CN102421901A

CN102421901A - 用于免疫调节的多联体

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Publication number: CN102421901A
Application number: CN2010800192919A
Authority: CN
Inventors: M·施罗夫; B·维蒂希; M·施密特; C·克洛斯
Original assignee: Mologen AG
Current assignee: Mologen AG
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2030-04-30
Also published as: US20120093804A1; EP2246433A1; KR101410146B1; MX2011011436A; EP2424988A1; IL216039A; IL216039A0; AU2010243546B2; AU2010243546A1; SG175209A1; WO2010125182A1; HK1169669A1; MY160401A; KR20120007519A; RU2556119C2; TWI454277B; CN102421901B; JP2012525132A; TW201038281A; CA2759165A1

Abstract

本发明涉及一种调节人类和动物免疫系统活性的聚合的、非编码核酸分子和其制备方法以及包括所述聚合的、非编码核酸分子的疫苗，其中聚合的、非编码核酸分子可理解为非编码核酸分子，包括至少四个共价键合分子(四聚体)或由更多彼此共价键合的非编码核酸分子组成(高分子聚合物)。

Description

用于免疫调节的多联体

本发明涉及一种调节人类和动物免疫系统活性的聚合的、非编码核酸分子和其制备方法以及包括所述聚合的、非编码核酸分子的疫苗，其中聚合的、非编码核酸分子可理解为非编码核酸分子，包括所述非编码核酸分子的至少四个共价结合分子(四聚体)。

在对各自病原体选择特异淋巴细胞、其克隆扩增和分化为效应细胞后，适应性免疫反应延迟(3-5天)开始，然后通过形成免疫学记忆对各自病原体提供长期持久的保护，先天性免疫系统细胞通过保守的病原体相关性分子图式(PAMP)由生殖细胞编码受体识别病原体并立即作出反应。不同的反应属于不同种类的细胞类型，如细胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)和趋化因子(如IL-8/CXCL8、MIP-1α/β、MCP-1)的分泌，效应物机制的激活(吞噬作用、呼吸放电、杀菌剂或细胞毒性物质或溶解颗粒的释放)，共刺激分子(CD80，CD86)的表达和MHC-分子的增强表达。因此，一方面效应细胞被募集和激活，这能消除已进入的病原体，另一方面，适应性免疫系统细胞接收为其激活所必要的信号。

为了提高免疫反应，CpG-寡核苷酸(CpG-ODN)已被用作一类新的免疫调节分子。这种非甲基化CG-基序能在细菌DNA中发现并代表了对于免疫系统的“危险信号”。病原体相关性分子图式(PAMP)引起先天性免疫系统的非特异性激活(Krieg，Nat.Med 2003，9：831-835)。CpG-ODN通过细胞因子白细胞介素-12、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α诱导基于T_H1的免疫反应。

包含所述CpG-ODN的免疫刺激核酸(ISS)具有若干个碱基长度以及不包括用于蛋白质表达的开放读框。

ISS表示线性核酸分子，其末端是开放的(游离羟基和磷酸基团)或由合成基团保护。

细胞免疫反应的刺激允许影响反馈环，其将不能对病人无干扰地产生令人满意的免疫活性。

可用于稳定CpG-DNA的CpC-ODN以硫代磷酸酯主链的修饰有一些严重缺陷。显著的毒性(Heikenwalder 2004，Levin 1999)和非特异性结合蛋白质(Brown 1994)特别属于该类。

由此，开发了新类型共价闭合免疫调节DNA(WO 01/07055/EP1196178)。这些DNA-分子由两个化学合成的DNA-ODN组成，在5’-端有自互补部分及在3’-末端有回文、重叠末端，使两个DNA分子的连接产生共价闭合分子。在非互补部分具有CG-基序的这些DNA-分子显示出与CpG-ODN相似的活性(增强的B-细胞上表面分子CD80、CD40、MHC的表达以及通过PBMC的IL-6、IFN-γ、IFN-α、IL-12、TNFα的分泌)，但与有硫代磷酸酯主链的CpG-ODN相比，对于诱导的细胞因子的表达模式其显示差异以及在小鼠中明显地更小毒性。现有技术中该免疫调节DNA对于人类和动物免疫系统的活性调节有若干缺陷。不可能以所希望的程度调节人类和动物免疫系统的活性，尤其是激活它。WO01/07055的分子，例如图1所示或权利要求11所示，由若干个脱氧核糖核苷酸支架组成，该脱氧核糖核苷酸支架形成部分单链哑铃型和共价闭合DNA分子，这在本发明的范围内指定为二聚体。根据WO 01/07055，用作初始材料的单体核酸在连接前被加热，接受相同的核酸分子，每一个由一哑铃型二聚体组成(对比WO 01/07055的图1)。所得的核酸是WO 01/07055图1所示的哑铃型。从本发明的意义上说，单体没有指定由例如单一碱基组成的结构，但是指定如下核酸，其本身由数个脱氧核糖核苷酸一磷酸组成(对比WO 01/07055的图1或权利要求11)，该脱氧核糖核苷酸一磷酸由于其给定的碱基序列或给定的三维构象而一起形成单体典型性能。

