TWI454277B - 用於免疫調節之連鎖子 - Google Patents

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Description

用於免疫調節之連鎖子
本發明涉及一種調節人類和動物免疫系統活性之聚合的、非編碼核酸分子，和其生成方法，以及一種包括聚合的、非編碼核酸分子的疫苗，其中聚合的、非編碼核酸分子可理解為非編碼核酸分子，包括該非編碼核酸分子的至少四個共價鍵結分子(四聚體)。
適應性免疫反應以延遲(3-5天)開始，在特異性淋巴細胞為各自的病原體，其克隆擴增和效應細胞差別的選擇後，但然後通過形成免疫記憶對各自的病原體提供長期持久的保護，先天性免疫系統細胞憑藉保守的病原體相關分子模式(PAMP)由生殖細胞編碼受體辨別病原體，及立即作出反應。不同的反應屬於不同種類的細胞類型，如細胞因數(如IL-1、IL-6、TNF-α)和趨化因數(如IL-8/CXCL8、MIP-1α/β、MCP-1)的分泌，效應機制的活化(吞噬作用、呼吸放電、殺菌劑或細胞毒性物質或溶解顆粒的釋放)，共刺激分子(CD80，CD86)的表達和MHC-分子的增強表達。因此，一方面效應細胞被補充和啟動，這能消除已進入的病原體，另一方面，適應性免疫系統的細胞接收為其啟動必要的信號。
為了提高免疫反應CpG-寡核苷酸(CpG-ODN)已被用作一類新的免疫調節分子。該非甲基化CG-基序能在細菌DNA中找到，以及作為免疫系統“危險信號”的象徵。病原體相關分子模式(PAMP)引起先天性免疫系統的非特異性活化(Krieg,Nat.Med 2003,9：831-835)。CpG-ODN誘導通過細胞因數白細胞介素-12、干擾素-γ和腫瘤壞死因數-α TH 1-基免疫反應。
免疫刺激核酸(ISS)含所述的CpG-ODN，有若干個鹼基長度，以及包括為蛋白質表達的非開放閱讀框。
ISS表示線性核酸分子，其末端是開放的(自由的羥基和磷酸基團)或由合成基團保護。
細胞免疫反應的刺激允許影響反饋回路，其將不能對病人無干擾地 引起令人滿意的免疫活性。
CpC-ODN以硫代主鏈的修飾，可用作固定CpG-DNA，有一些嚴重的缺陷。著名之毒性特別屬於該類(Heikenwalder 2004，Levin 1999)和非特異性結合至蛋白質(Brown 1994)。
由於如此，新類型共價閉合免疫調節DNA被開發(國際專利WO 01/07055/歐洲專利EP 1196178)。該等DNA-分子由兩個化學合成的DNA-ODN組成，在5’-端有自補部分及在3’-末端有回文、重疊終止端，使DNA分子間連接產生一共價閉合分子。CG-基序在非互補部分的該等DNA-分子顯示出與CpG-ODN相似的活性(B-細胞上表面分子CD80、CD40、MHC的增強表達，以及由PBMC分泌IL-6、IFN-γ、IFN-α、IL-12、TNFα)，但與有硫代主鏈CpG-ODN相比，對於誘導細胞因數的表達模式其顯示差異以及在老鼠中明顯地更小毒性。現有技術中該免疫調節DNA關於人類和動物免疫系統的活性調節有若干缺陷。調節人類和動物免疫系統的活性在一理想程度，尤其啟動它，是不可能的。根據WO 01/07055的分子，如第1圖所示實施例或申請專利範圍第11項所示，由若干個去氧核糖核苷酸支架組成，該去氧核糖核苷酸支架形成一部分單股啞鈴型和共價閉合DNA分子，這在本發明的範圍內指定為二聚體。根據WO 01/07055用作初始材料的單體核酸在連接前被加熱，接受核酸的統一的分子，每一個包括一啞鈴型二聚體(對比WO 01/07055的第1圖)。生成核酸是啞鈴型根據WO 01/07055的第1圖。從本發明的意義上說，單體沒有指定結構組成，例如用單一鹼基，但是指定核酸，其本身由數個去氧核糖核苷酸單磷酸鹽組成(對比第1圖或WO 01/07055的申請專利範圍第11項)，該去氧核糖核苷酸單磷酸鹽形成由於已定義的鹼基序列或已定義的結合單體典型性能的三維構象。
來自現有技術，本發明的目標是提供合適的免疫調節DNA分子，開創提高的免疫反應，及生產方法和疫苗，包括所述免疫調節DNA-分子。
一種用於人類或動物免疫系統活性之調節的串聯體分子、其生成方法 以及疫苗。其中該串聯體分子包括至少4個去氧核糖核酸序列作為單體單元，該去氧核糖核酸共價鍵結及遵照公式：B-M-{[Ji -Ui -Ai ]0..n }n -E-K-T-{[Rn-i+1 -Yn-i+1 ln-i+1 ]0..n }n -GnIN0 ，其中A、B、E、G、I、J、K、M、R、T、U、Y是去氧核糖核苷酸分子；且“-”代表磷酸二酯鍵，核酸通過該磷酸二酯鍵彼此共價鍵結；且相同分子的(i+1)之核酸分子的成分i順序可不同或相同；且至少一個核酸包括一去氧核糖核苷酸序列CG基序；且B、Ui 、K、和Yn-i+1 主要是單股；且B、Ui 、K、和Yn-i+1 由至少4個去氧核糖核苷酸組裝；且序列Ji 與ln-i+1 、Ai 與Rn-i+1 、M與G及E與T分別是彼此反向互補；以及G通過一磷酸二酯共價連接B。
