WO2006015560A1

WO2006015560A1 - Immunmodulierendes mittel in verbindung mit chemotherapeutischen massnahmen

Info

Publication number: WO2006015560A1
Application number: PCT/DE2004/001801
Authority: WO
Inventors: Burghardt Wittig; Manuel Schmidt; Heribert Bohlen
Original assignee: Mologen Ag
Priority date: 2004-08-09
Filing date: 2004-08-09
Publication date: 2006-02-16
Also published as: ES2621123T3; US9212366B2; EP3202407A1; US20090053250A1; WO2006015872A9; EP1776124B1; DK1776124T3; PL1776124T3; EP1776124A1; WO2006015872A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von DNA-basierten Immunmodulatoren in Form von kovalent geschlossenen Desoxyribonukleinsäuremolekülen, enthaltend immunstimulatorische Sequenzmotive zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen Behandlung von Tumorerkrankungen in Kombination mit chemotherapeutischen Substanzen.

Description

IMMUNMODULIERENDES MITTEL IN VERBINDUNG MIT CHEMOTHERAPEUTISCHEN MASSNAHMEN

Beschreibung

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines kovalent geschlossenen Nukleinsäure- moleküls zur Herstellung eines Arzneimittels, welches in Kombination mit Che¬ motherapeutika zur therapeutischen Behandlung von Tumorerkrankungen dient.

Tumorerkrankungen sind eine der wesentlichsten Todesursachen in der industriali- 5 sierten Welt. Etablierte Methoden der Therapie von Krebserkrankungen wie chirur¬ gische Entfernung, Bestrahlung und Chemotherapie führen häufig bestenfalls zu einem zeitlich begrenzten Rückgang der Erkrankung. Bestimmte karzinogene Er¬ krankungen, wie das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom, sind jedoch beispielswei¬ se nicht operabel und die Lebensdauer der Patienten beträgt derzeit mit oder ohne 10 Therapie ungefähr 1 Jahr.

Die Wirksamkeit der Chemotherapie beruht vor allem darauf, dass besonders dieje¬ nigen Zellen empfindlich auf den Angriff von Medikamenten reagieren, die sich ständig teilen und vermehren. Dies sind in erster Linie die malignen Tumorzellen. Da sich aber auch gesunde Zellen verschiedener Organsysteme teilen, reagieren 15 auch diese empfindlich auf die Chemotherapie. Einige Zytostatika sind dabei selbst krebserregend, mutagen oder keimbahnschädigend. Aus diesem Grund wäre eine kurze Behandlungsdauer mit wenigen Chemotherapie-Zyklen von großem Vorteil für die Patienten, um die Nebenwirkungen für den Patienten gering zu halten.

Eine der großen Herausforderungen bei der Anwendung der Chemotherapie ist aber 20 nicht nur die Reduzierung der Nebenwirkungen. Es zeigt sich auch, dass gewisse Krebsarten eine Resistenz gegen Medikamente der Chemotherapie entwickeln. Trotz aller teilweise schweren Nebenwirkungen bleibt die Chemotherapie dennoch eine unverzichtbare Säule der Krebsbehandlung. Stand der Technik

Chemotherapien erfolgen üblicherweise in mehreren Zyklen, die von 2- bis 4- wöchigen Behandlungspausen unterbrochen sind. In dieser Zeit wirken die Medika¬ mente und der Patient kann sich von den Nebenwirkungen erholen.

Die Chemotherapeutika vernichten die Tumorzellen durch biochemische Reaktio¬ nen, die den Zelltod einleiten.

Zellen können durch zwei Arten des Zelltodes untergehen, durch Apoptose, den programmierten Zelltod, oder durch Nekrose, den provozierten Zelltod. Tumorzellen gehen durch Nekrose zu Grunde. Der Zellkern zerfällt und die inneren Strukturen der Tumorzelle lösen sich auf. Dadurch wird eine Immunantwort ausgelöst, in deren Folge Zellen des Immunsystems angelockt werden. Sie grenzen die Nekrose zu lebensfähigem Gewebe ab und zersetzen die Proteine der abgestorbenen Zellen.

Im Gegensatz zu Pathogenen, die in den Körper eindringen, induzieren die beim Zerfall freigesetzten tumor-assoziierten Antigene (TAA) meistens nur eine schwache Immunantwort. Um gegen solche Antigene eine suffiziente Immunantwort zu indu¬ zieren, muß die vorhandene immunologische Toleranzschwelle durchbrochen wer¬ den. Aus diesem Grund besteht ein Therapieansatz darin, die Wirkung der Chemo¬ therapie durch Kombination mit anderen Therapien, u.a. durch zusätzliche Verabrei¬ chung von Interferonen oder Zytokinen, zu verbessern und so das körpereigene Immunsystem zu unterstützen (McDermott et al., 2004, Expert Opin Biol Ther. 4: 455-68).

Bei Versuchen zur Stimulation von Immunantworten ist beobachtet worden, daß gewisse Nukleinsäuresequenzen, die CpG-Motive (CpG = unmethyliertes Cytosin- Guanosin) aufweisen, eine enorme immunstimulatorische Wirkung haben können. Solche nicht methylierten CpG-Motive kommen in bakterieller DNA vor und stellen für das Immunsystem ein „danger signal" dar (Krieg, Nat. Med 2003, 9: 831-835).

In Mausexperimenten zeigte sich, daß die Verabreichung von CpG-reichen DNA- Sequenzen zu einer starken Aktivierung der B-Lymphozyten führt und die Expression bestimmter Zytokine, beispielsweise von IL-6 und GM-CSF, anregt. Zusätzlich induzieren sie über die Zytokine lnterleukin-12, Interferon-gamma und Tumomekrosefaktor-alpha eine zytotoxische, also T_H1 -betonte, Immunantwort. Die zytotoxischen T-Lymphozyten des T_H1 -Armes sind in der Lage, Tumorzellen anzugreifen und zu zerstören. Daneben führen CpG-Motive zur Aktivierung von NK- (natural killer) und dendritischen Zellen (Klinman et al., 1996, PNAS USA 93: 2879, Sparwasser et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 2045).

