CN101490257A - 用于免疫刺激的多聚体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节人或动物免疫系统活性的多聚体非编码核酸分子，并涉及其制备方法和包含所述多聚体非编码核酸分子的疫苗。

Description

用于免疫刺激的多聚体
发明概述
本发明涉及用于调节人或动物免疫系统活性的多聚体非编码核酸分子，其制备方法和含有此多聚体非编码核酸分子的疫苗。
尽管在相应病原体特异性的淋巴细胞的选择及其克隆扩充并分化成效应细胞后，获得性免疫应答仅以滞后方式(3-5天)发挥作用，然而随后它因“免疫记忆”的形成而提供免受相应病原体影响的长效保护作用，先天性免疫系统的细胞基于保守性病原体相关分子模式(PAMP)用生殖细胞编码的受体识别病原体并立即应答。对于不同类型细胞不同的反应包括：分泌细胞因子(例如IL-1、IL-6、TNF-α)和趋化因子(例如IL-8/CXCL8、MIP-1α/β、MCP-1)、效应器机理激活(吞噬作用、呼吸放电(respiratory discharge)、释放杀菌性物质或裂解颗粒)、共刺激性分子(CD80、CD86)表达以及MHC分子表达增强。一方面，这召集并活化了能够清除侵入病原体的效应细胞，而在另一方面，获得性免疫系统的细胞接受自身活化所必需的信号。
为产生改善的免疫应答，CpG寡核苷酸(CpG ODN)已经作为新类型免疫调节分子使用。此类非甲基化CG基序存在于细菌DNA中并且代表对免疫系统而言的“危险信号”。作为“病原体相关分子模式”(PAMP)，它们主要引起先天性免疫系统的非特异性激活(Krieg，Nat.Med2003，9：831-835)。
CpG ODN通过白细胞介素-12(IL-12)细胞因子、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α诱导TH1增强型免疫应答。
含有上述CpG-ODN的免疫刺激性核酸序列(ISS)仅有几个碱基长度并且不通过表达在其序列上所编码的蛋白质发挥作用。
ISS是共价闭合的核酸分子。它们由寡核苷酸组成，其中所述寡核苷酸的碱基可以发生局部自我配对，并且所述寡核苷酸的一个或两个环包含30个碱基及数个CG基序并且在下文中称作载体分子。
对细胞免疫应答的强烈刺激允许对调节性循环产生影响，其在不干预时总是产生对患者不利的免疫活动。
如在“CpG DNA”的稳定中所用，以硫代磷酸酯骨架修饰CpG ODN具有若干严重缺点，特别包括观察到的毒性[Heikenwalder 2004，Levin 1999]以及与蛋白质的非特异性结合[Brown 1994]。
出于该原因，已经开发了一个新类型共价闭合的免疫刺激性DNA(EP1196178)。这些DNA分子由两种化学合成的DNA分子组成，其中所述的DNA分子在5′和3′末端具有带回文重叠序列的自我互补区，从而这两种DNA分子的连接产生共价闭合分子。在非互补区内带CG基序的这些DNA分子显现与CpG ODN相似的活性(B细胞上表面分子CD80、CD40、MHC分子的增强表达以及PBMC细胞增强IL-6、IFN-γ、IFN-α、IL-12、TNF-α分泌)，但与具备硫代磷酸酯骨架的CpG ODN相比，它们具有略微不同的表达模式和在小鼠中明显更低的毒性。然而，就调节人或动物免疫系统活性而言，现有技术的此类免疫刺激性DNA具有若干缺点。并非总是可以在需要的水平上调节、尤其触发人或者动物免疫系统的活性。
鉴于上述现有技术，本发明目的旨在提供能够触发改良免疫应答的适宜免疫刺激性DNA分子、其制备方法以及含有所述免疫刺激性DNA分子的疫苗。
在本发明上下文中，免疫刺激作用意指免疫系统的中介细胞和效应细胞，即特别是目前已知的具备辅助功能的胸腺细胞和细胞毒性胸腺细胞、B细胞及所谓NK(自然杀伤)细胞、巨噬细胞和单核细胞、树突状细胞及其前体细胞以及在免疫系统中承担目前尚未阐明功能的细胞群体，因核酸分子的使用受到刺激以显示增殖、移行、分化或活性。免疫调节意指，除上文定义的意义中的一般刺激作用之外，还存在对免疫反应的类型或特征的影响，假定免疫反应参与其起源或成熟进程，或其在本质上改变先前建立的反应。
本发明通过提供多聚体非编码核酸分子解决此目的。多聚体分子可以通过包括以下步骤的方法产生：
-提供在水中的5-磷酸化寡脱氧核糖核酸序列，
-冻干直至获得干燥残留物，随后将其重悬于缓冲液中，
-添加T4DNA连接酶，从而形成反应混合物，和
-在37℃温育该反应混合物至少30分钟。
最意想不到地，上述提及步骤的顺序产生一种多聚体分子，其比现有技术的分子更好地适用于调节人或动物免疫系统的活性。在本发明含意中的多聚体分子基本上是脱氧核醣核酸分子，该核酸分子优选地具有至少100个核苷酸、更优选200个、特别优选超过300个核苷酸的长度。尽管EP1196178公开了就其茎-环结构而言可以称作单体的分子，然而本发明的方法提供其中若干此类茎-环单体结构装配成多聚体或寡聚体结构的分子。意想不到地，所得的装配物有效调节免疫系统。令人惊讶的是以上提及的本身(perse)简单及实验室常用的处理步骤导致有效结构的形成。与根据EP 1 196 178的结构相比，本发明的多聚体分子代表较早期的分子复合体。
在本发明的优选实施方案中，寡聚体或多聚体装配物(即本发明的分子)的特征在于所述的寡脱氧核糖核酸序列包含以下序列：
a)GTTCCTGGAGACGTTCTTAGGAACGTTCTCCTTGACGTTGGAGAGAAC，或
b)ACCTTCCTTGTACTAACGTTGCCTCAAGGAAGGTTGATCTTCATAACGTTGCCTAGATCA，或
c)包含具有碱基序列AACG TTCTTCGGGG CGTT的寡脱氧核糖核酸序列，
d)该寡脱氧核糖核酸序列具有40-1,600个核苷酸的长度。
在本发明含意中的包含优选序列的多聚体装配物特别适用于刺激家畜和人类中免疫系统的活性。
在优选的方式中，依据特征c)的碱基序列被包含在以下序列中：CCTAGGGGTT　ACCACCTTCA　TTGGAAAACG　TTCTTCGGGGCGTTCTTAGG　TGGTAACC　CCTAGGGGTT　ACCACCTTCATTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC。意想不到地，上述序列的存在导致该分子的极高效果，其中所述的效果在本发明含意中理解为激活免疫系统。
本发明的另一个优选实施方案构思所述分子包含部分单链的共价闭合的脱氧核糖核苷残基链。正是在该分子的装配寡聚体或多聚体结构内的部分单链、共价闭合的脱氧核糖核苷残基链才是此分子在其中已经并入该分子的靶生物体中有效活性延长的原因。
本发明的另一个优选实施方案构思所述分子包含碱基序列N1N2CGN3N4，其中N1N2是来自GT、GG、GA、AT或AA的基元，N3N4是来自CT或TT的基元，并且C是脱氧胞苷，G是脱氧鸟苷，A是脱氧腺苷，而T是脱氧胸苷。
一个特别优选的实施方案构思碱基序列N1N2CGN3N4位于闭合脱氧核糖核苷残基链的单链区内。特别是这些优选的分子才在免疫系统中显示高度有效的活性。