来自现有技术，本发明的目的是提供合适的免疫调节DNA分子，其起始改良的免疫反应及提供其制备方法和包括所述免疫调节DNA-分子的疫苗。

免疫调节在本发明文中意指免疫系统的介质和效应细胞，因此目前主要已知的有辅助功能的胸腺细胞和细胞毒性胸腺细胞、B-细胞和所谓的NK(自然杀伤)-细胞、巨噬细胞和单核细胞和树突细胞及其前体以及目前没有明确鉴别功能的在免疫系统内具有作用的细胞群通过使用核酸分子而被刺激以增殖、迁移、分化或其活性。免疫调节意指除了上述定义的含义中免疫反应的一般改良，免疫反应的类型或特征也将被影响，无论通过影响开始或成熟的免疫反应或对于已确立的反应改变其特性。

本发明请求保护的具有改良的免疫调节性质的分子与WO 01/07055聚合的、非编码核酸分子二聚体物质对比。聚合的核酸分子应被理解为所谓的高分子多联体(concatemer)。本发明的聚合分子可由包括以下步骤的方法制备：

-提供5’磷酸化脱氧核糖核苷酸(5’-phosphorylateddeoxyribonucleotide acid)；

-乙醇沉淀，随后在50℃干燥沉淀物或在50℃冻干所述DNA分子，尤其在存在MgCl₂的情况下，直到得到干残留物，然后在缓冲液中重悬；

-添加T4-DNA-连接酶，从而产生反应混合物；以及

-在37℃温育所述反应混合物至少30分钟。

多联体包括共价结合的单体单元，其完全环状闭合，在组成性单体距离内具有双链部分及免疫调节CG-基序，优选在单链部分内。完全惊人的是，包括四聚体、六聚体或共价闭合免疫调节DNA的高分子组装物的这些聚合物与现有技术中二聚体分子相比有惊人的改良效果。

本发明请求保护的聚合分子的分子特性在图1和图2示出，图3和图4示出功能特性，其得自本领域技术人员应用的制备方法。在描述的方法中使用具有回文5′-或者包括3′-末端的核酸分子作为离析物导致聚合物具有不同的大小，其中只有请求保护的四聚体或高分子组装物实现了高效力功能。由于扩展的和多样的分子大小，不可能通过结构特征来鉴别，而经由其制备方法鉴别所述聚合物是非常准确的。新方法提供了不同于现有技术中描述的产物。此可根据本发明图3所示的二聚体和聚合物性质上的明显差异来证明。本发明的高分子聚合物比现有技术中已知的非聚合结构出人意料的更适合免疫调节。

如果利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的等同方法纯化，尤其采用HPLC接着FPLC的联合纯化，本发明的分子也能通过在水里提供5’-磷酸化脱氧核糖核苷酸而制备。本领域技术人员已知通过几种高性能方法如HPLC或FPLC的联合可得到PAGE-纯化的类似纯化级别。

出人意料地，所述方法的单一步骤的顺序产生多聚体分子，包括环状稳定和与彼此共价结合的单体，单体具有至少24个核苷酸。同时形成的高分子聚合物通常包括偶数的单体组分。分子的生成链不包括游离5’-或3’-端。经分子间酯化形成本发明分子的单体特征如下：

-包括至少2个连续核苷酸的一部分，其在适宜的条件下与单体的另一部分形成双链茎；

-在这些反向互补部分间是至少4个核苷酸；

-被细胞结构识别的CG-基序优选存在于单链部分；

-修饰的核苷酸也可以是部分单链区域，其和脂肪酸、糖或氨基酸共价连接。

本发明的分子包括至少4个单体，在上述合成中关于其构象而形成。单体经分子间键通过形成共价键形成二、四、六或更多的链。这导致形成所谓的二聚体、四聚体或六聚体，除二聚体之外所有被指定为聚合物。

本发明的分子亦可被定义为多联体。在优选的实施方案中，本发明的分子是多联体分子，其中至少四个单独单体的环彼此连接，优选呈线性以便优选两个尤其优选若干双链部分彼此通过单链环元件分开。