Klinische Versuche der Phase l/ll zur Verwendung von CpG-haltigen Oligonukleotiden zur Unterstützung der Therapie von metastasiertem Brustkrebs mit Herceptin (HER) wurden durchgeführt. Die Therapie führte in einem signifikanten Anteil an Patienten zu einer Tumorregression (Baselga et al., 1996, J. Clin. Oncol. 14: 737-744). Im Gegensatz zu den Chemotherapeutika ist das Wirkungsprinzip von Herceptin ein völlig anderes. Bei etwa 20 Prozent aller Brustkrebspatientinnen wird das HER-2 Rezeptorprotein auf den Krebszellen überexprimiert. Herceptin, ein monoklonaler Antikörper, bindet gezielt an Teile des HER-2 Rezeptors und blockiert ihn, so daß keine Wachstumssignale mehr ausgesandt werden. Bei HER-2- negativen Tumoren finden sich auf den Krebszellen dagegen keine oder zu wenige Andockstellen für den Antikörper. Das Wachstum dieser Zellen wird von ihm so we¬ nig beeinflusst, dass eine Blockade des Rezeptors keinen Effekt hat; diese Patien¬ tinnen haben keinen Nutzen von einer Therapie.

Das US-Patent 6,653,292 zeigt ein Konzept auf, Tumor-Erkrankungen per Kombina¬ tion von Zytokinen, bspw. GM-CSF, mit chemotherapeutischen Maßnahmen als auch mit der Kombination von immunstimulatorischen CpG-enthaltenen Oligonukle¬ otiden mit Chemotherapie zu behandeln. In-vivo bzw. in-vitro Daten oder klinische Ergebnisse, die die Wirksamkeit der beanspruchten Kombinationen belegen, kön¬ nen allerdings nicht gezeigt nicht gezeigt werden.

Die in beiden Fällen eingesetzten linearen CpG-Oligonukleotide sind zum Schutz vor deren Abbau durch zelluläre Enzyme an ihren Enden mit Phosphorthioaten ge¬ schützt. In klinischen Studien zeigte sich allerdings, dass diese Thioat- Verbindungen erhebliche nachteilige Nebenwirkungen, vor allem auf das Blutgerin¬ nungssystem und das Komplementsystem, haben (Sheehan et al., 1998, Blood 92: 1617-1625). So wurde in Rhesus Affen eine starke Toxizität der thioat-geschützten CpG-Oligonukleotide infolge der Aktivierung des Komplementssystems nachgewie¬ sen (Henry et al., 2002, Int. Immunopharmacol 2: 1657). Zudem führen die Thioat- Modifikationen zu einer signifikanten Milzvergrößerung, zur Zerstörung lymphati- - A -

scher Follikel und zur Immunsuppression nach wiederholter Anwendung in Mäusen (Heikenwalder et al., 2004, Nat. Med. 10: 187).

Diese gravierenden Nebenwirkungen, lassen eine Anwendung thioat-geschützter CpG-Oligonukleotide in der Tumortherapie nur unter großem Vorbehalt zu.

Aus der EP 1 196 178 B1 sind weiterhin immunstimulatorische Nukleinsäurese- quenzen (ISS) bekannt, die ebenfalls CpG-Motive enthalten, nur einige Basen lang sind und nicht über die Expression von auf ihnen kodierten Proteinen wirken. Es handelt sich dabei um hanteiförmige, kovalent geschlossene Desoxyribonukleinsäu¬ remoleküle. Sie bestehen aus Oligonukleotiden, deren Basen partiell mit sich selbst paaren können und einer oder zwei Haarnadelschleifen (Loop), die 30 Basen um¬ fassen und mehrere CpG -Motive enthalten (siehe Fig. 1 ). Die Lehre vom Gebrauch und Herstellung immunstimulatorischer, CpG-enthaltender ISS ist in der EP 1 196 178 B1 umfassend erläutert. Die kovalent geschlossenen Desoxyribonukleinsäure¬ moleküle können mit Vorteil aus offenkettigen Desoxyribonukleinsäuremolekülen, welche eine in Teilen selbstkomplementäre Sequenz aufweisen und miteinander oder einem zweiten Molekül ein intermediär stabiles Hybrid bilden können, gewon¬ nen werden. Vorteilhafterweise kann das Molekül auch durch intramolekulare Ligati- on eines Moleküls, welches mindestens zwei selbstkomplementäre Bereiche auf¬ weist, welche durch nur eine Lücke im Phosphatrückgrat getrennt sind, gewonnen werden. Die so gewonnenen Moleküle weisen keine freien 5^'- oder 3^'- Enden auf und sind somit nicht für Exonukleasen zugänglich.

Vorzugsweise umfaßt das immunmodulierende Oligodesoxyribonukleotid nach der EP 1 196 178 B1 eine Sequenz mit der Basenfolge N¹N²CGN³N⁴, wobei N¹N² ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N³N⁴ ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend CT oder TT, sowie C Desoxyzyto- sin, G Desoxyguanosin, A Desoxyadenosin und T Desoxythymidin ist. Vorzugswei¬ se ist die Sequenz mit der Basenfolge N¹N²CGN³N⁴ im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert und besagtes Desoxyribonukleinsäuremole¬ kül umfasst 40 bis 200 Nukleotide.

Trotz langjährigen Forschungen und erfolgversprechenden Ansätzen, ist es bisher nicht gelungen, eine wirksame Therapie gegen Tumorerkrankungen zu entwickeln. Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein Arz¬ neimittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen zur Verfügung zu stellen, wel¬ ches zu einer effektiven gegen die Tumor-Antigene gerichteten humoralen und zel¬ lulären Immunantwort führt.

Lösung der Aufgabe und Vorteile der Erfindung

Das grundsätzliche Problem in der Erkennung eines Tumors durch das körpereige¬ ne Immunsystem besteht darin, dass Tumore im Gegensatz zu den meisten Mikro¬ organismen keine Entzündungsreaktion auslösen. Dadurch fehlt dem Immunsystem das Signal zum Start der Immunreaktion. Die Tumorzellen werden nicht als entarte- te Zellen erkannt und können dadurch ungehindert wachsen und sich vermehren.

