JP5873794B2 - 免疫調節用コンカテマー - Google Patents
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Description
5’−リン酸化デオキシリボヌクレオチド酸を提供するステップ、
アルコール沈殿し、その後、乾燥残渣が得られるまで50℃でこの沈殿物を乾燥するか、または、特にMgCl2の存在下で50℃でDNA分子を凍結乾燥し、その後緩衝液中に再懸濁するステップ、
T4−DNAリガーゼを添加し、それによって反応混合物を生成するステップ、および
この反応混合物を37℃で少なくとも30分インキュベートするステップを含む方法によって製造することができる。
適切な条件下でモノマーの別の部分と2本鎖のステムを形成する少なくとも2個の連続したヌクレオチドの部分を含み、
これらの逆相補的部分の間が少なくとも4ヌクレオチドであり、
細胞構造によって認識されるCGモチーフは好ましくは1本鎖部分に存在し、
改変されたヌクレオチドはまた、脂肪酸、糖またはアミノ酸に共有結合する1本鎖領域の一部であり得ることである。
5’−P−W−S−3’、式中、
P、W、Sは、ホスホジエステル結合「−」を介して、列記した読み取りの順番で互いに結合した核酸であり、
核酸P、WまたはSの配列は、デオキシリボヌクレオチド配列CGの少なくとも1個のモチーフを含み、
Wは少なくとも4ヌクレオチドの長さであり、
核酸部分SおよびPの配列は、互いに逆相補的である。
式中、
前記モノマー単位は、G-B-M、J i -U i -A i 、E-K-T及びR n-i+1 -Y n-i+1 -l n-i+1 で表わされ、
A i 、B、E、G、l n-i+1 、J i 、K、M、R n-i+1 、T、U i 、Y n-i+1 は、デオキシリボヌクレオチド配列であり、
下付き文字iは、{[J i -U i -A i ] 1 .. n } n で表わされる繰り返し配列におけるモノマー単位J i -U i -A i の上記式の5´末端からの順番を意味し、下付き文字n-i+1は、{[R n-i+1 -Y n-i+1 -l n-i+1 ] 1 .. n } n で表わされる繰り返し配列におけるモノマー単位R n-i+1 -Y n-i+1 -l n-i+1 の上記式の3´末端からの順番を意味し、
「-」は、デオキシリボヌクレオチド配列が互いに共有結合するホスホジエステル結合を表し、
nが2以上の場合、複数のJ i -U i -A i は異なっていてもいなくてもよく、かつ、複数のR n-i+1 -Y n-i+1 -l n-i+1 は異なっていてもいなくてもよく、
A i 、B、E、G、l n-i+1 、J i 、K、M、R n-i+1 、T、U i 、Y n-i+1 のうち少なくとも1つは、デオキシリボヌクレオチド配列cgを有するモチーフを含み、
B、U i 、KおよびY n-i+1 は、1本鎖であり、
B、U i 、KおよびY n-i+1 は、それぞれ、少なくとも4個のデオキシリボヌクレオチドで組み立てられており、
J i とl n-i+1 、A i とR n-i+1 、MとGおよびEとTの配列は、互いに逆相補的であり、
Gは、ホスホジエステル結合によってBに共有結合されている。
5'- gggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccc-3' (SEQ ID No. 1)
を含むことを特徴とし、このデオキシリボ核酸は、20から400ヌクレオチドの長さを有する。
5'-tcattggaaacgttcttcggggcgttctt-3' (SEQ ID No. 2)
に従うならば、特に好ましい。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製して、水中に5’リン酸化DNA分子を提供するステップ、
乾燥残渣が得られるまで50℃で凍結乾燥し、その後緩衝液中に再懸濁するステップ、
T4 DNA−リガーゼを添加し、反応混合物を形成するステップ、および
37℃で少なくとも30分間反応混合物をインキュベートするステップ、あるいは、
沈殿後、デオキシリボヌクレオチド酸モノマーを提供し、その後沈殿物を50℃で乾燥するか、またはDNA分子を塩化マグネシウムの存在下で50℃で凍結乾燥するステップ、