本发明还涉及共价地结合于若干取代基的本发明分子，所述的取代基优选地是肽、蛋白质、糖类、抗原结构、DNA和/或RNA分子。
本发明还涉及包含至少一种本发明分子和化疗药的联合剂。意想不到地，当本发明的化合物与熟知化疗药联合并且针对肿瘤使用这种联合剂时，由本发明分子对免疫系统的极高刺激作用甚至可以得以改进。在本发明含意中的联合剂也可以以试剂盒的形式提供，其中本发明的药剂与现有技术的化疗药分立地存在。因此，在优选的实施方案中，该试剂盒的至少两种组分可以在相同时间或以时间交替方式应用。例如，本发明联合剂的施用可以以如此方式激活免疫系统，从而随后应用的化疗药可以尤其有效地发挥活性。显而易见，还可以对人或动物生物体以时间交替方式首先应用化疗药并且随后施用本发明的分子。对于特定肿瘤，优选同时施用本发明的分子和化疗药。
在本发明的优选实施方案中，化疗药选自抗体、烷化剂、铂类似物、嵌入剂、抗生素、有丝分裂抑制剂、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物和/或L-天冬酰胺酶、羟基脲、米托坦和/或鹅膏蕈碱。
在本发明的优选实施方案中，烷化剂选自包括以下物质的组：
-氮芥类衍生物，尤其
  -环磷酰胺，
  -异环磷酰胺，
  -曲磷胺，
  -美法仑，和/或
  -苯丁酸氮芥，
-烷基磺酸酯，尤其
  -二甲磺酸丁酯，和/或
  -丁四醇磺酯，
-亚硝基脲，尤其
  -亚硝基脲氮芥，
  -环己亚硝基脲，
  -嘧啶亚硝基脲，
  -雌氮芥，和/或
  -链脲霉素，
  -甲基苄肼和达卡巴嗪，
  -替莫唑胺，和/或
  -塞替派。
烷化剂对肿瘤具有极高作用，因而抑制其生长。
在本发明的优选实施方案中，铂类似物选自包括以下物质的组：
-顺铂，
-卡铂，和/或
-奥沙利铂。
本发明的另一个优选实施方案构思嵌入剂选自包括以下物质的组：
-蒽环类，尤其：
  -多柔比星(阿霉素)，
  -柔红霉素，
  -表阿霉素，和/或
  -伊达比星，
-米托蒽醌，
-胺苯吖啶，和/或
-去氧氟尿苷。
本发明的另一个优选实施方案构思抗生素选自包括以下物质的组：
-博莱霉素
-放线菌素D(更生霉素)，和/或
-丝裂霉素。
在本发明的另一个优选实施方案中，可以有利的是选择来自包括以下物质的组的有丝分裂抑制剂：
-长春花生物碱，尤其
  -长春瑞滨，
  -长春新碱(安可平)，
  -长春花碱和/或
  -长春地辛。
在本发明另特别优选的实施方案中，紫杉烷类选自包括以下物质的组：
-紫杉醇，和/或
-多西他塞。
此外，可以优选的是选择来自包括以下物质的组的拓扑异构酶抑制剂：
-拓扑异构酶I抑制剂，尤其
  -喜树碱，
  -托泊替康，和/或
  -伊立替康，和/或
-拓扑异构酶II抑制剂，尤其
  -足叶乙甙，
  -替尼泊苷。
还优选在本发明具体实施方案中的抗代谢物选自包括以下物质的组：
-叶酸拮抗剂，尤其
  -甲氨蝶呤，
-嘧啶类似物，尤其：
  -5-氟尿嘧啶，
  -卡培他滨，
  -胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)，和/或
  -吉西他滨，
-嘌呤类似物，尤其
  -6-硫代鸟嘌呤，
  -喷司他丁，
  -硫唑嘌呤，
  -6-巯基嘌呤，
  -氟达拉滨，和/或
  -克拉屈滨。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含本发明分子和化疗药，任选地有关组合该试剂盒的内容物的信息。如上文所述，本发明也涉及一种药用剂，其包含本发明的分子或联合剂，任选地连同可药用载体。
此外，本发明也涉及所述分子、联合剂或药用剂的用途，用于制备用以调节人或动物免疫系统或调节该免疫系统活性的药物。对人或动物免疫系统的调节理解为对免疫系统的任何影响，所述影响导致免疫系统对肿瘤或癌的抑制作用。对免疫系统活性的调节可以同义地理解为或描述本领域技术人员熟知的免疫系统的活性，所述的活性针对肿瘤，并且意想不到地由本发明的化合物提高强度。更具体地，调节因而是刺激或提高增强免疫系统的效果或免疫系统本身。因此，在优选的实施方案中，本发明的化合物可以用来刺激T细胞介导的免疫应答，还可以用来刺激不依赖T细胞的免疫应答。在本发明的优选实施方案中，此过程可以包含B细胞增殖或B细胞活化。
在特别优选的实施方案中，调节免疫系统的活性导致如此方式的刺激，从而分泌或以更高水平分泌细胞因子。可以特别优选的是将本发明的分子或本发明的联合剂用作治疗性或预防性接种中的佐剂。以特别有效的方式，本发明的药剂可以用在治疗细胞生长疾病中，并且在优选的实施方案中，所述细胞生长疾病是肿瘤病。在优选的方式中，该肿瘤病选自包括以下疾病的组：耳-鼻-喉部位肿瘤，其包括内鼻、鼻窦、鼻咽、唇、口腔、口咽部、喉、下咽部、耳、唾液腺和副神经节的肿瘤；肺的肿瘤，其包括非小细胞性支气管癌、小细胞性支气管癌；纵隔的肿瘤；胃肠道的肿瘤，其包括食管、胃、胰脏、肝脏、胆囊及胆道、小肠、结肠与直肠癌和肛门癌；泌尿生殖道肿瘤，其包括肾、输尿管、膀胱、前列腺腺、尿道、阴茎和睾丸的肿瘤；妇科肿瘤，其包括宫颈、阴道、外阴的肿瘤、子宫癌、恶性滋养细胞疾病、卵巢癌、输卵管(Tuba Faloppii)肿瘤；腹腔肿瘤；乳腺癌；内分泌器官肿瘤，其包括甲状腺、甲状旁腺、肾上腺皮质的肿瘤、内分泌性胰腺肿瘤、类癌瘤和类癌综合征、多发性内分泌腺瘤；骨和软组织肉瘤、间皮瘤、皮肤肿瘤、黑素瘤，包括皮肤及眼内黑素瘤；中枢神经系统肿瘤；婴儿期肿瘤，包括视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经纤维瘤病、神经母细胞瘤、Ewing肉瘤肿瘤家族、横纹肌肉瘤；淋巴瘤，其包括非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、中枢神经系统原发性淋巴瘤、霍奇金病；白血病，包括急性白血病、慢性髓细胞性白血病和淋巴细胞性白血病、浆细胞瘤、脊髓增生异常综合征；副肿瘤性综合征、原发灶不明的肿瘤转移(CUP综合征)；腹膜癌病；免疫抑制相关性恶性肿瘤，其包括AIDS相关恶性肿瘤如卡波西肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、中枢神经系统AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关性霍奇金病和AIDS相关性肛殖肿瘤；移植相关性恶性肿瘤；转移肿瘤，包括脑转移、肺转移、肝转移、骨转移、胸膜和心包转移，以及癌性腹水。
不意图限制，本发明将参考实施例而更详细地阐述如下：
对于每项方法所需要的设备、材料和溶液在相应方法下表述。下表包括一系列已经使用且不从属于具体方法的设备和材料以及为制备前述溶液所需要的化学品及溶液。
表：所用的设备、材料、化学品和溶液
所用的ODN和dSLIM，使用mfold的序列选择