本发明的分子与现有技术分子相比能更好的调节人类或动物免疫系统的活性。现有技术分子是已知的免疫调节核酸序列，其作为低分子哑铃型结构是有效的。最知名的免疫修饰短寡脱氧核糖核苷酸包括未甲基化胞嘧啶-鸟苷-基序。在本发明意义中，这种核酸的生理学作用也被理解为免疫调节或者包括免疫系统活性的调节。EP1 196 178公开了另外若干分子，由具有至少一个环的茎组成，其例如在EP1 196 178的图1和2中公开。在本发明的意义内，这种分子是二聚体结构。本发明不包括这种二聚体。应注意到术语聚合物在科学中有若干不同含义。聚合物可能例如是较长的核酸和包括若干形成较大组装物的相同或相似分子的结构。本发明的意义内，聚合物指定为分子的链，包括至少四个单体。如果使用优选的单体，产生的四聚体的分子量相当于大约170kDa(对比图2)。在本发明意义内，聚合物是例如若干茎-环结构，如图1所述，由若干相同或相似茎-环结构组装成更高级的结构(聚合物)。指定本发明的大于23kDa的所有分子是聚合物。对于描述的反应条件在连接过程中引起单体瞬时附着，其可通过连接酶酯化。在特定反应条件下，只为了进行确认，在合成中形成所得的聚合物。从已形成的二聚体中制备高分子聚合物是不可能的。形成聚合物的单体结构彼此共价连接。已形成的聚合物对于加热或变性剂是稳定的，这意味着反过来，所述二聚体不能从本发明的高分子分子用简单物理手段得到。

出乎意外的，相对简单的方法步骤能得到和二聚体结构相比有改良的、不明显性质的这种聚合结构。产生高分子组装物例如能经由离心、凝胶电泳或柱层析来检测并获得和二聚体相比对于免疫系统的调节具有改良性质的高复杂结构如四聚体、六聚体或其它(对比图3和4)来完成。在实验室生物体或人类中免疫调节的不同形式证明了这一点。

所有根据以下描述的脱氧核糖核酸能用于所述聚合方法。

5’-P-W-3’，其中：

-P、W、S是核酸，以列出的阅读顺序中经磷酸二酯连接“-”彼此连接；

-核酸P、W或S的序列包括至少一个脱氧核糖核苷酸序列CG基序；

-W是至少4个核苷酸长；以及

-核酸部分S和P的序列是彼此反向互补的。

所得的聚合物符合下式：

W-S-{P-W-S}_n-P-W-S-{P-W-S)_n-P

其中

-在式右边核酸P和左边核酸W共价连接；

-“n”通过标示内部单体单元的数量描述了串联化程度。

因为本发明请求保护的聚合物通过它们的确认获得其性质，在本发明意义内，聚合结构可从不连续的相同单体组装。核酸组W在这个连接中可包含具有B、U、K、Y序列的分子，核酸组P可包含具有J、E、R、G序列的分子，以及核酸组S可包含M，A，T，I序列。依据在所得聚合物的核心部分中单体的数n，存在若干不同的序列部分J-U-A或者包括R-Y-I，其不需要彼此序列相同，其通过指数“i”或者包括“n-i+1”表示。本发明请求保护的具有序列相同或序列不同的单体组分的聚合物符合下式：

B-M-{[J_i-U_i-A_i]_0..n}_n-E-K-T-{[R_n-i+1-Y_n-i+1l_n-i+1]_0..n}_n-G

其中：

-A、B、E、G、I、J、K、M、R、T、U、Y是脱氧核糖核苷酸分子；且

-与相同分子的(i+1)比较，核酸分子组分i的序列可以不同，但不必须如此；且

-至少一个核酸包括具有脱氧核糖核苷酸序列CG的基序；且

-B、U_i、K和Y_n-i+1主要是单链；且

-B、U_i、K和Y_n-i+1每个由至少4个脱氧核糖核苷酸组装；且

-Ji至l_n-i+1、A_i至R_n-i+1、M至G或者包括E至T的序列是彼此反向互补的；以及

-G通过磷酸二酯键共价连接于B。

优选本发明的聚合物特征在于用于所述方法中的脱氧核糖核酸包括以下序列：

5’-GGGTTACCACCTTCTATAGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTC-ATCGGTAACCC-3’(SEQ ID No.1)

-其中所述脱氧核糖核酸长度为20到400个核苷酸。

具有优选序列的离析物的合成产生了出人意料的适合免疫反应调节的分子。尤其优选如果在单链分子部分内的碱基序列是部分地或完全符合以下序列：

5’-TCATTGGAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTT-3’(SEQ ID No.2)

令人惊奇的是，这些序列的存在产生了多联体聚合物的非常良好的活性。在分子的多联体结构内，脱氧核糖核苷酸的部分单链共价闭合链负责所述分子在其被导入的靶生物体中的长期作用。

在本发明另一个优先实施方案中，所述单体包括碱基序列N¹N²CGN³N⁴，其中N¹N²是GT、GG、GA、AT或AA组的元件，N³N⁴是CT或TT组的元件，以及C脱氧胞嘧啶、G脱氧鸟嘌呤、A脱氧腺嘌呤和T脱氧胸腺嘧啶。