免疫調節在本發明的內容中意思是免疫系統的介質和效應細胞，因此目前主要已知有輔助功能的胸腺細胞和胸腺細胞毒性、B-細胞和所謂的NK(自然殺傷)-細胞、巨噬細胞和單核細胞、和樹突細胞及其前體細胞，和目前沒有明確定義功能的在免疫系統內具有作用之細胞群，為了增殖、遷移、分化或其活性，通過核酸分子的使用而被刺激。免疫調節意思是，除在上述定義的含義中免疫反應的一般改進外，免疫反應的類型或特徵也將被影響，無論通過影響初始或成熟的免疫反應，或對於已確立的反應改變其特性。
如本發明申請專利範圍中的改進免疫調節性能的分子與國際專利WO 01/07055中聚合的、非編碼核酸分子二聚體物質對比。聚合的核酸分子應被理解為所謂的高分子串聯體。發明的聚合分子可由一方法生成，包括以下步驟：- 提供5’磷酸去氧核糖核酸；- 乙醇沉澱，且隨後在50℃乾燥沉澱物或在50℃進行DNA分子的冷凍乾燥，尤其要有MgCl2 的存在，直到得到幹剩餘物，然後在緩衝液中再 懸浮；- 添加T4-DNA-連接酶，從而產生一反應混合物；以及- 反應混合物的培養在37℃至少30分鐘。
串聯體包括共價鍵結單體單元，其在它們的整體環狀封閉，具有在基本的單體雙股部分及免疫調節CG-基序更適宜地在單股部分的距離內。完全驚人的是，包括四聚體、六聚體或共價閉合免疫調節DNA的高分子組合的該聚合體與現有技術中二聚體分子相比，有驚人的改進效果。
關於申請專利範圍的聚合分子之分子特性在第1圖和第2圖展示，第3圖和第4圖是關於功能特性，源於熟悉本領域的技術人員應用製造方法所產生的。核酸分子和回文5'-各別的3'-端在已描述方法中作為析出物的使用導致聚合體具有不同的尺寸，自其中只有申請專利範圍的四聚體或高分子組合符合高強效功能。由於分子大小的延長的和多樣，藉由結構特點來描述不可行，而經由其生成方法描述聚合體是非常準確的。新方法提供了不同於現有技術中描述的產物。此可根據本發明第3圖中所示的二聚體和聚合體的性質上明顯的差異來證明。根據本發明的高分子聚合體比現有技術中已知的非聚合結構出人意料的更適合免疫調節。
根據本發明的分子也能由在水裡提供5’-磷酸去氧核糖核酸生成，如果利用當量法聚丙烯醯胺凝膠電泳純化，尤其採用HPLC接著FPLC組合進行純化。熟悉本領域的技術人員熟知，通過幾種高性能方法的聯合，如HPLC或FPLC，可得到PAGE-純化的類似級別。
出人意料地，方法的單步式出現順序造成多亞基分子，包括迴圈環狀穩定和與彼此共價鍵結單體，單體至少有24個核苷酸。同時形成的高分子聚合體通常包括一些單體成分。分子的生成鏈不包括自由的5’-或3’-端。經由根據本發明分子間酯化形成單體，描述如下：- 包括至少2個序列核苷酸部分，在適宜的條件下與單體一雙股幹的另一部分形成；- 在反向互補部分間是至少4個核苷酸；-CG-基序，可通過細胞結構識別，更適宜在單股部分出現；- 修飾的核苷酸也可以是部分單股區域，其和脂肪酸、糖或氨基酸共價結合。
一根據本發明之分子包括至少4個單體，在上述合成中關於其構象而形成。單體形成經由分子間鍵二、四、六或更多耦合通過共價鍵的形成。這導致了所謂的二聚體、四聚體或六聚體的形成，除二聚體之外所有被指定為聚合體。
一根據本發明之分子亦可被定義為串聯體。在優選實施方式中，根據本發明之分子是串聯分子，其中至少四個單獨單體環被彼此連接，最好呈線性以便最好兩個尤其優先若干雙股部分彼此通過單股環要素分離。
一根據本發明之分子與現有技術的分子相比，能更好的調節人類或動物免疫系統的活性。來源於現有技術的分子是已知的免疫調節核酸序列，其作為低分子啞鈴型結構是有效的。最知名，免疫修飾短去氧核糖核酸核苷酸包括一未甲基化胞嘧啶-鳥苷-基序。在本發明意涵內，該核酸的生理學影響也被理解為免疫調節各別免疫系統活性調節。歐洲專利EP1 196 178公開了另外的若干分子，包括一幹(stem)，至少有一個環的，在歐洲專利EP1 196 178的第1和2圖中以例子形式公開。在本發明意涵內，該分子是二聚結構。本發明不包括該二聚體。應注意到術語聚合體在科學中使用有若干不同含義。聚合體可能是例如一長核酸也可是一結構包括若干形成大的組裝的相同或相似分子。聚合體依據本發明指定為分子耦合，包括至少四個單體。如果使用優選的單體，產生的四聚體的分子量相當於170kDa(對比第2圖)。在本發明意涵內，聚合體是例如若干幹環結構如第1圖所描述，和若干相同或相似幹環結構組合成高級結構(一聚合體)。所有根據本發明之聚合體是分子特指大於23kDa的。對於反應描述的條件在連接過程中引起單體暫態依附，其可通過連接酶酯化。只在特定反應條件下，將對於其確認性在合成中形成生成聚合體。從已生成的二聚體中生成高分子聚合體是不可能的。形成聚合體的單體結構式彼此共價連接。已生成的聚合體對於加熱或變性劑是穩定的，這意味著反過來，根據本發明二聚體不能由簡單物理手段在高分子的分子外得到。