Durch das nekrotische Absterben der Tumorzellen infolge der Chemotherapie wer¬ den Zelltrümmer und molekulare Bruchstücke aus dem Zytoplasma freigesetzt. Die¬ se freigesetzten Strukturen, die auch als Tumor-Antigene bezeichnet werden, bilden wichtige Erkennungs- und Zielstrukturen für den Angriff des Immunsystems gegen den Rest-Tumor oder im Körper verstreute Tumorzellen. Als Folge chemotherapeu¬ tischer und/oder strahlentherapeutischer Maßnahmen mit teilweise hoch-toxischen Zytostatika, befinden sich aufgrund der eintretenden Nekrose der Zellen eine Viel¬ zahl von Antigenen im Körper. Das körpereigene, angeborene (innate) Immunsys¬ tem hat jedoch keine evolutiv ausgebildete Spezifität für solche Strukturen wie es für Mikroben oder andere externe Krankheitserreger vorhanden ist. Tumor-spezifische antigene Strukturen werden aus diesem Grund nur schlecht oder nicht erkannt vom innaten Immunsystem. Das hat zur Folge, dass die Tumor-Antigene durch das inna¬ te Immunsystem nicht effektiv bekämpft werden. Da das adaptive Immunsystem noch nicht durch Tumor-Antigene in Abwesenheit von notwendigen Kofaktoren wie Entzündungssignalen ausgelöst ist, ist eine spezifische Immunantworten gegen die Tumor-Antigene noch nicht hervorgerufen.

Dieses Problem wird durch die erfindungsgemäße Verwendung von DNA-basierten Immunmodulatoren und die erfindungsgemäße Kombinationsvakzine gelöst.

Die Erfindung macht sich die Erkenntnis zunutze, dass eine unspezifische Immun- antwort in eine adaptive, spezifische Immunantwort überführbar ist, sofern auch in unmittelbarem Zusammenhang die Antigene, gegen die sich die Immunantwort rich¬ ten soll, vorhanden sind.

Durch die Verabreichung von DNA-basierten Immunmodulatoren wird dem körper¬ eigenen Immunsystem eine Infektion vorgetäuscht, die tatsächlich nicht stattgefun- den hat. Infolgedessen werden Zellen, also vor allem die Thymozyten mit Helfer¬ funktion und die zytotoxischen Thymozyten, B-Lymphozyten und sog. NK (natural killer)-Zellen, Makrophagen und Monozyten sowie dendritische Zellen und ihre Vor¬ läufer, sowie bisher in ihrer Funktion nicht aufgeklärte Zellpopulationen mit Funktio¬ nen innerhalb des Immunsystems zur Proliferation, Migration, Differenzierung oder Aktivität angeregt und zum Infektionsort „gelockt". Die verschiedenen Immunzellen, ob in den beschriebenen Prozessen neu gebildet oder durch Botenstoffe „ange¬ lockt", finden allerdings am Infektionsort keine Infektionserreger. Infolge der Chemo¬ therapie befinden sich jedoch die durch Nekrose freigesetzten Tumor-Antigene im Körper. Die durch die DNA-basierten Immunmodulatoren ausgelöste Immunreaktion führte wie beschrieben zur Bildung von Immunzellen. Diese fressen nun die Tumor- Antigene anstelle der nicht vorhandenen Infektionserreger und präsentieren sie als molekulare Bruchstücke dem adaptiven Immunsystem. Dadurch lernt das adaptive Immunsystem die molekularen Erkennungs- und Zielstrukturen der Tumorzellen kennen und bildet immer mehr spezifische Immunzellen gegen diese aus. Das Im- munsystem ist dadurch in die Lage versetzt worden, auch zukünftig Abwehr- und Zerstörungszellen gegen diese auszubilden.

Die DNA-basierten Immunmodulatoren führen zur Bildung von Gedächtnisantige¬ nen, sog. Recall-Antigenen. Durch spezielle Abwehrzellen kann sich das Immunsys¬ tem an diese Antigene "erinnern" und es kommt zur Auslösung einer zellulären Im- munantwort bei erneutem Kontakt (siehe Fig. 7).

Die Erfindung betrifft somit die neuartige Verwendung von DNA-basierten Immun¬ modulatoren, entsprechend Anspruch 1 und folgende, zur Herstellung eines Arz¬ neimittels, welches in Kombination mit Chemotherapeutika in der Tumortherapie eingesetzt wird.

Bei den DNA-basierten Immunmodulatoren handelt es sich um hanteiförmige, kova- lent geschlossene, CpG-Motive enthaltende Desoxyribonukleinsäuremoleküle. Die immunmodulierende Wirkung der hanteiförmigen, kovalent geschlossenen Des¬ oxyribonukleinsäuremoleküle hängt stark von der Loop-Doppelstrang-Kombination sowie den enthaltenen CpG Motiven ab. Die Linearisierung, die Deletion einer Haarnadelschleife, die Verkleinerung des Moleküls oder die Entfernung von CpG Motiven aus dem Molekül führt zu einem veränderten Induktionsmuster von Zytoki¬ nen.

Erfindungsgemäß werden daher Oligodesoxyribonukleotide eingesetzt, wobei das immunstimulierende Oligodesoxyribonukleotid

a) eine Sequenz mit der Basenfolge N¹N²CGN³N⁴ umfasst, wobei N¹N² ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N³N⁴ ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend CT oder TT, sowie C Desoxycytosin, G Desoxyguanosin, A Desoxy- adenosin und T Desoxythymidin ist,

b) und einen zirkulären Strang Desoxyribonukleinsäure mit einer teil- weise zueinander komplementären, antiparallelen Basensequenz umfasst und hanteiförmig ausgebildet ist.

Die Sequenz mit der Basenfolge N¹N²CGN³N⁴ ist dabei im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert und umfasst 40 bis 200 Nukleotide.

Die in der EP 1 196 178 B1 beschriebenen immunmodulierenden Desoxyribo- nukleotide sind bevorteilt. Es war aber weder beschrieben noch war es zu erwarten, dass diese immunmodulierenden Desoxyribonukleinsäuremoleküle dazu geeignet sind, der Anregung des körpereigenen Immunsystems als vorbereitende Maßnahme bei Vorliegen der Diagnose einer malignen Tumorerkrankung bei gleichzeitig indi¬ ziertem Einsatz von Zytostatika zu dienen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend eine Reihe allgemeiner Begriffe wie folgt verstanden:

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Behand¬ lung" die prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung eines Arzneistoffes. Immunstimulation/ Immunmodulation bezeichnet die therapeutische Beeinflussung der Immunreaktion, also der Abwehrbereitschaft des Organismus. Das Ziel einer solchen Therapie ist es, den Tumor mit körpereigenen Mitteln zu bekämpfen.

