MX2008014380A - Multimero para inmunoestimulacion. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico no codificante multimérica para modular la actividad del sistema inmunitario humano o animal, un procedimiento de preparar la misma, y una vacuna que contiene la molécula de ácido nucleico no codificante multimérica.

Description

ULTÍMERO PARA INMUNOESTIMULACIÓN "CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico no codificante mul-timérica para modular la actividad del sistema inmunitario humano o animal, un procedimiento de preparar la misma, y una vacuna que contiene la molécula de ácido nucleico no codificante multimérica.

"ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN" Mientras que la respuesta inmunitaria adaptativa tras la selección de los linfo-citos específicos para el patógeno respectivo y la expansión clonal y la diferenciación de los mismos produciendo linfocitos efectores sólo se produce de forma retardada (3 - 5 días), pero después ofrece una protección duradera contra el patógeno respectivo a través de la formación de una "memoria inmunológica", las células del sistema inmunitario innato reconocen los patógenos en base a patrones moleculares asociados a los patógenos conservados (PAMP) con receptores codificados por células germinales y responden inmediatamente. Las reacciones que son diferentes para tipos de células diferentes incluyen la secreción de citocinas (por ejemplo IL-1 , IL-6, TNF-a) y quimiocinas (por ejemplo IL-8/CXCL8, ???-1a/ß, MCP-1), la activación de mecanismos efectores (fagocitosis, descarga respiratoria, liberación de sustancias bactericidas o granulos líticos), la expresión de moléculas coestimuladoras (CD80, CD86) así como la expresión potenciada de moléculas MHC. Por una parte, esto recluta y activa las células efectoras capaces de eliminar al patógeno invasor y, por otra parte, las células del sistema inmunitario adaptivo reciben las señales necesarias para su activación. Para producir una respuesta inmunitaria mejorada, se han usado oligonucleó-tidos CpG (ODN CpG) como una nueva clase de moléculas inmunomoduladoras. Dichos motivos CG no metilados se producen en el DNA y representan una "señal de peligro" para el sistema inmunitario. Siendo "patrones moleculares asociados a patógenos" (PAMP), provocan principalmente la activación no específica del sistema inmunitario innato (Krieg, Nat. Med 2003, 9: 831-835). Los ODN de CpG inducen una respuesta inmunitaria principalmente de tipo TH1 mediante las citocinas interleucina-12, interferón-? y factor de necrosis tumoral a. Las secuencias de ácido nucleico inmunoestimuladoras (ISS) que portan los ODN de CpG mencionados anteriormente tienen sólo unas pocas bases de longitud y no funcionan mediante la expresión de las proteínas codificadas sobre ellos. Las ISS son moléculas de ácido nucleico cerradas covalentemente. Están formadas por oligonucleótidos, cuyas bases pueden parearse parcialmente entre sí, y uno o dos bucles que comprenden 30 bases y diversos motivos CG y se denominarán moléculas portadoras más adelante en el presente documento. La fuerte estimulación de la respuesta inmunitaria celular permite ejercer in-fluencia sobre los ciclos reguladores que, sin intervención, provocarían una actividad inmunitaria insatisfactoria para el paciente. La modificación de los ODN de CpG con esqueleto de fosforotioato, tal como la se usa en la estabilización del "DNA de CpG", presenta numerosas desventajas graves, que incluyen en particular la toxicidad que se observa [Heikenwalder 2004, Levin 1999], así como la unión no específica a proteínas [Brown 1994]. Por este motivo, se ha desarrollado una nueva clase de DNA inmunoestimula-dor cerrado covalentemente (documento EP 1196178). Estas moléculas de DNA están formadas por dos moléculas de DNA sintetizadas químicamente que tienen una región de autocomplementariedad en los extremos 5' y 3' con superposiciones palindrómicas de forma que al ligar dos moléculas de DNA se produce una molécula cerrada covalentemente. Estas moléculas de DNA con motivos CG en la región de no complementariedad muestran una actividad similar a los ODN de CpG (expresión potenciada de las moléculas superficiales CD80, CD40, MHC de los linfocitos B y secreción de IL-6, IFN-?, IFN-a, IL-12, TNF-a por los PBMC), pero, si se comparan con los ODN de CpG con esqueleto de fosforotioato, tienen un patrón de expresión algo diferente y una toxicidad significativamente menor en los ratones. Sin embargo, este DNA inmunoestimulador de la técnica anterior presenta un número de desventajas con respecto a la modulación de la actividad del sistema inmunitario humano o animal. No siempre es posible modular, especialmente desencadenar, la actividad del sistema inmunitario humano o animal a un nivel deseado. Dado el anterior estado de la técnica, el objeto de la presente invención es proporcionar moléculas de DNA inmunoestimuladoras adecuadas capaces de desencadenar una respuesta inmunitaria mejorada, un procedimiento para su producción, así como vacunas que contienen dichas moléculas de DNA inmunoestimuladoras. En el contexto de la presente invención, inmunoestimulación quiere decir que las células mediadoras y efectoras del sistema inmunitario, es decir, especialmente los timocitos actualmente conocidos con función cooperadora y los timocitos citotóxi-cos, los linfocitos B y los denominados linfocitos citolíticos o NK (natural killer en inglés), los macrófagos y los monocitos así como las células dendríticas y sus precursores, así como las poblaciones celulares que asumen funciones dentro del sistema inmunitario, cuyas funciones que no se han aclarado todavía, son estimuladas para que muestren proliferación, migración, diferenciación o actividad mediante el uso de moléculas de ácido nucleico. Inmunomodulación quiere decir que, además de una estimulación general con el significado que se define anteriormente, también se produce una influencia sobre el tipo o carácter de una reacción inmunitaria, ya sea implicación de una reacción inmunitaria en el proceso de su origen o maduración, o ya sea cambiando la naturaleza de una reacción previamente establecida.

"DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN" La presente invención resuelve el objeto proporcionando una molécula de ácido nucleico no codificante multimérica. La molécula multimérica puede producirse mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas: proporcionar una secuencia de ácido oligodesoxirribonucleico fosforilado en 5' en agua, - liofilizar hasta que se obtiene un residuo seco, seguido de resuspender en una solución de tampón, añadir una DNA ligasa de T4, formando así una mezcla de reacción, e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante al menos 30 minutos. Muy sorprendentemente, el orden de las etapas mencionadas anteriormente produce una molécula multimérica que es más adecuada para usar en la modulación de la actividad del sistema inmunitario humano o animal que las moléculas de la técnica anterior. Una molécula multimérica con el significado de la invención es esencialmente una molécula de ácido desoxirrinucleico, y dicha molécula de ácido nucleico preferiblemente tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos, más prefe-riblemente 200, de forma especialmente preferible más de 300. Aunque el documento EP 1 196 178 describe moléculas que, a la vista de su estructura de horquilla, pueden denominarse monómeros, el procedimiento de acuerdo con la invención proporciona moléculas en las que un número de dichas estructuras monoméricas en horquilla se ensamblan produciendo estructuras multiméricas u oligoméricas. Sor-prendentemente, los ensamblados resultantes son eficaces para modular el sistema inmunitario. Fue sorprendente que las etapas del proceso de por sí simples y habi- tuales en el laboratorio mencionadas anteriormente produjeran la formación de estructuras eficaces. Comparadas con las estructuras de acuerdo con el documento EP 1 196 178, las moléculas multiméricas de acuerdo con la invención representan complejos moleculares superiores.

En una realización preferida de la invención el ensamblado oligomérico o multimérico, es decir, la molécula de acuerdo con la invención, se caracteriza porque la secuencia de ácido oligodesoxirribonucleico comprende las siguientes secuencias: a) GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC o b) ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA, o c) comprende una secuencia de ácido oligodesoxirribonucleico que tiene la secuencia de bases AACG TTCTTCGGGG CGTT, d) teniendo dicha secuencia de ácido oligodesoxirribonucleico una longitud de 40 a 1.600 nucleótidos.

Los ensamblados multiméricos con el significado de la invención, que incluyen las secuencias preferidas, son particularmente adecuados para estimular la actividad del sistema inmunitario en animales domésticos y seres humanos. En una forma preferida la secuencia de bases de acuerdo con la característica c) está incluida en la secuencia CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC. Sorprendentemente, la presencia de la secuencia anterior produce un efecto particularmente elevado de la molécula, efecto que en el significado de la invención se entiende que es la activación del sistema inmunitario. Otra realización preferida de la invención prevé que la molécula comprende una cadena parcialmente monocatenaria, cerrada covalentemente de restos desoxi-rribonucleosídicos. Es la cadena parcialmente monocatenaria, cerrada covalentemente de restos desoxirribonucleosídicos dentro de la estructura oligomérica o po-limérica ensamblada de la molécula la que es responsable de la prolongada actividad eficaz de la molécula en un organismo diana al que se ha incorporado. Otra realización preferida de la invención prevé que la molécula comprende la secuencia de bases de N1N2CGN3N4 en la que N1N2 es un elemento del grupo de GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 es un elemento del grupo de CT o TT, y C es desoxicito-sina, G es desoxiguanosina, A es desoxiadénosina, y T es desoxitimidina. Una realización particularmente preferida prevé que la secuencia de bases N1N2CGN3N4 está situada en la región monocatenaria de la cadena cerrada de restos desoxirribonucleosídicos. Son particularmente estas moléculas preferidas las que muestran una actividad muy eficaz en la estimulación del sistema inmunitario. La invención también se refiere a la molécula de la invención unida covalentemente a un número de sustituyentes, siendo dichos sustituyentes preferiblemente péptidos, proteínas, sacáridos, estructuras antigénicas, moléculas de DNA y/o RNA. La invención también se refiere a un agente de combinación que comprende al menos una molécula de acuerdo con la invención y un agente quimioterapéutico. Sorprendentemente, la increíblemente elevada estimulación del sistema inmunitario por la molécula de la invención puede mejorarse incluso cuando el agente de la invención se combina con un agente quimioterapéutico notorio y el agente de combi-nación se usa contra tumores. El agente de combinación con el significado de la invención también puede proporcionarse en forma de un kit en el que el agente de la invención y el agente quimioterapéutico de la técnica anterior están presentes por separado. Así, en realizaciones preferidas, los al menos dos componentes del kit pueden aplicarse al mismo tiempo o de un modo escalonado en el tiempo. Por ejemplo, la administración del agente de combinación de acuerdo con la invención puede activar el sistema inmunitario de tal forma que un agente quimioterapéutico aplicado posteriormente pueda desarrollar su actividad de una forma especialmente eficaz. Obviamente, también es posible aplicar el agente quimioterapéutico primero y después administrar la molécula de la invención al organismo humano o animal de una forma escalonada en el tiempo. Para tumores particulares, se prefiere la administración simultánea de la molécula de acuerdo con la invención y el agente quimioterap-éutico. En una realización preferida de la invención el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que comprende anticuerpos, agentes de alquilación, análogos de platino, agentes de intercalado, antibióticos, inhibidores de la mitosis, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, antimetabolitos y/o L-asparraginasa, hidroxicarbamida, mitotano y/o amanitinos. En una realización preferida de la invención los agentes de alquilación se seleccionan del grupo que comprende derivados de mostaza de nitrógeno, especialmente ciclofosfamida, - ifosfamida, trofosfamida, melfalán y/o clorambucilo alquilsulfonatos, especialmente - busulfán y/o treosulfán nitrosoureas, especialmente carmustina, lomustina, nimustina, estramustina y/o estreptozotocina procarbazina y dacarbazina, temozolomida y/o tiotepa.

Los agentes de alquilación tienen un efecto especialmente elevado sobre los tumores, inhibiendo así su crecimiento. En una realización preferida de la invención los análogos de platino se seleccionan del grupo que comprende: cisplatino, carboplatino y/o oxaliplatino.

Otra realización preferida de la invención prevé que los agentes de intercalado se seleccionan del grupo que comprende: antraciclinas, especialmente doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, epirrubicina y/o idarrubicina, mitoxantrona, amsacrina y/o doxifluridina.

Otra realización preferida de la invención prevé que los antibióticos se seleccionan del grupo que comprende: bleomicina, actinomicina D (dactinomicina) y/o mitomicina. En otra realización preferida de la invención, puede ser ventajoso seleccionar los inhibidores de la mitosis del grupo que comprende: alcaloides de Vinca rosea, especialmente vinorelbina, vincristina (oncovina), vinblastina y/o vindesina. En otra realización particularmente preferida de la invención los taxanos se seleccionan del grupo que comprende: paclitaxel y/o docetaxel.

Además, puede preferirse seleccionar los inhibidores de topoisomerasas del grupo que comprende: inhibidores de topoisomerasa I, especialmente camptotecina, topotecano y/o irinotecano y/o inhibidores de topoisomerasa II, especialmente etopósido tenipósido.