出乎意外的，比較簡單的方法步驟能得到和二聚結構相比有改進的、不明顯性質之該聚合結構。高分子組裝的產物舉例說能經由離心、凝膠電泳或柱層析來檢測，得到複雜結構來完成，例如四聚體、六聚體或其他，和二聚體相比，對於免疫系統的調節其具有改善的性質(對比第3圖和第4 圖)。在實驗室有機體或人類中免疫調節的不同形式證明了這一點。
所有根據以下描述的去氧核糖核酸能用於聚合方法。
5’-P-W-3’，其中：-P、W、S是核酸，在列出的閱讀順序中經由磷酸二酯連接“-”彼此連接；- 核酸P、W或S的序列包括至少一個去氧核糖核酸序列CG基序；-W是至少4個核苷酸長；以及- 核酸S和P部分序列是彼此反向互補。
生成的聚合體與以下分子式一致：W-S-{P-W-S}n -P-W-S-{P-W-S}n -PnIN0 ，其中- 在運算式右邊核酸P和左邊核酸W共價連接；以及-“n”通過標示內單體單元的數量描述了串聯體化程度。
因為申請專利範圍的聚合體通過它們的確認性接收其性質，在本發明意涵內，聚合結構可從不連續相同單體組裝。核酸群W可包含B、U、K、Y序列之該連接分子，核酸群P可包含J、E、R、G序列之分子，以及核酸群S可包含M，A，T，I序列。依據在生成聚合體的核心部分單體的許多n，不同的序列部分J-U-A各別的R-Y-I存在，這並不需要相對於彼此相同的序列，其通過指數“i”各別的“n-i+1”表示。有序列相同或序列不同單體組分之申請專利範圍所述的聚合體與運算式一致：B-M-{[Ji -Ui -Ai ]0..n }n -E-K-T-{[Rn-i+1 -Yn-i+1 ln-i+1 ]0..n }n -GnIN0 ，其中：-A、B、E、G、I、J、K、M、R、T、U、Y是去氧核糖核苷酸分子；且- 核酸分子成分i的序列可以不同，但不一定如此，與相同分子的(i+1)比較；且-至少一個核酸包括一去氧核糖核苷酸序列CG基序；且-B、Ui 、K、和Yn-i+1 主要是單股；且-B、Ui 、K、和Yn-i+1 由至少4個去氧核糖核苷酸組裝；且-序列Ji 與ln-i+1 、Ai 與Rn-i+1 、M與G及E與T分別是彼此反向互補；以及-G通過一磷酸二酯共價連接B。
根據本發明更優選的聚合體，其特徵在於，用在方法中的去氧核糖核酸包括以下序列：5’-GGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTA-GGTGGTAACCC-3’(SEQ ID No.1)
- 其中去氧核糖核酸長度為20到400個核苷酸。
析出物和優先順序的合成產生了出人意料的適合免疫反應調節的分子。尤其優選如果在單股分子部分內鹼基序列是部分地或完全依據以下序列：5’-TCATTGGAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTT-3’(SEQ ID No.2)
令人驚奇的是，該序列的存在產生了串聯體聚合體的良好活性。在分子的串聯體結構內去氧核糖核苷酸部分單股共價閉合鏈對其被引進的靶生物中分子的長期影響負責。
在本發明另一個優先實施方式中，單體包括鹼基序列N1 N2 CGN3 N4 ，其中N1 N2 是GT、GA、GA、AT、或AA基團的單元，N3 N4 是CT或TT基團的單元、與C為去氧胞嘧啶、G為去氧鳥嘌呤、A為去氧腺嘌呤、以及T為去氧胸腺嘧啶。
在特別優選實施方式中，鹼基序列N1 N2 CGN3 N4 是被安置在去氧核糖核苷酸的閉合鏈的單股部分內。該優先分子在免疫系統的調節中顯示非常強的作用。
事所必然，根據本發明之分子可能有一個或多個通過共價鍵的取代約束。該取代可以為如肽、蛋白質、糖、脂質、抗原結構，DNA及/或RNA。
本發明涉及除了上述產物的結構和功能特徵，還包括分子的生成方法，包括以下步驟：- 提供一5’-磷酸化DNA分子在通過聚丙烯醯胺凝膠電泳純化的水中；-50℃冷凍乾燥直到得到乾燥的殘渣，隨後在緩衝液中再懸浮；- 添加T4-DNA連接酶，形成反應混合物；以及- 在37℃反應混合物培養至少30分鐘；或- 提供去氧核糖核酸單體在沉澱後，隨後50℃乾燥沉澱物或在50℃氯化鎂存在下DNA分子的冷凍乾燥；- 添加T4-DNA-連接酶；以及 -37℃至少培養10分鐘，最好至少培養30分鐘。
