC의 핵막 불규칙성에 관한 프로게린의 영향을 나타낸 것으로, A는 인간 RCC 세포주인 C2에서의 핵막 불규칙성, B는 RCC에서 프로게린의 핵 변성에 관한 형상, C는 RCC에서 프로게린의 전사적 발현, D는 전사 수준에서의 프로게린 발현, E는 RCC의 핵막 불규칙성에 대한 si-프로게린의 영향, F는 HGPS의 핵 형상에 대한 si-프로게린의 영향을 각각 나타낸 것이고,
도 2는 프로게린 발현에 대한 pVHL의 영향을 나타낸 것으로, A는 프로게린 발현에 대한 pVHL 과발현의 영향, B는 프로게린 발현에 대한 si-VHL의 영향, C는 pVHL-형질주입 C2V 세포에서의 프로게린 분석, D는 프로게린 반감기에 대한 pVHL의 영향, E는 프로게린 발현에 대한 pVHL 돌연변이의 영향, F는 HGPS 세포의 핵 변형에 대한 pVHL의 영향을 각각 나타낸 것이고,
도 3은 p53에 대한 프로게린의 영향을 나타낸 것으로, A는 caki-2 세포에서의 p53 발현에 대한 si-프로게린의 영향, B는 C2 세포의 p53 발현에 대한 si-프로게린의 영향, C는 C2 세포에서의 p53에 대한 FHIT 또는 RKIP 영향, D는 si-프로게린 형질주입 C2 세포에서의 p53 면역염색 분석, E는 C2 세포에서의 DNA 손상제 민감도에 대한 si-프로게린 영향, F는 p53의 전사 활성에 대한 si-프로게린의 영향을 각각 나타낸 것이고,
도 4는 pVHL에 의한 p53 유도에 관한 프로게린 상관관계를 나타낸 것으로, A는 C2 세포에서의 p53 발현에 대한 pVHL 형질주입의 영향, caki-2 세포에서의 p53 유도에 대한 pVHL의 영향, C는 A549에서의 p53 유도에 대한 pVHL의 영향, D는 HCT116에서의 p53 유도에 대한 pVHL의 영향, E는 caki-2 세포에서의 si-프로게린 처리에 따른 p53 유도에 대한 pVHL의 영향, F는 HGPS에서의 p53 유도에 대한 si-프로게린의 영향, G는 HGPS에서의 p53 유도에 대한 pVHL의 영향을 각각 나타낸 것이고,
도 5는 p14-매개 p53 활성화에 대한 프로게린의 영향을 나타낸 것으로, A는 인간 조로증 세포에서의 p53의 민감도, B는 HGPS 세포에서의 p53 유도에 대한 너트린-3의 영향, C는 C2 세포에서의 DNA 손상반응에 대한 si-프로게린의 영향, D는 프로게린-유도 p53 억제에 대한 p14 과발현의 영향, E는 si-프로게린에 의한 p53 유도에 대한 si-p14의 영향을 각각 나타낸 것이고,
도 6은 p14-프로게린의 직접 결합에 대한 pVHL의 영향을 나타낸 것으로, A는 p14와 프로게린의 상호작용, B는 p14-프로게린 간의 상호작용에 대한 pVHL의 영향, C는 GST-p14를 이용한 GST-풀다운 분석, D는 p53-p14 간의 상호작용에 대한 프로게린의 영향, E는 p14 반감기에 대한 프로게린의 영향, F는 p14 반감기에 대한 pVHL의 영향을 각각 나타낸 것이고,
도 7은 인간 백혈병 시료에서의 프로게린 발현을 분석한 것으로, A는 백혈병 시료에서의 프로게린 발현, B는 확립된 세포주에서의 프로게린 발현, C는 si-프로게린에 의한 세포 생존율, D는 p53 발현 및 DNA 손상반응에 대한 si-프로게린의 영향, E는 노화에 따른 암 진행 관련 메카니즘을 각각 나타낸 것이고,
도 8은 RCC의 핵 형상을 분석한 것으로, A는 caki-2(왼쪽) 및 C2 세포에서의 DAPI 염색 분석, B는 프로게린 발현에 대한 si-프로게린의 영향, C는 핵 형상에 대한 si-프로게린의 영향을 각각 나타낸 것이고,
도 9는 pVHL의 프로게린 발현 조절에 있어서 HIF-1a의 영향을 나타낸 것으로, A는 C2 및 pVHL-형질주입 C2V에서의 핵 형상, B는 프로게린 발현에 대한 si-HIF1a의 영향, C는 프로게린 유도에 대한 HIF-1a 과발현의 영향, D는 프로게린 전사물에 대한 pVHL의 영향을 각각 나타낸 것이고,
도 10은 pVHL과 프로게린 간의 직접 상호관계를 나타낸 것으로, A는 프로게린과 pVHL 간의 상호작용, B는 GST-풀다운 분석을 각각 나타낸 것이고,
도 11은 p53 유도에 대한 si-프로게린의 영향을 나타낸 것으로, A는 C2 세포에서의 p53의 면역염색 분석, B는 HGPS에서의 p53 유도에 대한 si-프로게린의 영향, C는 C2V 세포에서의 p53 유도에 대한 si-프로게린 영향을 각각 나타낸 것이고,
도 12는 p14 조절에 대한 프로게린의 영향을 나타낸 것으로, A는 p14 및 si-프로게린의 상승효과, B는 핵 형상에 대한 p14의 영향을 각각 나타낸 것이다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이러한 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