También se prefiere que los antimetabolitos en una realización especial de la invención se seleccionen del grupo que comprende: antagonistas de ácido fólico, especialmente metotrexato, análogos de pirimidina, especialmente 5- fluorouracilo, capecitabina, arabinosida de citosina (citarabina) y/o gemcitabina, análogos de purinas, especialmente 6- tioguanina, pentostatina, azatioprina, 6-mercaptopurina, fludarabina y/o cladribina. La invención también se refiere a un kit que comprende la molécula de la invención y el agente quimioterapéutico, opcionalmente junto con información relacionada con la combinación del contenido del kit. Tal como se describe anteriormente, la invención también se refiere a un agente farmacéutico que comprende la molécula de la invención o el agente de combinación, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente tolerable. Además, la invención se refiere al uso de dicha molécula, agente de combinación o agente farmacéutico para la producción de un agente para modular un sistema inmunitario humano o animal o para modular la actividad de dicho sistema inmunitario. La modulación del sistema inmunitario humano o animal se entiende que es cualquier influencia sobre el sistema inmunitario que provoque un efecto inhibidor del sistema inmunitario sobre tumores o cánceres. Modular la actividad del sistema inmunitario puede entenderse de forma sinónima o describe actividades del sistema inmunitario notorias para los expertos en la técnica, que se dirigen contra tumores y, sorprendentemente, con una potencia aumentada por los agentes de acuerdo con la invención. De forma más específica, la modulación es por lo tanto una estimulación o una potenciación de los efectos del sistema inmunitario o del mismo sistema inmunitario. Así, en una realización preferida, los agentes de acuerdo con la invención pueden usarse para estimular la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T pero también la respuesta inmunitaria independiente de los linfocitos T. En una realización preferida de la invención, este proceso puede comprender la proliferación de los linfocitos B o la activación de los linfocitos B. En una realización particularmente preferida, modular la actividad del sistema inmunitario provoca la estimulación de un modo tal que se segregan citocinas, o se segregan a niveles más elevados. Puede preferirse particularmente usar la molécula de la invención o el agente de combinación de acuerdo con la invención como adyuvante en la vacunación terapéutica o profiláctica. De una forma particularmente eficaz, los agentes de la invención pueden usarse en el tratamiento de trastornos del crecimiento celular, y en una realización preferida el trastorno del crecimiento celular es una enfermedad tumoral. En una forma preferida, la enfermedad tumoral es una enfermedad que se selecciona del grupo que comprende tumores del área del oído, nariz, garganta, que comprenden tumores de la nariz interna, senos nasales, nasofaringe, labios, cavidad bucal, orofaringe, laringe, hipofaringe, oído, glándulas salivares, y paragangliomas, tumores de los pulmones que comprenden carcinomas bronquiales no parvicelulares, carcinomas bronquiales parvicelulares, tumores del mediastino, tumores del tubo gastrointestinal, que comprenden tumores del esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y vías biliares, carcinomas del intestino delgado, colon y recto y carcinomas anales, tumores urogenitales que comprenden tumores de los ríñones, uréter, vejiga, glándula prostética, uretra, pene y testículos, tumores ginecológicos que comprenden tumores de cuello de útero, vagina, vulva, cáncer uterino, enfermedad trofoblástica neoplásica, carcinoma de ovario, tumores del tubo uterino (trompas de Falopio), tumores de la cavidad abdominal, carcinomas de mama, tumores de los órganos endocrinos, que comprenden tumores del tiroides, paratiroídes, córtex suprarrenal, tumores del páncreas endocrino, tumores carcinoides y síndrome carcinoide, neoplasias endocrinas múltiples, sarcomas óseos y de los tejidos blandos, mesoteliomas, tumores de piel, melanomas que comprenden melanomas cutáneos e intraoculares, tumores del sistema nervioso central, tumores durante la infancia, que comprenden retinoblastoma, tumor de Wilms, neurofibromatosis, neuroblastoma, familia tumoral del sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma, linfomas que comprenden linfomas no de Hodgkin, linfomas cutáneos de linfocitos T, linfomas primarios del sistema nervioso central, enfermedad de Hodgkin, leucemias que comprenden leucemias agudas, leucemias mieloides y linfáticas crónicas, neoplasmas de células plasmáticas, síndromes de mielodisplasia, síndromes paraneoplásicos, metástasis con tumor primario desconocido (síndrome CUP), carcinomatosis peritoneal, enfermedad neoplásica relacionada con la inmunosupresión que comprende malignidad relacionada con el SIDA tal como sarcoma de Kaposi, linfomas asociados al SIDA, linfomas del sistema nervioso central asociados al SIDA, enfermedad de Hodgkin asociada al SIDA y tumores anogenitales asociados al SIDA, enfermedad neoplásica relacionada con transplantes, tumores metastáticos que comprenden metástasis cerebral, metástasis pulmonar, metástasis hepática, metástasis ósea, metástasis pleural y pericardíaca, y ascitis maligna. Sin pretender que sea limitante, la invención se explicará en mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos. El equipo, los materiales y las soluciones necesarias para los procedimientos individuales se representan con el procedimiento respectivo. La siguiente tabla incluye un listado del equipo y de los materiales, que se han usado y no pertenecen a un procedimiento específico, y los compuestos químicos y soluciones necesarios para la preparación de las soluciones: Tabla: Equipo, materiales, compuestos químicos y soluciones utilizados ODN y dSLIM usados, selección de secuencias usando mfold Muchas de las secuencias que se usan para producir moléculas modelo para la investigación de la estructura de dSLIM se construyeron usando el programa "mfold" disponible en la web (http://www.bioinfo.rpi.edu/applicaciones/mfold). Es un programa que se usa para predecir la estructura secundaria de los ácidos nucleicos basándose en datos termodinámicos [Zuker, 2003]. Las secuencias del DNA de 58 nucleótidos de longitud, que se denominan ODN más adelante en el presente documento, que se usaron para sintetizar dSLIM se introdujeron como DNA lineal en "DNA mfold", usando los ajustes estándar y los siguientes parámetros: temperatura 37°C, concentración iónica Na+ 150 mM y Mg2+ 0,5 mM, corrección de oligómeros. Se usó la secuencia de dSLIM-30L1 como base para las moléculas modelo para investigar la formación de estructuras de G. Inicialmente, éstas se modificaron de tal forma que no quedaban restos de guanina consecutivos, a la vez que se mantenía una proporción de GC de la región complementaria (denominada "tallo" más adelante en el presente documento). La secuencia de la región no complementaria (denominada "bucle" más adelante en el presente documento) se modificó de tal forma que preferiblemente no fuera posible un emparejamiento de bases de Watson- Crick y que no hubiera restos de guanina consecutivos. Como resultado de modificar el bucle, se modificaron los motivos CG situados en esta región con respecto a 30L1. El ODN modelo construido de este modo se denominará KG en lo sucesivo. El ODN GL corresponde a KG con una secuencia poli(G) en el bucle, que, al contrario de lo que ocurre en 30L1 , no está situado en los motivos CG. El ODN MS corresponde a la molécula inicial 30L1 , pero tiene restos guanina adicionales en el tallo. Los ODN GS, - GLS y ML incluyen combinaciones de tallo y bucle de los ODN descritos anteriormente. Las moléculas no30L1 y noGL, que tienen cada una CG sustituido con TG, se usaron como moléculas de control para determinar si el efecto observado dependía de los motivos CG. La molécula dSLIM-60L1 se usó como molécula modelo de un dSLIM-30L1 "dimérico", tal y como podría formarse mediante concatenamerización. Consiste en dos ODN parcialmente complementarios, pero no autocomplementarios, (60L1forw y 60L1 rev) que tras la hibridación, tienen una colgadura en 5' a la que puede ligarse otro ODN (30L1-AGGG) con una colgadura 3' correspondiente y regiones 5' y 3' autocomplementarias. Las secuencias de los bucles de los 3 ODN anteriores corresponden a los de 30L1. Melanie Rothe (Mologen AG) proporcionó las fracciones de dSLIM-30L1 obtenidas separando una gran cantidad de dSLIM-30L1 usando la separación mediante un gradiente continuo de NaCI en una HPLC. Los ODN que se usaron en este trabajo se compraron en TIB Molbiol (Berlín) con fosforilación en 5' (excepciones: M362, 2006), disueltos en H2O a una concentración de 3 g/l después de la purificación por HLC: Tabla: ODN usados (fosforotioato: minúsculas) Nombre Secuencia Características Peso estructurales molecular 30L1 CCT AGG GGT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ACG G en el tallo y 17871 TTC TTC GGG GCG TTC TTA GGT GGT AAC C bucle (S1.L1) KG CTG CAG CTG TAG CAG CTT CAT TCC ATA TCG sin secuencias poli(G), 17723 TTC TTC GTG TCG TTC TTA GCT GCT ACA G bucle no pareado (S2, L2) L CCT AGG GGT TAC CAC CTT CAT TCC ATA TCG tallo de 30L1 , 17723 TTC TTC GTG TCG TTC TTA GGT GGT AAC C bucle de KG (S1. L2) MS CCT AGG GGT GGG GGC CTT CAT TGG AAA ACG 30L1 con 17874 TTC TTC GGG GCG TTC TTA GGC CCC CAC C G5 adicional en el tallo GL CTG CAG CTG TAG CAG CTT CGG GGG GTA TCG KG con G6 en el bucle 17885 TTC TTC GTG TCG TTC TTA GCT GCT ACA G (S2.L3) GS CCT AGG GGT GGG GGC CTT CAT TCC ATA TCG KG con tallo de 17726 TTC TTC GTG TCG TTC TTA GGC CCC CAC C MS (S3, L2) GLS CCT AGG GGT GGG GGC CTT CGG GGG GTA TCG tallo de MS, bucle 17888 TTC TTC GTG TCG TTC TTA GGC CCC CAC C de GL (S3, L3) no30L1 CCT AGG GGT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ATG 30L1 sin motivos CG (TG 17871 TTC TTT GGG GTG TTC TTA GGT GGT AAC C en lugar de CG) noGL CTG CAG CTG TAG CAG CTT TGG GGG GTA TTG GL sin motivos CG 17900 TTC TTTC GTG TTG TTC TTA GCT GCT ACA G (TG en lugar de CG) 60L1 forw CCT AGG GGT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ACG no autocomplementario, 19147 TTC TTC GGG GCG TTC TTT CCC CAA TGG TGG AA bucle de 30L1 60L1 rev CCC CTT CCA CCA TTG GGG ATC ATT GGA AAA no autocomplementario, 19108 CGT TCT TCG GGG CGT TCT TAG GTG GTA ACC CC bucle de 30L1 30L1- GGG GTT ACC ACC TTC ATT GGA AAA CGT TCT autocomplementario, 16177 AGGG TCG GGG GCT TCT TAG GTG GTA A colgadura en 3' M362 tcg tcg tcg ttc gaa cga cgt tga t CpG-C fosforotioato 7640 esqueleto 2006 tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gtt CpG-B fosforotioato 7303 esqueleto Debido a la orientación de sus cuatro sitios de unión de puentes de H, la guanina puede formar un cuarteto de base cíclica con 8 puentes de H (cuarteto de G) mediante un emparejamiento de bases guanina-guanina. Una secuencia de DNA que contiene un número de nucleótidos de guanina consecutivos por lo tanto puede formar una estructura helicoidal tetramérica en la que las bases de guanina muestran un alto nivel de planicidad con una interacción de apilamiento específica. Dependiendo de la posición, número y distribución de los nucleótidos de guanina en la secuencia, es posible la formación de diversas estructuras de G que pueden dividirse en tres grupos: DNA de G2' (tetraplexos paralelos o antiparalelos bimoleculares), DNA de G4' (tetraplexos antiparalelos unimoleculares) o DNA de G4 (tetraplexos paralelos tetramoleculares). El DNA de G4 puede formar nanoestructuras autoensamblantes, denominadas "G wires". Aparte del número de restos de guanina disponibles y de su disposición y los emparejamientos de bases de Watson-Crick del entorno, la formación y estabilidad de las estructuras de G, siendo esta última a veces muy elevada, depende de la temperatura, concentración de DNA y de la presencia de diversos cationes (por ejemplo Na+, K\ Mg2+, Ca2+). Por ejemplo, se han identificado estructuras de G4 en secuencias de los telómeros, en regiones de intercambio de las inmunoglobulinas y en el DNA de VIH [Sen 1992, Marsh 1994, 1995]. Después se produjeron diversas moléculas monoméricas y multiméricas que contenían combinaciones de diversas secuencias de bucle y tallo. Cada vez se usaron tres secuencias de bucle y tres secuencias de tallo que incluían motivos de poli(G) largos, cortos o no los incluían, influenciando así la capacidad de formar estructuras de G. Las estructuras de G estables pueden formarse en condiciones apropiadas en ODN cortos (12mero) con sólo cuatro bases de guanina consecutivas. En los ODN más largos son necesarios motivos más largos debido a que la posibilidad de que se formen estructuras de G estables tiene una relación directa con la proporción de bases de guanina que contribuyen a la secuencia global [Sen, 1992].