在特别优选实施方案中，碱基序列N¹N²CGN³N⁴位于脱氧核糖核苷酸的闭合链的单链部分内。尤其地，这些优选的分子在免疫系统的调节中显示非常强的作用。

当然，本发明的分子可能有一或多个通过共价键结合的取代物。该取代物可以为如肽、蛋白质、糖、脂质、抗原结构、DNA和/或RNA。

除了上述产物的结构和功能特征，本发明还涉及制备所述分子的方法，包括以下步骤：

-在水中提供通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的5’-磷酸化DNA分子；

-50℃冻干直到得到干燥残留物，随后在缓冲液中重悬；

-添加T4-DNA连接酶，形成反应混合物；以及

-在37℃温育反应混合物至少30分钟；或

-在沉淀后提供脱氧核糖核苷酸单体，随后50℃干燥沉淀物或在50℃氯化镁存在下冻干DNA分子；

-添加T4-DNA-连接酶；以及

-37℃温育至少10分钟，优选至少30分钟。

对于聚合物的制备，在氯化镁存在下采用沉淀或冻干，尤其如果脱氧核糖核苷酸用聚丙烯酰胺凝胶电泳或用HPLC和FPLC的联合纯化，可得到相同结果。

完全出人意料的是，所述方法的应用产生不同于现有技术描述(WO2007/131495或WO 01/07055)的二聚体的分子结构。所述方法显示只在几个步骤中存在不同，更令人惊奇的是相对细微的改变导致不同分子的生成。从现有技术(WO 01/07055或WO 2007/131495)中已知方法得到的结构显示在其性质上的明显差异。对于免疫调节作用，分子差异明显，其它性质也如此，如副作用。除了方法步骤的不同外，使用具有优选序列的离析物导致具有特异性和突出性质的非常特异的反应产物的形成。使用本发明的序列和上述方法步骤形成了具优势的聚合物，相对于现有技术中的显示出优选性质。

本发明的聚合物优选包括2+2单体(对比图1)、优选脱氧核糖核苷酸组分的部分单链的、共价闭合链，其中单体有茎和环，其中茎有至少2个脱氧核糖核苷酸，环有至少4个脱氧核糖核苷酸，且环有1至6个CG-基序，变数n是来自全体自然数的集合的元件。

本发明进一步涉及组合物，其包括至少本发明的分子和化疗剂。令人惊奇的是，由本发明分子产生的免疫反应的出乎意料的显著改良能够通过结合本发明的治疗和已知的化疗剂及使用优选例如用于治疗肿瘤的组合物而进一步显著改良。尽管本领域技术人员已知WO 01/07055的二聚体有免疫调节作用，且还已知化疗剂对肿瘤有作用，令人惊奇的，由单体组成的免疫调节二聚体组合化疗剂引起过加性效应。更出乎意外的是，由单体组成的聚合物或多联体结合化疗剂比二聚体显示更积极的作用。所述元件联合本发明的组合物对治疗病原体尤其是肿瘤的相同目的具有作用。在本发明的组合物里每一个元件没有限定孤立的结果，但是在单个元件间的相互作用引起令人惊讶的作用，在聚合物中比二聚体更显著。本发明的组合物可提供为试剂盒，其中本发明的分子和现有技术的化疗剂被分别提供。因此，在优选实施方案中，所述试剂盒的至少两个组分被同时或延迟应用。本发明的组合物的应用可例如激活免疫系统，使随后化疗剂的应用可具有非常好的作用。当然可能首先应用化疗剂，随后延迟应用本发明的分子给人类或动物生物体。对于确定的肿瘤，本发明分子和化疗剂的同时应用是优选的。

在本发明优选实施方案中，化疗剂选自包括抗体、烷化剂、铂类似物、嵌入剂、抗生素、有丝分裂抑制剂、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物和/或L-天冬酰胺酶、羟基脲、米托坦和/或鹅膏蕈碱的组中。