1. 세포 배양 및 시약 준비

본 발명에서 사용한 세포주는 ATCC로부터 구입하였고, 10% FBS 및 1% 항생제를 함유한 RPMI-1640(A549, HCT116) 또는 DMEM(293) 성장 배지를 이용하여 37℃의 성장챔버에서 유지되었다. 다른 세포주는 Dr. Jung YJ(부산대학교)로부터 제공받았으며, 10% FBS 및 1% 항생제를 함유한 DMEM(C2(UMRC2), C2V(UMRC2V), CAKI2) 성장 배지를 이용하여 37℃의 성장챔버에서 유지되었다.

워너 증후군 환자로부터 얻은 인간 섬유아세포(AG03141; 30살 여성), HGPS 환자로부터 얻은 인간 섬유아세포(AG01972; 14살 여성) 및 정상인로부터 얻은 인간 섬유아세포(GM 00038; 9살 여성)는 Coriell Cell Repositories로부터 구매하였으며, 15% FBS, 2 mM Glu(항생제 없음)를 함유한 EMEM 배지에서 유지되었다.

노코다졸 및 콜세마이드를 포함한 일반적인 화학 저해제는 Calbiochem으로부터 구매하였으며, p14/ARF(MS-850-P0), 에머린은 Novocastra로부터 구매하였다. 또한, 본 발명에서 사용된 항체 즉, 프로게린의 항체(sc-81611), 라민 A의 항체(sc-20680), GST의 항체(sc-138), GFP의 항체(sc-9996), VHL의 항체(sc-17780), p53 (DO-1) (sc-126), 액틴의 항체(sc-1616), MDM2의 항체(sc-965) 및 His의 항체(sc8-036)는 Santa Cruz로부터, α-FLAG의 항체(F3165)는 sigma로부터, p21의 항체(#2946), p-chk2의 항체(#2661)는 Cell Signaling으로부터 구매하였다.

2. 벡터 준비 및 형질주입

GFP-융합 프로게린 및 GFP-융합 라민 A 발현 벡터는 Scaffidi and Misteli (NCI)로부터 제공받았다. pVHL 포유동물 발현벡터는 Dr. Jung YJ(부산대학교)로부터 제공받았다. Myc-ARF 벡터 및 p21-루시퍼레이즈 벡터는 Addgene으로부터 구매하였다. si-프로게린 및 si-p14는 종래 알려진 문헌(Scaffidi and Misteli, 2005; Voorhoeve and Agami, 2005)에 따라 제작하였다. 이러한 벡터들의 포유동물세포 내 발현을 위하여, Jetpei(polyplus)를 사용하여 형질주입을 수행하였다. 1.5 ㎍의 벡터를 150 nM NaCl 용액에 용해된 Jetpei 시약 1.5 ㎕와 혼합하였다. 이러한 반응혼합물을 실온에서 15분 동안 배양한 후, 반응혼합물을 세포에 첨가하였다. 3시간 후, 혈청없는 배지를 10% FBS 함유 배지로 교체하였다.