Las moléculas que tienen motivos poli(G) largos adicionales muestran una mayor formación de moléculas multiméricas. También, los perfiles de elución de estas moléculas son diferentes de los que no tienen motivos poli(G) porque aparecen dos picos, el pico con un volumen de elución mayor corresponde a la distribución de DNA que se encuentra en la región superior de los geles de agarosa. El cambio más notable se observó para GL, la molécula cuyos motivos poli(G) están localizados en el bucle. Aquí podían distinguirse dos picos claramente separados en el perfil de elución, donde el pico con un volumen de elución mayor tenía una mayor intensidad que el de un volumen de elución menor. Para GL, la cantidad de DNA dispersa de forma difusa en el gel por encima de la banda monomérica era comparativamente grande, extendiéndose en su distribución al orificio del gel. Estas observaciones permiten concluir que hay presente una gran cantidad de DNA en los complejos multiméricos. La distribución de los picos en el perfil de elución de HPLC y la distribución del DNA tras la electroforesis en gel de agarosa eran similares en las construcciones que contenían motivos poli(G) en el tallo (GS, MS). Mostraban un segundo pico pequeño con mayores volúmenes de elución en el perfil de elución y una distribución de DNA imprecisa y ligeramente visible sobre la banda monomérica en el gel de agarosa. Por lo que se refiere al patrón de los picos (HPLC) y distribución del DNA (gel de agarosa), el comportamiento de la migración en la HPLC y el gel de agarosa observado para las moléculas con motivos poli(G) en bucle y tallo (GLS) eran también los de GL y GS y MS. Se observaban dos picos separados de igual altura en el perfil de elución, y la cantidad de DNA distribuido en la región superior del gel era algo mayor que la de las moléculas con motivos poli(G) en el tallo (GS y MS), pero menor que con GL. Por consiguiente, la formación de moléculas multiméricas debería verse particularmente favorecida cuando los motivos poli(G) están situados en el bucle, tal y como es el caso con GL. La razón es que no existe competición entre la formación de pares de bases de Watson-Crick y la formación de estructuras G en un bucle monocatenario. Esta condición previa se da también en la molécula de GLS. En este caso, sin embargo, los motivos poli(G) como posibles parejas de interacción están presentes tanto en el tallo como en el bucle. Por lo tanto, es posible la formación de estructuras G2 intramoleculares, es decir, las que se forman en gran medida de forma independiente de la concentración. El resultado es que representan una competición para la formación intermolecular de estructuras de G de forma que la formación de complejos de mayor peso molecular se ve reducida en GLS con respecto a GL. La menor tendencia de formar complejos con mayor peso molecular se observó en moléculas con motivos poli(G) en el tallo, aunque los motivos poli(G) en este caso eran mayores que los de GL. Con cantidades iguales de material inicial, no se observaron las características descritas anteriormente en la molécula monomérica 30L1 que, al igual que GLS, tiene motivos poli(G) en el tallo y el bucle. La razón para esto puede ser que, por otra parte, los motivos poli(G) de esta molécula son más cortos que los de las moléculas multiméricas. Por otra parte, la predicción de la estructura de "DNA mfold" indica una mayor tendencia a formar pares de bases de Watson-Crick en el bucle de forma que la probabilidad de la formación de una estructura de G debería reducirse más. Sin embargo, al igual que las moléculas multiméricas con motivos poli(G) largos, la fracción F4 obtenida de una gran cantidad de 30L1 mediante la separación por HPLC también muestra la distribución difusa de DNA descrita anteriormente en la región superior del gel y el DNA restante en los orificios del gel en la electroforesis en gel de poliacrilamida (véase la Fig. 3.1.9). Obviamente, la proporción de complejos de mayor peso molecular las estructuras de G es tan baja en 30L1 que su detección sólo es posible cuando se usan cantidades mayores de material inicial. Por el contrario, las porciones de DNA del orificio no desaparecen totalmente para GL y GLS que tienen motivos poli(G) en el bucle, y puede reconocerse un patrón de bandas regular, adicional. Esto probablemente se debe a los dimeros o tetrámeros u ODN no degradados que habiendo permanecido en los agregados, se han disuelto de los agregados por desnaturalización y todavía están unidos entre sí mediante interacciones guanina-guanina. Las propiedades experimentales muestran que las moléculas multiméricas con motivos poli(G) largos de hecho están formadas por estructuras de G. Además de la aparición de una distribución de DNA imprecisa en la región superior del gel, dichas propiedades incluyen la aparición de bandas regulares tras la desnaturalización, tal y como se observa para GL y GLS en un gel de poliacrilamida. Al contrario que con la banda del tercio superior del gel, que se aisló de 30L1 , las bandas observadas para KG y ML no podían reconocerse después de la desnaturalización (véase la Fig. 3.1.6). Estas bandas por lo tanto son dimeros que se forman mediante interacciones entre pares de bases entre dos moléculas monoméricas y, como consecuencia, pueden separarse fácilmente mediante desnaturalización térmica. La aparición preferida de la misma en KG y ML puede deberse a la secuencia en bucle que tienen en común que favorece la interacción de dos moléculas. El fraccionamiento por HPLC de una gran cantidad de molécula 30L1 proporcionó 4 fracciones que mostraron un comportamiento de migración muy diferente en el gel. La concentración de las fracciones únicas permitió su disolución por separado de forma que un número de bandas que anteriormente no podían reconocerse en el gel se volvieron visibles. El comportamiento de migración de la primera fracción correspondía a las dos conformaciones monoméricas observadas, la de la segunda fracción correspondía a una mezcla continua de ambas conformaciones, en la que la conformación abierta prevalecía después de la desnaturalización de esta fracción, y la de la tercera fracción correspondía principalmente a una molécula dimérica tal como se describe anteriormente. Al tener partes claramente visibles de DNA que permanecían en el orificio, la cuarta fracción era similar a MS en su comportamiento de migración. El desplazamiento de la banda que correspondía a un dímero de 30L1 y de la fracción 3 de 30L1 del medio de cultivo celular comparado con su distancia de migración en el gel que se observó en agua era notable. Una comparación con gel teñido con Coomassie muestra que la banda correspondiente en el medio se mueve al mismo nivel que la banda de proteína inferior. Por lo tanto, puede asumirse que el desplazamiento de la banda viene provocado por la unión de la molécula dimérica a las proteínas. El comportamiento de migración de las bandas que corresponden a las conformaciones monoméricas cambió muy poco mediante la adición de medio, sólo con GL se observó un aumento de la banda correspondiente a la conformación abierta. Después de la incubación a 37 °C durante cinco horas, se observó una distribución difusa del DNA entre las dos bandas observadas anteriormente en KG y 30L1 , donde la intensidad de la banda que corresponde a la conformación abierta disminuyó para KG. En las condiciones seleccionadas, las conformación abierta se ve ligeramente favorecida con respecto a la solución acuosa. Después de 27 h de incubación en medio, las intensidades de DNA observado para ML y GL se vieron reducidas masivamente, e incluso con KG sólo podía verse la banda inferior con una intensidad reducida, mientras que el menor descenso en la intensidad se observó con 30L1. Una explicación posible sería que las conformaciones abiertas se degradan más fácilmente que las conformaciones bicatenarias. El efecto inmunoestimulador de diversas moléculas monoméricas y multiméricas iba a investigarse determinando las concentraciones de IFN-?, IFN-a y IL-6 en los sobrenadantes de PBMC de donaciones de sangre humana tras la estimulación con estas moléculas. El sistema de prueba que se usó para determinar la actividad de las moléculas usando PBMC de donaciones de sangre humana es un sistema muy complejo en el que las diferentes células pueden influirse mediante interacción y/o secreción de citocinas de forma que es poco posible asignar una respuesta observada a un tipo celular o vía de reacción particular. Además, hay grandes variaciones entre los resultados de los donantes individuales de forma que son necesarios números mayores de pruebas independientes. La ventaja de este sistema de prueba es que se acerca lo más posible a la situación in vivo de entre todos los sistemas posibles ya establecidos in vitro . Las pruebas mostraron que la detección de la activación celular que se estaba usando está sometida a una influencia relativamente fuerte por las condiciones de cultivo debido a que también se segrega IL-8/CXCL8 como respuesta a factores que inducen el estrés. En particular, esto se vuelve evidente cuando se observan los resultados obtenidos con las células cuyo medio no se cambió antes de la estimulación (véase la Fig. 3.3.1) y en las que se detectó una elevada concentración de IL-8/CXCL8 incluso en células no estimuladas. La proporción determinada de concentración de quimiocinas medida en las células no estimuladas y la concentración de quimiocinas detectada en las células estimuladas era de 1 ,3 y así muy baja comparada con las células en las que se había cambiado el medio. Estas tenían una proporción de 2,3. Por lo tanto, para obtener resultados lo más informativos posible, es particularmente importante en esta prueba cultivar las células en condiciones en gran medida libres de estrés. Presumiblemente, el estrés celular es la razón por la que los resultados obtenidos con las células estimuladas 24 horas antes de sembrar no eran tan claros como los obtenidos con las células cultivadas a confluencia. El pase de las células y las técnicas de cultivo celular asociadas generan este estrés celular. Tal como se observa en la prueba referida a la dependencia del tiempo de estimulación (véase la Fig. 3.3.2), sólo después de 6 horas era posible detectar una diferencia en la cantidad de quimiocinas segregada entre las células no estimuladas y estimuladas. La cantidad de IL-8/CXCL8 aumentó entre 6 h y 24 h, mientras que el aumento que se observó entre las 24 h y las 48 h era pequeño. Las actividades de las moléculas del sistema de prueba se investigaron en dos pruebas en las que se observaron las diferencias entre las moléculas individuales empleadas (véase la Fig. 3.3.3). La mayor secreción de IL-8/CXCL8 en las pruebas se indujo mediante la estimulación con GL, que fue algo mayor que la inducida por ODN 2006. Las cantidades de IL-8/CXCL8 medidas después de la estimulación con KG y 30L1 eran algo menores, donde KG mostró una actividad algo mayor que 30L1. Las diferencias observadas en la actividad de estas diferentes moléculas monoméricas y multiméricas puede deberse a las diferencias estructurales observadas. Así, es posible demostrar que KG y GL, comparados con 30L1 , tienden a tener una conformación abierta de la región del bucle con motivos CG, de forma que se prefiere la forma monocatenaria de los mismos. Tal como demuestran Rutz y cois, mediante resonancia plasmática superficial, el DNA se une a TLR9 con mayor afinidad que el DNA bicatenario [Rutz, 2004], lo que puede ser la razón para una actividad algo mayor de KG y GL que de 30L1. Sin embargo, los motivos CG son diferentes incluso en 30L1 y KG/GL de forma que la diferente actividad puede deberse también a la diferente afinidad de los diferentes motivos CG por el receptor. GL, la molécula con la mayor potencia para formar agregados, mostró la mayor actividad de entre las moléculas analizadas en ambas pruebas, lo que posiblemente se deba a un entrecruzamiento más fuerte entre los receptores por los complejos de mayor peso molecular. Sin embargo, no se observó una mayor actividad de GL en las pruebas realizadas con PBMC. Por otra parte, podría ser posible que otros receptores de reconocimiento de patrones presentes en el sistema más complejo de PBMC estén implicados en la actividad inmunomoduladora de las moléculas monoméricas y multiméricas que se observa en ellos, que reconocen otras características estructurales de las moléculas. Así, por ejemplo, podría ser posible que el reconocimiento también se realizara mediante receptores específicos de otros ácidos nucleicos tales como TLR8 o TLR7, produciendo así un efecto cooperador o modular. En conclusión, puede decirse que específicamente, la presencia de motivos poli(G) en el bucle de las moléculas monoméricas favorece la formación de complejos multiméricos. Además, estos complejos tienen una gran estabilidad contra la desnaturalización térmica. Para identificar las diferencias entre el efecto inmunomodulador de diversas construcciones, se emplearon estos últimos en los experimentos de estimulación con PBMC. Los resultados muestran que las moléculas multiméricas tienen una actividad particularmente elevada.

Determinación de la concentración de DNA La concentración de los ODN y las moléculas de DNA monoméricas se determinó midiendo la absorción a 260 nm (?260)· Los anillos aromáticos de las bases de ácido nucleico son los responsables de la absorción a 260 nm, teniendo las bases individuales diferentes coeficientes de absorción molar e (A > G > T > C). Como resultados de las interacciones entre cromóforos, los ácidos nucleicos bicatenarios tienen una menor absorción que los ácidos nucleicos monocatenarios (efecto hipocrómico). Para determinar la concentración, el volumen correspondiente de solución de DNA a determinar se diluyó inicialmente en un recipiente Eppendorf con tampón TE en un volumen final de 300 µ? (ODN 1 :200, dSLIM 1 :100). La solución de DNA posteriormente se transfirió a una cubeta de cuarzo y se midió la absorción a 260 nm en un fotómetro comparando con tampón TE. La concentración se calculó a partir de la absorción medida de acuerdo con la ecuación: c ^g/ml) = A260 x factor de dilución ? factor de conversión El factor de conversión es un valor aproximado y se estima que es 50 µg/m\ para el DNA bicatenario y 33 µg/ml para el DNA monocatenario. Debido a la proporción de regiones bicatenarias de ODN y de moléculas de DNA monoméricas, se usa un factor de conversión estandarizado de 50 µ9/?t??. Se realizaron determinaciones dobles con diluciones separadas cada vez, a partir de las que se calculó el valor medio.