T4 DNA−リガーゼを添加するステップ、および
37℃で少なくとも10分間、好ましくは少なくとも30分間インキュベートするステップを含む、分子の製造方法にも関する。
ナイトロジェンマスタード誘導体、特に
シクロホスファミド、
イホスファミド、
トロホスファミド、
メルファランおよび/もしくは
クロラムブシル、
アルキルスルホン酸、特に
ブスルファン、および/もしくは
トレオスルファン、
ニトロソウレア、特に
カルムスチン、
ロムスチン、
ニムスチン、
エストラムスチン、および/もしくは
ストレプトゾトシン、
プロカルバジンおよびダカルバジン、
テモゾロミドならびに/または
チオテパ
を含む群から選択される。
シスプラチン、
カルボプラチン、および/または
オキサリプラチンを含む群から選択される。
アントラサイクリン、特に
ドキソルビシン(アドリアマイシン)、
ダウノルビシン、
エピルビシンおよび/もしくは
イダルビシン、
ミトキサントロン、
アムサクリンならびに/または
ドキシフルリジン
を含む群から選択されるものとする。
ブレオマイシン、
アクチノマイシンD(ダクチノマイシン)および/または
マイトマイシン
を含む群から選択されるものとする。
ニチニチソウアルカロイド、特に
ビノレルビン、
ビンクリスチン(オンコビン)、
ビンブラスチンおよび/または
ビンデシン
を含む群から選択されるものとすることができる。
パクリタキセルおよび/または
ドセタキセル
を含む群から選択される。
トポイソメラーゼ−I阻害剤、特に
カンプトテシン、
トポテカンおよび/もしくは
イリノテカンならびに/または
トポイソメラーゼ−II阻害剤、特に
エトポシド、
テニポシド
を含む群から選択されることが好ましい可能性がある。
葉酸拮抗剤、特に
メトトレキセート、
ピリミジン類似体、特に
5−フルオロウラシル(5−flouridacil)、
カペシタビン、
シトシンアラビノシド(シタラビン)および/または
ゲムシタビン、
プリン類似体、特に、
6−チオグアニン(6−thiogunaine)、
ペントスタチン、
アザチオプリン、
6−メルカプトプリン、
フルダラビンおよび/または
クラドリビン
を含む群から選択されることが好ましい。
a)特許請求されていない二量体モノマーの製造:
配列
cctaggggtt accaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc (SEQ ID No. 3)
を有する5’−リン酸化オリゴデオキシリボヌクレオチド(ODN)を90℃で5分間加熱し、その後、ヘアピン構造の発達を可能にするために氷上で冷却した。自己相補的オーバーハングは、最終濃度1mg/ml DNAで、T4 DNAリガーゼ(0.1U/μg ODN)の存在下において37℃で24時間で連結した。
精製した連結産物の3%アガロースゲルによる分離、図2の列2参照。
b)特許請求されているポリマーの例であるテトラマーの製造:
重合化の程度は、使用した核酸の濃度によってのみある程度まで影響を受け得る。図2に示したように、二量体コンカテマーの具体的な製造では、製造方法は以下のように改変した。
5'-ccctaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttctttccccaatggtgga-3' (SEQ ID No. 4)および
5'-cccttccaccattggggatcattgg aaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacccct-3' (SEQ ID No. 5)
を等モル濃度(50μM)で95℃で5分間変性し、その後25℃まで50分かけてゆっくり冷却した。
これに配列
5'-aggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaac-3' (SEQ ID No. 6)
を有する5’−リン酸化核酸を1モル過剰に添加した。
他の全ステップは、前述した方法にしたがって実施した。
精製した連結産物の3%アガロースゲルによる分離、図2、列2参照。
c)高分子ポリマーの製造:
1mg/mlの濃度の配列
5'-pctaggggttaccacctacaaaaaaa aacgaaattcggggcgaagggaggtggtaaccc-3' (SEQ ID No. 7)