3. 재조합 단백질 준비 및 GST-풀다운 분석

단백질-단백질 간의 상호작용을 조사하기 위하여, PCR을 통해 말단 코돈의 업스트림으로부터 100개 아미노산을 클로닝하여 재조합 라민 A-C-말단 영역(L-C), 프로게린-C-말단 영역(Prog)을 생산하였다. 전장 p14와 VHL을 PCR을 통해 생산하고 pGEX 벡터에서 클로닝하였다. DNA 시퀀싱을 통해 각 클론을 확인하였다. 니켈 컬럼을 이용하여 상기 재조합 단백질을 정제하였다.

결합 분석을 위하여, 실온에서 2시간 동안 GST-비드-융합 라민 A-C 또는 프로게린-C를 p14/ARF 형질주입된 세포로부터 얻어진 293 세포 용해물과 반응시켰다. 그리고, GST-p14 또는 pVHL을 GFP-라민 A 또는 프로게린-형질전환된 293 세포 용해물과 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS로 2회 세정하고 RIPA로 1회 세정한 후, 침전물을 모아 SDS-PAGE로 옮기고 항-p14 및 GST를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

4. 면역침강(IP) 및 웨스턴 블롯(WB) 분석

전세포(whole cell) 용해물을 RIPA 완충액에서 준비하였고, 상기 용해물을 14,000 rpm에서 30분 동안 원심분리 하였다. 세포 추출물 20 ㎍을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 분리하였고, PVDF 멤브레인 상에 옮겼다. 상기 멤브레인을 4℃에서 1시간 내지 밤새도록 블로킹 완충액과 반응하고 실온에서 1시간 동안 적절한 1차 항체와 반응시킨 후, 2차 항체와 반응시켰다. 퍼옥시데이즈 활성은 제조자의 지침에 따라 ECL 키트(Intron)를 사용하여 화학발광으로 검출하였다.

pVHL 및 라민 A 간의 상호작용을 조사하기 위하여, 단백질 추출물에 pVHL 또는 라민 A/C (2g/샘플)에 대한 항체를 첨가하였다. 4℃에서 2시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 단백질 A 및 단백질 G를 첨가하였다. PBS로 2회 세정한 후, 침전물을 RIPA 완충액과 SDS 샘플 완충액으로 용해시켰다.

5. 면역형광(IF) 분석

핵 형상을 조사하기 위하여, 정해진 벡터로 형질주입된 세포를 4℃에서 10분 동안 100% 메탄올로 고정시켰다. PBS로 세정한 후, 블로킹 완충액(PBS + 1% BSA + 정상 고우트 Ab)으로 1시간 동안 배양하였다. PBS로 2회 세정한 후, 2시간 동안 블로킹 완충액에 항-라민 A/C 항체(1:200)를 첨가하여 반응시킨 후, 2시간 동안 블로킹 완충액에 항-래빗 Ab-FITC 또는 항-래빗 Ab-로다민(1:1000)을 첨가하여 반응시키고, 마운팅하였다. DAPI로 핵을 염색하였고, 면역형광 신호를 형광현미경(Zeizz)을 통해 분석하였다.

6. RNA 분리 및 RT-PCR

RT-PCR을 위하여, Qiagen RNA 추출 키트를 이용하여 총 세포성 RNA를 추출하였다. RNA 농도를 측정한 후, MMLV RT(invitrogen) 및 랜덤 헥사머를 이용하여 총 RNA 1 ㎍을 cDNA로 역전사하였다. RT-PCR은 다음과 같은 특정 프라이머를 사용하여 수행하였다:

라민 A/C - 정방향 프라이머: 서열번호 1(5'-AAGGAGATGACCTGCTCCATC-3'), 역방향 프라이머: 서열번호 2(5'-TTTCTTTGGCTTCAAGCCCCC-3')