對於聚合體的生成可得到相同的結構，在氯化鎂存在下採用沉澱或冷凍乾燥方式，尤其如果去氧核糖核酸用聚丙烯醯胺凝膠電泳或用HPLC和FPLC的組合進行純化。
完全出人意料的是，方法的應用產生不同於二聚體的分子結構，如在現有技術描述(WO 2007/131495或WO 01/07055)。方法顯示只在幾個步驟中存在不同，更令人驚奇的是，相對細微的改變導致不同分子的生成。從現有技術(WO 01/07055或WO 2007/131495)中已知方法得到的結構顯示在其性能重大不同。對於免疫調節作用分子明顯不同，其他性質也如此，如副作用。除了方法步驟的不同外，使用優先序列的沉澱物導致有特異性和突出性質的特異性反應產物的形成。根據本發明之序列的使用和上述方法步驟形成了具優勢的聚合體，相對於現有技術中的顯示出優選性質。
根據本發明之聚合體包括優選2+2單體(對比第1圖)、優選部分單股、去氧核糖核苷酸組分的共價閉合鏈，其中單體有一幹和一環，其中幹有至少2個去氧核糖核苷酸，環至少有4個去氧核糖核苷酸，且環有1至6 CG-基序，和變數n是來自全體自然數的集合組分。
本發明進一步涉及組成，其包括至少一根據本發明之分子和化學療劑。令人驚奇的是，由一根據本發明之分子之免疫反應的出乎意料的顯著改進能夠通過結合根據本發明之治療物和已知的化學療劑及使用優選的如為腫瘤治療的組分而有進一步顯著改進。儘管熟悉本領域的技術人員已知，根據WO 01/07055之二聚體有免疫調節作用，且進一步瞭解化學療劑對腫瘤有影響，令人驚奇的，由單體組成的免疫調節二聚體和化學療劑一起引起過加性效應。更出乎意外的是，由單體串聯體單體組成的聚合體結合化學療劑顯示比二聚體更有積極作用。元素聯合根據本發明之組成對治療病原體，尤其是腫瘤，相同目標的影響。在根據本發明之組成裡每一個元素沒有定義為孤立的結果，但是在單個元素間的相互作用引起驚人作用，在聚合體中宣稱的比二聚體多。根據本發明之組成可被提供作為試劑組(kit)，其中根據本發明之分子和根據現有技術之化學療劑被分別地提供。因此，在優選實施方式中，至少試劑組的兩個成分被同時或延遲施加。根據本發明之組成的應用可能例如啟動免疫系統，使隨後化學療劑的應用有 良好作用。勢所必然，這是可能的，首先施加化學療劑，隨後延遲根據本發明之分子進入人類或動物有機體。對於確定的腫瘤，根據本發明之分子和化學療劑的同時施加是優選的。
在本發明一優選實施方式中，化學療劑從包括抗體、烷化劑、鉑類似物、嵌入劑、抗生素、有絲分裂抑制劑、紫杉烷類、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝藥及/或L-天冬醯胺酶、羥基脲、米托坦及/或鵝膏蕈鹼之組群中選擇。
在本發明一優選實施方式中，烷化劑從包括下列組群中選擇：氮芥衍生物；特別是環磷醯胺；異環磷醯胺；曲磷胺；馬法蘭；及/或苯丁酸氮芥；烷基磺酸酯；特別是白消安；及/或蘇消安；亞硝基脲；特別是卡莫司汀；洛莫司汀；嘧啶亞硝脲；雌氧芥；及/或鏈脲佐菌素；丙卡巴肼和氮烯咪(唑)胺；替莫唑胺；及/或塞替派。
烷化劑對腫瘤有良好的作用，抑制其生長。
在本發明一優選實施方式中，鉑類似物從包括下列組群中選擇：順鉑；卡鉑；及/或奧沙利鉑。
在本發明一進一步優選實施方式中，嵌入劑從包括下列組群中選擇：蒽環黴素；特別是亞德里亞黴素(阿黴素)；柔紅黴素；表阿黴素；及/或去甲氧柔紅黴素，米托蒽醌；安吖啶；及/或去氧氟脲苷。
在本發明又一進一步優選實施方式中，抗生素從包括下列組群中選擇：博來黴素；放線菌絲素(放線菌素D)；及/或絲裂黴素。
在本發明更進一步另一選實施方式中做為有利條件，有絲分裂抑制劑從包括下列組群中選擇：長春光的生物鹼，特別是長春瑞濱；長春新鹼(長春新鹼)；長春花鹼；及/或長春地辛。
在本發明進一步特別優選實施方式中，紫杉烷類從包括下列組群中選擇：紫杉醇；及/或多西紫杉醇。
進一步，其可為優選的，拓撲異構酶抑制劑從包括下列組群中選擇：拓撲異構酶-I-抑制劑，特別是喜樹鹼；拓撲替康；及/或依利替康；及/或拓撲異構酶-Ⅱ-抑制劑；特別是 足葉乙甙；替尼泊苷。
在本發明的特殊優選實施方式，抗代謝物從包括下列組群中選擇：葉酸拮抗劑；特別是甲氨蝶呤；嘧啶類似物；特別是5-氟尿嘧啶；卡培他濱；阿糖胞苷(阿糖胞苷)；及/或吉西他濱；嘌呤類似物；特別是6-硫代鳥嘌呤；噴司他丁；硫唑嘌呤；6-硫醇嘌呤；氟達拉濱；及/或克拉屈濱。
本發明進一步涉及試劑組，包括根據本發明之分子和化學療劑，如果適當的話，結合關於該試劑組所含內容的資訊。本發明也涉及，已描述過，包括根據本發明之分子之藥物或組成，如果適當的的話，和藥物相容載體。