Unter Chemotherapie soll die systemische medikamentöse Therapie von Tumorer- krankungen mit sog. Zytostatika verstanden werden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff Chemothera¬ peutika Zytostatika, die in der adjuvanten, palliativen und kurativen Tumortherapie üblicherweise eingesetzt werden. Dazu gehören beispielsweise, aber nicht aus¬ schließlich und abschließend, Chemotherapeutika

• aus der Gruppe der Topoisomerase-Inhibitoren, bspw. Irinotecan, Topote- can,

• aus der Gruppe der Alkylantien, bspw. Busulfan und Dacarbazin,

• aus der Gruppe der Platinverbindungen, bspw. Cisplatin, Carboplatin oder Oxaliplatin,

• aus der Gruppe der Antimetaboliten, bspw. Methotrexat, 5- Fluoruracil, Mer- captopurin oder Cytarabin,

• aus der Gruppe der Antracycline und Actinimycine, bspw. Mitoxantron und Amsacrin,

• aus der Gruppe der Vinca-Alkaloide, wie bspw. Vinorelbin,

• aus der Gruppe der Taxane, bspw. Paclitaxel und Docetaxel,

• sowie Zytostatika aus der Gruppe der AntiÖstrogene, bspw. Tamoxifen.

Im Sinne der Erfindung sind auch weitere nicht ausdrücklich genannte Zytostatika umfasst, die im Rahmen einer Chemotherapie zum Einsatz kommen. Bevorzugt sind Zytostatika oder Kombinationen davon, die nur in einem einzigen Zyklus einem Patienten verabreicht werden.

Der Begriff Tumorerkrankungen umfaßt karzinogene metastasierende Erkrankungen aus der Gruppe der Cervixkarzinome, der Mammakarzinome, der kolorektalen und rektalen Karzinome, der primären Leberzellkarzinome, der Prostatakarzinome, des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomes (NSCLC), der Pankreaskarzinome, der Harnblasenkarzinome und der Ovarialkarzinome, sowie weitere nicht genannte Tu¬ morerkrankungen.

Die aufgrund der neuen erfindungsgemäßen Verwendung resultierende Vakzine ist dazu vorgesehen, als Injektion für Patienten zu dienen, die diese in und unter die Haut und in die Muskulatur erhalten.

Die Verabreichung von Desoxyribonukleinsäuremolekülen, entsprechend Anspruch 1 und folgende, im unmittelbaren Vorfeld des Beginns einer Therapie am Patienten mit Zytostatika führt somit am Applikationsort infolge der stattfindenden Immunreak- tion zu einer hohen Konzentration an löslichen proliferationsfördemden Zytokinen und kostimulatorischen Molekülen im Verbund mit tumor-assoziierten Antigenen (TAA), die zu Aktivierung und Proliferation von tumor-spezifischen T-Zellen führt.

Ebenso werden in Folge der Injektionen mit Desoxyribonukleinsäuremolekülen ent¬ sprechend Anspruch 1 und folgende antigenpräsentierende Zellen (APC) und den- dritische Zellen (DC) an den Applikationsort dirigiert. Das Vorhandensein dieser beiden Zelltypen wirkt synergistisch auf die Präsentation von TAA und die verstärkte Präsentation der TAA wirkt seinerseits auf die aktivierten zytotoxischen T- Lymphozyten, die jetzt verstärkt gebildet werden.

Weiterhin führt die Injektion von Desoxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende zur Expression immunrelevanter Oberflächenmoleküle auf den Tumorzellen, eingeschlossen ICAM-1 , HLA-DR, CD80 und CD40. Das Adhäsi¬ onsmolekül ICAM-1 bewirkt die Aktivierung von Effektor-T-Helferzellen und über das HLA-DR konnte gezeigt werden, dass die Expressionsdichte des HLA-DR auf den Monozyten ein sehr guter Surrogatmarker für die Fähigkeit der Monozyten mit der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine (z.B. Tumomekrosefaktor-alpha, IL-1 , IL- 6, IL-8) zu reagieren, ist. In-vitro konnte gezeigt werden, das Desoxyribonukleinsäu¬ remoleküle entsprechend Anspruch 1 und folgende zur Bildung von Interferon- gamma und lnterleukin-6, ein weiterer Stimulator der Immunantwort und der Häma- topoese führt (siehe Fig. 2). Die verstärkte Expression der Oberflächenmoleküle ICAM-1 und HLA-DR auf B-Lymphozyten ist in Fig. 3 gezeigt.

Weiterhin verursachen die Desoxyribonukleinsäuremoleküle entsprechend An¬ spruch 1 und folgende eine verstärkte Proliferation von B-Lymphozyten, den Trä¬ gern der humoralen Immunantwort. Die B-Lymphozyten differenzieren sich entwe¬ der zu antikörperproduzierenden Plasmazellen oder zu Gedächtniszellen, die bei erneutem Kontakt mit dem bekannten Antigen direkt zur Antikörperproduktion über¬ gehen. Es konnte gezeigt werden, das die Desoxyribonukleinsäuremoleküle ent¬ sprechend Anspruch 1 und folgende zu einer verstärkten Sekretion der Immunglo¬ buline IgM, IgA und IgG führen (siehe Fig. 4). Die Antikörperisotypen IgGI und lgG2 wurden ebenfalls bestimmt, um einen möglichen Th2/Th1 shift in der Immunantwort nachzuweisen. Die Isotopenverteilung von Immunglobin gamma (IgG) für ein be¬ stimmtes Antigen spiegelt die Ausprägung der gesamten Immunantwort gegen die¬ ses Antigen wider. Dabei sind IgG -1 Subtypen charakteristisch für eine humorale Antwort, begleitet von einer verstärkten Ausschüttung von Interleukinen IL-4 und IL- 10 durch aktivierte Lymphozyten. Ein erhöhter Spiegel von Subtyp IgG 2 ist typisch für eine zelluläre Th1 -Antwort, begleitet von erhöhter Ausschüttung von IFN-gamma und lL-12.