在本发明优选实施方案中，烷化剂选自下组：

氮芥衍生物；特别是

环磷酰胺；

异环磷酰胺；

曲磷胺；

美法仑；和/或

苯丁酸氮芥；

烷基磺酸盐/酯；特别是

白消安；和/或

曲奥舒凡；

亚硝基脲；特别是

卡莫司汀；

洛莫司汀；

尼莫司汀；

雌莫司汀；和/或

链脲霉素；

丙卡巴肼和达卡巴嗪；

替莫唑胺；和/或

塞替派。

烷化剂对肿瘤有非常好的作用，抑制其生长。

在本发明优选实施方案中，铂类似物选自下组：

顺铂；

卡铂；和/或

奥沙利铂。

在本发明进一步优选实施方案中，嵌入剂选自下组：

蒽环类抗生素；特别是

亚德里亚霉素(阿霉素)；

柔红霉素；

表柔比星；和/或

伊达比星，

米托蒽醌；

安吖啶；和/或

脱氧氟脲苷。

在本发明进一步优选实施方案中，抗生素选自下组：

博来霉素；

放线菌素D(更生霉素)；和/或

丝裂霉素。

在本发明更进一步另一优选实施方案中作为有利条件，有丝分裂抑制剂选自下组：

长春光的生物碱，特别是

长春瑞滨；

长春新碱(长春新碱)；

长春碱；和/或

长春地辛。

在本发明进一步特别优选实施方案中，紫杉烷类选自下组：

紫杉醇；和/或

多西紫杉醇。

进一步，优选拓扑异构酶抑制剂选自下组：

拓扑异构酶-Ⅰ-抑制剂，特别是

喜树碱；

托泊替康；和/或

伊立替康；和/或

拓扑异构酶-Ⅱ-抑制剂；特别是

依托泊苷；

替尼泊苷。

在本发明的特殊优选实施方案中，抗代谢物选自下组：

叶酸拮抗剂；特别是

甲氨蝶呤；

嘧啶类似物；特别是

5-氟尿嘧啶；

卡培他滨；

胞嘧啶阿糖核苷(阿糖胞苷)；和/或

吉西他滨；

嘌呤类似物；特别是

6-硫代鸟嘌呤；

喷司他丁；

硫唑嘌呤；

6-巯嘌呤；

氟达拉滨；和/或

克拉屈滨。

本发明进一步涉及试剂盒，包括本发明的分子和化疗剂，如果适当的话，还包括关于该试剂盒所含内容组合的信息。本发明也涉及，已描述过，包括本发明分子的药物或组合物，如果适当的的话，还包括药物相容载体。

本发明进一步涉及所述分子、组合物或药物在制备用于调节人类或动物免疫系统或调节所述免疫系统活性的治疗物中的应用。调节人类或动物免疫系统应理解为对免疫系统的每一种影响，有免疫系统抑制肿瘤或癌症的作用。免疫系统活性的调节能等同的理解为此或描述为本领域技术人员已知的免疫系统活性，其可直接抗肿瘤以及通过本发明治疗物其作用被惊人的提高。调节特别是刺激免疫系统或提高免疫系统作用或者包括免疫系统本身，意指肿瘤抑制或减轻预防作用。因此，在优选实施方案中，本发明治疗物可用来刺激T-细胞介导的免疫反应，而且改变T-细胞非依赖型免疫反应。在本发明优选实施方案中，该过程可包括B-细胞的增殖或B-细胞激活。

在特别优选实施方案中，免疫系统活性的调节导致不同的有关细胞群的细胞因子的分泌被改变或者包括返祖遗传的改良作用。特别优选本发明的分子或本发明的组合物在治疗或预防接种中用作佐剂。本发明的治疗物可非常有效的用于治疗细胞生长失调，其中在优选实施方案中，细胞生长失调是肿瘤疾病。优选地，肿瘤疾病是选自下组的疾病：耳-鼻-喉区域的肿瘤，内鼻、鼻窦、鼻咽、唇、口腔、口咽、喉、下咽、耳、唾液腺、和副神经节瘤的肿瘤；肺肿瘤，包含非小细胞支气管癌、小细胞支气管癌；纵隔膜的肿瘤；胃肠道肿瘤，包含食道、胃、胰腺、肝、胆囊和胆道、小肠、结肠和直肠癌以及肛门癌的肿瘤；泌尿生殖器的肿瘤，包含肾脏、输尿管、膀胱、前列腺、尿道、阴茎以及睾丸的肿瘤；妇科肿瘤，包含宫颈、阴道、外阴、子宫癌、恶性滋养细胞病、卵巢癌的肿瘤、输卵管的肿瘤(TubaFaloppii)；腹腔肿瘤；乳腺癌；内分泌器官的肿瘤，包含甲状腺、甲状旁腺、肾上腺皮质的肿瘤、胰腺内分泌肿瘤；类癌肿瘤和类癌综合症；多发性内分泌瘤；骨和软组织肉瘤；间皮瘤；皮肤肿瘤；黑色素瘤，包含皮肤和眼内黑色素瘤；中枢神经系统的肿瘤；婴儿期的肿瘤，包含视网膜母细胞瘤、维尔姆斯瘤、神经纤维瘤病，神经母细胞瘤、尤因肉瘤家族肿瘤、横纹肌肉瘤；淋巴瘤，包含非何杰金氏淋巴癌、皮肤T细胞淋巴瘤、中枢神经系统的原发性淋巴瘤、霍奇金病；白血病，包含急性白血病、慢性髓样和淋巴性白血病、浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合症；副肿瘤综合症；不明原发肿瘤转移(CUP综合症)；转移性肿瘤，包含脑转移、肺转移、肝转移、骨转移、胸膜和心包转移以及恶性腹水；腹膜癌病；免疫抑制相关的恶性肿瘤，包含AIDS-相关恶性肿瘤如卡波西氏肉瘤、AIDS-相关淋巴瘤、中枢神经系统的AIDS-相关淋巴瘤、AIDS-相关霍奇金病和AIDS-相关肛门生殖器肿瘤；移植相关恶性肿瘤。