本發明進一步涉及為人類或動物免疫系統調節或為所述免疫系統活性調節的治療物製造之分子、組成、或藥物的使用。人類或動物免疫系統的調節應理解為每一個對免疫系統之影響，有免疫系統抑制腫瘤或癌症的效果。免疫系統活性的調節能等同的理解為此或描述為熟悉本領域之人員已知的免疫系統活性，其可直接反抗腫瘤以及通過根據本發明之治療物驚人的提高其作用。調節是特別的刺激或提高免疫系統作用，分別的免疫系統本身意思是腫瘤抑制或減輕預防作用。因此，根據本發明之治療物可用在一優選實施方式中來刺激T-細胞調節免疫反應，而且改變T-細胞獨立免疫反應。在本發明一優選實施方式中，該過程可包括B-細胞的增殖或B-細胞活化。
在特別的優選實施方式中，免疫系統活性的調節導致不同有關細胞群的細胞因數的分泌作用被改變而各自返祖遺傳之改善效應。特別優選的為根據本發明的分子分別地根據本發明之組成在治療或預防接種中用作佐藥。根據本發明之治療物可非常有效的用在細胞生長失調的處理，其中在優選實施方式中，細胞生長失調是腫瘤疾病。優選地，腫瘤疾病是選自下列組群的疾病，包括耳-鼻-喉區域的腫瘤，包含內鼻、鼻竇、鼻咽、唇、口腔、口咽、喉、咽下部、耳、唾液腺、和副神經節瘤的腫瘤；肺部的腫瘤，包含非小細胞支氣管癌、小細胞支氣管癌；縱隔膜的腫瘤；消化道的腫瘤，包含食道、胃、胰腺、肝臟、膽囊和膽道、小腸、結腸和直腸癌、以及肛門癌的腫瘤；泌尿生殖器的腫瘤，包含腎臟、輸尿管、膀胱、前列腺、尿道、陰莖、以及舉丸的腫瘤；婦科腫瘤，包含宮頸、陰道、陰門、子宮癌、惡性滋養細胞疾病、卵巢癌的腫瘤、輸卵管的腫瘤(Tuba Faloppii)；腹腔腫瘤；乳房癌；內分泌器官的腫瘤，包含甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質的腫瘤、胰腺內分泌腫瘤；類癌腫瘤和類癌綜合症；多發性內分泌瘤；骨和軟組織腫瘤；間皮瘤；皮膚腫瘤；黑色素瘤，包含皮膚和眼內黑色素瘤；中樞神經系統的腫瘤；嬰兒期的腫瘤，包含視網膜母細胞瘤、維爾姆斯瘤、神經纖維瘤病，神經母細胞瘤、尤因肉瘤家族腫瘤、橫紋肌肉瘤；淋巴瘤，包含非何傑金氏淋巴癌、皮膚T細胞淋巴瘤、中樞神經系統的原發性淋巴瘤、霍奇金病；白血病，包含急性白血病、慢性粒細胞、和淋巴白血病、漿細胞腫瘤、骨髓增生異常綜合症；副腫瘤綜合症；不明原發腫瘤轉移(CUP綜合症)；轉移性腫瘤，包含腦轉移、肺轉移、肝轉移、骨轉移、胸膜和心包轉移、以及惡性腹水；腹膜癌病；免疫抑制相關的惡性腫瘤，包含AIDS-相關的惡性腫瘤如卡波西氏肉瘤、AIDS-相關的淋巴瘤、中樞神經系統之AIDS-相關的淋巴瘤、AIDS-相關的霍奇金病、和AIDS-相關的肛門生殖器腫瘤；移植相關的惡性腫瘤。
以下發明藉由實施例說明，但不侷限於這些實施例。
免疫調節核酸分子的生成實施例：
(a)生成不是申請專利範圍的二聚單體：5’-磷酸化寡去氧核苷酸(OND)具有序列CCTAGGGGTT AC-CACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACC(S EQ ID No.3)加熱5分鐘至90℃且隨後在冰中冷卻，使髮夾結構發展成為可能。自補突出端用最終濃度1mg/ml DNA在T4-DNA連接酶(0，1U/μg ODN)存在下，連接(ligated)24小時於37℃。
在3%瓊脂糖凝膠中分離純化的連接產物，對照第2圖電泳泳道2。
(b)生成為申請專利範圍的聚合體的例子的四聚體：聚合的程度只能通過使用的核酸的濃度被一定程度的影響。對於如第2圖所示之二聚串聯體的特殊生成之生成方法如下所修改：5’-CCCTAGGGGTTACC-ACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTTCCCCAATGGTGGA-3’(SEQ ID No.4)和5’-CCCTTCCACCATTGGGGATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCCCT-3’(SEQ ID No.5)為莫爾濃度(50μM)，於95℃進行5分鐘性質改變，且隨後於25℃緩慢冷卻50分鐘；5’-磷酸核酸具有序列5’-AGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGG-TAAC-3’(SEQ ID No.6)被添加超過單莫爾；根據上述方法，完成所有進一步步驟。
在3%瓊脂糖凝膠上分離純淨化之連接產物，對照第2圖電泳泳道2。