を有する核酸を酢酸ナトリウム0.3M(pH5.25)、MgCl210mMおよび3倍量の無水エタノールで沈殿させた。遠心(4℃、13000rpm)後、ODNを50℃で10分間乾燥させた。ペレットを直接連結に使用し(0.5U/μg ODN)、37℃で60分間インキュベートした。連結産物を3%アガロースゲルで分離した、図2、列4参照。
分子量を測定するために、製造した分子を3%アガロースゲルで分離した。左の列1は2本鎖DNAの分子量を示し、異なる移動距離に対応して、各バンドの質量を示している。列2から4は、異なる重合化反応の産物を添加した。ダイマー(列2)およびテトラマー(列3)およびポリマーの全形態を含むラダー(列4)に対応して、1本のバンドを認めることができる。
a) 5'-ctaggggttaccaccttctatagaaaacgttcttcggggcgtt cttcatcggtaaccc-3' (SEQ ID No. 8)
または
b) 5'-agctgggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgtt cttaggtggtaaccc-3' (SEQ ID No. 9)
または
c)各5’−末端がリン酸化した核酸、もしくは図1で示したような立体構造をとることができ、記載した立体構造の基準を満たし、互いに少なくとも4個の適切なヌクレオチドの1本鎖オーバーハング(突出末端)を介してハイブリダイズする配列を有する核酸の混合物
を使用することによって、本発明による分子を製造することができる。
反応物質として使用したデオキシリボ核酸配列は連結前に加熱せず、ポリアクリルアミド電気泳動と同程度の精製度を有する。反応物質はHPLCの後FPLCによって精製することができる。HPLCおよびFPLCの組み合わせは、ポリアクリルアミド電気泳動と同等の精製度を生じる。その後、DNA反応物質は乾燥残渣が得られるまで50℃で凍結乾燥する。緩衝液に溶かした懸濁物を作製し、T4−DNAリガーゼを添加し、その後37℃で40分間インキュベートする。驚くべきことに、得られたコンカテマーは、マウスにおいて改善された免疫調節を引き起こす。驚くべきことに、本発明によるコンカテマーの単一の成分と化学療法薬の組み合わせは、改善された効果をもたらす。改善された効果は、単一成分の効果よりも驚くほど高く、相加効果を上回る。化学療法薬として、抗体、アルキル化剤、白金類似体、インターカレート剤、抗生物質、有糸分裂抑制剤、タキサン、トポイソメラーゼ抑制剤、代謝拮抗剤および/またはL−アスパラギナーゼ、ヒドロキシカルバミド、ミトタンおよび/またはアマニチンを使用してもよい。
Claims (18)
- ヒトまたは動物の免疫系の活性を調節するためのコンカテマー分子であって、下式に示されるとおり、互いに共有結合により結合した少なくとも4個のモノマー単位を含むコンカテマー分子:
式中、
前記モノマー単位は、G-B-M、J i -U i -A i 、E-K-T及びR n-i+1 -Y n-i+1 -l n-i+1 で表わされ、
A i 、B、E、G、l n-i+1 、J i 、K、M、R n-i+1 、T、U i 、Y n-i+1 は、デオキシリボヌクレオチド配列であり、
下付き文字iは、{[J i -U i -A i ] 1 .. n } n で表わされる繰り返し配列におけるモノマー単位J i -U i -A i の上記式の5´末端からの順番を意味し、下付き文字n-i+1は、{[R n-i+1 -Y n-i+1 -l n-i+1 ] 1 .. n } n で表わされる繰り返し配列におけるモノマー単位R n-i+1 -Y n-i+1 -l n-i+1 の上記式の3´末端からの順番を意味し、
「-」は、デオキシリボヌクレオチド配列が互いに共有結合するホスホジエステル結合を表し、
nが2以上の場合、複数のJ i -U i -A i は異なっていてもいなくてもよく、かつ、複数のR n-i+1 -Y n-i+1 -l n-i+1 は異なっていてもいなくてもよく、
A i 、B、E、G、l n-i+1 、J i 、K、M、R n-i+1 、T、U i 、Y n-i+1 のうち少なくとも1つは、デオキシリボヌクレオチド配列cgを有するモチーフを含み、
B、Ui、KおよびYn-i+1は、1本鎖であり、