使用在网址(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold)可获取的“mfold“软件构建用来产生模型分子以研究dSLIM结构的众多序列。“mfold“是用来基于热力学数据预测核酸二级结构的程序[Zuker，2003]。在“DNA mfold”中输入作为线型DNA的用来合成dSLIM的58个核苷酸的长度的DNA序列，以下称为ODN，使用标准设置和下列参数：温度37℃，离子浓度150mMNa+和0.5mM Mg2+，寡聚物校正。
dSLIM-30L1的序列用作该模型分子的基础以研究G结构的形成。起初，以如此方式修饰G结构，从而连续的鸟嘌呤残基不再存在，同时保留该互补区域的GC部分(下文称为“茎”)。以如此方式修饰非互补区序列(下文称为＂环＂)，从而Watson-Crick碱基配对优选地将不可能进行并且连续鸟嘌呤残基将不存在。作为修饰该环的结果，与30L1相比，位于此区域内的CG基序受到修饰。以如此方式构建的模型ODN将在下文称为KG。GL ODN对应于环内具有聚(G)序列的KG，其中与30L1中的聚(G)序列不同，所述的聚(G)序列不位于CG基序内。MS ODN对应于起始分子30L1，但在茎内具有额外的鸟嘌呤残基。GS、GLS和ML ODN包括上述ODN的茎和环的组合。使用分子no30L1和noGL(各自使CG由TG替换)作为用以所观察CG基序效应的依赖性的对照分子。dSLIM-60L1分子用作“二聚体”dSLIM-30L1的模型分子，如可能通过连环化作用形成。它可以由两个部分互补，但非自我互补的ODN(60L1forw和60L1rev)组成，其中所述的ODN在杂交后具有5′突出端，其中所述的5′突出端可以与其中具备相应3′突出端及自我互补性5′和3′区的另一种ODN(30L1-AGGG)连接。以上3种ODN的环的序列对应于30L1的那些环的序列。
dSLIM-30L1的级分由Melanie Rothe(Mologen AG)提供，其中所述的级分通过使用分离法借助连续NaCl梯度在HPLC中分离大量的dSLIM-30L1而获得。
用于此研究中的ODN从TIB Molbiol(Berlin)购买，其带有5′磷酸化(例外：M362，2006)，在HPLC纯化后以3g/l浓度溶解于水中。
表：所用的ODN(硫代磷酸酯：小写字母)
 
名称 序列 结构特征 分子量(g/mol)
30L1 CCT AGG GGT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ACGTTC TTC GGG GCG TTC TTA GGT GGT AAC C 在茎和环中的G4(S1，L1) 17871
KG CTG CAG CTG TAG CAG CTT CAT TCC ATA TCGTTC TTC GTG TCG TTC TTA GCT GCT ACA G 无聚(G)序列，环不成对(S2，L2) 17723
ML CCT AGG GGT TAC CAC CTT CAT TCC ATA TCGTTC TTC GTG TCG TTC TTA GGT GGT AAC C 30L1的茎，KG的环(S1，L2) 17723
MS CCT AGG GGT GGG GGC CTT CAT TGG AAA ACGTTC TTC GGG GCG TTC TTA GGC CCC CAC C 30L1，在茎中具有额外的G5(S3，L1) 17874
GL CTG CAG CTG TAG CAG CTT CGG GGG GTA TCGTTC TTC GTG TCG TTC TTA GCT GCT ACA G 在环中具有G6的KG(S2，L3) 17885
GS CCT AGG GGT GGG GGC CTT CAT TCC ATA TCGTTC TTC GTG TCG TTC TTA GGC CCC CAC C 具有MS的茎的KG(S3，L2) 17726
GLS CCT AGG GGT GGG GGC CTT CGG GGG GTA TCGTTC TTC GTG TCG TTC TTA GGC CCC CAC C MS的茎，GL的环(S3，L3) 17888
no30L1 CCT AGG GGT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ATGTTC TTT GGG GTG TTC TTA GGT GGT AAC C 无CG基序的30L1(TG替代CG) 17871
noGL CTG CAG CTG TAG CAG CTT TGG GGG GTA TTGTTC TTTC GTG TTG TTC TTA GCT GCT ACA G 无CG基序的GL(TG替代CG) 17900
60L1前向 CCT AGG GGT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ACGTTC TTC GGG GCG TTC TTT CCC CAA TGG TGG AA 非自我互补性，30L1的环 19147
60L1反向 CCC CTT CCA CCA TTG GGG ATC ATT GGA AAACGT TCT TCG GGG CGT TCT TAG GTG GTA ACC CC 非自我互补性，30L1的环 19108
30L1-AGGG GGG GTT ACC ACC TTC ATT GGA AAA CGT TCTTCG GGG GCT TCT TAG GTG GTAA 自我互补性，3′突出端 16177
M362 tcg tcg tcg ttc gaa cga cgt tga t CpG-C硫代磷酸酯主链 7640
2006 tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gtt CpG-B硫代磷酸酯主链 7303
由于其4个氢桥结合位点的取向，鸟嘌呤能够通过鸟嘌呤-鸟嘌呤碱基配对作用形成带8个氢桥(G四集体)的环状碱基四集体。含有若干连续鸟嘌呤核苷酸的DNA序列因而能够形成四聚物螺旋结构，其中鸟嘌呤碱基以特殊堆积相互作用显示高水平的平面性(planarity)。依据序列中鸟嘌呤核苷酸的位置、数量和分布，可以形成多种G结构，其中所述的G结构分成三组：G2′DNA(双分子的平行或反平行四链)、G4′DNA(单分子的反平行四链)或G4DNA(四分子的平行四链)。G4DNA能够形成自装配性纳米结构(所谓G线(G wire))。除了可用鸟嘌呤残基的数目及其排列和周边Watson-Crick碱基配对作用之外，G结构的形成及稳定性取决于温度、DNA浓度和各类阳离子(如Na+、K+、Mg2+、Ca2+)的存在，其中G结构的稳定性有时极高。例如，G4结构已在端粒序列、免疫球蛋白转换区和HIV DNA中鉴定到[Sen1992，Marsh 1994，1995]。
其次，产生了包含各种环和茎序列的组合的多种单体分子和多聚体分子。每次使用了包含长基序、短基序或无聚(G)基序的三种环序列和三种茎序列，因而影响形成G结构的能力。稳定的G结构可以在适宜的条件下在短ODN(12聚物)中只用四个连续鸟嘌呤碱基形成。在较长ODN中，较长基序是必需的，原因是形成稳定G结构的概率与有助于整体序列的鸟嘌呤碱基的比例正相关[Sen，1992]。