Im Unterschied zu den im Stand der Technik bekannten linearen, thioat-geschützten CpG-Motive enthaltenden Oligonukleotiden, weisen die verwendeten Desoxyribo¬ nukleinsäuremoleküle, entsprechend Anspruch 1 und folgende, eine Reihe von Vor- teilen auf. Sie führen nicht zu einer Organvergrößerung, was am Beispiel der Orga¬ ne Leber, Milz und Lymphknoten in Mäusen im Vergleich gezeigt werden konnte (siehe Fig. 5). Ebenso konnten keine auftretenden Anomalien dieser Organe im Be¬ handlungszeitraum festgestellt werden.

Desweiteren führen sie nicht zu der beschriebenen Verlängerung der Blutgerin- nungszeit als Folge der Behandlung (siehe Fig. 6). Eine Erhöhung der Blutgerin¬ nungszeit würde zu einer verlängerten Blutungsdauer bei äußeren Wunden, Nasen¬ bluten, Zahnfleischbluten oder winzigen Verletzungen durch die Aufnahme von Nah- rung auf der Magen-Darmschleimhaut und bei Operationen führen. Weiterhin be¬ stünde die Gefahr innerer Blutungen, die evtl. zu spät erkannt werden.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, das die Gabe von Desoxyribonuklein¬ säuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende im Vorfeld einer Chemothe- rapie zu einer Hochregulation der Expression von Oberflächenantigenen an Tumor¬ zellen führt und damit die Tumorzellen für das Immunsystem besser erkennbar macht. Ebenso kommt es zur Aktivierung von Rezeptoren für wichtige Immunzellen, unter anderem NK-Zellen, die die Fähigkeit des Immunsystems zur Bekämpfung der Tumorzellen steigern. Desweiteren ist die verstärkte Bildung von Antikörpern, die ebenfalls die Tumorzellen zerstören können, zu beobachten. Lokale Interaktionen zwischen antigenpräsentierenden Zellen und Effektorzellen wie natürlichen Killerzel¬ len (NK-Zellen) und T-Lymphozyten sind wichtig für eine effektive Immunreaktion gegen Tumore.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Un- teransprüchen und der Beschreibung. Die überraschende Wirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittels zur Tumortherapie, sowie das erfindungsmäße Verfahren wird anhand der Tabellen und den Ausführungsbeispielen deutlich; es zeigt:

Fig. 1a und 1b: Schematische Darstellung kovalent geschlossener immunmo- dulierender CpG-Motive enthaltende Oligodesoxyribonukleoti- de: hanteiförmige Struktur mit jeweils drei, als dunkler Kreis dargestellten CpG-Motiven in den Haarnadelstrukturen der Loops; darin bedeuten I: Loop und II: Stamm.

Fig. 2: Zeigt die Ausschüttung der Zytokine Interferon-gamma und lnterleukin-6 nach der in-vitro Stimulation von periphären

Blutmonozyten (PBMCs) mit:

A: Negativkontrolle, Puffer

B: DNA-basierte Immunmodulatoren

C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide. Die Negativkontrolle führt erwartungsgemäß zu keiner Ausschüttung von Interferon- gamma oder lnterleukin-6. Beide Moleküle B und C sind in der Lage, die PBMCs zur Zytokinausschüttung anzuregen. Die Ausschüttung von Interferon-gamma wird durch B sogar signifikant um das 2,5 fache im Vergleich zu C gesteigert. Auch für das Zytokin lnterleukin-6 ist diese Tendenz der signifikant verbesserten Ausschüttung im Vergleich zu C sichtbar.

Fig. 3: Zeigt die Expression der immunrelevanten

Oberflächenmoleküle HLA-DR und ICAM-1 nach in-vitro Stimulation von B-Lymphozyten durch: A: Negativkontrolle, Puffer

B: DNA-basierte Immunmodulatoren

C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide.

Die Negativkontrolle führt erwartungsgemäß zu keiner Stimulation von HLA-DR oder ICAM-1. Die angegebenen Werte von 9,7% und 209.6 werden als Grundwerte für die mittlere Fluoreszenzintensität zur Berücksichtigung von nicht-stimulierten positiven Zellen benutzt. Beide Moleküle B und C führen zu einer Stimulation beider Oberflächenmoleküle. Wobei durch B und C annähernd gleiche Ergebnisse erreicht werden.

Fig. 4: Zeigt die erhöhte Antikörperproduktion nach in-vitro Stimulation von periphären Blutmonozyten (PBMCs) durch:

A: Negativkontrolle, Puffer

B: DNA-basierte Immunmodulatoren

C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide.

Die Negativkontrolle führt erwartungsgemäß zu keiner Stimulation der Immunglobuline IgM₁ IgA, IgGI und lgG2. B und C führen zu einer deutlichen Stimulation der Antikörperproduktion, wobei die IgA Ausschüttung durch B um das Dreifache im Vergleich zu C gesteigert wird. Die relativen Titer der Isotypen IgGI und lgG2 können als Indikator für die dominante Art der entstandenen Immunant¬ wort gewertet werden. Das Verhältnis von lgG2 und IgGI zeigt, das die DNA- basierten Immunodulatoren neben der humoralen Immunantwort auch eine zytotoxi¬ sche Immunantwort (Th1 ) auslösen. Fig. 5a: Es wurde untersucht, ob die DNA-basierten Immunmodulato¬ ren und die thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide auf den lebenden Organismus eine toxische Wirkung haben. Die Bestimmung erfolgte anhand der Gewichtszunahme der inneren Organe Leber, Milz und Lymphknoten Es wurden in

Mausexperimenten verabreicht:

A: Negativkontrolle, Puffer

B: DNA-basierte Immunmodulatoren

C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide. Die Negativkontrolle dient wieder als Grundwert. Die DNA-basierten Immunmodula¬ toren, B, führen unabhängig von der verabreichten Menge zu keiner Vergrößerung der Leber. Die thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide hingegen, führen schon bei der geringen Menge von 60 Mikrogramm zu einer signifikanten Lebervergrößerung.

Fig. 5b: Hier wurde der Einfluß von B und C auf das Organ Milz untersucht. Verabreicht wurde:

A: Negativkontrolle, Puffer

B: DNA-basierte Immunmodulatoren

C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide.