(c)生成高分子聚合體：核酸具有序列5’-pCTAGGGGTTACCACCTACAAAAAAAAACGAAATTCGGGGCGAAGGGAGGTGGTAACCC-3’(SEQ ID No.7)濃度為1mg/ml用0.3M醋酸鈉(pH5.25)、10mM MgCl2 和乙醇絕對值的三倍量沉澱。離心後(4℃，13000rpm)ODN於50℃乾燥10分鐘。顆粒直接被用作連接(0.5U/μg ODN)，並於37℃培養60分鐘。在3%瓊脂糖凝膠分離連接產物，對照第2圖，電泳泳道4。
第2圖的描述：
為了測定分子量，生成的分子在3%瓊脂糖凝膠分離，左電泳泳道1顯 示雙股DNA的分子量表明每一個電泳條帶的質量，對應不同遷移距離。電泳泳道2至4負載不同聚合反應的產物。可觀察到單股對應二聚體(電泳泳道2)，分別對應四聚體(電泳泳道3)，分別對應包括聚合體的所有形式的序列梯(電泳泳道4)。
根據本發明之分子的功能證實：
為了證明根據本發明分子的免疫調節特性，進行不同細胞培養實驗。通過細胞系RAW 264的小鼠巨噬細胞的使用研究了刺激TLR9的能力，在該細胞系中綠色螢光蛋白EGFP的表達在由TLR9調節NF-κB啟動子的正控制下。細胞以125000細胞/cm2 培殖，16小時後根據本發明之二聚的(根據方法a生成的)和聚合的(根據方法c生成的)分子被施加。在培養(37℃，5% CO2 )7小時後，收成細胞及由EGFP表達利用螢光活化細胞分揀器(FACS)測量判定。結果用來生成濃度-影響曲線，如第3圖所示；做為分子組群的分子量，二聚重量用作為基準從而允許直接對比。
根據本發明之聚合分子的效力和低分子量分子相比(低虛曲線開放符號)提高了10倍(上曲線封閉符號)。根據本發明之高分子聚合體與等量的二聚的或單體分子做為可比較的量相比有明顯更好效果。TLR9更高影響力的刺激歸因於局部高濃度，由特別可在活體內之多聚分子來實現，不是由高劑量實現，如由於適用量的原因。同時高分子串聯體效率提高，該提高效率完全出乎人意料，根據現有科學知識是不能解釋的。
細胞因數生產之PBMCs刺激
為了執行刺激分析，外周血單核細胞(PBMC)從整個人類血液中或所謂的“血沉棕黃色層”分離。分離的細胞(PBMC)在多孔板中培殖。第一混合物包含不受刺激的細胞做負控制，與現有技術對比，第二混合物以二聚體刺激，第三混合物以四聚聚合體刺激；使用相同體積內相同質量之二聚體和聚合體。兩天後，ELISA測定由浮於表面細胞培養上細胞介素干擾素-γ、干擾素-α、和白細胞介素-6的分泌，對照第4圖。
根據第4圖，根據本發明以聚合分子刺激PBMCs導致雙倍的干擾素分泌，與由二聚分子刺激相比。附圖進一步顯示由聚合分子刺激所造成IL-6 的分泌，和用二聚體刺激相比高出許多。
其為可能藉由使用具有以下序列之單體生成根據本發明之分子：a)5’-CTAGGGGTTACCACCTTCTATAGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTCATCGGTAACCC-3’(SEQ ID No.8)或b)5’-AGCTGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCC-3’(SEQ ID No.9)或c)每一個5’-終端磷酸核酸或有序列核酸混合物能採用如第1圖所示的結構，符合描述結構標準及憑藉至少4個合適的核苷酸的單股突出端(粘性末端)彼此雜交。
用作析出物的去氧核糖核酸序列在連接前不被加熱，具有與聚丙烯醯胺凝膠電泳相等級純化級。析出物可用HPLC及接著用FPLC純化。HPLC和FPLC的結合使得和聚丙烯醯胺凝膠電泳有相等的純化級別。隨後DNA-析出物於50℃下冷凍乾燥，直到得到乾燥殘留物。在緩衝液中再懸浮，添加T4-DNA連接酶接著於37℃培育40分鐘。出乎意料的，得到的串聯體引起老鼠免疫調節改進。出乎意料的，根據本發明之串聯體的單組份與化學療劑的結合產生改進的結果。改進的結果出人意料的比單組份之一要高，且超出加性效應。可使用抗體、烷化劑、鉑類似物、嵌入劑、抗生素、有絲分裂抑制劑、紫杉烷類、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝藥及/或L-天門冬素酶、羥基脲、米托坦及/或鵝膏蕈鹼作為化學療劑。
第1圖說明本發明聚合分子的分子架構；第2圖為本發明不同聚合反應之產物的電泳泳道圖；第3圖為本發明聚合分子與低分子量分子之濃度-影響曲線比較；以及第4圖為本發明聚合分子與其他分子的干擾素分泌比較圖。
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<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5’端磷酸化之合成寡去氧核苷酸
<400> 1