GAPDH - 정방향 프라이머: 서열번호 3(5'-ATCTTCCAGGAGCGAGATCCC-3'), 역방향 프라이머: 서열번호 4(5'-AGTGAGCTTCCCGTTCAGCTC-3')

7. MTT 분석

세포 생존율을 측정하기 위하여, 24시간 동안 정해진 벡터 또는 si-RNA로 세포를 형질주입 시켰다. 세정 후, 세포를 아드리아마이신과 캄프토테신으로 2시간 동안 처리하였다. MTT 분석을 위하여, 37℃에서 4시간 동안 세포를 0.5 mg/ml MTT 용액과 반응하였다. 과량의 용액을 제거한 후, 침전물을 200 ㎕의 DMSO로 용해시키고 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

8. 루시퍼레이즈 분석

p21 활성 분석을 위하여, p21-luc 벡터를 siRNA와 같이 293 세포에 24 시간 동안 형질주입 시켰다. 세정 후, 세포를 2시간 동안 아드리아마이신으로 처리하였다. 세정 완충액(promega)으로 세정한 후, 세포를 라이시스 완충액으로 용해시켰다. 루시퍼레이즈 활성을 발광측정기(Luminometer)로 측정하였다.

9. 인간 백혈병 시료 준비

백혈병 환자와 정상인의 혈액 샘플을 부산대학교 의학센터로부터 제공받았다. WBC를 모은 후, 사용 전까지 세포를 -70℃에서 보관하였다. 진단은 일반적인 절차로 수행하였다. 세포주를 확립하기 위하여, WBC를 DMEM(15% FBS 함유)에서 배양하고 3종류의 안정하게 성장한 세포를 얻었다.

10. 실험결과

1) RCC의 핵막 불규칙성은 프로게린 발현 증가에 따른 것이다.

인간 RCC 세포주인 UMRC2(C2)는 HGPS 세포와 함께 유사한 핵막 불규칙성을 나타내었다(도 1A 및 도 1B). 또한, Caki-2 세포주에서도 유사한 핵막 불규칙성을 관찰할 수 있었다(도 8A).

HGPS 세포에서의 핵 변형이 프로게린 발현에 영향을 미치기 때문에 프로게린 전사물을 RCC 세포주 C2에서 RT-PCR로 조사한 결과, 유방암 세포주인 MCF-7과 비교하면 C2는 프로게린 발현을 상승시키는 것으로 확인되었으며(도 1C), 이러한 프로게린 발현을 웨스턴 블롯으로 관찰하였다(도 1D).

프로게린이 RCC의 핵막 불규칙성에 관여하는지를 판단하기 위하여, 프로게린에 대한 si-RNA을 제작하고 C2 및 Caki2 세포에 형질주입 시킨 결과, RCC 세포의 핵막 불규칙성은 프로게린의 제거에 의해 개선되었다(도 1E 및 도 8C). 또한, 프로게린의 제거는 라민 A/C 발현을 증가시켰다(도 1D 및 도 1E).

그리고, 라민 A/C 발현에 대한 프로게린의 억제 효과를 관찰한 결과, 프로게린의 제거는 HGPS 세포에서 핵 변형을 개선시켰다(도 1F).

이러한 결과로부터 HGPS의 핵 변형과 RCC의 핵막 불규칙성은 프로게린의 발현 상승에 따른 것으로 확인되었다.

2) pVHL은 프로게린 발현을 억제한다.

pVHL이 RCC에서 자주 변형되기 때문에 pVHL과 핵 변형 간의 상관관계를 검토하였다. 즉, C2의 핵 형상을 pVHL-안정화 형질주입 세포주 UMRC2V(C2V)와 비교한 결과, C2(C2V)에서 pVHL의 재발현은 핵 형상을 개선시켰다(도 9A).

pVHL이 프로게린 발현을 조절하는 방법을 규명하기 위하여, 프로게린 발현에 대한 pVHL의 영향을 검토한 결과, pVHL의 과발현은 프로게린 발현을 억제하는(도 2A) 반면, pVHL의 제거는 프로게린 발현을 증가시켰다(도 2B). 그러나, 라민 A 발현은 pVHL에 의해 영향을 받지 않았다(도 2A 및 도 2B).