具有额外的长聚(G)基序的分子显示多聚体分子的形成增强。另外，这些分子的洗脱曲线不同于无长聚(G)基序的那些分子，从而两个峰出现，在较高洗脱体积上的峰对应于在琼脂糖凝胶的上半区内遇到的DNA。对于其聚(G)基序位于环中的GL观察到最引人注目的变化。这里，可以在洗脱曲线中区别两个明显分开的峰，其中在较高洗脱体积上的峰比在较低洗脱体积上的峰具有更高的强度。对于GL而言，在单体条带上方弥散性分散于凝胶中的DNA量是相对较大的，在其分布方面延伸至凝胶的加样孔。这些观察得出结论：相对大量的DNA存在于多聚体复合物中。在HPLC洗脱曲线中的峰分布和在琼脂糖凝胶电泳后的DNA分布是在茎内含有聚(G)基序的构建体(GS，MS)中相似的。它们显示个在洗脱曲线中于较高洗脱体积上的第二小峰和一个在琼脂糖凝胶中单体条带上方的微弱可见的密着DNA分布。就峰模式(HPLC)和DNA分布(琼脂糖凝胶)而言，在HPLC和琼脂糖凝胶中对环和茎内具有聚(G)基序的分子(GLS)观察到的迁移行为处于GL和GS及MS的迁移行为之间。在洗脱曲线中观察到相等高度的两个独立峰，并且在凝胶的上半区域内分布的DNA量略微高于在茎内具有聚(G)基序的分子(GS和MS)的相应DNA量，而低于GL的相应DNA量。因此，当聚(G)基序位于环内时，应当特别有利于多聚体分子的形成，如GL的情况即是如此。其原因在于单链环中缺乏Watson-Crick碱基对形成与G结构形成之间的竞争。这个先决条件也存在于GLS分子中。然而在这种情况下，聚(G)基序作为相互作用的可能伴侣同时存在于茎和环中。因此，可以形成分子内G2结构，即不依赖于浓度而大量进行。因此，它们代表对分子间G结构形成的竞争，从而与GL相比时，对于GLS而言，较高分子量复合物的形成减少。在茎内具备聚(G)基序的分子中观察到形成较高分子量复合物的最低趋势，虽然这种情况下聚(G)基序比GL中的那些聚(G)基序更长。
给定相等量的起始材料，没有在如同GLS那样在茎和环内具备聚(G)基序的单体分子30L1中观察到上述特征。其原因可能是：一方面，该分子中的聚(G)基序比多聚体分子中的那些聚(G)基序更短，另一方面，来自“DNA mfold”的结构预测显示在环中形成Watson-Crick碱基对的趋势更高，从而G结构形成的概率应当进一步降低。然而，如同具有长聚(G)基序的多聚体分子，借助HPLC分离法从大量30L1中获得的级分F4也显示上述在凝胶上半区内的弥散DNA分布和在聚丙烯酰胺凝胶电泳中凝胶加样孔内的滞留性DNA(见图.3.1.9)。显然，G结构的较高分子量复合物的比例对于30L1是如此之低，以至于仅在使用更高数量的起始材料时才可以检测到30L1。
相反，对于在环内具有聚(G)基序的GL和GLS而言，凝胶加样孔内的DNA份额没有完全消失，并且可以识别到一个规则的额外带型。这可能归因于留在聚集体中的二聚体或四聚体或未降解的ODN，它们已经因变性而从聚集物中分离并且仍然通过鸟嘌呤-鸟嘌呤相互作用彼此结合。
实验特性显示具有长聚(G)基序的多聚体分子实际上由G结构组成。除了密着DNA分布出现在凝胶上之外，该特性还包括在变性后出现规则条带，如对GL和GLS在聚丙烯酰胺凝胶中所观察到那样。
与从30L1分离的在凝胶上半区内的条带不同，对KG和ML观察到的条带在变性后不再是可识别的(见图.3.1.6)。这些条带因而是通过两个单体分子间的碱基对相互作用所形成的二聚体，并且因此，可以轻易地通过热变性加以分离。这些条带在KG和ML中的偏好性出现可能归咎于支持两种分子相互作用的共有环序列。
大量30L1分子的HPLC分级提供了在凝胶中显示高度不同迁移行为的4种级分。对单种级分的浓缩能够分别溶解它们，从而先前在凝胶中不可辨认的若干条带变得可见。第一级分的迁移行为对应于观察到的两种单体构象，第二级分的迁移行为对应于这两种构象的连续性混合，其中开放构象在使该级分变性后占优势，并且第三级分的迁移行为主要对应于如上所述的二聚体分子。由于具有留在凝胶加样孔内的清晰可见DNA份额，因此第四级分在迁移行为上类似于MS。
与在水中观察到的凝胶内迁移距离相比，在细胞培养基中的条带的迁移是明显的，其中所述条带对应于30L1的二聚体和30L1级分3的二聚体。用考马斯染色凝胶进行的对比显示在培养基中的相应条带在与低分子量蛋白带(lower protein band)相同的水平上运行。因而，可以推断该条带的迁移由二聚体分子与蛋白质的结合引起。
对应于单体构象的条带的迁移行为几乎不因添加培养基而改变，仅对GL观察到对应于开放构象的条带增加。经37℃温育5小时后，在KG和30L1中见到先前观察的DNA在两个条带之间弥散分布，其中对KG而言，对应于开放构象的条带的强度降低。在所选条件下，与水溶液相比，开放构象略受支持。在培养基中温育27小时后，对于ML和GL观察到的DNA强度大为降低，并且甚至对于KG，仅在降低的强度上可见到低分子量条带(the lower band)，然而对30L1观察到强度下降最小。一种可能的解释是开放构象比双链构象更容易受降解。
各类单体分子和多聚体分子的免疫刺激作用将通过确定IFN-γ、IFN-α和IL-6在用这些分子刺激后的PBMC的上清液中的浓度进行研究，其中所述的PBMC来自人血捐助。
用于利用来自人血捐助的PBMC确定所述分子的活性的试验系统是高度复杂的系统，其中不同细胞可以通过相互作用和/或细胞因子分泌而相互影响，从而将观察到的反应赋予具体细胞类型或反应途径几乎是不可能的。况且，在单个供体的结果之间存在巨大变异，从而需要更多数目的独立试验。本试验系统的优势在于它是所有可能完善建立的体外系统中最接近体内环境的。
该试验证实目前使用的细胞活化检测法因细胞培养条件而易受相对强烈的影响，原因是IL-8/CXCL8也应答于细胞应激诱导因子而分泌。尤其，对使用在刺激前不更换其培养基的细胞所获得的结果(见图.3.3.1)而言和其中甚至在未刺激的细胞中检测到高浓度IL-8/CXCL8的情况下，这是显而易见的。在未刺激细胞内测量的趋化因子浓度与在受刺激细胞中测量的趋化因子浓度的测定的比例是1.3，并且与其中已经更换培养基的细胞相比，该比例是极低的。后者具有2.3的比例。因此，为尽可能获得更有信息的结果，本试验中特别重要的是在基本无细胞应激条件下培养细胞。据推测，用接种24小时后受刺激的细胞获得的结果为何不如用培育至汇合的细胞获得的结果同样清楚，其原因在于细胞应激。细胞传代和相关细胞培养技术导致高度细胞应激。
如在涉及刺激时间依赖性的试验中所观察(见图.3.3.2)，在仅6小时后可以检测到未刺激细胞与受刺激细胞之间趋化因子分泌量的差异。IL8/CXCL8的量在6小时-24小时之间增加，然而从24小时-48小时所观察到的这种增加是小的。
所述分子在该试验系统中的活性在其中观察到所用各种分子之间差异的两个试验内研究(见图.3.3.3)。