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5’端磷酸化之合成寡去氧核苷酸
<400> 2
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5’端磷酸化之合成寡去氧核苷酸
<400> 3
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5’端磷酸化之合成寡去氧核苷酸
<400> 4
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5’端磷酸化之合成寡去氧核苷酸
<400> 5
<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5’端磷酸化之合成寡去氧核苷酸
<400> 6
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5’端磷酸化之合成寡去氧核苷酸
<400> 8
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5’端磷酸化之合成寡去氧核苷酸
<400> 9

Claims (22)

  1. 一種串聯體分子，用於人類或動物免疫系統活性的調節，其中該串聯體分子包括至少4個共價鍵結去氧核糖核酸序列做為單體單元，及遵照公式：B-M-{[Ji -Ui -Ai ]0..n }n -E-K-T-{[Rn-i+1 -Yn-i+1 ln-i+1 ]0..n }n -GnIN0 ，其中IN0 代表一自然數；且A、B、E、G、I、J、K、M、R、T、U、Y是去氧核糖核苷酸分子；且“-”代表磷酸二酯鍵，核酸通過該磷酸二酯鍵彼此共價鍵結；且至少一個核酸包括一去氧核糖核苷酸序列CG基序；且B、Ui 、K、和Yn-i+1 是單股；且B、Ui 、K、和Yn-i+1 由至少4個去氧核糖核苷酸組裝；且序列Ji 與ln-i+1 、Ai 與Rn-i+1 、M與G及E與T分別是彼此反向互補；以及G通過一磷酸二酯共價連接B，其中該去氧核醣核酸單體單元包含下列序列：5'-GGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTA-GGTGGTAACCC-3'(SEQ ID No.1)；或5'-CCCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGC-GTTCTTTCCCCAATGGTGGA-3'(SEQ ID No.4)；或5'-CCCTTCCACCATTGGGGATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGC-GTTCTTAGGTGGTAACCCCT-3'(SEQ ID No.5)；或5'-AGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCT-TAGGTGGTAAC-3'(SEQ ID No.6)；或5'-CTAGGGGTTACCACCTACAAAAAAAAACGAAATTCGGGGCGA-AGGGAGGTGGTAACCC-3'(SEQ ID No.7)，其中該去氧核糖核酸長度為20到400個核苷酸。
  2. 一種包含如申請專利範圍第1項所述之分子和化學療劑之組成，該化學療劑從包括抗體、烷化劑、鉑類似物、嵌入劑、抗生素、有絲分裂抑制劑、紫杉烷類、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝物及/或L-天冬醯胺酶、羥基脲、米托坦及/或鵝膏蕈鹼之組群中選擇。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之組成，其中該烷化劑從包括下列組群中選擇：氮芥衍生物；烷基磺酸酯；亞硝基脲；丙卡巴肼和氮烯咪(唑)胺；替莫唑胺；及/或塞替派；及/或該鉑類似物從包括下列組群中選擇：順鉑，卡鉑；及/或奧沙利鉑；及/或該嵌入劑從包括下列組群中選擇：蒽環黴素；米托蒽醌；安吖啶；及/或去氧氟脲苷；及/或該抗生素從包括下列組群中選擇：博來黴素；放線菌絲素(放線菌素D)；及/或絲裂黴素；及/或該有絲分裂抑制劑從包括下列組群中選擇：長春光的生物鹼；及/或該紫杉烷類從包括下列組群中選擇：紫杉醇；及/或 多西紫杉醇；及/或該拓撲異構酶抑制劑從包括下列組群中選擇：拓撲異構酶-I-抑制劑；及/或拓撲異構酶-Ⅱ-抑制劑；及/或該抗代謝物從包括下列組群中選擇：葉酸拮抗劑；嘧啶類似物；及/或嘌呤類似物。