또한, pVHL이 HIF-1a 발현을 억제하기 때문에, 프로게린 발현에 대한 HIF-1a의 영향을 검토한 결과, HIF-1a 과발현 또는 넉다운은 명시적으로 프로게린 발현을 변화시키지 않았다(도 9B 및 도 9C). 이러한 결과는 pVHL-유도 프로게린 억제는 HIF-1a와 무관한 경로에 의한 것으로 확인되었다.

프로게린에 대한 pVHL의 영향을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯을 통해 C2V에서의 프로게린 발현을 C2와 비교하여 분석한 결과, pVHL 발현 C2V 세포에서 프로게린의 발현이 감소되었으나(도 2C), 프로게린의 전사물은 pVHL 형질주입에 의해 의미있게 억제되지 않았다(도 2D). 따라서, pVHL은 전사 이후 단계에서 프로게린을 조절하는 것으로 확인되었다.

또한, pVHL은 E3 라이게이즈로서 알려져 있기 때문에 파동 추적 분석(pulse-chase analysis)을 통해 프로게린의 pVHL 의존성 반감기를 조사한 결과, pVHL은 명확하게 프로게린 발현을 억제하는 반면, 라민 A는 억제하지 않았다(도 2D). 이때, 상기 파동 추적 분석은 사이클로헥사마이드(cyclohexamide, CHX)를 이용하여 단백질의 신생을 막은 후 일정한 시간동안 단백질의 양이 감소하는 속도를 관찰하여 수행하였다.

프로게린 발현에 대한 pVHL의 역할을 확인하기 위하여, 돌연변이 pVHL로 형질주입 시킨 후, 프로게린 발현을 측정한 결과, 정상 pVHL과 달리, E3-라이게이즈 활성이 손상된 돌연변이 pVHL은 프로게린 발현을 억제하지 못하였다(도 2E).

라민 A/C를 이용한 IF 염색과 웨스턴 블롯을 통해 HGPS 세포의 핵 변형에 대한 pVHL의 영향을 조사한 결과, RCC 세포와 유사하게, pVHL 과발현은 핵 형상을 개선시켰다(도 2F).

이러한 결과로부터, pVHL은 단백질 턴오버 증진을 통해 프로게린 발현을 억제하는 것을 알 수 있다.

3) 프로게린은 프로게린-pVHL 간의 직접 결합을 통해 p53을 억제한다.

pVHL과 프로게린 간의 상호작용을 IP 분석을 통해 조사한 결과, 두 개의 단백질은 pVHL(Flag) 항체와 함께 침전되었다(도 10A). 라민 A가 비록 pVHL과 함께 이동할지라도 pVHL-프로게린 간의 결합 친화도는 pVHL과 라민 A 간의 결합 친화도보다 강한 것으로 나타났으며, GST-풀다운 분석을 통해 프로게린-pVHL 간의 직접적인 결합은 확인할 수 있었다(도 3B).

또한, RCC의 중요한 특징 중 하나는 유전적 변이없이 p53을 불활성화하는 것으로 알려져 있기 때문에, C2 세포에서 MDM2, COP1 및 Parc-1을 포함한 잘 알려진 p53 저해제의 p53 발현에 대한 영향을 검토한 결과, 이러한 p53 저해제의 넉다운은 p53 발현을 유도하지 못하였다(도 10A).

그리고, p53 불활성화와 프로게린 발현 간의 상관관계를 다음과 같이 조사하였다. 먼저, HGPS 세포에서 p53 발현을 조사한 결과, 정상 섬유아세포와 비교하면, p53 발현은 HGPS에서 가장 낮았으나(도 10B), 프로게린의 제거가 p53 발현을 유도할 수 있었다(도 10B). 또한, Caki-2에서 p53 발현과 DNA 손상에 대한 영향을 si-프로게린으로 형질주입 후 확인한 결과, 매우 낮은 p53 발현과 Adr에 대한 낮은 감도는 si-프로게린에 의해 회복되었다(도 4A). C2 세포로부터 유사한 결과를 얻을 수 있었다(도 4B).