下文中，本发明通过实施例说明，但本发明不限于这些实施例。

免疫调节核酸分子的制备实施例：

a)制备不是请求保护的二聚体单体：

具有序列CCTAGGGGTT ACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACC(SEQ ID No.3)的5’-磷酸化寡脱氧核糖核苷酸(OND)加热5分钟至90℃且随后在冰中冷却，使产生发夹结构成为可能。自互补突出端用终浓度1mg/ml DNA在T4-DNA连接酶(0.1U/μg ODN)存在下于37℃连接24小时。

在3％琼脂糖凝胶中分离纯化的连接产物，对照图2泳道2。

b)制备作为请求保护的聚合物的例子的四聚体：

聚合程度只能通过使用的核酸的浓度被一定程度的影响。对于如图2所示的二聚体多联体的特殊制备，制备方法如下修改：

-等摩尔浓度(50μM)的5’-CCCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTTCCCCAATGGTGGA-3’(SEQ ID No.4)和5’-CCCTTCCACCATTGGGGATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCCCT-3’(SEQ ID No.5)于95℃变性5分钟，随后于25℃缓慢冷却50分钟；

-以单一摩尔过量添加具有序列5’-AGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAAC-3’(SEQ ID No.6)的5’-磷酸化核酸；

-根据上述方法进行所有进一步步骤。

在3％琼脂糖凝胶上分离纯化的连接产物，对照图2泳道2。

c)制备高分子聚合物：

具有序列5’-pCTAGGGGTTACCACCTACAAAAAAAAACGAAATTCGGGGCGAAGGGAGGTGGTAACCC-3’(SEQ ID No.7)、浓度为1mg/ml的核酸用0.3M醋酸钠(pH5.25)、10mM MgCl₂和三倍体积乙醇abs沉淀。离心后(4℃，13000rpm)，ODN于50℃干燥10分钟。沉淀直接用于连接(0.5U/μg ODN)，并于37℃温育60分钟。在3％琼脂糖凝胶分离连接产物，对照图2泳道4。

图2的描述：

为了测定分子量，制备的分子在3％琼脂糖凝胶分离。左侧泳道1显示表明每一条带质量的双链DNA分子量，对应不同迁移距离。泳道2至4负载不同聚合反应的产物。可观察到单一条带对应二聚体(泳道2)，或者四聚体(泳道3)，或者包括所有形式聚合物的梯形(泳道4)。

本发明分子的功能证实：

为了证明本发明分子的免疫调节特性，进行不同细胞培养实验。通过使用细胞系RAW 264的鼠巨噬细胞研究了刺激TLR9的能力，在该细胞系中绿色荧光蛋白EGFP的表达在TLR9调节的NF-κB启动子的正控制下。细胞以125000细胞/cm²种植，16小时后应用本发明的二聚体(根据方法a制备的)和聚合物(根据方法c制备的)分子。在温育(37℃，5％CO₂)7小时后，收获细胞及通过EGFP表达利用荧光活化细胞分拣(FACS)测量。结果用来生成浓度-作用曲线，如图3所示；作为两组分子的分子量，二聚体重量用作为基准从而允许直接对比。

本发明聚合分子的效力和低分子量分子相比(低虚曲线开放符号)提高了10倍(上曲线封闭符号)。与用作二聚体或单体分子的可比较量等量的本发明高分子聚合物有明显更好效果。TLR9刺激的更高效力归因于局部高浓度，通过尤其在体内不能通过较高剂量实现的多聚体分子来实现，如由于适用量的原因。同时，高分子多联体效率提高，其完全出人意料，根据现有科学知识不能解释。

细胞因子生产的PBMC刺激

为了进行刺激分析，外周血单个核细胞(PBMC)从人全血或所谓的“血沉棕黄色层”分离。分离的细胞(PBMC)在多孔板中种植。第一混合物包含不受刺激的细胞做负对照，与现有技术对比，第二混合物以二聚体刺激，第三混合物以四聚体聚合物刺激；使用相同体积内相同质量的二聚体和聚合物。两天后，ELISA测定细胞培养上清中的细胞因子干扰素-γ、干扰素-α、和白细胞介素-6的分泌，对照图4。