Die Negativkontrolle dient wieder als Grundwert. Die DNA-basierten Immunmodula- toren, B, führen auch hier unabhängig von der verabreichten Menge zu keiner Ver¬ größerung der Milz. Die thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide hingegen, führen schon bei der geringen Menge von 60 Mikrogramm zu einer signifikanten Milzvergrößerung, die eine Gewichtszunahme um fast das Fünfache zu A oder B darstellt.

Fig. 5c: Hier wurde der Einfluß von B und C auf die Lymphknoten untersucht. Verabreicht wurde:

A: Negativkontrolle, Puffer

B: DNA-basierte Immunmodulatoren

C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide. Die Negativkontrölle dient wieder als Grundwert. Die DNA-basierten Immunmodula¬ toren, B, führen auch hier wieder unabhängig von der verabreichten Menge zu kei¬ ner Vergrößerung der Lymphknoten. Die thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide hingegen, führen schon bei der geringen Menge von 60 Mikrogramm zu einer signifikanten Lymphknotenvergrößerung, die eine Zunahme um das Doppelte zu A oder B darstellt.

Fig. 6: Zeigt eine weitere Untersuchung zur toxischen Wirkung auf den Organismus infolge der Verabreichung der DNA-basierten Immunmodulatoren und thioat-geschützten CpG- Oligonukleotide. Als Parameter wurde hier die Verlängerung der Blutgerinnungszeit untersucht. Bei den zwei Abbildungen handelt es sich um zwei verschiedene Spender. Die partielle Thromboplastinzeit in Sekunden ist auf der Ordinate aufgetragen. Verabreicht wurde: A: Negativkontrolle, Puffer

B: DNA-basierte Immunmodulatoren

C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide.

Die DNA-basierten Immunmodulatoren zeigen in allen beiden Versuchen im Gegensatz zur Negativkontrolle zu keiner Verlängerung der Blutgerinnungszeit. Hingegen führen die thioat-geschützten CpG-Oligonukleotide im Vergleich zur Negativkontrolle und zu B zu einer deutlichen Verlängerung der Blutgerinnungszeit.

Fig. 7: Zeigt die Recall-Antigene von vier Patienten nach einem

Chemotherapie-Zyklus.

Alle Patienten befanden sich zu Beginn der Behandlung in einer fortgeschrittenen Phase der Erkrankung. Zur Beurteilung des klinischen Erfolges sollen folgende

Formulierungen entsprechend World Health Organization (1979) gelten: als eine partial Response (PR) wird der Rückgang der erfaßbaren Tumorherde um mehr als

50% in den letzten vier Wochen sowie die Unterdrückung neuer Tumorherde bezeichnet. Unter stable disease (SD) ist das Gleichbleiben des Zustandes zu verstehen. Eine mixed Response (MR) ist eine gemischte Reaktion, bspw. das

Fortschreiten der Metastasierung und ein Rückgang der Metastasen an einem anderen Ort. Eine complete Response (CR) bezeichnet den vollständigen Rückgang der Tumorherde.

Auswahl der Patienten: Patienten mit Cervixkarzinom, Mammakarzinom, kolorekta¬ lem und rektalem Karzinom, primärem Leberzellkarzinom, Prostatakarzinom, nichtkleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC), Pankreaskarzinom, Harnblasenkar¬ zinom und Ovarialkarzinom im Alter zwischen 18 und 70 Jahren, und einem Karnofsky-Index von 70-100 waren aufnahmeberechtigt. Ausschlusskriterien waren: eine vorhergegangene Zytokinbehandlung oder Chemotherapie, die weniger als 28 Tage zurücklag, Kreatinwerte über 265μmol/l, Bilirubinwerte über 51 μmol/l, nichtkompensierte Herzinsuffizienz, ventrikuläre Rhytmusstörungen, schwere psychiatrische Krankheiten, aktive Hepatitis A, B oder C, HIV Infektion.

Behandlung: Neben der Anamnese wurden die folgenden Parameter vor Begin der Behandlung bestimmt: physische Untersuchung, Hämatologie (Hämoglobin, Hematocrit, Leukozyten und Plättchenzahl), chemische Blutwerte and Urinanalyse. Es wurde für die Immunstatusbestimmung Blut genommen. DHT (Delayed type hypersensitivity) Hauttests wurden mit dem Multitest Merieux Test (Leimen, Germany) durchgeführt. Röntgenaufnahmen des Oberkörpers sowie Computertomographien des Oberkörpers und Abdomens wurden erstellt. Umfassende immunologische Untersuchungen, hämatologische Untersuchungen und grobe klinische Untersuchungen (physische Untersuchung, Ultraschall Untersuchung und Untersuchung des Unterleibes, bei Bedarf) wurden wiederholt durchgeführt. Eine komplette klinische und immunologische Untersuchung, vergleichbar mit der eingangs durchgeführten Auswahluntersuchung, fand am Ende eines Behandlungs-Zyklus statt.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass Patienten Injektionen von 500 Mikrogramm der Desoxyribonukleinsäuremoleküle entsprechend Anspruch 1 und folgende in und unter die Haut und in die Muskulatur erhalten. Dabei erhalten die Patienten im Zeit¬ raum um den jeweiligen Chemotherapie- Zyklus in festgelegten Abständen, die von 2 bis 8 Tagen reichen, fünfmal jeweils zwei Injektionen a 500 Mikrogramm mit Des- oxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende. Die Ge¬ samtmenge an verabreichten Desoxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend An¬ spruch 1 und folgende, in PBS-Puffer gelöst, beträgt somit pro Injektionstag 1000 Mikrogramm der Desoxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende. Die Gesamtmenge an Desoxyribonukleinsäuremolekülen variiert und liegt zwischen 1 und 10 Miligramm.

Die zwei Injektionen erfolgen am ersten Injektionstag an die typischen Impfstellen intradermal seitlich am linken und rechten Oberarm, am zweiten Tag intradermal auf der Vorderseite des linken und rechten Oberschenkels, am dritten Injektionstag subkutan ca. 30 Millimeter links und rechts des Bauchnabels, am vierten Injektions¬ tag subkutan in die beschriebenen Stellen der Oberarme und am fünften Tag intra¬ muskulär in die Vorderseite des linken und rechten Oberschenkels.