Preparación de moléculas de DNA monoméricas Para la preparación del moléculas de DNA monoméricas, se usaron materiales estériles (desechables) y tampones recientes o tampones esterilizados por filtración almacenados a -20°C para evitar la contaminación con bacterias, debido a que los resultados de la estimulación pueden falsificarse incluso con pequeñas cantidades de endotoxinas. La primera etapa en la producción de moléculas de DNA monoméricas es ligar dos ODN usando DNA ligasa de T4. La DNA ligasa de T4 cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos 5 -fosfato y 3 -OH en el DNA o RNA bicatenario con extremos romos o cohesivos. Además, puede reparar las roturas monocatenarias en el DNA, RNA o híbridos de DNA-RNA bicatenarios. El ligado de dos ODN se produce entre la colgadura 5'-fosfato de un ODN y el extremo 3" del otro ODN, formando así una molécula circular. La reacción del mismo modo produce las moléculas multiméricas de DNA de acuerdo con la invención. La cantidad inicial de ODN para la preparación de las moléculas era de 500 a 1000 Para el ligado, los ODN se emplearon a una concentración de 0,55 g/l en 1 x de tampón de ligasa. Con este fin, se diluyeron con enjuage Aqua y se añadió la cantidad correspondiente de 10 ? tampón de ligasa. Después de mezclar cuidadosamente, se añadió DNA ligase de T4 en una cantidad tal que había presente una proporción 0.01 U^g de DNA. El lote de ligado se incubó al baño maría a 37 °C durante de 15 a 24 h. Se usó la digestión con T7 para degradar los ODN no ligados. La DNA polimerasa de T7 es una DNA polimerasa dependiente de plantilla que cataliza la síntesis de DNA en la dirección 5 -3' pero que también tiene actividad de exonucleasa 3'-5' en DNA monocatenario y bicatenario, siendo así adecuado para la degradación de los ODN no ligados. Se comprobó el éxito del ligado antes de realizar la digestión con T7. Con este fin se separaron 0,3 µg de ODN, lote de ligado y una digestión con T7 cada vez en un gel de agarosa al 3% (véase 2.4.1). Para la prueba de digestión con T7, se empleó un exceso de DNA polimerasa T7 en una proporción de 10 U/1 ,1 µg de DNA en un volumen de 21 µ?. La reacción continuó durante 1 h a 37°C y se terminó calentando a 70°C durante 10 minutos. Para la digestión con T7, el lote de ligado se diluyó con enjuague Aqua y una cantidad correspondiente de 10 ? tampón de ligasa de forma que el DNA estaba presente a una concentración de 0,3 g/l en 1 ? tampón de ligasa. Se añadió la cantidad de DNA polimerasa de T7 necesaria para obtener una proporción de 0,03 U^g de DNA. El lote se incubó al baño maría a 37 °C durante de 15 a 24 h. Se comprobó el éxito de la reacción separando 0,3 µg de lote de ligado junto con 0,3 µg y 0,9 µg del lote de digestión con T7 en un gel de agarosa al 3%.

Purificación de las moléculas de acuerdo con la invención La purificación se efectuó usando cromatografía de intercambio iónico. El principio de este procedimiento se basa en la presencia de grupos cargados positivamente en una matriz porosa (fase estacionaria), que interactúa con los grupos fosfato de ácido nucleico cargados negativamente por encima de pH 2 de manera que los últimos se unen a la fase estacionaria. La resistencia de la interacción depende del valor de pH, la resistencia iónica de la fase móvil y las cargas negativas presentes en la molécula. Las moléculas no cargadas no proporcionan ninguna interacción o débil con la fase estacionaria y rápidamente se eluyen con la fase móvil de baja resistencia iónica. Mediante el incremento de la resistencia iónica de la fase móvil, las moléculas unidas a la fase estacionaria se desplazan desde la columna. Como resultado de una interacción más fuerte con la fase estacionaria, los ácidos nucleicos mayores se eluyen después de las más pequeñas [Lottspeich, 1998; Mülhardt, 2003]. Fractogel-DMAE, una resina de polímeros con grupos de dimetilaminoetilo, se usó como fase estacionaria en la purificación. Se usó un gradiente por etapas de NaCI (0%, 50%, 100% 1 M NaCI) para la separación. Antes del comienzo de la purificación, todas las entradas y salidas del aparato de HPLC, se cargaron con etanol al 20% cuando se estaba trabajando, se enjuagan inicialmente con enjuague Aqua, y se empaquetó la columna. En este extremo, 1 ,6 -1 ,8 mi de DMAE se colocó en la columna, se cargó con agua hasta el borde, y la columna se agitó para asegurar la distribución uniforme. Posteriormente, la columna se conectó al aparato de HPLC de una manera sin burbujas de aire. La columna se enjuagó a un caudal de 1 ml/min hasta que el material de la columna se había sedimentado completamente. El pistón superior se atornilló sobre la matriz de una manera sin burbujas de aire, y el exceso de agua se desplazó de la columna. La columna se volvió a conectar al aparato de HPLC y se enjuagó a un caudal del ml/min, posiblemente los espacios muertos que se producen entre la matriz y el pistón se eliminaron repitiendo la última etapa. La columna así empaquetada, así como el aparato de complete de HPLC, se equilibraron posteriormente con tampón T20 a un caudal de 1 ml/min. El equilibrio de la columna se realizó usando un volumen de matriz de la columna de aproximadamente 10 veces y se comprobaron usando una tira indicadora de pH. Usando una jeringa de Hamilton, se inyectaron los lotes en el aparato HPLC mediante un bucle de muestra de 2 mi. El aparato de HPLC se controló mediante un protocolo software diseñado para efectuar el fraccionamiento automático. Sin embargo, en algunos casos, los máximos secundarios que se produjeron se fraccionaron a mano. Antes de la aplicación de la muestra la muestra se equilibró con el volumen de doble columna (CV), y la elución de las moléculas no unidas (nucleótidos de proteínas) se efectuó con 5 CV de tampón T20, seguido de la elución de las moléculas unidas de manera débil (ATP, ODN) con 7 CV de tampón al 50% T20N1000 y la elución de dSLIM con 7 CV de tampón al 100% T20N1000. El caudal fue 1 ml/min. Después de esto, la columna se volvió a equilibrar con 10 CV de tampón T20 para la aplicación de la siguiente muestra, y las salidas y entradas del aparato de HPLC se enjuagaron manualmente con tampón T20. Las moléculas purificadas por HPLC se concentraron usando precipitación con etanol y se desalaron. En la presencia de cationes monovalentes, los ácidos nucleicos en alcohol forman un precipitado insoluble que se puede aislar mediante centrifugación. La sal precipitada conjuntamente se pueden retirar en gran medida mediante lavado en etanol al 70% etanol debido a que, a diferencia de los ácidos nucleicos, es también soluble. Para incrementar el rendimiento en el caso de cantidades menores de ácidos nucleicos de la tendencia para la protección, es posible para realizar la precipitación a bajas temperaturas y / o adición de iones Mg2+. Si no se interfiere con los usos posteriores, también se pueden añadir los materiales vehículo tales como tRNA o glicógeno, que incrementan la concentración eficaz de los ácidos nucleicos [Lottspeich, 1998; Mülhardt, 2003]. Para la precipitación, las fracciones respectivas de la purificación de HPLC se transfirieron a cristalería de centrífuga Corex y se añadieron a un volumen de 1/100 de 1 M MgCl2, volumen 1/10 de 3 M de solución de acetato de sodio 2,5 volúmenes de etanol al 96%. Se mezclaron los lotes y se precipitaron a 20°C durante 2 - 24 h. Los lotes se centrifugaron posteriormente a 10.000 rpm (11.000 g) y 4°C durante 30 min, se retiró el sobrenadante, se lavó con 5 mi de etanol al 70% y se centrifugó durante otras 10 - 30 min a 10.000 rpm (11.000 g) y 4°C. Se retiró el sobrenadante y el sedimento de DNA se secó al aire hasta que desapareció el olor a alcohol. Se recogió el sedimento de DNA hasta que desapareció el olor a alcohol. Se recogió el AND en 100 - 350 µ? de enjuague de Aqua y se transfirió a recipientes de reacción de 1 ,5 mi. El volumen para la resuspensión se estimó con referencia a la cantidad de DNA empleada de manera que se obtuvo la concentración de 1 g/l con un rendimiento de 50%.

Electroforesis en gel de agarosa Para la separación y caracterización de los ácidos nucleicos, la electroforesis en gel de agarosa es un medio adecuado. Los ácidos nucleicos, que se están cargados de manera negativa en un amplio intervalo de pH, se expusieron a un campo eléctrico en una matriz de agarosa o poliacrilamida y migraron al ánodo. Su velocidad de migración depende de su tamaño. El comportamiento de los ácidos nucleicos (hasta aproximadamente 10 kb) durante la electroforesis de gel se puede describir usando una combinación de las dos teorías. El efecto de selección de Ogstron se basa en la asunción que los ácidos nucleicos asumen una forma globular y chocan con la matrix de gel más frecuentemente mayor que la circunferencia de la partícula, de manera que las moléculas mayores se retrasan de manera más notable que las pequeñas. De acuerdo con esta teoría, las moléculas cuyo diámetro es mayor que el diámetro de poro del gel no debería migrar a través del gel. La teoría de reptación asume que los ácidos nucleicos pierden su forma globular en el gel, y más a través del gel de una manera de tipo serpiente con un extremo más adelante, dicho movimiento requiere más tiempo para las moléculas más largas que las cortas. Debido a la influencia del tamaño en la velocidad de migración de los ácidos nucleicos, la formación de las estructuras secundarias tiene un efecto secundario sobre el comportamiento de migración en el gel. De este modo, por ejemplo, el comportamiento de migración del DNA del plásmido varía de acuerdo con su conformación. La velocidad de migración aumenta desde el DNA de plásmido abierto (forma I) vía lineal (forma III), superhélice (forma II) a desnaturalizado (enrollado). Para el DNA de doble cadena lineal (forma III), una correlación entre logirj. longitud (en pares de bases) y la distancia de migración relativa en el gel existe en un amplio intervalo de manera que la determinación del tamaño relativamente preciso es posible basándose en los patrones de longitud. La detección de ácidos nucleicos en geles se puede efectuar usando bromuro de etidio que, debido a que su estructura planar, se intercala en el DNA, de manera que la excitación por fluorescencia con luz en la región UV (254 - 366 nm) es posible, la emisión de la cual se observa en la región naranja - rojo (590 nm) [Lottspeich, 1998]. La agarosa es un polisacárido que se recupera de algas marinas y forma ges con poros relativamente grandes en solución acuosa después de enfriar (1% (p/v) aproximadamente 150 nm). El tamaño de poro es inversamente proporcional a la concentración de agarosa. Los geles de agarosa son adecuados para la separación de ácidos nucleicos de 0,1 a 25 kb de longitud. La ventaja de los geles de agarosa depende de su intervalo de separación relativamente grande y facilidad de manejo. Sin embargo, la resolución de los fragmentos de DNA pequeños es muy lenta. Loa adecuado para la separación de fragmentos de DNA más pequeños en Sieve Agarose, una forma derivatizada de agarosa [Lottspeich, 1998; Mühlhardt, 2003].

Para separar los ODN y las moléculas de acuerdo con la invención, se usó 3% de gel de agarosa en 1 ? TAE de tampón con 0,125 µg/ml de bromuro de etidio . Usando el sistema BioRad, se moldearon geles horizontales (40 mi para geles pequeños con 8 bolsas, 100 mi para ges grandes con 20 bolsas). Se aplicaron las muestras a analizar a un tampón de ensayo 1 ? junto con los patrones de longitud apropiada (véase 2.4.3). Se realizó la electroforesis en tampón 1 ? TAE a 120 V durante 30 min. Los geles se fotografiaron usando el equipo de documentación de gel.

Electroforesis de gel de poliacrilamida nativa. (PAGE) Los geles de poliacrilamida se forman mediante la copolimerización de radial libre de monómeros de acrilamida usando el reticulador ?,?'- metilenbisacrilamida. El tamaño de poro de los geles varía entre aproximadamente 3 - 6 nm y depende de la concentración de acrilamida total (% T = macrilam¡da + mbisacrilamida (p/v)) y el grado de reticulación (% C = mb¡sacrilamida / macrjlamida + mbisacr¡lamida). Disminuye con el incremento de T a C constante y tiene un mínimo a 5% C a T constante. Los geles de poliacrilamida tienen muy buen poder de resolución especialmente para los fragmentos de DNA pequeños (< 1 kb). Sin embargo, el intervalo de separación es sustancialmente más estrecho comparado con los geles de azarosa. El intervalo de separación se hacer más amplio mediante el uso de ges de gradiente. El poder de resolución superior de los geles de poliacrilamida permite la diferenciación de conformaciones de DNA diferentes que, debido a sus formas diferentes, tienen diferente comportamiento de migración que se pueden influenciar mediante la temperatura y concentración de iones. Los geles con 8% de T, 2,6% de C se encontraron óptimos para la separación de las moléculas, y los geles con 12% de T, 5% de C en 1 ? TBE para la separación de los ODN. Los geles horizontales se moldearon el día anterior antes de la electroforesis (15 ml/gelpequeñ0, 25 ml/gelgrande) y se almacenaron en un refrigerador durante toda la noche. Antes de la aplicación de la muestra, los geles se sometieron a una electroforesis previa a 70 V (170 Vgrande) hasta que no se observaron cambios en la intensidad de corriente más tiempo (10 - 11 mA). Se aplicaron las muestras en tampón de ensayo 1 ? junto con los patrones de longitud apropiados (véase 2.4.3) sin la adición de tintes. Para controlar< el progreso de la electroforesis, 1 ? tiente de carga se aplicó en una calle separada. Se realizó la electroforesis en 1 ? TBE a una tensión constante de 70 V (170 Vgrande) (« 9 V/cm) y temperatura ambiente y se terminó tan pronto como el azul de bromofenol alcanzó el extremo del fondo del gel (aproximadamente 2 h). Después de la electroforesis los geles se tiñeron en solución de bromuro de etidio durante 10 - 15 m¡n y se fotografiaron usando el equipo de documentación de gel. En el caso de una tinción excesiva de fondo los geles se lavaron en agua desmineralizada durante 10 - 30 min.