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之組成，其中該氮芥衍生物從包括下列組群中選擇：環磷醯胺；異環磷醯胺；曲醯胺；馬法蘭；及/或苯丁酸氮芥；及/或該烷基磺酸酯從包括下列組群中選擇：白消安；及/或蘇消安；及/或該亞硝基脲從包括下列組群中選擇：卡莫司汀；洛莫司汀；嘧啶亞硝脲；雌氧芥；及/或鏈脲佐菌素；及/或該蒽環黴素從包括下列組群中選擇： 亞德里亞黴素(阿黴素)；柔紅黴素；表阿黴素；及/或去甲氧柔紅黴素；及/或該長春光的生物鹼從包括下列組群中選擇：長春端濱；長春新鹼(長春新鹼)；長春花鹼；及/或長春地辛；及/或該拓撲異構酶-I-抑制劑從包括下列組群中選擇：喜樹鹼；拓撲替康；及/或依利替康；及/或該拓撲異構酶-Ⅱ-抑制劑從包括下列組群中選擇：足葉乙甙；及/或替尼泊苷；及/或該葉酸拮抗劑從包括下列組群中選擇：甲氨蝶呤；及/或該嘧啶類似物從包括下列組群中選擇：5-氟尿嘧啶；卡培他濱；阿糖胞苷；及/或吉西他濱；及/或該嘌呤類似物從包括下列組群中選擇： 6-硫代鳥嘌呤；噴司他丁；硫唑嘌呤；6-硫醇嘌呤；氟達拉濱；及/或克拉屈濱。
  5. 一種試劑組，包含如申請專利範圍第1項所述之分子或如申請專利範圍第2項至第4項中任一項所述的組成，及關於結合該試劑組之內容的資訊。
  6. 一種使用如申請專利範圍第1項所述之分子作為製備藥劑之用途。
  7. 一種使用如申請專利範圍第2項至第4項中任一項所述之組成作為製備藥劑之用途。
  8. 一種藥物，包含如申請專利範圍第1項所述之分子或如申請專利範圍第2項至第4項中任一項所述之組成，結合一藥物相容載體。
  9. 一種如申請專利範圍第1項所述之分子用於製造調節人類或動物免疫系統或所述免疫系統活性調節的治療物之用途。
  10. 一種如申請專利範圍第2項至第4項中任一項所述之組成用於製造調節人類或動物免疫系統或所述免疫系統活性調節的治療物之用途。
  11. 一種如申請專利範圍第8項所述之藥物用於製造調節人類或動物免疫系統或所述免疫系統活性調節的治療物之用途。
  12. 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項所述之用途，其中，該調節是該免疫系統活性的提高，其中該免疫系統的單細胞或細胞亞群的活性被刺激或加快或抑制或衰減。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中，該調節包括T-細胞調解或獨立免疫反應，且該免疫反應包括B-細胞增殖及/或B-細胞啟動。
  14. 如申請專利範圍第9、10、11及13項中任一項所述之用途，其中，該免疫系統的刺激包括細胞因數的分泌。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中，該免疫系統的刺激包括細胞因數的分泌。
  16. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中，如申請專利範圍第1項所述之分子被用作在治療或預防疫苗中的佐劑。
  17. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中，如申請專利範圍第2項至第4項中任一項所述之組成被用作在治療或預防疫苗中的佐劑。
  18. 一種用於人類或動物免疫系統活性的調節如申請專利範圍第1項所述之串聯體分子，係由包含以下步驟之製造方法所製造：提供一5’-磷酸化去氧核糖核酸分子在水中；於50℃下冷凍乾燥直到得到一乾燥殘渣，隨後在一緩衝液中再懸浮；添加一T4-DNA連接酶形成一反應混合物；以及將該反應混合物於37℃培養至少30分鐘。
  19. 一種用於人類或動物免疫系統活性的調節如申請專利範圍第1項所述之串聯體分子，係由包含以下步驟之製造方法製造：提供一經沉澱後之去氧核糖核酸單體單元，隨後於50℃乾燥該沉澱物；添加一T4-DNA連接酶形成一反應混合物；以及且將該反應混合物於37℃培養至少10分鐘。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之串聯體分子，其中該反應混合物於37℃最佳至少培養為30分鐘。
  21. 如申請專利範圍第18項所述之串聯體分子，其中在冷凍乾燥前，該去氧核糖核酸先以聚丙烯醯胺凝膠電泳、或高效液相色譜法(HPLC)與快速液相層析法(FPLC)之組合進行純化。
  22. 如申請專利範圍第18項至第21項中任一項所述之串聯體分子，其中在氯化鎂存在下執行冷凍乾燥或沉澱方式。
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