通过用GL刺激诱导了试验中IL-8/CXCL8的最高分泌，其略微高于由ODN2006诱导的最高分泌。用KG和30L1刺激后所测量的IL-8/CXCL8的量是略微较低的，其中KG与30L1相比显示略微较高的活性。在不同单体分子和多聚体分子的活性方面观察到的差异可能归因于观察的结构差异。因此，可以证实KG和GL与30L1相比时，倾向具有带CG基序的环区的开放构象，从而其单链形式是优选的。如Rutz等借助表面等离子共振法证实，单链DNA比双链DNA以更高亲和力结合于TLR9[Rutz，2004]，这可能是KG及GL与30L1相比具有略微更高活性的原因。然而，CG基序即便在30L1和KG/GL中也不同，从而不同活性可能归因于不同CG基序对受体的不同亲和力。
GL，即具有形成聚集体的最高能力的分子，在两个试验内显示出受测试分子中的最高活性，这可能归因于较高分子量复合物对受体的更强交联作用。然而，用PBMC进行的试验中没有观察到增强的GL活性。在另一方面，还有可能的是存在于更复杂系统PBMC中的其它模式识别受体参与本文中观察到的单体分子和多聚体分子的免疫调节活性，其中所述的其它模式识别受体识别所述分子的其它结构特征。因此，例如，识别有可能还通过其它核酸特异性受体如(如TLR8或TLR7)进行，从而产生协作或调节效果。
总之，可以得出结论：具体而言，聚(G)基序在单体分子的环中的存在有助形成多聚体复合物。此外，此类复合物具有针对热变性的高度稳定性。
为鉴定多种构建体的免疫调节作用的差异，在用PBMC的刺激实验中使用所述的多种构建体。
结果表明多聚体分子具备特别高的活性。
DNA浓度的测定
通过测量在260nm(A260)处的吸收而确定ODN及单体DNA分子的浓度。正是核酸碱基的芳环才导致在260nm处的吸收，每种碱基具有不同的摩尔吸光系数ε(A>G>T>C)。因为生色团-生色团相互作用，双链核酸具有比单链核酸更低的吸收(减色效应)。
为测定所述浓度，首先将相应体积的待测定DNA溶液在Eppendorf管中用TE缓冲液稀释于终体积300μl中(ODN 1:200，dSLIM 1:100)。随后将DNA溶液转入石英比色杯，并且在光度计中比照TE缓冲液测量在260nm处的吸收。根据下列公式从测量的吸收中计算浓度：
c(μg/ml)＝A260×稀释系数×转换系数
转换系数是一个近似值并且对双链DNA估计为50μg/ml，而对于单链DNA估计为33μg/ml。鉴于双链区在ODN和单体DNA分子中共有，使用标准转换系数50μg/ml。每次用独立的稀释物测定两次，从中计算平均值。
单体DNA分子的制备
为制备单体DNA分子，使用贮存在-20℃的无菌(一次性)材料和新鲜缓冲液或无菌过滤的缓冲液而避免细菌污染，因为刺激结果甚至可以由于少量内毒素而被曲解。
在单体DNA分子制备中的第一步骤是使用T4 DNA连接酶连接两个ODN。T4 DNA连接酶催化磷酸二酯键在带平末端或粘末端的双链DNA或RNA中5′-磷酸末端与3′-OH末端之间形成。此外，T4 DNA连接酶能够修复双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链断口。
两个ODN的连接在一个ODN的5′-磷酸突出端与另一ODN的3′末端之间进行，从而形成环状分子。在反应期间，该反应类似地产生本发明的多聚体DNA分子。
用于制备所述多聚体DNA分子的ODN起始量是500-1000μg。为连接，ODN以0.55g/l浓度用于1×连接酶缓冲液中。为此目的，将ODN用Aquarinse稀释并添加相应量的10×连接酶缓冲液。彻底混合后，T4DNA连接酶以如此量添加，从而出现0.01U/μgDNA的比例。连接批次(batch)在水浴中于37℃温育15-24小时。
利用T7消化来降解未连接的ODN。T7 DNA聚合酶是一种模板依赖性DNA聚合酶，其以5′-3′方向催化DNA合成，还对单链和双链DNA具有3′-5′核酸外切酶活性，因而适用于降解未连接的ODN。
在T7消化之前检验连接成功与否。为此目的，每次在3％的琼脂糖凝胶上分离0.3μg ODN、连接批次和试验T7消化产物(a test T7 digestion)(见2.4.1)。对于试验T7消化，将过量T7DNA聚合酶以10U/1.1μgDNA的比例用于21μl体积中。该反应在37℃下进行1小时并且通过在70℃加热10分钟终止。
对于T7消化，将连接批次用Aqua rinse稀释并添加相应量的10×连接酶缓冲液，从而DNA以0.3g/l浓度存在于1×连接酶缓冲液中。添加为产生比例0.03U/μgDNA所需的T7 DNA聚合酶量。该批次在水浴中于37℃温育15-24小时。通过在3％琼脂糖凝胶上分离0.3μg连接批次和0.3μg及0.9μg的T7消化批次检验连接成功与否。
本发明分子的纯化
使用阴离子交换层析法实施纯化。该方法的原理以多孔基质(固定相)中存在带正电荷的基团为基础，其中所述的基团与在pH值2以上带负电荷的核酸磷酸酯基团相互作用，从而将后者结合于固定相上。相互作用的强度取决于pH值、移动相的离子强度和分子上存在的负电荷。不带电分子不与固定相相互作用或仅微弱地与其相互作用，并且将该分子迅速用低离子强度的移动相洗脱。通过提高移动相的离子强度，将结合于固定相的分子从柱中置换。由于与固定相的更强相互作用，体积更大的核酸比体积更小的核酸更晚洗脱[Lottspeich，1998；Mülhardt，2003]。
使用Fractogel-DMAE(一种带二甲基氨基乙基的聚合物树脂)作为纯化中的固定相。NaCl进阶梯度(0％、50％、100％1M NaCl)用于分离。
在开始纯化前，首先用Aqua rinse淋洗HPLC装置的全部出口和入口并且装柱，其中所述的HPLC装置在不运行时充以20％乙醇。为此目的，将1.6-1.8ml DMAE置于柱内、用水填充直至边缘，并且摇动该柱以确保均匀分布。随后，该柱以无空气泡方式连接于HPLC装置。此柱以1ml/分钟流速淋洗直至所述柱材料已经彻底沉积。将上位活塞以无空气泡方式拧紧在基质(matrix)上，并且从柱中排出过量的水。将该柱再连接至HPLC装置并以流速1ml/分钟淋洗，并且通过重复淋洗步骤消除可能存在于基质和活塞之间的无效空间。如此装填好的柱以及HPLC装置随后用T20缓冲液以流速1ml/分钟平衡。柱的平衡使用大约10倍柱基质体积实施并且使用pH指示试纸来检查。使用Hamilton注射器，将批次批经2ml进样环注射至HPLC装置中。借助设计旨在实施自动分级的软件方案控制HPLC装置。但在一些情况下，通过手工分级出现的侧峰。在施加样品前，该柱用双倍柱体积(CV)平衡，并且随后用5CV的T20缓冲液实施洗脱未结合分子(蛋白质、核苷酸)，随后用7CV的50％ T20N1000缓冲液洗脱微弱结合的分子(ATP，ODN)，并且用7CV的100％ T20N1000缓冲液实施dSLIM的洗脱。流速1ml/分钟。此后，该柱以10CV的T20缓冲液重新平衡用于下一轮样品施加，并且用T20缓冲液手工淋洗HPLC装置的入口和出口。