Desnaturalización térmica y renaturalización para asignación de bandas Ya que las moléculas de DNA monoméricas son moléculas de DNA circular que, muchas son de tipo DNA de plásmido, muestran un comportamiento de migración complejo en un gel, la asignación de bandas observadas en el gel a una conformación o tamaño particular no es una materia directa. El hecho que las conformaciones diferentes, al contrario que las moléculas de tamaño diferente, se pueden interconvertir de manera reversible en condiciones adecuadas se pueden usar en la diferenciación. Las conformaciones diferentes tienen un grado diferente de compactación y por lo tanto pudiera ser perceptible en el gel mediante su diferente comportamiento de migración, con formas de DNA compactas que tienen frecuentemente mayor movilidad en el gel comparadas con las más voluminosas, formas de DNA abiertas.

Las formas compactas se deben convertir en las formas abiertas mediante las destrucción de los puentes de hidrógeno. Para hacer una asignación de las bandas observadas en el gel de poliacrilamida, las moléculas se desnaturalizaron por calor mediante calentamiento a 95°C durante 10 minutos. Las muestras desnaturalizadas se colocaron inmediatamente sobre hielo para evitar la renaturalización. A este extremo, se produjo una mezcla maestra que incluía la molécula de dSLIM respectiva a una concentración de 0,05 g/l en 1 ? tampón TE. El lote se dividió en la mitad y se calentó el lote y 1 lote se mantuvo a temperatura ambiente. Las muestras a aplicar sobre gel se recogieron de los lotes, se añadieron con la cantidad correspondiente de 5 ? de tampón de muestra y se separaron sobre un gel de poliacrilamida al 8% nativa. Para observar la renaturalización, el lote desnaturalizado restante se dividió una vez más y se incubó posteriormente durante 3 días a 4°C y 37°C, respectivamente. El lote no desnaturalizado restante se almacenó a 4°C se dividió de la misma manera después de 3 días, y una parte se desnaturalizó como se ha descrito anteriormente y la otra parte se mantuvo a temperatura ambiente. Se añadieron los lotes con la cantidad correspondiente de 5 ? de tampón de muestra y se separaron sobre un gel de poliacrilamida al 8%.

Incubación en medio de cultivo de células La actividad de las moléculas se ensayó in vitro usando PBMC y células HEK293. Las moléculas se disolvieron en medio de cultivo de células que contiene proteína mejor que tampón y se incubaron a una temperatura de 37°C. Después la intención era investigar la influencia de estos parámetros modificados sobre la estructura y estabilidad de las moléculas y los ODN. Un factor importante que puede influenciar la actividad de las moléculas de DNA en diversas formas es la unión no específica a las proteínas. La unión a las proteínas cambia el comportamiento de de migración de DNA en una electroforesis de gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE nativo) de manera que se puede reconocer un desplazamiento de la banda de DNA en la presencia de proteína. En la mayoría de los casos la movilidad electroforética de un complejo de DNA - proteína se reduce en comparación con el DNA; para los minicírculos de DNA, la movilidad electroforética también se puede incrementar hasta el grado que la compactación aumenta mediante la unión a proteína [Toulmé, 1995]. Para investigar las moléculas y los ODN empleados en los ensayos de estimulación en términos de su comportamiento en las condiciones encontradas en los ensayos de estimulación, las soluciones de ODN y molécula se diluyeron hasta una concentración de 1 µ? en medio y se incubaron durante 5 h o 24 h a 37°C en una fase de calor, después de la adición de una cantidad apropiada de 5 ? de tampón de muestra, se separaron directamente sobre un gel de poliacrilamida. Las soluciones de ODN y molécula diluidas de manera correspondiente en H2O se aplicaron para comparación. Para verificar que los cambios observados han sido provocados por la presencia de proteínas, los lotes que incluyen ODN y moléculas de la invención se diluyeron hasta una concentración de 1 µ? en medio al que no se había añadido nada de FCS. Para comparar las distancias de migración de las bandas de DNA y proteína en el gel, permitiendo de este modo las conclusiones en lo que se refiere a la posible de unión de proteína, se detectaron DNA así como proteínas en los geles. La detección adicional de proteínas se realizó después de la detección de ácido nucleico. Los ges se fijaron durante 30 min en solución de fijación y se tiñeron posteriormente durante 30 - 60 min en solución de Coomassie. Se retiró el exceso de tinte mediante incubación en solución de destinción durante toda una noche, y los geles se fotografiaron usando el equipo de documentación de gel.

Patrones de longitud de DNA usados: Como patrones de longitud, la anchura de bolsa cantidad/mm recomendada por el proveedor se aplicó en tampón de muestra 1 ? cada vez. Se usaron los siguientes patrones: GeneRuler 100 pb DNA Ladder Plus (MBI Fermentas) GeneRuler 50 pb DNA Ladder (MBI Fermentas) 10 pb DNA Ladder (Invitrogen) 25 pb DNA Ladder (Invitrogen) Cultivo de células Todas las operaciones de cultivo de células se realizaron en condiciones estériles usando materiales desechables estériles Las condiciones del incubador fueron 37°C, 5% C02, 90% de humedad.

Investigación del efecto inmunomodulador de las moléculas en PBMC Para investigar el efecto inmunomodulador de las moléculas multiméricas, la secreción de citoquinas de linfocitos y monocitos recuperados de las donaciones de sangre humana se midieron usando ELISA. El material de aislamiento para el aislamiento de linfocitos y monocitos, también denominados células mononucleares de sangre (PBMC) = fracción de células mononucleares de la sangre periférica, era un concentrado de leucocitos, también denominado capa de leucocitos, que se obtiene mediante centrifugación de la sangre entera y se compró en DRK-Blutspendedienst Berlín Wannsee. Usando centrifugación en gradiente de densidad Ficoll- Hypaque, las PBMC se pueden separar de otros componentes del concentrado de leucocitos (plasma, trombocitos, eritrocitos, granulocitos). El medio de separación Ficoll-Hypaque es una solución que incluye una mezcla de Ficoll 400, un polímero fuertemente ramificado de monómeros de sacarosa reticulados mediante epiclorohidrina y diatrizoato de sodio (Hypaque) con una densidad de 1 ,077 g/ml. Usando la centrifugación isopícnica del medio de separación con una capa de concentrado de leucocitos diluido en la parte superior, es posible separar los diferentes componentes de acuerdo con su diferente densidad, obteniendo de este modo las fracciones representadas en Figura 2.5.1 [Luttmann, 2004]. Para aislar PBMC, cada concentrado de leucocitos se transfirió a una botella estéril de 250 mi y se diluyó 1 :2 con PBS. 15 mi de solución Ficoll- Hypaque cada vez se colocó en cuatro tubos de centrífuga de 50 mi, se recubrió cuidadosamente con aproximadamente 30 mi de mezcla sangre-PBS usando una pipeta de 10 mi y se centrifugó a 800 g durante 20 min con el freno desconectado (tiempo total time aproximadamente 50 min). La inferíase que contenía PBMC se retiró por succión cuidadosamente con una pipeta de 5 mi y se transfirió a tubos de centrífuga de 50 mi con 20 mi de PBS frío. Para retirar las contaminaciones de eritrocitos, Ficoll/Hypaque y trombocitos, las células se sometieron posteriormente a un número de etapas de lavado. Aunque todas las etapas hasta el aislamiento de PBMC se llevaron a cabo a temperatura ambiente de manera que se evitó la agregación de trombocitos, las etapas de lavado se llevaron a cabo a 4°C para evitar la adhesión de monocitos a los materiales plásticos empleados y de este modo su pérdida. En la primera etapa de lavado las células se centrifugaron a 400 g durante 8 min a 4°C. Se retiró por succión el sobrenadante y el sedimento de células se volvió a suspender en 5 mi de PBS frío y se llenó hasta 45 mi con PBS frío. Las siguientes etapas de lavado se llevaron a cabo de la misma manera, pero se llevó a cabo la centrifugación a 300 g durante 5 min. Las etapas de lavado se repitieron hasta que el sobrenadante estuvo transparente y el sedimento tuvo un color de color amarillo (aproximadamente 5 - 6 veces). Se volvieron a suspender las células posteriormente en 5 mi de medio frío cada vez y se combinaron, y el volumen se completó con medio frío para hacer 30 mi. Se determinó el número de células usando un contador de células automático a un tamaño de exclusión de 8 µ?? y se ajustó hasta una concentración de 4 ? 106 células/ml usando medio frío. 600 µ? de PBMC aislado previamente a una concentración de 4 ? 106 células/ml se colocó en cada pocilio de placas de cultivo de 24 pocilios. Después de esto, se añadió el volumen correspondiente de moléculas a ensayar de manera que la concentración en el lote era de 1 µ?. Se incubaron las células durante 2 días (42 - 48 h) en un incubador. Se transfirió la suspensión de células a un recipiente de reacción Eppendorf y se centrifugó en un Biofuge a 3000 rpm durante 4 min. Los sobrenadantes sin células así obtenidos se transfirieron a un Nuevo recipiente de reacción y o bien se usó directamente para determinar la concentración de citoquinas ELISA o se almacenó a -70°C.

Cultivo de células HEK293 Las células se cultivaron en botellas de cultivo de células de 162 cm2. Se sembraron a una densidad de 1 ,3 - 1.9 ? 105 células/cm2. Después de la incubación en un incubador durante 2 - 3 días, se dividieron las células 1 :3. Para este fin, se retiró el medio por succión, se lavaron las células con 10 mi de PBS y posteriormente se incubaron a temperatura ambiente durante 3 - 5 min, seguido de desprendimiento con 5 mi de solución tripsina/EDTA. La reacción se terminó mediante la adición de 5 mi de medio. Las células se volvieron a suspender y se añadieron otros 5 mi de medio. 5 mi de suspensión de células cada vez se mantuvo o bien en la botella de cultivo de células o se transfirió a uno nuevo y se añadieron con 45 mi de medio. De manera ocasional, algunas células desprendidas del fondo de la botella antes de que el medio se haya separado por succión. En este caso, las células se transfirieron a un tubo de centrífuga estéril y se centrifugaron a 300 g durante 4 min. Después de esto, el medio se retiró por succión y se volvieron a suspender las células en 5 mi de solución de tripsina/EDTA, se añadieron con 10 mi de medio y se transfirieron a una nueva botella de cultivo de células como se ha descrito anteriormente.

Estimulación de células HEK293 Para establecer el ensayo, células HEK293-TLR9 y HEK293 nulas a una concentración de 0,6 - 1 ? 106 células/ml cada vez se sembraron en un volumen de 400 µ? en placas de cultivo de células de 24 pocilios durante 1 - 5 días. Se determine el número de células usando el contador de células a un tamaño de exclusión de 8 µ m, y se ajustó la concentración apropiada. Para el cultivo de larga duración, se cargó el medio después de 48 horas. Para este fin, el medio se retiró por succión cuidadosamente y se añadieron cuidadosamente 400 µ? de medio reciente cada vez a las células. También, en algunos lotes el medio se cargó inmediatamente antes de la adición de estimulantes. La estimulación se efectuó mediante la adición de un volumen apropiado de los ODN/moléculas de manera que se alcanzara una concentración final de 2.5 µ? y 1 µ?, respectivamente. Se empleó LPS a una concentración de 0,5 µg/ml. Después de esto, las células se incubaron en un incubador durante períodos variables de tiempo (6 - 48 h). Finalmente, se transfirió el medio a recipientes de reacción de 1 ,5 mi, se centrifugaron en Biofuge a 1400 rpm para sedimentar las células posiblemente incluidas, y se usaron los sobrenadantes para determinar la concentración de IL-8 por medio de ELISA.

Detección de citoquina/quimioquina usando ELISA Para investigar el efecto inmunomodulador de dSLIM sobre PBMC, se midió la inducción de IL-6, IFN-a alfa e IFN-?.

IL-6 es una citoquina multifuncional que está secretada por una diversidad de linfocitos y de monocitos activados, además de inducir las proteínas de fase acuosa en hepatocitos, tiene un efecto promotor sobre el crecimiento, diferenciación y fagocitosis de linfocitos [Kirchner, 1994].