B、Ui、KおよびYn-i+1は、それぞれ、少なくとも4個のデオキシリボヌクレオチドで組み立てられており、
Jiとln-i+1、AiとRn-i+1、MとGおよびEとTの配列は、互いに逆相補的であり、
Gは、ホスホジエステル結合によってBに共有結合されており、
上記モノマー単位は、塩基配列n 1 n 2 cgn 3 n 4 (式中、n 1 n 2 はgt、gg、ga、at及びaaの群から選択され、n 3 n 4 はct及びttの群から選択される)を含み、
上記において、cはデオキシシトシン、gはデオキシグアノシン、aはデオキシアデノシンおよびtはデオキシチミジンである。 - 前記分子は、
5'-gggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaaccc-3' (SEQ ID No. 1)
5'-ccctaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggc-gttctttccccaatggtgga-3' (SEQ ID No. 4)
5'-cccttccaccattggggatcattggaaaacgttcttcggggc-gttcttaggtggtaacccct-3' (SEQ ID No. 5)
及び
5'-aggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttct-taggtggtaac-3' (SEQ ID No. 6)
からなる群より選択された配列を含み、かつ、
最大400ヌクレオチドの長さを有する、請求項1に記載の分子。 - 請求項1または2に記載の分子ならびに、抗体、アルキル化剤、白金類似体、インターカレート剤、抗生物質、有糸分裂抑制剤、タキサン、トポイソメラーゼ抑制剤、代謝拮抗剤および/またはL−アスパラギナーゼ、ヒドロキシカルバミド、ミトタンおよび/またはアマニチンを含む群から選択される化学療法薬を含む組成物。
- 前記アルキル化剤が、
シクロホスファミド、
イホスファミド、
トロホスファミド、
メルファランおよび
クロラムブシル
からなる群より選ばれたナイトロジェンマスタード誘導体、
ブスルファンおよび
トレオスルファン
からなる群より選ばれたアルキルスルホン酸、
カルムスチン、
ロムスチン、
ニムスチン、
エストラムスチンおよび
ストレプトゾトシン
からなる群より選ばれたニトロソウレア、
プロカルバジンおよびダカルバジン、
テモゾロミド、ならびに
チオテパ
を含む群から選択され、
前記白金類似体が、
シスプラチン、
カルボプラチン、および
オキサリプラチン
を含む群から選択され、
前記インターカレート剤が、
ドキソルビシン(アドリアマイシン)、
ダウノルビシン、
エピルビシンおよび
イダルビシン
からなる群より選ばれたアントラサイクリン、
ミトキサントロン、
アムサクリン、および
ドキシフルリジン
を含む群から選択され、
前記抗生物質が、
ブレオマイシン、
アクチノマイシンD(ダクチノマイシン)、および
マイトマイシン
を含む群から選択され、
前記有糸分裂抑制剤が、
ビノレルビン、
ビンクリスチン(オンコビン)、
ビンブラスチンおよび
ビンデシン
からなる群より選ばれたニチニチソウアルカロイド
を含む群から選択され、
前記タキサンが、
パクリタキセル、および
ドセタキセル
を含む群から選択され、
前記トポイソメラーゼ抑制剤が、
カンプトテシン、
トポテカンおよび
イリノテカン
からなる群より選ばれたトポイソメラーゼ−I阻害剤、および
エトポシドおよび
テニポシド
からなる群より選ばれたトポイソメラーゼ−II阻害剤
を含む群から選択され、
前記代謝拮抗剤が、
メトトレキセート
からなる群より選ばれた葉酸拮抗剤、
5−フルオロウラシル(5−flouridacil)、
カペシタビン、
シトシンアラビノシド(シタラビン)および
ゲムシタビン
からなる群より選ばれたピリミジン類似体、および、
6−チオグアニン(6−thiogunaine)、
ペントスタチン、
アザチオプリン、
6−メルカプトプリン、
フルダラビンおよび
クラドリビン
からなる群より選ばれたプリン類似体
を含む群から選択されることを特徴とする、請求項3に記載の組成物。 - 請求項1もしくは2に記載の分子および/または請求項3もしくは4に記載の組成物を含むキット。