使用乙醇沉淀法浓缩HPLC纯化的分子并使其脱盐。在一价阳离子存在下，醇中的核酸形成一种可以通过离心予以分离的不溶性沉淀。可以通过在70％乙醇中的洗涤去除大部分共沉淀的盐，因为不同于核酸，所述的盐是可溶性的。为在更不易沉淀的较少量核酸的情况下提高回收率，可以通过在低温下沉淀和/或添加Mg2+离子来进行。如果不干扰后续用途，也可以添加载体材料如tRNA或糖原，其增加核酸的有效浓度[Lottspeich，1998；Mülhardt，2003]。
为了沉淀，将HPLC纯化的各级分转入Corex离心玻璃管内并添加1/100体积的1M MgCl2、1/10体积3M乙酸钠溶液和2.5体积96％乙醇。将所述批次混合并且在20℃沉淀2-24小时。该批次随后在4℃以10,000转/分钟(11,000g)离心30分钟，移去上清液，以5ml 70％乙醇洗涤并且在4℃以10,000转/分钟(11,000g)离心额外10-30分钟。移去上清液并且将DNA沉淀在空气中干燥直至乙醇味消散。将DNA溶解于100-350μl Aqua rinse内并且转入无菌1.5m1反应管。参考在制备中所用DNA的量估计用于重悬的体积，从而以50％回收率获得1g/l浓度。
琼脂糖凝胶电泳
对于分离和表征核酸而言，凝胶电泳是一种适用的方法。核酸(其在宽泛pH值范围内带负电荷)在琼脂糖或聚丙烯酰胺基质中暴露于电场并且向阳极迁移。它们的迁移率根据核酸大小不同。核酸(长达约10kb)在凝胶电泳期间的行为可以利用两种理论的组合来描述。奥格斯顿氏(Ogstron)筛分效应基于如此假设，即核酸采取球体形状并且与凝胶基质碰撞越频繁，则粒子周长越大，从而较大的分子比小分子更强烈受到迟滞。根据该理论，直径大于凝胶孔径的分子不应当迁移穿过凝胶。蛇行理论假定：核酸在凝胶中丧失其球体形式并且以一端在前的蛇样方式移动穿过凝胶，这种运动对于较长分子比短分子需要更长的时间。由于大小对核酸迁移率的影响，故二级结构的形成对凝胶中的迁移行为有影响。因此，例如，质粒DNA的迁移行为根据其构象而不同。迁移率从开环(I型)至线型(III型)、超螺旋(II型)至变性(螺旋)质粒DNA依次增加。对于线型双链DNA(III型)，在广大范围内存在其长度(以bp计)的常用对数与凝胶中相对迁移距离之间的相关性，从而基于长度标准，可以相对精确地确定大小。
可以通过使用溴化乙锭实施凝胶中核酸的检测，其中所述的溴化乙锭因其平面结构而嵌入DNA中，从而采用在UV区(254-366nm)内的光进行荧光激发是可能的，在橙红区(590nm)内观察荧光的发射[Lottspeich，1998]。
琼脂糖是从海藻中回收的多糖并且在冷却后的水溶液中形成具有相对大的孔(1％(w/v)约150nm)的凝胶。孔度与琼脂糖浓度成反比。琼脂糖凝胶适宜用于分离长度0.1-25kb的核酸。琼脂糖凝胶的优势在于它们相对大的分离范围并且易于操作。然而，琼脂糖凝胶对小DNA片段的分辨率极低。适用于分离较小DNA片段的是筛孔琼脂糖(Sieve Agarose)，这是琼脂糖的一种衍生形式[Lottspeich，1998；Mühlhardt，2003]。
为分离ODN和本发明的分子，使用在含有0.125μg/ml溴化乙锭的1×TAE缓冲液中的3％的琼脂糖凝胶。使用BioRad系统浇注水平凝胶(40ml用于具有8个加样孔的小体积凝胶，100ml用于具有20个加样孔的大体积凝胶)。待分析样品在1×试验缓冲液中随合适的长度标准施加(参见2.4.3)。电泳在120V电压下、在1×TAE的缓冲液中进行30min。使用凝胶记录设备对凝胶照相。
非变性聚丙烯酰胺电泳凝胶(PAGE)
使用交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，通过丙烯酰胺单体的自由基共聚作用形成聚丙烯酰胺凝胶。此凝胶的孔度是大约3-6nm并且依赖于丙烯酰胺总浓度(％T＝m丙烯酰胺+m双丙烯酰胺)(w/v))和交联度(％C＝m双丙烯酰胺/m丙烯酰胺+m双丙烯酰胺)。它在恒定的C上随T增加而降低，并且在恒定的T上在5％C上具有最小值。聚丙烯酰胺凝胶具备极佳的分辨能力，尤其对于小DNA片段(<1kb)。然而，聚丙烯酰胺凝胶的分离范围与琼脂糖凝胶相比明显较窄。分离范围可以因使用梯度凝胶而变得更宽。聚丙烯酰胺凝胶的优异分辨能力能够区分因其不同形式而具备不同迁移行为的不同DNA构象，而所述的迁移行为通过温度和离子浓度加以影响。
发现具有8％T、2.6％C的凝胶最佳用于所述分子的分离，并且具有12％T、5％C的凝胶在1×TBE中最佳用于分离ODN。在电泳前一天浇注水平凝胶(15ml/凝胶小体积，25ml/凝胶大体积)并且贮存在冰箱中过夜。在施加样品前，将凝胶在70V(170V大体积)上预电泳直至观察不到电流强度变化(10-11mA)。样品在1×试验缓冲液中连同不添加染料的合适长度标准施加(参见2.4.3)。为监测电泳进程，在单独的泳道施加1×上样染液。电泳在1×TBE中于恒定电压70V(170V大体积)(≈9V/cm)下在室温进行并且一旦溴酚蓝到达凝胶底端就立即终止(约2小时)。在电泳后，凝胶用溴化乙锭溶液染色10-15分钟并使用凝胶记录设备照相。在背景过度染色的情况下，将凝胶在去矿化水中洗涤10-30分钟。
用于条带分配的热变性和复性
由于单体DNA分子是环状DNA分子，其极类似于质粒DNA而在凝胶中显示复杂迁移行为，对凝胶中观察到的条带指定具体构象或尺寸不是简单明了的事情。可以在区分中利用如下事实，即不同的构象可以在合宜的条件下可逆地相互转化，与不同尺寸的分子相反。
不同构象具有不同的致密度并且应当因其区别性迁移行为而可觉察的，其中致密的DNA形式与大体积的开放DNA形式相比，往往在凝胶中具有更高迁移率。致密形式应当可通过破坏氢桥转化成开放形式。
为了分配聚丙烯酰胺凝胶中所观察到的条带，通过加热至95℃持续10分钟使分子热变性。变性的样品立刻置于冰上以防止复性。为此目的，产生主混合物，其包含在1×TE缓冲液中浓度0.05g/l的相应dSLIM分子。将该批次分成两等分并且将1个批次加热而将1个批次保存在室温。待施加于凝胶上的样品取自所述批次，随相应量的5×样品缓冲液一起添加并且在非变性8％聚丙烯酰胺凝胶上分离。为观察复性，将剩余的变性的批次再次等分并且随后分别在4℃和在37℃温育3日。剩余的非变性的批次贮存在4℃并且在3日之后类似地加以等分，并且将一部分进行如上所述的变性而另一部分则保存在室温。所述批次随相应量的5×样品缓冲液一起添加并且在非变性8％聚丙烯酰胺凝胶上分离。
在细胞培养基中的温育
所述分子的活性使用PBMC和HEK293细胞在体外测试。将所述分子溶解于含蛋白质的细胞培养基内而非缓冲液中，并且在温度37℃温育。其目的因此是研究这些修改的参数对所述分子及ODN的结构及稳定性的影响。
可以以各种方式影响DNA分子活性的一个重要因素是与蛋白质的非特异性结合。与蛋白质的结合将改变DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(非变性PAGE)中的迁移行为，因而可以识别在蛋白质存在下DNA条带的迁移。在大多数情况下，DNA-蛋白质复合物的电泳迁移率与DNA相比降低；对于DNA微环，电泳迁移率也可以提高，若致密程度因蛋白质结合而增加[Toulmé，1995]。