Injektionsschema für die Behandlung von metastasiertem Mammakarzinom:

Der Injektionszeitpunkt ist in Relation zum Beginn der Chemotherapie (Tag Null) mit Gemcitabin angegeben.

Für die begleitende Diagnostik werden den Patienten vor Beginn der Behandlung und vor den jeweiligen Injektionen bis zu 50 Milliliter Blut entnommen.

Patienten mit metastasiertem Cervixkarzinom werden nach der Injektion von Des¬ oxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende durch Be¬ strahlung behandelt.

Patienten mit metastasiertem Mammakarzinom werden nach der Injektion von Des¬ oxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende mit dem ge- bräuchlichen Chemotherapeutikum Gemcitabin oder mit Xeloda behandelt. Ebenso ist der Einsatz von Anthracyklinen (Epirubicin, Doxorubicin, Mitoxanthrane) in Kom¬ bination mit der Behandlung mit Desoxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 vorgesehen.

Patienten mit metastasiertem primären Leberkarzinom und Prostatakarzinom wer- den palliativ mit der Kombination an Desoxyribonukleinsäuremolekülen, entspre¬ chend Anspruch 1 und folgende, und Taxotere oder Desoxyribonukleinsäuremolekü¬ len, entsprechend Anspruch 1 und folgende, und Mitoxanthron behandelt.

Patienten, die an metastasiertem rektalen oder colorektalen Karzinom leiden, wer¬ den durch eine adjuvante oder palliative Therapie nach Injektion von Desoxyribo- nukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende mit der Zytostatika- kombination Leucovorin und 5-Fluorouracil (5-FU) behandelt. Ebenso ist die Kombi¬ nation mit FOLFOX 4 (Oxaliplatin, Folinsäure und 5-Fluorouracil) und FOLFIRI (Iri- notecan, Folinsäure und 5-Fluorouracil) nach der Injektion von Desoxyribonuklein¬ säuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende vorgesehen. AIIe Behandlungen finden nach vorgegebenen Zyklen statt. Dabei ist vorgesehen, nur einen Zyklus der Kombination bestehend aus der Behandlung mit Desoxyribo¬ nukleinsäuremolekülen und nachfolgender Chemotherapie durchzuführen. Sollte nach Beendigung des Chemotherapie-Zyklus eine weitere Behandlung notwendig sein, wird diese mit weiteren Injektionen mit Desoxyribonukleinsäuremolekülen ent¬ sprechend Anspruch 1 und folgende fortgesetzt. Ebenso kann die Behandlung durch immunotherapeutische Ansätze fortgeführt werden. Eine sofort anschließende Fortführung der Chemotherapie erscheint aus medizinischer Sicht nicht sinnvoll, wird aber nicht ausgeschlossen. Es erscheint durchaus möglich und ggf. auch ange- raten nach 6 Monaten die Behandlung fortzuführen, was im Sinne der Erfindung als weitere Verabreichung der erfindungsgemäßen Vakzine verstanden wird.

Beispiel 1 : Synthese kovalent geschlossener immunmodulierender Oligodesoxy- ribonukleotide entsprechend Anspruch 1 und folgende

Die Synthese kovalent geschlossener immunmodulierender Oligodesoxyribonukleo- tide wurde entsprechend der EP 1 196 178 B1 durchgeführt.

Zur Reinigung von Endotoxinen wurde das Ligationsprodukt einer anschließenden Anionenaustauschchromatographie (Trägermaterial: LiChrospher DMAE, Merck Darmstadt; 0-1 M NaCI in 50 mM NaPhosphat) unterworfen und durch Isopropa- nolpräzipitation konzentriert. Für in-vivo-Versuche wird das Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt und das Endprodukt in sterilem PBS aufgenommen.

Beispiel 2: Erhöhte Zytokinausschüttung durch DNA-basierte Immunmodulato¬ ren.

Periphere Blutmonozyten (PBMCs) in RPMI 1640 - Medium wurden in 96-Loch- Platten ausgesät. Die PBMCs wurden durch Zugabe folgender Substanzen: A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat- geschützte CpG-Oligonukleotide stimuliert und danach für 48h inkubiert. Die Inkubation der PBMCs erfolgte mit äquimolaren Mengen der eingesetzten Substanzen (1 Mikromol/Liter). Danach wurde der Überstand der Ansätze abgenommen und ein ELISA für die Zytokine Interferon-gamma und lnterleukin-6 durchgeführt. Auf der Ordinate ist Delta Ct aufgetragen. Delta Ct ist die Differenz der Ct-Werte (von Referenzgen minus Zytokin). Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.

Beispiel 3: Stimulation von immunologisch relevanten Oberflächenmolekülen auf B-Lymphozyten durch DNA-basierte Immunmodulatoren.

Die Inkubation von RPMI-8226 Zellen (Zelllinie der B-Lymphozyten) erfolgte über 48h mit äquimolaren Mengen (I Mikromol/Liter) der eingesetzten Substanzen (A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat- geschützte CpG-Oligonukleotide). Nach der Inkubation wurden die Zellen geerntet und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen die Oberflächenmoleküle HLA-DR und ICAM-1 angefärbt und im FACS gemessen. Aufgetragen auf der Ordinate ist die Fluoreszenzintensität, auf der Abszisse die Zellgröße. In Abb. A sind die Ergebnisse der mit Puffer stimulierten B-Lymphozyten aufgetragen. Danach sind 9,7% der lebenden Zellen positiv für das Oberflächenmolekül HLA-DR, für ICAM-1 209,6%. Diese Werte werden als Grundwerte angesehen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.

Beispiel 4: Erhöhte Antikörperproduktion durch DNA-basierte Immunmodulato¬ ren.

Periphere Blutmonozyten (PBMCs) in RPMI 1640 - Medium wurden in 96-Loch- Platten ausgesät. Die PBMCs wurden durch Zugabe folgender Substanzen: A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat- geschützte CpG-Oligonukleotide stimuliert und danach für 48h inkubiert. Die Antikörpertiter IgM, IgA und IgG wurden mittels ELISA bestimmt. Die Antikörperisotypen Ig1 und Ig2 wurden bestimmt, um ein Maß für die zelluläre und humorale Immunantwort zu erhalten. Die auftretenden Titer können als Indikator für die dominante Art der entstandenen Immunantwort gewertet werden. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Beispiel 5: Toxizitätsvergleiche anhand von Organvergrößerungen.