- 医薬として使用するための、請求項1もしくは2に記載の分子、または、請求項3もしくは4に記載の組成物。
- 請求項1もしくは2に記載の分子および/または請求項3もしくは4に記載の組成物を含む医薬品。
- ヒトもしくは動物の免疫系の調節のための治療薬を製造するための、または、前記免疫系の活性の調節のための治療薬を製造するための、請求項1もしくは2に記載の分子、請求項3もしくは4に記載の組成物、または、請求項7に記載の医薬品の使用。
- 前記調節が前記免疫系の活性の増加であり、前記免疫系の単一細胞または細胞小集団の活性が刺激または促進される、請求項8に記載の使用。
- 前記調節がT細胞媒介性免疫応答もしくはT細胞非依存性免疫応答を含むこと、並びに/または、前記免疫応答がB細胞の増殖および/もしくはB細胞活性化を含むことを特徴とする、請求項8に記載の使用。
- 前記免疫系の調節が、サイトカインの分泌を含むことを特徴とする、請求項8から10の一項に記載の使用。
- 請求項1もしくは2に記載の分子および/または請求項3もしくは4に記載の組成物が、治療用ワクチンまたは予防用ワクチンにおいてアジュバントとして使用されることを特徴とする、請求項8から11の一項に記載の使用。
- 細胞増殖障害の治療のための治療薬を製造するための、請求項1もしくは2に記載の分子、請求項3もしくは4に記載の組成物、または請求項7に記載の医薬品の使用。
- 前記細胞増殖障害が腫瘍疾患であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
- 前記腫瘍疾患が、内鼻、副鼻腔、鼻咽喉、唇、口腔、中咽頭、喉頭、下喉頭、耳、唾液腺の腫瘍およびパラガングリオーマを含む耳鼻咽喉領域の腫瘍、非小細胞性気管支癌腫、小細胞性気管支癌腫を含む肺の腫瘍、縦隔腫瘍、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆道、小腸、結腸および直腸の腫瘍ならびに肛門癌を含む胃腸管腫瘍、腎臓、尿管、膀胱、前立腺、尿道、陰茎および睾丸の腫瘍を含む泌尿器性殖器腫瘍、子宮頸部、膣、外陰の腫瘍、子宮癌、悪性絨毛性疾患、卵巣癌腫、卵管(Tuba Fallopii)の腫瘍を含む婦人科腫瘍、腹腔の腫瘍、乳癌、甲状腺、副甲状腺、副腎皮質の腫瘍、膵内分泌部腫瘍、カルチノイド腫瘍およびカルチノイド症候群、多発性内分泌腫瘍を含む内分泌器官の腫瘍、骨および軟部組織の肉腫、甲皮腫、皮膚腫瘍、皮膚および眼球内黒色腫を含む黒色腫、中枢神経系の腫瘍、網膜芽腫、ウイルムス腫瘍、神経線維腫症、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫腫瘍ファミリー、横紋筋肉腫を含む幼児期の腫瘍、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、中枢神経系の原発性リンパ腫、ホジキン病を含むリンパ腫、急性白血病、慢性脊髄性およびリンパ性白血病を含む白血病、形質細胞腫、脊髄異形成症状群、腫瘍随伴症候群、原発不明腫瘍による腫瘍転移(CUP症状群)、腹膜癌、カポジ肉腫及びその他のAIDS関連悪性腫瘍、AIDS関連リンパ腫、中枢神経系のAIDS関連リンパ腫、AIDS関連ホジキン病およびAIDS関連肛門性器部腫瘍、移植関連悪性腫瘍を含む免疫抑制に関連する悪性腫瘍、脳転移、肺転移、肝転移、骨転移、胸膜転移および心膜転移含む転移腫瘍、ならびに悪性腹水を含む群から選択される疾患であることを特徴とする、請求項14に記載の使用。
- 水中に5’リン酸化DNA分子を提供するステップ、
乾燥残渣が得られるまで50℃で凍結乾燥し、その後緩衝液中に再懸濁するステップ、
T4 DNA−リガーゼを添加し、反応混合物を形成するステップ、および
37℃で少なくとも30分間反応混合物をインキュベートするステップ、
を含む、請求項1に記載のヒトまたは動物の免疫系の活性を調節するためのコンカテマー分子の製造方法。 - 凍結乾燥前に、前記DNA分子をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC及びFPLCの組み合わせで精製する、請求項16に記載の製造方法。
- 前記凍結乾燥は、塩化マグネシウムの存在下に行われる、請求項16または17に記載の製造方法。
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