FHIT 및 RKIP는 RCC에서 결손되는 것으로 알려져 있는데, RCC 세포주에서 p53의 조절에 대한 관련성을 조사한 결과, RKIP은 p53을 부분적으로 유도할지라도 p53 발현의 증가는 si-프로게린에 전적으로 의존하는 것으로 확인되었다(도 4C). 면역형광 염색을 통해 si-프로게린이 p53 발현을 유발할 수 있다는 유사한 결과를 얻었다(도 4D).

프로게린 넉다운에 대한 반응에서의 p53의 재활성화를 확인하기 위하여, p53의 전사 활성을 p21-루시퍼레이즈(luc) 활성을 통해 모니터링 한 결과, Adr 처리는 대조군인 C2 세포에서 p21-luc 발현을 증가시키지 못한(도 3D) 반면, si-프로게린은 Adr-유도 p21-luc 활성화를 복원할 수 있었다(도 3E).

MTT 분석을 통하여 세포 생존율을 모니터링 한 결과, DNA 손상 유발 세포사는 si-프로게린에 의해 복원되었다(도 3F).

이러한 결과로부터, 프로게린의 발현 상승이 p53-유도 세포사 및 종양 억제를 차단할 수 있음을 알 수 있다.

4) pVHL은 프로게린 의존적으로 p53을 활성화한다.

pVHL은 프로게린 발현을 차단하기 때문에(도 2), RCC에서 p53 발현에 대한 pVHL의 효과를 조사한 결과, pVHL의 강제적인 발현은 C2 및 Caki-2 세포주에서 MDM2 저해제인 너트린-3 뿐 아니라, DNA 손상제에 대한 p53의 반응성을 복원시켰다(도 4A 및 도 4B). C2V에서 p53 발현은 무자극 조건 하에서 C2 세포주보다 더 높았다.

pVHL은 직접적인 결합을 통해 p53을 활성화할 수 있다고 보고되어 있기 때문에, 프로게린-음성 세포주인 HCT116 및 A549에서의 pVHL의 효과를 검토하였다. 이러한 세포주에서는 p53의 의미있는 유도나 DNA 손상제에 의한 상승효과를 관찰할 수 없었다(도 4C 및 도 4D). 이러한 결과는 pVHL-매개 p53 유도는 프로게린 억제에 의해 얻어지는 것으로 확인되었다.

또한, si-프로게린과 pVHL을 함께 형질주입 시킬 경우 상승적으로 p53 발현을 증진시켰다(도 4E). 그러나, si-프로게린에 의해 C2V에서 DNA 손상에 대한 p53 반응성의 증진 또는 p53 유도는 관찰되지 않았다(도 11C). 이러한 결과는 RCC에서의 p53 불활성화는 프로게린의 발현 상승으로부터 기인하는 것이며, 이는 pVHL 결함에 의해 얻어지는 것으로 확인되었다.

또한, si-프로게린 또는 pVHL-형질주입된 HGPS 세포에서의 p53 발현을 조사한 결과, 두 조건 하에서, 프로게린은 공통적으로 감소되었고 p53은 증가되었다(도 4F 및 도 4G).

이러한 결과들을 고려하면, pVHL-매개 p53 활성화는 프로게린 억제를 통해 얻어지는 것을 알 수 있었다.

5) 프로게린은 p14-매개 p53 활성화를 차단한다.

프로게린이 p53 기능을 차단하는 상세한 분자적 기전 규명을 위하여, DNA 손상에 대한 p53의 반응성을 인간 조로증 세포주(HGPS 및 WS)에서 검토한 결과, 정상세포에서는 p53이 아드리아마이신(Adr)에 의해 명확하게 증가되는 반면, HGPS 및 워너 증후군 세포(WS)는 p53의 유도를 보이지 않았다(도 5A). 워너 증후군 세포는 DNA 손상-유도 p53 활성화에 대하여 반응을 나타내지 않는 것으로 알려져 있고, WS 세포는 프로게린을 발현시킬 수 있다는 것을 관찰하였다. 이러한 결과로부터, 프로게린은 DNA 손상-유도 p53 활성화 경로를 차단할 수 있음을 알 수 있다.