IFN-a, que tiene varios subtipos, pertenece a los interferones de tipo I teniendo principalmente un efecto antiviral. Se secretan grandes cantidades de IFN por pDC después de la activación de TLR7, 8 ó 9 [Perry, 2005], véase también la sección 1.3.2. IFN-? se secreta predominantemente por células NK y T pero también por monocitos, células dendríticas y células B. es el interferón de tipo II y, al contrario que los interferones de tipo I, en su lugar tiene un efecto inmunomodulador más que un efecto antiviral. Además de su papel en la diferenciación, IFN-? es la citoquina efectora más importante de una respuesta inmune dirigida por TH1. Se usó la secreción de IL8/CXCL8 para detector la activación de TLR9 en células transformadas HEK293. IL-8 es una quimioquina CXC secretada por leucocitos pero también por fibroblastos, células endoteliales y epiteliales. La inducción de IL8/CXCL8 procede por ejemplo mediante IL-1 y TNF-? pero también mediante PRR y factores ambientales tal como hipoxia. La expresión de IL8/CXCL8 está regulada por la regulación de la transcripción mediante la activación cooperativa de NF-a y AP-1 y sobre el nivel de estabilidad de RNAm. Además de su efecto como activador de neutrófilos, IL8/CXCL8 tiene un efecto quimiotáctico sobre diversos leucocitos y está implicado en el proceso de transmigración de leucocitos en tejidos [Mukaida, 2003].

Para detectar las citoquinas en los sobrenadantes de cultivo de células de PBMC y células HEK293, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se usó en la forma de un "ELISA sándwich". Es un inmunoensayo cuantitativo en el que los anticuerpos específicos para la proteína a detectar se inmovilizan sobre la superficie de una placa de microvaloración mediante absorción. La unión del antígeno al anticuerpo respectivo inmovilizado del mismo modo al anterior, y otros componentes se puede retirar mediante lavado. La unión de antígeno y anticuerpo es una reacción de equilibrio de manera que la cantidad de antígeno unido depende de la concentración. La detección del antígeno se efectúa usando un Segundo anticuerpo específico biotinilado que a su vez se une a estreptavidina - enzima conjugada usada en la detección. En el ensayo realizado en el presente documento la enzima era peroxidasa de rábano picante (HRP). La cantidad medida real es la cantidad (concentración) de un sustrato cromogénico que hace reaccionar la enzima dentro de un período definido de tiempo. El sustrato usado en el presente documento era TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) que se oxida en la presencia de H202 para absorber la luz de una longitud de onda de 370 nm (azul). La reacción se termina mediante la adición de H2S04, cambiando por lo tanto la longitud de onda de absorción a 450 nm (amatillo) [Luttmann, 2004]. Usando una serie de dilución estándar de concentración conocida de citoquina a determinar, es posible de esta manera determinar las concentraciones de citoquinas desconocidas en los sobrenadantes de cultivo de células. Los pares de anticuerpos requeridos, soluciones patrones de enzima y sustrato se compraron en R&D Systems en la forma de kits. El equipo y materiales para la implementación se presentan en la tabla más adelante.

IL-6 e IFN-? La detección de IL-6 e IFN-? en el sobrenadante del cultivo de células de PBMC se realizó usando los kits DuoSet ELISA Development System de R&D Systems de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Para este fin, el "anticuerpo de captura" se diluyó con PBS hasta una concentración de 4 µ?/??? (IFN-?) y 2 µ?/?t?? (IL-6), respectivamente, y 100 µ? cada vez se colocó en los pocilios de una placa de microvaloración. La placa se incubó a temperatura ambiente durante toda la noche, posteriormente se lavó 3 veces con tampón de lavado y se incubó con 300 µ? de tampón de bloqueo por pocilio durante 1 - 2 h para saturar los sitios de unión libres. La placa se lavó 3 veces con tampón de lavado, y posteriormente se colocaron 100 µ I de muestras y patrones cada vez sobre la placa. Se usaron los sobrenadantes a una dilución de 1 :2 en tampón de reactivo para la detección de IL-6 y sin diluir para la detección de IFN-?. La serie de dilución patrón para IL-6 comprendía las siguientes concentraciones: 12,5; 25; 50; 100; 200; 350; 700 pg/ml. La serie de dilución patrón para IFN-? comprendía las siguientes concentraciones: 12,5; 25; 50; 100; 250; 500; 1000 pg/ml. Se realizaron determinaciones dobles en cada caso. El tiempo de incubación era 2 h. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado, 100 µ? de "anticuerpo de detección" a una concentración de 100 ng/ml (IL-6) y 200 ng/ml (IFN-? ), respectivamente, en tampón de reactivo se colocó sobre la placa cada vez. Después de un tiempo de incubación de 2 h, lá placa se lavó tres veces con tampón de lavado, y se colocaron 100 µ? de estreptavidina-HRP diluidos 1 :200 en tampón de reactivo en cada pocilio. El tiempo de incubación era 20 min. Después de una etapa de lavado triple final, 100 µ? de solución de sustrato ("reactivo de color" A y B a una relación de 1 :1) cada vez se añadió a las placas y se incubaron durante 20 min en la oscuridad. La reacción se terminó mediante la adición de 50 µ? de 1 M H2S04, y se midió la absorción en cada pocilio individual a 450 nm en un lector de microplacas. La evaluación se realizó usando el software SoftMax Pro 2.6. Se calculó la curva patrón con un ajuste de 4 parámetros.

IFN-a La detección de IFN-cc en los sobrenadantes de cultivo de células de PBMC se realizó usándole Kit ELISA lnterferón-cc humano de Biosource de cuerdo con las instrucciones adjuntas. 100 µ? de patrones y muestras por pocilio se añadieron a las tiras de microvaloracion incluidas en el kit, ya proporcionadas con anticuerpos y se bloquearon, y se incubaron durante 1 h a RT. Se diluyeron los sobrenadantes 1 :2 con tampón de dilución, y la serie de dilución patrón comprendía las siguientes concentraciones: 156; 312; 625; 1250; 2500; 5000 pg/ml. Después de una etapa de lavado, se añadieron 100 µ? de Concentrado D de anticuerpo en tampón C de dilución a cada pocilio y se incubaron durante 1 h a TA. La placa se lavó 3 veces y se añadieron 100 µ? de HRP en diluyente de HRP con cada placa y se incubaron durante 1 hora. La solución se retiró mediante lavado 4 veces y se pipetearon 100 µ? de Solución G de Sustrato en cada pocilio. Esto se incubó en la oscuridad durante 20 min, y se terminó la reacción mediante la adición de 100 µ? de Solución H de parada. La absorción a 450 nm se midió en el lector de microplacas. Se realizó la evaluación usando el software SoftMax Pro 2.6. Se calculó la curva patrón con un ajuste punto a punto. IL-8/CXCL8 Se llevó a cabo detección de IL-8/CXCL8 en los sobrenadantes de cultivos celulares de células HEK293 usando el Kit de Sistema de Desarrollo de ELISA de DuoSet de R&D Systems de acuerdo con las instrucciones anexas y fue idéntica a aquella descrita para IL-6 e IFN-?. Las series de dilución estándar comprenden las siguientes concentraciones: 31 ,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000; 2000 pg/ml. Los sobrenadantes se emplearon en forma no diluida. Las concentraciones de anticuerpos empleadas fueron; 4 µg/ml de anticuerpo de captura, 20 ng/ml de anticuerpo de detección.

Preparación y descripción de moléculas de DNA multiméricas Para investigar la influencia de características estructurales, particularmente aquellas que favorecen la capacidad de formar estructuras G, se produjeron combinaciones de moléculas de DNA monoméricas con restos de poli(G) en diversas regiones usando el procedimiento de acuerdo con la invención que, aparte de liofilización, está de acuerdo con aquel de preparación de monómeros. Para este fin, / se combinaron tres secuencias diferentes para tallo (S) y bucle (L) cada vez que, por otro lado, se diferencian en el número y localización de bases de guanina, pero también en la estructura secundaria predicha por el programa de " DNA mfold". Las secuencias individuales y sus características estructurales se representan en la siguiente tabla: Tabla 3.1 : Características estructurales y secuencias L1-L3, S1-S3 (rojo: poli(G)) Características estructurales Tendencia de Nom-bre Secuencia Secuencia de poli(G) bucle T CAT TGG AAA ACG TTC TTC GGG GCG corta (G4) no L1 TTC TT dentro de resto GC T CAT TCC ATA TCG TTC TTC GTG TCG SI L2 ninguna TTC TT T CGG GGG GTA TCG TTC TTC GTG larga (G6) SI L3 TCG TTC TT fuera del resto CG 5'-CCT AGG GGT TAC CAC CT ... S1 corta 3'- CCA ATG GTG GA ... 5'-CTG CAG CTG TAG CAG CT ... S2 ninguna 3'-GAC ATC GTC GA ... 5-CCT AGG GGT GGG GGC CT ... S3 largo (G4TG5) 3'-CCA CCC CCG GA ...

El siguiente diagrama da una visión general de combinaciones usadas y su nomenclatura usada más adelante en el presente documento: Tabla 3.2: Nomenclatura de moléculas con diferentes combinaciones de bucle/tallo Como se demuestra anteriormente, las moléculas de dSLIM poliméricas que, en el significado de la invención, pueden referirse también como moléculas multiméricas o moléculas oligoméricas, están muy bien establecidas para inducir respuesta inmune en un organismo. La respuesta inmune potenciada permitió el uso ventajoso de los agentes con agentes quimioterapéuticos. Comparado con el efecto adictivo de los dos agentes, la combinación de agentes quimioterapéuticos y los agentes de acuerdo con la invención da como resultado el efecto sinérgico en el tratamiento de tumores. Debido a la combinación con el agente de acuerdo con la invención, que se puede obtener por medio de las etapas de procedimiento anteriormente mencionadas (véase la reivindicación principal), se potencian todos los efectos de los agentes quimioterapéuticos o citostáticos adicionalmente empleados. Aunque las formas monoméricas de moléculas de dSLIM se han combinado ya con agentes quimioterapéuticos o citostáticos, el efecto logrado combinando la forma multimérica o polimérica de dSLIM con agentes citostáticos fue una sorpresa completa. En el uso práctico de un agente de combinación que comprende la forma monomérica de dSLIM y los agentes citostáticos se encontró que sólo podrían mejorarse las propiedades particulares de agentes citostáticos pero no -como con la forma polimérica- sus propiedades generales. Además, la activación del sistema inmune mediante la forma polimérica/multimérica de dSLIM fue sorprendentemente más alta de tal forma que se puede lograr un resultado general en el tratamiento de tumores que está sorprendentemente mejorado comparado con el uso de la forma monomérica de agentes citostáticos. Así, en particular, la formación de metástasis se evitó por el uso de moléculas de dSLIM multiméricas en un organismo cuando se administran agentes citostáticos/agentes quimioterapéuticos conjuntamente con estos agentes. Se entiende que la combinación en el significado de la invención es simultánea así como la administración de ambos agentes variada en el tiempo. La Figura 3.1.1 ejemplifica las dos estructuras secundarias diferentes de las moléculas de dSLIM 30L1 (tales como MS) y KG (tales como ML, GS, GL, GLS) para las secuencias de tres bucles como se calculan mediante "DNA mfold". En contraste con 30L1 , no se predijo ningún emparejamiento de bases en el bucle para KG bajo las afecciones seleccionadas.

Preparación de diversas moléculas monoméricas y multiméricas La Figura 3.1.2 muestra el resultado de separación de 0,3 µg de lotes de ligazón y digestión de T7 de prueba de las diferentes moléculas de SLIM junto con el 30L1 ODN en gen de agarosa al 3%. En todos los carriles donde las diferentes moléculas se separaron, se puede ver una banda a corta distancia por debajo del nivel por encima del que ha migrado el marcador, banda que corresponde a la molécula monomérica. En el carril que contiene el 30L1 ODN es visible una banda por debajo de la banda de moléculas monoméricas. Para moléculas que contienen L3 (GL, GLS), una distribución borrosa de DNA se puede ver en la región superior del gel hasta los bolsillos, que son marcadamente más fuertes para GL y más débiles para GLS en el lote de digestión con T7 comparado con el lote de ligazón. Para moléculas que contiene restos de poli(G) largos (GL, GS, GLS MS), las bandas en el gel son relativamente borrosas comparadas con las otras moléculas (30L1 , KG, ML). En los carriles donde se aplicaron los lotes de digestión, las intensidades de fluorescencia, especialmente en I la región superior del gel, son más bajas comparadas con aquellos carriles que tenían lotes de ligazón aplicados en esto.