根据图4，与由二聚体分子刺激相比，本发明聚合分子刺激PBMC导致双倍的干扰素分泌。附图进一步显示由聚合分子刺激所造成IL-6分泌比用二聚体刺激显著更高。

可能使用具有以下序列的单体制备本发明的分子：

a)5’-CTAGGGGTTACCACCTTCTATAGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTCATCGGTAACCC-3’(SEQ ID No.8)或

b)5’-AGCTGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCC-3’(SEQ ID No.9)或

c)每一个5’-末端磷酸化核酸或具有能够采用图1所示构象的序列的核酸的混合物，符合描述的构象标准及通过至少4个合适的核苷酸的单链突出端(粘性末端)彼此杂交。

用作离析物的脱氧核糖核酸序列在连接前不加热，具有与聚丙烯酰胺凝胶电泳相当的纯化等级。离析物可用HPLC随后FPLC纯化。HPLC和FPLC的组合导致和聚丙烯酰胺凝胶电泳相当的纯化等级。随后，DNA-离析物于50℃冻干，直到得到干燥残留物。在缓冲液中重悬，添加T4-DNA连接酶，随后于37℃温育40分钟。出乎意料的，得到的多联体引起小鼠免疫调节改良。出乎意料的，本发明多联体的单一组分与化疗剂的结合产生改良的作用。改良的作用出人意料的比单一组份任一高，且超出加性效应。可使用抗体、烷化剂、铂类似物、嵌入剂、抗生素、有丝分裂抑制剂、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物和/或L-天冬酰胺酶、羟基脲、米托坦和/或鹅膏蕈碱作为化疗剂。

Claims

1.一种用于调节人类或动物免疫系统活性的多联体分子，其中所述多联体分子包括至少4个脱氧核糖核酸序列作为单体单元，所述脱氧核糖核酸序列共价键合并且符合下式：

B-M-{[J_i-U_i-A_i]_0..n}_n-E-K-T-{[R_n-i+1-Y_n-i+1l_n-i+1]_0..n}_n-G

其中

A、B、E、G、I、J、K、M、R、T、U、Y是脱氧核糖核苷酸分子；且

“-”代表磷酸二酯键，核酸通过该磷酸二酯键彼此共价结合；且

相同分子的(i+1)的核酸分子的组分i的序列可不同或相同；且

至少一个核酸包括具有脱氧核糖核苷酸序列CG的基序；且

B、U_i、K和Y_n-i+1主要是单链；且

B、U_i、K和Y_n-i+1每个由至少4个脱氧核糖核苷酸组装；且

序列J_i至1_n-i+1、A_i至R_n-i+1、M至G或者包括E至T是彼此反向互补的；以及

G通过磷酸二酯键共价连接于B。

2.前述权利要求的分子，其特征在于所述方法中使用的脱氧核糖核酸包括以下序列：

5’-GGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCC-3’(SEQ ID No.1)；或

5’-CCCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTTCCCCAATGGTGGA-3’(SEQ ID No.4)；或

5’-CCCTTCCACCATTGGGGATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCCCT-3’(SEQ ID No.5)；或

5’-AGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAAC-3’(SEQ ID No.6)；

其中所述脱氧核糖核酸长度为20到400个核苷酸。

3.一种包含权利要求1或2的分子和化疗剂的组合物，所述化疗剂选自包括抗体、烷化剂、铂类似物、嵌入剂、抗生素、有丝分裂抑制剂、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物和/或L-天冬酰胺酶、羟基脲、米托坦和/或鹅膏蕈碱的组中。