为了在刺激试验中所遇到的条件就其行为而研究刺激试验中所用的分子和ODN，将ODN及分子的溶液在培养基中稀释成1μM浓度，并且在37℃在热台(hotstage)上温育5小时或24小时，或者在添加适宜量的5×样品缓冲液后，直接在聚丙烯酰胺凝胶上分离。稀释在H2O中的ODN和分子的溶液相应地用于比较。为验证观察到的变化因蛋白质的存在引起，包含本发明ODN和分子的批次在其中不添加FCS的培养基内稀释成1μM浓度。为比较DNA和蛋白带在凝胶中的迁移距离，因而得出关于蛋白质可能结合的结论，在凝胶中检测DNA以及蛋白质。
对蛋白质的额外检测在核酸检测后进行。将凝胶在固定液中固定30分钟并随后在考马斯溶液染色30-60分钟。通过在脱色液中过夜温育去除过量的染料，并且使用凝胶记录设备对凝胶拍照。
所用的DNA长度标准
对于长度标准，每次在1×样品缓冲液中施加由供应商建议的量/mm加样孔宽度。使用以下标准物：
GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus(MBI Fermentas)
GeneRuler 50bp DNA Ladder(MBI Fermentas)
10bp DNA Ladder(Invitrogen)
25bp DNA Ladder(Invitrogen)
细胞培养
全部细胞培养操作在无菌的条件之下使用无菌一次性材料进行。
培养箱中的条件是37℃，5％二氧化碳，90％湿度。
研究所述分子在PBMC中的免疫调节作用。
为研究多聚体分子的免疫调节作用，使用ELISA方法测量从人血捐赠中回收的淋巴细胞与单核细胞的细胞因子分泌。
用于分离淋巴细胞和单核细胞(也称为外周血单核细胞(PBMC)＝外周血的单核细胞级分)的起始材料是白细胞浓缩物，也称为血沉棕黄层，其通过全血离心而获得并且从DRK-Blutspendedienst Berlin Wannsee购买)。使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，PBMC细胞可以与白细胞浓缩物的其它组分(原生质、血小板、红细胞、粒细胞)分开。Ficoll-Hypaque分离介质是这样的溶液，其包括Ficoll400、经表氯醇交联的蔗糖单体的高度分支聚合物和泛影酸钠(Hypaque)的批次，密度1.077g/ml。使用在顶端有一层稀释的白细胞浓缩物的分离介质的等密度离心法，可以根据其不同密度分离不同组分，因而获得在图2.5.1中所述的级分[Luttmann，2004]。
为分离PBMC，将每种白细胞浓缩物转入无菌250ml瓶中并且用PBS进行1:2稀释。每次将15ml的Ficoll-Hypaque溶液置于四个50ml离心管内，使用10ml吸管小心地覆盖约30ml血-PBS混合物并且在关闭制动器的情况下在800g离心20分钟(总时间约50分钟)。用5ml吸管小心吸取含有PBMC的相间层并且转入含有20ml冷PBS的50ml离心管内。为去除红细胞、Ficoll/Hypaque及血小板杂质，将细胞依次进行若干洗涤步骤。尽管直至分离PBMC的全部步骤均在室温下进行从而避免血小板聚集，然而所述的洗涤步骤在4℃进行，以防止单核细胞吸附于所用的塑料材料并因而防止其损失。在第一洗涤步骤中，细胞在4℃于400g离心8分钟。吸去上清液并且将细胞沉淀重悬于5ml的冷PBS内并用冷PBS充盈至45ml。后续洗涤步骤以相同方式进行，在300g离心5分钟。重复洗涤步骤直至上清液清亮并且沉淀具有黄色(约5-6次)。每次将细胞重悬于5ml冷培养基中并合并，并且用冷培养基填充体积以获得30ml。使用自动细胞计数器在8μm排除尺寸上确定细胞数并且使用冷的培养基调节细胞数至浓度4×106个细胞/ml。
浓度4×106个细胞/ml的600μl先前分离的PBMC置于24孔细胞培养板的每孔中。此后，添加对应体积的待测试分子，从而在该批次中的浓度是1μM。将细胞在培养箱中温育2日(42-48小时)。将细胞混悬液转入Eppendorf反应管并在Biofuge中以3000转/分钟离心4分钟。把如此获得的无细胞上清液转入新的反应管内，并且直接用来由ELISA确定细胞因子浓度或贮存在-70℃。
HEK293细胞的培养
该细胞在162cm2细胞培养瓶中培养。它们以1.3-1.9×105个细胞/cm2密度接种。在培养箱中温育2-3日后，将细胞按1:3分瓶。为此目的，吸去培养基，将细胞用10ml PBS洗涤并随后在室温温育3-5分钟并且随后用5
ml胰酶-EDTA溶液脱离。通过添加5ml培养基终止该反应。将细胞重悬并且另外添加5ml培养基。每次将5ml细胞混悬液保持在细胞培养瓶中或转入一个新细胞培养瓶中并添加45ml培养基。有时，一些细胞在吸去培养基之前从培养瓶的底部脱离。在此情况下，将细胞转入无菌离心管并在300g离心4分钟。此后，吸去培养基并且将细胞重悬于5ml胰酶-EDTA溶液中，如上所述，添加10ml培养基并转入新的细胞培养瓶中。
HEK293细胞的刺激
为建立该试验，将HEK293-TLR9和HEK293空白细胞每次以浓度0.6-1×106个细胞/ml接种在24孔细胞培养板内的400μl体积中并且培养1-5日。使用细胞计数器在8μm排除尺寸上确定细胞数，并且调节为适宜浓度。对于长期培养，48小时后更换培养基。为此目的，小心地吸去培养基并且每次向细胞小心添加400μl新鲜培养基。另外，在一些批次中，培养基在紧接在添加刺激物之前更换。通过添加适宜体积的ODN/分子从而分别达到终浓度2.5μM和1μM来实行刺激。相应地，以浓度0.5μg/ml施加LPS。此后，将细胞在培养箱中温育不同时间(6-48小时)。最后，将培养基转入1.5ml反应管，在Biofuge内在1400转/分钟离心旨在沉淀细胞，并且将上清液用来由ELISA确定IL-8浓度。
使用ELISA检测细胞因子/趋化因子
为研究dSLIM对PBMC的免疫调节作用，测量了IL-6、IFN-α和IFN-γ的诱导作用。
IL-6是由多种活化的淋巴细胞和单核细胞分泌的多功能细胞因子，并且，除在肝细胞中诱导急性期蛋白外，还对淋巴细胞的生长、分化和吞噬具有促进作用[Kirchner，1994]。
IFN-α具有若干亚型，属于主要具有抗病毒作用的I型干扰素素家族。大量IFN由pDC在激活TLR7、8或9后分泌[Perry，2005]，还参见第1.3.2部分。
IFN-γ主要由NK和T细胞分泌，但也由单核细胞、树状突细胞和B细胞分泌。它是唯一的II型干扰素，并且与I类干扰素不同，其具有免疫调节作用而非抗病毒作用。除在分化中的作用外，IFN-γ是TH1指导的免疫应答中最重要的效应细胞因子。