Weiblichen Mäuse (C57BL/6) wurden zu drei Gruppen, je 10 Tiere zusammengefaßt. Den Tieren wurde über eine Woche täglich 100 Mikroliter der

Substanzen: A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide intraperitoneal injiziert. Die

Konzentration der injizierten Substanzen betrug dabei 2,5 Mikrogramm/Mikroliter und 60 Mikrogramm/Mikroliter. Nach einer Woche wurden die Tiere betäubt und getötet. Milz, Leber, die inguinalen und mesenterialen Lymphknoten wurden entfernt und gewogen. Die statische Anlalyse wurde mittels ANOVA Test durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 a, b, c dargestellt.

Beispiel 6: Untersuchung des Einflusses auf die Blutgerinnungszeit.

Periphere Blutmonozyten (PBMCs) wurden durch Zugabe folgender Substanzen: A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat- geschützte CpG-Oligonukleotide stimuliert und danach für 3 min inkubiert. Nach der Zentrifugation wurde die Blutgerinnungszeit anhand der partiellen Thromboplastinzeit (aPPT) in Sekunden bestimmt und ist auf der Ordinate aufgetragen. Die Werte der Diagramme stammen von unterschiedlichen Spendern. Die Bestimmung der aPPT erfolgte nach dem klinischen Standard mittels des BBL Fibro System Fibrometer (Becton Dickinson). Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt.

Beispiel 7: Bestimmung der Recall-Antigene nach einem Chemotherapy-Zyklus

Nach dem ersten Chemotherapy-Zyklus erhaltene PBMCs wurden auf das Vorhandensein Recall-Antigen spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten untersucht. Die Bestimmung der Recall-Antigene erfolgte vor und nach der Therapie. Als Recall-Antigene wurden Zytomegalie- und Epstein-Barr Virus (CMV, EBV) verwendet. Die Werte wurden mittels durchflußzytometrischer Analyse bestimmt (siehe Fig. 7). Danach zeigt sich bei Pat12 (Patient 12) eine Steigerung der CD8 positiven Zellen um 723% nach dem ersten Zyklus.

Claims

Patentansprüche

1. Verwendung von DNA-basierten Immunmodulatoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Erzeugung einer spezifischen Immunantwort gegen Tumor- Antigene, die durch chemotherapeutische oder strahlentherapeutische Maß- nahmen freigesetzt werden, wobei die DNA-basierten Immunmodulatoren in

Form von hanteiförmigen, kovalent geschlossenen Desoxyribonukleinsäu¬ remolekülen vorliegen.

2. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei es sich bei den DNA-basierten Im¬ munmodulatoren um CpG-Motive enthaltende immunstimulatorische Nuk- leinsäuresequenzen handelt.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das immunstimulierende Oligodesoxy- ribonukleotid

a. eine Sequenz mit der Basenfolge N¹N²CGN³N⁴ umfasst, wobei N¹N² ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N³N⁴ ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend

CT oder TT, sowie C Desoxycytosin, G Desoxyguanosin, A Desoxy- adenosin und T Desoxythymidin ist,

b. und einen zirkulären Strang Desoxyribonukleinsäure mit einer teil¬ weise zueinander komplementären, antiparallelen Basensequenz umfasst und hanteiförmig ausgebildet ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Sequenz mit der Basenfol¬ ge N¹N²CGN³N⁴ im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert ist und wobei besagtes Desoxyribonukleinsäuremolekül 40 bis 200 Nukleotide umfasst.

5. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die immunmstimulierenden Oligodesoxyribonukleotide in eine applika¬ tionsfähige pharmazeutische Zusammensetzung überführt werden.

6. Arzneimittel zur Erzeugung einer spezifischen Immunantwort gegen Tumor- Antigene, die durch chemotherapeutische oder strahlentherapeutische Maß¬ nahmen freigesetzt werden, insbesondere eine Vakzine, entsprechend ei¬ nem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5.

7. Kombinationsvakzine zur Erzeugung einer spezifischen Immunantwort ge¬ gen Tumor-Antigene, die durch chemotherapeutische oder strahlentherapeu¬ tische Maßnahmen freigesetzt werden, bestehend aus zumindest zwei wirk¬ samen Komponenten, nämlich einem DNA-basierten Immunmodulator und einem Zytostatikum.

8. Kombinationsvakzine nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem DNA- basierten Immunmodulator um CpG-Motive enthaltende immunstimulatori- sche Nukleinsäuresequenzen handelt.

9. Kombinationsvakzine nach Anspruch 8, wobei das immunstimulierende ON- godesoxyribonukleotid

a. eine Sequenz mit der Basenfolge N¹N²CGN³N⁴ umfasst, wobei N¹N² ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N³N⁴ ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend CT oder TT, sowie C Desoxycytosin, G Desoxyguanosin, A Desoxy- adenosin und T Desoxythymidin ist,

10. Kombinationsvakzine nach Anspruch 9, wobei die Sequenz mit der Basen¬ folge N¹N²CGN³N⁴ im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert ist und wobei besagtes Desoxyribonukleinsäuremolekül 40 bis

200 Nukleotide umfasst.

11. Kombinationsvakzine nach Anspruch 7, wobei das Zytostatikum ausgewählt ist aus einer oder mehreren der Gruppe der Topoisomerase-Inhibitoren, aus der Gruppe der Alkylantien, aus der Gruppe der Platinverbindungen, aus der Gruppe der Antimetaboliten, aus der Gruppe der Antracycline und Actinimy- cine, aus der Gruppe der Vinca-Alkaloide, aus der Gruppe der Taxane, aus der Gruppe der Antiöströgene, sowie Kombinationen und Modifikationen da- von.

12. Kombinationsvakzine nach Anspruch 11 , wobei mehrere Zytostatika unter¬ schiedlicher Gruppen Bestandteil der Vakzine sind.

13. DNA-basierter Immunmodulator als Teil einer Kombinationsvakzine nach Anspruch 7 bis 12.

14. Zytostatikum als Teil einer Kombinationsvakzine nach Anspruch 7 bis 12.