La figura 3.1.3 muestra los cromatogramas de una purificación de HPLC de las diferentes moléculas. Cada uno de los trazados de absorción a 260 nm (línea azul) frente al volumen fluyó a través de la columna después de separarse la mezcla (línea rosa discontinua). La línea verde representa el gradiente de tampón de NaCI del 0%, 50% y 100% del tampón de NaCI 1 M (T20N1000). El primer pico con su máximo a 2,5 mi y T20N1000 (F2) al 0% corresponde a las moléculas no unidas, el segundo pico con su máximo a 8 mi y T20N1000 (F3) al 50% corresponde a las moléculas con afinidad baja a la fase estacionaria (a pesar de aplicar la cantidad de 12 veces comparada con la fracción F4, no se detectó nada de DNA en el gel de agarosa para cualquiera de las fracciones). El tercer pico es máximo a 14 mi y T20N1000 (F4) al 100% corresponde a las moléculas monoméricas.

Figura 3.1.3: cromatogramas de la purificación de HPLC de diferentes moléculas multiméricas. a) 30L1 , b) ML, c) KG, d) MS, e) GS, f) GLS, g) GL, columna : 1 mi de DMAE; cantidad aplicada: 700 µg; velocidad de flujo: 1 ml/min; tampón A: Tris 20 mM, pH 7; tampón B: Tris 20 mM, NaC1 1 M, pH 7; gradiente: tampón B al 0%, al 50%, al 100%.

Cuando se comparan los cromatogramas de las diferentes moléculas, se ve claramente que F4 es un pico individual para moléculas que no contienen ningún resto de poli(G), es decir ni S3 ni L3 (30L1 , ML, KG). En contraste, se observó un pliegue en F4 para aquellas moléculas que contengan S3. Para moléculas que contienen g L3 (GL, GLS), el máximo tuvo dos picos, con distribución de intensidad diferente entre GL y GLS. Para GLS, ambos máximos parciales tienen aproximadamente la misma intensidad, mientras que para GL el máximo parcial observado a volumen mayor tiene una intensidad más alta que aquel a un volumen menor. Los máximos laterales aparentes o pliegues se fraccionaron separadamente mediante operación manual. Las fracciones se designaron F1 y D2 de acuerdo con el orden cronológico de su elución.

Las fracciones de dSLIM anteriormente descritas de separación de HPLC tras precipitación de etanol, es decir los productos finales, se aplican en el gel de agarosa representado en la figura 3.1.4. En todos los carriles la banda que corresponde a las moléculas monoméricas se puede ver a corta distancia por debajo de la distancia de migración del fragmento marcador de 100 pares de bases. Para ML y KG, se puede reconocer una segunda banda, más débil, a corta distancia por encima de esta banda que tiene una intensidad más alta para ML. GL, MS y GLS muestran una movilidad un tanto más alta en el gel que las otras moléculas. Para moléculas que no contienen ningún resto de poli(G) (30L1 , KG, MS), se puede reconocer una distribución de intensidad no discreta hasta el nivel de. aproximadamente 200 pb por encima de la banda de dSLIM. Además, una banda débil al nivel del marcador de 200 pb puede reconocerse por KG y ML.

Figura 3.1.4: diversas moléculas monómericas u multiméricas después de precipitación con etanol.

Gel de agarosa al 3, cantidad aplicada 0,3 µg, 0,5 µg de marcador 100 pb (100 pb, 30L1 , 30L1 , KG, ML, GL-F1 , GL-F2, EM-F1 , EM-F2, GS-F1 , GS-F2 GLS-F1 , GLS-F2, 100 pb).

Para moléculas donde se observó una distribución de multipico y el máximo se fraccionó en purificación de HPCL, cada fracción 1 corresponde a la banda monomérica, mientras los carriles que tienen las fracciones 2 aplicadas en ellos muestran principalmente una distribución de intensidad durante un amplio intervalo por encima de la banda monomérica. Aquí, MS y GS tienen distribuciones de intensidad similares que, empezando aproximadamente a partir de la banda monomérica, se extienden hasta un nivel de migración que corresponde a 500 pares de bases. Para GL, por otro lado, ello empieza por encima de 200 pb, extendiéndose hasta el bolsillo del gel. Para GLS, sin embargo, se puede observar distribución del DNA a través del carril entero, empezando a partir de la banda monomérica.

Figura 3.1.6: desnaturalización térmica de diversas moléculas monoméricas y multiméricas.

El PAGE nativo, gel al 8% (C al 2,6%), 0,25 µg de cantidad aplicada, 0,3 µg de marcador de 25 pb (25 pb, no tratado, desnaturalización a 95°C durante 10 min: 30L1 , MS, ML, KG, GS, GL-F2, GLS-F2).

El gel en figura 3.1.6 muestra el efecto de la desnaturalización térmica de las diferentes moléculas en su comportamiento de migración en el gel. Con este fin, los lotes se dividieron y una parte se calentó a 95°C durante 10 minutos, se enfrió inmediatamente en hielo y se aplicó. Las bandas observadas corresponden a aquellas en el gel descrito bajo 3.1.5, pero en este caso, no es visible ningún DNA separado en el bolsillo del gel para MS y GS también, y se ve una segunda banda para MS, que corre al mismo nivel que la segunda banda de 30L1. GS y MS implican un lote de producción diferente del gel mostrado en la figura 3.1.5, donde el máximo lateral en fraccionamiento de HPLC no se recogió por separado. Una comparación de las bandas en gel con dSLIM desnaturalizado y no desnaturalizado muestra que la intensidad de la 1a banda está disminuida y que aquella de la 2a banda está incrementada en todas las moléculas después de calentar. La banda en los carriles ML y KG que aparece en el tercio superior del gel no es más visible después de la desnaturalización. Además, el DNA en los bolsillos de los carriles donde se aplican MS y GS no se puede reconocer más después de la desnaturalización. En los carriles GL-F2 y GLS-F2 la cantidad de DNA en el bolsillo está asimismo reducida, pero por otro lado es visible un número mayor de bandas dispuestas regularmente por encima de la 2a banda.

Para examinar si los cambios causados por desnaturalización son reversibles, las muestras desnaturalizadas se dividieron e incubaron durante 3 días a 4°C y 37°C, respectivamente. Los lotes de dSLIM no tratados se almacenaron a 4°C, asimismo se dividieron después de 3 días, y se calentó una alícuota cada vez a 95°C durante 10 minutos e inmediatamente se situó en hielo. Los resultados de un PAGE nativo usado para separar los lotes se representaron en las figuras 3.1.7 y 3.1.8. Las muestras no tratadas y desnaturalizadas muestran el mismo comportamiento de migración en el gel como se describe para el gel representado en la figura 3.1.6. En su comportamiento de migración, las muestras desnaturalizadas incubadas a 4°C corresponden a las muestras desnaturalizadas inmediatamente antes de su aplicación. Las muestras incubadas a 37°C muestran un comportamiento de migración en el gel, que corresponde grandemente con aquel de las muestras no tratadas. Sin embargo, la intensidad de la segunda banda para 30L1 , MS y GS es más alta que aquella para lo anterior. Otra diferencia para GS y MS se ve en la cantidad de DNA que ha permanecido en el bolsillo del gel, que es muy baja comparada con la muestra no tratada.

Molécula dimérica y fracciones de 30L1 monoméricas Para examinar si la banda reconocida en el tercio superior es una banda que corresponde a un dímero, se aplicó una fracción (F3) obtenida a partir de una cantidad grande de moléculas monoméricas por medio de separación de HPLC y que representa a esta banda sobre un PAGE nativo conjuntamente con la molécula dimérica 60L1.

Figura 3.1.9: comparación de la fracción 3 con la molécula dimérica 60L1.

PAGE nativo, gel al 8% (C al 5%), cantidad aplicada 0,25 µ9, 0,3 µg de marcador de 25 pb (25 pb, F3, F3 95°C, 60L1 , 60L1 95°C, fracción 1 (F1), fracción 2 (F2), fracción 3 (F3), fracción 4 (F4) a partir de purificación con HPLC de dSLIM 30L1 , 60L1).

Las bandas observadas se corrieron al mismo nivel. Cuando se aplican muestras en forma desnaturalizada en un gel, las bandas se encuentran a un nivel mayor en el gel comparadas con un carril que tiene muestras no tratadas aplicadas en él. Los carriles correspondientes del PAGE nativo se representaron en la figura 3.1.9 conjuntamente con el resultado de separación de las cuatro fracciones diferentes de monómero 30L1 obtenidas por medio de fraccionamiento de HPLC.

Medio de incubación, unión a proteína Para investigar el efecto de las condiciones en el cultivo celular, especialmente la presencia de proteínas, en las moléculas usadas para estimulación, las últimas se incubaron en medio de cultivo celular durante 0,5 y 27 horas a 37°C y se separaron junto con las moléculas disueltas en agua usando PAGE nativo. Tras la tinción de DNA, las proteínas presentes en el medio se detectaron en el gel por medio de tinción de Coomassie. Los resultados se representaron en las figuras 3.1.10. y 3.1.11.

Figura 3.1.10: incubación de moléculas monoméricas en medio PAGE nativo, gel al 8% (C al 5%), cantidad aplicada 0,25 µg, 0,3 µg de marcador de 25 pb, 0,3 µg de marcador de 50 pb (50 pb, medio de 27 h, medio de 5 h, medio de 0 h, H20: 30L1 , ML, F3, KG, 25 pb).

PAGE nativo, gel al 8% (C al 2,6%), cantidad aplicada 0,25 µg, 0,35 µg de 25 pares de bases (medio de 27 h, medio de 5 h, medio de 0 h, H20: GL, 25 pb).

Sección de tinción de Coomassie, PAGE al 8% nativo (C al 5%), de figura 3.1.11 a) (medio de 27 h, medio de 5 h, medio de 0 h, H20: ML).

Figuras 3.1.10 a) y 3.1.10 b) muestran el PAGE teñido con bromuro de etidio que tiene las moléculas aplicadas en él. La figura 3.1.10 c) da una representación ejemplar de una sección del gel teñido con Coomassie usado para comparar las distancias de migración. La comparación con los carriles que incluyen los diferentes lotes muestra que una banda aparece en el bolsillo de gel para todas las moléculas en medio, que se usa en los carriles de H20 (con la excepción de GL). La banda que aparece en la región superior del gen en H20 durante 30L1 y fracción 3 muestra una distancia de migración en medio que está al nivel de la banda de proteína más baja. La intensidad tanto de DNA como de las bandas de proteína decrece con incremento del tiempo de incubación. Para GL, la intensidad de la 2a banda se incrementa en medio comparada con H20.

Figura 3.1.11 : Incubación de ODN M362 en medio PAGE nativo, gel al 12% (C al 5%), cantidad aplicada 0,25 µg, 0,3 µg de marcador de 25 pb (25 pb, H20, medio de 0 h, medio de 5 h, medio de 27 h).

Sección de tinción de Coomassie, PAGE nativo, gel al 12% (C al 5%), de figura 3.1.12 a) (H20, medio de 0 h, medio de 5 h, medio de 27 h).

Figura 3.1.11 muestra el PAGE nativo en el que se aplicó la molécula control protegida con fosforotioato. Como se vio claramente en esto, la banda de DNA visible en H20 en el borde del fondo del gel ha desaparecido en el medio. En cambio, se pueden ver una banda en el borde superior del gel, que corresponde en su distancia de migración a la banda de proteína más baja (figura 3.1.11 b), y se puede ver una banda en el bolsillo del gel. Se puede observar un decrecimiento en la intensidad de las bandas de DNA con incremento del tiempo de incubación en este caso también.

Para verificar que los cambios observados se causaron por la presencia de proteínas más que por otros componentes del medio, las moléculas se diluyeron también en medio sin adición de FCS para comparación. En la figura 3.1.12 los carriles correspondientes de los geles se ejemplificaron por IdSLIM (KG) y M362. Los carriles donde los ODN y las moléculas se separaron en medio sin nada de FCS corresponden en su distribución de intensidad a aquellos donde los ODN y los dSLIM se aplicaron como una solución en agua. En contraste, los ODN disueltos en medio con FCS y las moléculas muestran un comportamiento de migración en el PAGE nativo que corresponde a aquel descrito en las figuras 3.1.10 y 3.1.11 para aquellos carriles donde se aplicaron moléculas monoméricas y ODN diluido en medio.

Efecto Inmunoestimulador: estimulación de PBMC El efecto inmunoestimulador de las diferentes moléculas se investigó en PBMC aislada de donaciones de sangre humana. Para este fin, la PBMC se incubó con la molécula respectiva o con la molécula control M362 a una concentración final de 1 µ? durante 48 h, y la cantidad de IL-6, IFN-a e IFN-? en los sobrenadantes de cultivos celulares se midió usando ELISA. Las células incubadas sin ningún aditivo se usaron como control.

Los resultados de ELISA de sobrenadantes de PBMC aislados a partir de 4 donaciones de sangre (donantes A-D) se representaron en los diagramas en la figura 3.2.1 a-c). Los valores respectivos corresponden a los valores promedio de determinaciones dobles, y las barras de errores representan la desviación estándar doble determinada de ahí. Para valores marcados con *, se llevaron a cabo determinaciones dobles adicionales para estimulación de PBMC, y los valores indicados corresponden a valores medios de los cuatro resultados obtenidos de ELISA. Las barras de error corresponden a la doble desviación estándar de estos cuatro valores. Figura 3.2.1 a-c): Resultados de ELISA de IFN-? (a), IFN-a (b), IL-6 (c) PBMC Las PBMC sobrenadantes (2,4 x 106 células por lote en 600 µ?) de donantes A-D diferentes, 48 horas de estimulación con dSLIM/ODN M362 1 µ? , intervalo de medición estándar — , * doble cultivo celular de determinación, barras de error: 2 x desviación estándar de ELISA de determinación doble ELISA (* cultivo celular de determinación doble + ELISA de determinación doble = 4 valores).