4.前述权利要求的组合物，其特征在于所述烷化剂选自下组：

氮芥衍生物，特别是：

环磷酰胺；

异环磷酰胺；

曲磷胺；

美法仑；和/或

苯丁酸氮芥；

烷基磺酸酯，特别是：

白消安；和/或

曲奥舒凡；

亚硝基脲，特别是：

卡莫司汀；

洛莫司汀；

尼莫司汀；

雌莫司汀；和/或

链脲霉素；

丙卡巴肼和达卡巴嗪；

替莫唑胺；和/或

塞替派。

5.前述权利要求之一的组合物，其特征在于所述铂类似物选自下组：

顺铂，

卡铂；和/或

奥沙利铂。

6.前述权利要求之一的组合物，其特征在于所述嵌入剂选自下组：

蒽环类抗生素，特别是：

亚德里亚霉素(阿霉素)；

柔红霉素；

表柔比星；和/或

伊达比星；

米托蒽醌；

安吖啶；和/或

脱氧氟脲苷。

7.前述权利要求之一的组合物，其特征在于所述抗生素选自下组：

博来霉素；

放线菌素D(更生霉素)；和/或

丝裂霉素。

8.前述权利要求之一的组合物，其特征在于所述有丝分裂抑制剂选自下组：

长春光的生物碱，特别是：

长春瑞滨；

长春新碱(长春新碱)；

长春花碱；和/或

长春地辛。

9.前述权利要求之一的组合物，其特征在于所述紫杉烷类选自下组：

紫杉醇；和/或

多西紫杉醇。

10.前述权利要求之一的组合物，其特征在于所述拓扑异构酶抑制剂选自下组：

拓扑异构酶-I-抑制剂，特别是：

喜树碱；

托泊替康；和/或

伊立替康；和/或

拓扑异构酶-II-抑制剂，特别是：

依托泊苷，

替尼泊苷。

11.前述权利要求之一的组合物，其特征在于所述抗代谢物选自下组：

叶酸拮抗剂，特别是：

甲氨蝶呤；

嘧啶类似物，特别是：

5-氟尿嘧啶；

卡培他滨；

胞嘧啶阿糖核苷；和/或

吉西他滨；

嘌呤类似物，特别是：

6-硫代鸟嘌呤；

喷司他丁；

硫唑嘌呤；

6-巯嘌呤；

氟达拉滨；和/或

克拉屈滨。

12.包含权利要求1或2之一的分子和/或权利要求3-11之一的组合物的试剂盒，和如果合适的话，所述试剂盒还包含关于组合该试剂盒的内容物的信息。

13.权利要求1或2之一的分子、权利要求3-11之一的组合物，其用作药物。

14.包含权利要求1或2之一的分子和/或权利要求3-11之一的组合物的药物，如果合适的话，所述药物还包含药物相容载体。

15.前述权利要求的药物，其特征在于所述载体选自包括抗体、烷化剂、铂类似物、嵌入剂、抗生素、有丝分裂抑制剂、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物和/或L-天冬酰胺酶、羟基脲、米托坦和/或鹅膏蕈碱的组中。

16.权利要求1或2的分子、权利要求3-11的组合物或者权利要求14或15的药物在制备用于调节人类或动物免疫系统或调节所述免疫系统活性的治疗物中的应用。

17.前述权利要求的应用，其特征在于所述调节是所述免疫系统活性的提高，其中所述免疫系统的单细胞或细胞亚群的活性被刺激或加快或抑制或减弱。

18.前述权利要求的应用，其特征在于所述调节包括T-细胞介导的免疫反应或T-细胞非依赖型免疫反应。

19.前述权利要求的应用，其特征在于所述免疫反应包括B-细胞增殖和/或B-细胞激活。

20.前述权利要求之一的应用，其特征在于所述免疫系统的刺激包括细胞因子的分泌。

21.前述权利要求之一的应用，其特征在于所述权利要求1或2的分子和/或权利要求3-11的组合物用作在治疗或预防疫苗接种中的佐剂。

22.权利要求1或2的分子、权利要求3-11的组合物或者权利要求14或15的药物在制备用于治疗细胞生长失调的治疗物中的应用。

23.前述权利要求的应用，其特征在于所述细胞生长失调是肿瘤疾病。

24.前述权利要求的应用，其特征在于所述肿瘤疾病选自下组：耳-鼻-喉区域的肿瘤，包括内鼻、鼻窦、鼻咽、唇、口腔、口咽、喉、下咽、耳、唾液腺和副神经节瘤的肿瘤；肺肿瘤，包括非小细胞支气管癌、小细胞支气管癌；纵隔膜的肿瘤；胃肠道的肿瘤，包括食道、胃、胰腺、肝、胆囊和胆道、小肠、结肠和直肠癌以及肛门癌的肿瘤；泌尿生殖器肿瘤，包括肾、输尿管、膀胱、前列腺、尿道、阴茎以及睾丸的肿瘤；妇科肿瘤，包括子宫颈、阴道、外阴、子宫癌、恶性滋养细胞病、卵巢癌的肿瘤、输卵管的肿瘤(Tuba Faloppii)；腹腔肿瘤；乳腺癌；内分泌器官的肿瘤，包括甲状腺、甲状旁腺、肾上腺皮质的肿瘤、胰腺内分泌肿瘤；类癌肿瘤和类癌综合症；多发性内分泌瘤；骨和软组织肉瘤；间皮瘤；皮肤肿瘤；黑色素瘤，包括皮肤和眼内黑色素瘤；中枢神经系统的肿瘤；婴儿期的肿瘤，包括视网膜母细胞瘤、维尔姆斯瘤、神经纤维瘤病、神经母细胞瘤、尤因肉瘤家族肿瘤、横纹肌肉瘤；淋巴瘤，包括非何杰金氏淋巴癌、皮肤T细胞淋巴瘤、中枢神经系统的原发性淋巴瘤、霍奇金病；白血病，包括急性白血病、慢性髓样和淋巴性白血病、浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征；副肿瘤综合征；不明原发肿瘤转移(CUP综合症)；腹膜癌病；免疫抑制相关恶性肿瘤，包括AIDS-相关恶性肿瘤如卡波西氏肉瘤、AIDS-相关淋巴瘤、中枢神经系统的AIDS-相关淋巴瘤、AIDS-相关霍奇金病和AIDS-相关肛门生殖器肿瘤；移植相关恶性肿瘤；转移性肿瘤，包括脑转移、肺转移、肝转移、骨转移、胸膜和心包转移；以及恶性腹水。