p53은 MDM2 경로에 의해 조절되기 때문에 MDM2-매개 p53 억제에 대한 프로게린의 관련성을 MDM2와 p53 간 결합을 보다 잘 차단하며 p53 발현을 유도하는 너트린-3의 처리에 의해 조사한 결과, 이 화합물은 정상세포에서 p53을 명확하게 유도하였으나(도 4B), HGPS는 부분적으로 반응하였다(도 5B). 또한, 너트린-3은 C2 및 Caki-2 세포주에서는 명확하게 p53을 유도하지 못하였다(도 4B). 이러한 결과를 종합하면, 프로게린의 상승된 발현은 DNA 손상-유도 p53 활성화와 MDM2-매개 p53 억제와 관련되는 것으로 판단되었다.

또한, p14/ARF는 MDM2 저해제이며 ATM/ATR-의존성 DNA 손상 신호에 의해 활성화 되기 때문에, p14/ARF는 프로게린-매개 p53 억제의 없어진 링크에 관한 강한 후보로서 판단되어 이를 조사하기 위하여, p14/ARF로 형질주입시킨 후 p53 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과, DNA 손상은 C2 세포에서 p53 발현을 유도하지 않았다. 그러나, si-프로게린은 이러한 반응성을 복원하였다(도 5C). 또한, si-프로게린은 p14/ARF의 발현을 증가시켰다(도 5C). 이를 재확인하기 위하여, si-프로게린 및 p14로 형질주입 시킨 후 HGPS에서 p53의 발현을 측정한 결과, 이러한 세포에서 프로게린의 제거와 p14의 과발현은 p53 발현을 상승적으로 유도하였다(도 12A).

또한, 프로게린-유도 p53 불활성화에 대한 p14의 효과를 검토한 결과, p14/ARF는 HCT116에서의 p53의 반응성을 증진시켰고, 프로게린은 p53 활성화를 차단하였다(도 5D). 그러나, p14의 과발현은 프로게린-유도 p53 억제를 극복하였다(도 5D). 또한, Caki-2에서 si-프로게린-유발 p53 활성화는 p14에 대한 si-RNA에 의해 차단되었다(도 5E). 이러한 결과로부터, p14는 프로게린의 하위인자로 작용하며 프로게린은 p14의 억제를 통해 p53 활성화를 차단함을 알 수 있었다.

또한, 프로게린은 핵 변형을 유발할 수 있기 때문에 HGPS의 핵 변성에 대한 p14의 영향을 조사한 결과, pVHL 및 si-프로게린이 핵 불규칙성 및 변성을 감소시킬지라도 p14 단독으로는 핵 변성을 개선시킬 수 없다(도 11B). 이러한 결과로부터, p53 조절에 있어서 프로게린-p14 간의 결합이 관련되며, 핵 변성 또는 불규칙성은 프로게린의 상승된 발현으로부터 야기됨을 알 수 있다.

6) pVHL은 프로게린 및 p14 간의 상호작용을 차단한다.

프로게린이 어떠한 기전으로 p14의 기능을 차단하는지를 확인하기 위하여, 프로게린 및 p14 간의 상호작용을 GST 풀다운 분석을 통해 모니터링 한 결과, p14는 라민 A가 아닌 프로게린과 특이적으로 상호작용을 하는 것을 발견하였다(도 6A). p14 및 프로게린 간의 특이적 상호작용을 확인하기 위하여, NBS-형질주입된 세포 용해물을 첨가하였다. 그러나, NBS 단백질은 라민 A 뿐 아니라, 프로게린과 상호작용을 하지 않았다(도 6A). 반면, pVHL-세포 용해물의 첨가는 p14-프로게린의 결합을 차단하였다(도 6B).

또한, 아티팩트(artifact)를 회피하기 위하여 GST-p14를 이용한 상호작용을 검토한 결과, 이전 결과와 동일하게 GST-p14는 프로게린과 특이적인 결합을 나타내었다(도 6C). 또한, pVHL은 GST-p14-프로게린 간의 상호작용을 차단하였다. 그러나, pVHL은 p14-GST 단백질과 결합하지 않았다(도 6C).