En referencia a los diagramas, una característica inmediatamente sorprendente es que las concentraciones de citoquinas en los sobrenadantes de los diferentes donantes muestran fuertes variaciones, impidiendo de este modo la comparación de los datos. Las desviaciones estándar de los valores adicionalmente determinados en el cultivo celular como determinaciones dobles son comparables a las desviaciones estándar meramente determinadas a partir de las determinaciones dobles en el ELISA, indicando que las diferencias se deben a diferencias en la PBMC. En los lotes no estimulados, no se detectan concentraciones de citoquinas muy bajas para todos los donantes. En la determinación de las concentraciones de la IL-6 y el IFN-? algunos de los valores determinados están en el límite superior o fuera del intervalo de medición estándar que es hasta 10.000 µg/ml para IFN-?, hasta 3.500 g ml para IL-6 por dSLIM y 7.000 µg/ml para M362.

Para permitir mejor comparación de datos a partir de donantes diferentes, los valores de citoquinas resultantes se normalizaron. Para este fin, el porcentaje de las concentraciones de citoquina determinadas en el valor determinado para M362 se calculó para cada donante. Los valores promedio de los datos así normalizados se representan en los diagramas en la figura 3.2.2 a-c). Cada barra de error corresponde a la desviación del valor promedio. Debido a grandes diferencias observadas entre los donantes individuales, las barras de error son muy grandes. Al fin, sin embargo, es posible estimar una tendencia para las moléculas individuales por medio de los diagramas.

Figura 3.2.2 a-c): valores medios normalizados de resultados de ELISA para IFN-y (a), IFN-a (b), IL-6 (c). Resultados de ELISA véase fig. 3.2.1 normalizada: cantidad de citoquina en M362 en % por donante, valores promedio de 4 donantes, barras de error: desviación de valor promedio.

Para IFN-?, los valores calculados para las moléculas probadas comprobadas estuvieron entre el 40% y el 80%, en relación a los valores de M362, y los valores de KG, ML, y GLS-F2 fueron más en la región inferior y para GL-F2 en la región superior.

Los valores promedio en porcentaje de las diferentes construcciones para IFN-oc corresponden aproximadamente a aquellos de M362, con la excepción de los valores calculados para GL-F1 , GLS-F1 y GL-F2 que serán sólo aproximadamente el 50% de los valores de M362.

Los valores promedio de los porcentajes de M362 para IL-6 estuvieron por debajo del 50% para 3011 , MS, GS, GL-F2 y GLS-F2, y MS y GLS-F2 - las construcciones con la concentración de endotoxina más baja - también tuvieron los valores más bajos. Los valores para GL-F1 y GL-F2, donde no está disponible ningún valor de endotoxina, estuvieron ligeramente por encima del 50%, en relación a M362. Los valores más altos de IL-6, que se corresponden con aquellos de M362 o están por encima del 100%, se encontraron en células estimuladas con KG y ML. Además, la concentración de endotoxinas más alta se midió para las dos construcciones.

Figura 3.3.2: Resultados de tiempo de estimulación de ELISA para IL-8 de HEK293-TLR9 HEK293-TLR9 sobrenadantes: 400 µ?/lote (5 ? 106 células/ml); estimulación 6 h, 24 h, 48 h con 2,5 µ? de ODN 2006; LPS 0,5 µg/ml; 3 días de estimulación después de sembrar células (medio cambiado después de 48 h y previo a estimulación); barras de error: desviación estándar 2 x de determinación doble de ELISA.

Razones de cantidades de quimioquina en lotes estimulados/no estimulados de a); barras de error: suma de errores relativos de determinación doble de ELISA.

Las concentraciones de quimioquinas medidas son relativamente bajas. Sin embargo, se puede observar un incremento de cantidad de IL-8/CXCL8 con tiempo de incubación creciente en todos los lotes, que, sin embargo llega a ser muy baja de 24 h a 48 h. Aquí también, los valores respectivos de LPS para células estimuladas por LPS y no estimuladas son aproximadamente iguales en magnitud, y aquellos para células estimuladas con ODN 2006 se incrementan mediante un factor de 1 ,5 comparado con células no estimuladas. No se puede reconocer ninguna diferencia en las razones de cantidades de IL-8/CXCL8 de lotes estimulados/no estimulados determinados en diferentes puntos temporales, razón por la que las estimulaciones se llevaron a cabo durante 24 horas.

Figura 3.3.4: ELISA para IL-8 nulos en HEK293 en diversas moléculas monoméricas.

Sobrenadantes nulos en HEK293: 400 µ?/lote (1 ? 106 células/ml); estimulación durante 24 h con ODN 2006/dSLIM 2 µ? ; LPS a 0,5 µ9/???; estimulación 4 días después de sembrar células (medio cambiado después de 48 h y antes de estimulación); barras de error: desviación estándar 2 x a partir de determinación doble de ELISA.

Razones de cantidades de quimioquina en lotes estimulados/no estimulados de a); barras de error: suma de errores relativos de determinación doble de ELISA.

No se observa ninguna diferencia significativa en secreción de IL-8/CXCL8 comparada con un lote no estimulado en cualquiera de los lotes incubados con dichos estimulantes diferentes.

Claims (30)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una molécula multimérica para modular la actividad del sistema inmunitario humano o animal, molécula que puede producirse mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas: proporcionar una secuencia de ácido oligodesoxirribonucleico fosforilado en 5' en agua, liofilizar hasta que se obtiene un residuo seco, seguido de nueva suspensión en una solución de tampón, añadir una DNA ligasa de T4, formando así una mezcla de reacción, e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante al menos 30 minutos.

2. La molécula de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque la secuencia de oligodesoxirribonucleótidos comprende las siguientes secuencias: a) GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC o b) ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA, o c) comprende una secuencia de ácido oligodesoxirribonucleico que tiene la secuencia de bases AACG TTCTTCGGGG CGTT, d) teniendo dicha secuencia de ácido oligodesoxirribonucleico una longitud de 40 a 1.600 nucleótidos.

3. La molécula de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizada porque la secuencia de bases de acuerdo con la característica c) está incluida en la secuencia CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC.

4. La molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula comprende una cadena parcialmente monocatenaria, cerrada covalentemente de restos desoxirribonucleosídicos. 5. La molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula comprende la secuencia de bases

NWCGNPN4 en la que N1N2 es un elemento del grupo de GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 es un elemento del grupo de CT o TT, y C es desoxicitosina, G es desoxiguanosina, A es desoxiadenosina, y T es desoxitimidina.

6. La molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la secuencia de bases N N2CGN3N4 está situada en la región monocatenaria de la cadena cerrada de restos desoxirribonucleosídicos.

7. La molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque uno o más sustituyentes están unidos a la molécula mediante enlaces covalentes.

8. La molécula de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el sustituyente se selecciona a partir de uno de los grupos que comprenden péptidos, proteínas, sacáridos, estructuras antigénicas, DNA y/o RNA.

9. Un agente de combinación, caracterizado porque comprende una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un agente quimioterapéutico.

10. El agente de combinación de acuerdó con la reivindicación precedente, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que comprende anticuerpos, agentes de alquilación, análogos de platino, agentes de intercalado, antibióticos, inhibidores de la mitosis, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, antimetabolitos y/o L-asparraginasa, hidroxicarbamida, mitotano y/o amanitinos.

11. El agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los agentes de alquilación se seleccionan del grupo que comprende: derivados de mostaza de nitrógeno, especialmente ciclofosfamida, - ifosfamida, trofosfamida, melfalán y/o clorambucilo, alquilsulfonatos, especialmente - busulfán y/o treosulfán, nitrosoureas, especialmente carmustina, lomustina, - nimustina, estramustina y/o estreptozotocina, procarbazina y dacarbazina, temozolomida y/o - tiotepa.

12. El agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los análogos de platino se seleccionan del grupo que comprende: cisplatino, - carboplatino y/o oxaliplatino.

13. El agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los agentes de intercalado se seleccionan del grupo que comprende: antraciclinas, especialmente - doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, epirrubicina y/o idarrubicina, mitoxantrona, - amsacrina y/o doxifluridina.

14. El agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el agente antibiótico se selecciona del grupo que comprende: - bleomicina, actinomicina D (dactinomicina) y/o mitomicina.

15. El agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el inhibidor de la mitosis se selecciona del grupo que comprende: alcaloides de Vinca rosea, especialmente vinorelbina, vincristina (oncovina), vinblastina y/o - vindesina.

16. El agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los taxanos se seleccionan del grupo que comprende: paclitaxel y/o docetaxel.

17. El agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los inhibidores de topoisomerasa se seleccionan del grupo que comprende: inhibidores de topoisomerasa I, especialmente camptotecina, topotecano y/o - irinotecano y/o inhibidores de topoisomerasa II, especialmente etopósido tenipósido.

18. El agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los antimetabolitos se seleccionan del grupo que comprende: antagonistas de ácido fólico, especialmente metotrexato, análogos de pirimidina, especialmente - 5-fluorouracilo, capecitabina, arabinosida de citosina (citarabina) y/o gemcitabina, análogos de purina, especialmente - 6-tioguanina, pentostatina, azatioprina, 6-mercaptopurina, fludarabina y/o cladribina.

19. Un kit que comprende la molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o el agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18 y opcionalmente información sobre la combinación del contenido del kit.

20. La molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y el agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18 para usar como fármaco.

21. Un agente farmacéutico que comprende una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente tolerable.

22. Uso de una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, un agente farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 20 para la producción de un agente para modular un sistema inmunitario humano o animal o para modular la actividad de dicho sistema inmunitario.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizado porque dicha modulación es estimular o potenciar la actividad del sistema inmunitario.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizado porque la estimulación comprende una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T o independiente de linfocitos T.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizado porque la respuesta inmunitaria comprende la proliferación de linfocitos B y/o la activación de linfocitos B.

26. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la estimulación del sistema inmunitario comprende la secreción de citocinas.

27. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o el agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17 se usan como adyuvantes en la vacunación terapéutica o profiláctica.

28. Uso de una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un agente de combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17 y/o un agente farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 20 en la producción de un agente para el tratamiento de un trastorno del crecimiento celular.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizado porque el trastorno del crecimiento celular es una enfermedad tumoral.

30. El uso de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizado porque la enfermedad tumoral se selecciona del grupo que comprende tumores del área del oído, nariz, garganta, que comprenden tumores de la nariz interna, senos nasales, nasofaringe, labios, cavidad bucal, orofaringe, laringe, hipofaringe, oído, glándulas salivares, y paragangliomas, tumores de los pulmones que comprenden carcinomas bronquiales no parvicelulares, carcinomas bronquiales parvicelulares, tumores del mediastino, tumores del tubo gastrointestinal, que comprenden tumores del esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y vías biliares, carcinomas del intestino delgado, colon y recto y carcinomas anales, tumores urogenitales que comprenden tumores de los ríñones, uréter, vejiga, glándula prostática, uretra, pene y testículos, tumores ginecológicos que comprenden tumores de cuello de útero, vagina, vulva, cáncer uterino, enfermedad trofoblástica maligna, carcinoma de ovario, tumores del tubo uterino (trompas de Falopio), tumores de la cavidad abdominal, carcinomas de mama, tumores de los órganos endocrinos, que comprenden tumores del tiroides, paratiroides, córtex suprarrenal, tumores del páncreas endocrino, tumores carcinoides y síndrome carcinoide, neoplasias endocrinas múltiples, sarcomas óseos y de los tejidos blandos, mesoteliomas, tumores de piel, melanomas que comprenden melanomas cutáneos e intraoculares, tumores del sistema nervioso central, tumores durante la infancia, que comprenden retinoblastoma, tumor de Wilms, neurofibromatosis, neuroblastoma, familia tumoral del sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma, linfomas que comprenden linfomas no de Hodgkin, linfomas cutáneos de linfocitos T, linfomas primarios del sistema nervioso central, enfermedad de Hodgkin, leucemias que comprenden leucemias agudas, leucemias mieloides y linfáticas crónicas, neoplasmas de células plasmáticas, síndromes de mielodisplasia, síndromes paraneoplásicos, metástasis con tumor primario desconocido (síndrome CUP), carcinomatosis peritoneal, enfermedad neoplásica relacionada con la inmunosupresión que comprende malignidad relacionada con el SIDA tal como sarcoma de Kaposi, linfomas asociados al SIDA, linfomas del sistema nervioso central asociados al SIDA, enfermedad de Hodgkin asociada al SIDA y tumores anogenitales asociados al SIDA, enfermedad neoplásica relacionada con transplantes, tumores metastáticos que comprenden metástasis cerebral, metástasis pulmonar, metástasis hepática, metástasis ósea, metástasis pleural y pericardíaca, y ascitis maligna.