이러한 결과로부터 pVHL이 프로게린과 결합하여 p14를 유도한다는 이전 결과를 뒷받침해 주시며, p14-프로게린 상호작용은 pVHL에 의해 방해됨을 알 수 있었다. 따라서, RCC와 같은 pVHL-결핍 세포에서 프로게린은 p14와 결합하여 p53의 불활성화를 야기할 수 있다. 이를 재확인하기 위하여, p14-p53 관련성에 대한 프로게린의 효과를 조사한 결과, p53-p14 간의 상호작용은 프로게린에 의해 방해되었다(도 6D). 이러한 결과를 고려하면, pVHL-결핍 조건에서 상승된 프로게린은 p14를 차단하여 p53의 불활성화를 야기하였다. 또한, 프로게린의 제거가 p14 발현을 유도하기 때문에 p14의 단백질 안정성을 측정하였다(도 5C). 파동 추적 분석을 통해 프로게린은 p14의 반감기를 줄이는 반면 si-프로게린은 p14의 반감기를 연장하는 것을 확인하였다(도 6E). 또한, pVHL-형질주입된 세포에서 p14 반감기의 연장을 관찰하였다(도 6F). 이러한 결과는 pVHL은 프로게린 억제를 통해 p14의 반감기를 연장함을 알 수 있었다.

7) 프로게린의 발현은 인간 백혈병에서 상승된다.

프로게린은 p14 활성화를 통해 p53을 억제할 수 있기 때문에 다른 종류의 암에서도 프로게린 발현이 증가될 것으로 추정하고, 이를 확인하기 위하여 16개의 백혈병 혈액 시료와 3개의 정상 혈액 시료에서 프로게린의 발현을 조사하였다. 문헌에 따르면, 백혈병은 화학요법 및 방사선요법에 대한 저항성과 다형성 핵을 나타낸다고 알려져 있는데, 19개의 시료 중 반은 프로게린을 발현시켰다(도 7A). 그러나, 정상 시료는 프로게린 발현을 나타내지 않았고 급성 골수성 백혈병과 급성 림프성 백혈병 간의 차이를 관찰하지 못하였다(표 1).

이러한 시료들로부터, 3종류의 백혈병 세포주(KDJ62, SJW2.2 및 SJW 92)를 확립하고, 프로게린의 발현을 조사한 결과, SJW2.2 및 SJW 92는 프로게린의 발현을 나타내었다(도 7B). 프로게린이 제거 후 세포 생존율을 조사하였고, SJW 92는 si-프로게린에 민감한 것을 확인하였다. 그러나, KDJ62는 si-프로게린에 대한 반응을 나타내지 않았다(도 7C). 또한, 이들 세포주를 이용하여 p53의 활성화와 p-chk2를 통한 DNA 손상 반응을 검토한 결과, KDJ 62에서는 si-프로게린이 아드리아마이신 및 너트린-3에 대한 반응에서 p53 활성화 및 p-chk2를 유도하지 않았다. 반면, SJW2.2 및 SJW92는 si-프로게린에 대한 반응성을 나타내었다(도 7D).

이러한 결과로부터, SJW 92 및 SJW2.2.는 RCC와 같이 프로게린-의존성 p53 불활성화를 나타내었다. 따라서, RCC, 백혈병 및 전립선암을 포함한 여러 종류의 암은 p14-유도 p53 활성화와 DNA 손상 신호를 차단하는 프로게린 과발현을 통해 p53-유도 종양 억제 효과를 차단함을 알 수 있었다(도 7E).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
pVHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein), 프로게린 및 후보약물을 배양하는 단계; 및 상기 배양물 중 프로게린 발현 수준을 분석하여 pVHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein)-프로게린 간의 결합을 촉진하여 프로게린과 p14 간의 결합을 억제하는 후보약물을 선별하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 신장암, 백혈병 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 암질환; 및 워너 증후군 또는 허친슨 길포드 증후군에서 선택된 조로증으로 이루어진 군에서 선택된 노화 관련 질환 치료제 스크리닝 방법.
삭제