利用IL8/CXCL8的分泌作用来检测转化的HEK293细胞中TLR9的激活。IL-8是由白细胞分泌并也由成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞分泌的CXC趋化因子。对IL8/CXCL8的诱导例如由IL-1和TNF-γ进行，不过也由PRR和环境因素如低氧而进行。IL8/CXCL8的表达通过经协同性激活NFα和AP-1对转录的调节而加以调节并且在mRNA稳定的水平上受到调节。除作为嗜中性粒细胞的激活物起作用之外，IL8/CXCL8对各类白细胞具有趋化效应并且参与组织中白细胞的变移过程[Mukaida，2003]。
为检测PBMC和HEK293细胞的细胞培养上清液中的细胞因子，使用“夹心ELISA”式的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。此方法是定量性免疫测定法，其中针对待检测蛋白质的特异性抗体通过吸附作用固定在微量滴定平板的表面上。抗原与相应抗体的结合类似地固定了该抗原，并且可以通过洗涤而去除其它组分。抗原和抗体的结合是一种平衡反应，因而结合的抗原的是浓度依赖性的。使用特异性生物素化的第二抗体实施对抗原的检测，其中所述的第二抗体转而结合于检测中所用的链霉抗生物素-酶缀合物。在本文中所进行的测试法中，酶是辣根过氧化物酶(HRP)。所测量的实际量是通过酶在限定时间长度中反应产生的生色底物的量(浓度)。本文中所用的底物是TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)，该底物在H2O2存在下被氧化以吸收波长370nm(蓝色)的光。该反应通过添加H2SO4终止，因而改变吸收的波长至450nm(黄色)[Luttmann，2004]。使用待确定细胞因子的已知浓度的标准稀释度系列，可以按照这种方式确定未知细胞因子在细胞培养上清液中的浓度。
从R&D Systems以试剂盒的形式购买所需的抗体配对、标准物、酶和底物溶液。用于实施的设备和材料在下表中列出。
IL-6和IFN-γ
使用来自R&D Systems的DuoSet ELISA Development System试剂盒，按照所包含的说明书实行对PBMC的细胞培养上清液中IL-6和IFN-γ的检测。为此目的，将“捕获抗体”用PBS分别稀释至浓度4μg/ml(IFN-γ)和2μg/ml(IL-6)，并且每次将100μl置于微量滴定平板的孔中。该平板在室温温育过夜，随后以用洗涤缓冲液洗涤3次，并且与每孔300μl封闭缓冲液温育1-2小时以饱和游离结合位点。该平板用洗涤缓冲液洗涤3次，并且随后每次将100μl的样品和标准物置于该平板上。对于检测IL-6，上清液以试剂缓冲液中1∶2稀释度使用，并且对于IFN-γ检测，不作稀释。适用于IL-6的标准稀释度系列包含以下浓度：12.5；25；50；100；200；350；700pg/ml。适用于IFN-γ的标准稀释度系列包含以下浓度：12.5；25；50；100；250；500；1000pg/ml。在每种情况下测定两次。温育时间是2小时。在用洗涤缓冲液洗涤3次后，每次将试剂缓冲液中的分别为100ng/ml(IL-6)和200ng/ml(IFN-γ)浓度的100μl“检测抗体”置于该平板上。在2小时温育时间后，该平板用洗涤缓冲液洗涤3次，并且将100μl的1:200稀释于试剂缓冲液中的链霉抗生物素-HRP置于各孔内。温育时间是20分钟。在最终三次洗涤步骤后，每次添加100μl底物溶液(比例1:1的“颜色试剂”A和B)至平板中并在黑暗下温育20分钟。该反应通过添加50μl的1M H2SO4终止，并且在微量平板读数仪中于450nm处测量每个单孔中的吸收。使用软件SoftMax Pro 2.6进行评估。标准曲线用“四参数拟合法”计算。
IFN-α
使用来自Biosource的人干扰素-αELISA试剂盒，按照所包含的说明书实行对PBMC的细胞培养上清液中IFN-α的检测。将每孔100μl标准物和样品添加至包含于试剂盒内的微量滴定板条中，其中所述的微量滴定板条已经配置以抗体并被封闭，并且在室温下温育1小时。使用了以稀释缓冲液1:2稀释的上清液，并且标准稀释度系列包含以下浓度：156；312；625；1250；2500；5000pg/ml。在一个洗涤步骤后，将100μl在稀释缓冲液C中的抗体浓缩物D添加至各孔，并在室温下温育1小时。将平板洗涤3次，并且添加100μl在HRP稀释液中的HRP至各平板内并且温育1小时。通过洗涤4次除去所述溶液并且将100μl底物溶液G吸加至各孔内。将平板在黑暗下温育20分钟，并通过加入100μl终止溶液H终止所述反应。在微量平板读数仪中测量在450nm处的吸收。用软件SoftMax Pro2.6进行评估。标准曲线用点对点拟合法计算。
IL-8/CXCL8
使用来自R&D Systems的DuoSet ELISA Development System试剂盒，按照所包含的说明书实行对HEK293细胞的细胞培养上清液中IL-8/CXCL8的检测，并与对于IL-6和IFN-□所述相同。标准稀释度系列包含以下浓度：31.25；62.5；125；250；500；1000；2000pg/ml。上清液以未稀释的形式使用。使用的抗体浓度是：捕获抗体4μg/ml，检测抗体20ng/ml。
单体DNA分子的制备和说明
为研究结构特性、尤其有利于形成G结构的那些结构特性的影响，使用本发明的方法产生在多个区域具有聚(G)基序的单体DNA分子的组合，其中除冻干外，所述的方法与单体制备方法相一致。为此目的，每次组合了用于茎(S)和环(L)的三种不同序列，其中所述的序列在鸟嘌呤碱基的数目和位置方面不同，还在由＂DNA mfold＂程序预测的二级结构方面不同。各自序列及结构特征在下表描述：
表3.1：结构特征和序列L1-L3，S1-S3(红色：聚(G))
Figure A200780026142D00341
下列的图表提供所用组合的概览及其下文所用的命名：
表3.2：具有不同环/茎组合的分子的命名
Figure A200780026142D00342
如上所示，在本发明含意中也可以称为多聚体分子或者寡聚体分子的聚合dSLIM分子极适合于在生物体中诱导增强的免疫应答。增强的免疫应答能够有利地使用与化疗药联合的所述药剂。与两种药剂的加性效应相比，化疗药与本发明药剂的联合导致肿瘤治疗中的协同效应。因为与本发明药剂联合，额外使用的化疗药或细胞生长抑制剂的全部效果均得以增强，其中所述的本发明药剂可以通过以上提及的方法步骤(见主权利要求)获得。虽然单体形式的dSLIM分子已经与化疗药或细胞生长抑制剂联合，然而通过联合多聚体或聚合物形式的dSLIM与细胞生长抑制剂所实现的效果是完全意想不到的。在实际使用包含单体形式的dSLIM和细胞生长抑制剂的联合剂中，发现仅可能改善细胞生长抑制剂的个别特性，而没有如与多聚体形式联合时那样改善其总体特性。另外，与使用单体形式的细胞生长抑制剂相比，免疫系统因多聚体/聚合物形式的dSLIM所致的激活意外地更高，以致可以实现肿瘤治疗中意想不到地得以改善的总体结果。因此，尤其，当细胞生长抑制剂/化疗药与这些药剂一起施用时，转移的形成因在生物体中使用多聚体dSLIM分子而被防止。联合在本发明的含义中理解为是同时以及时间交替地施用两种药剂。
图3.1.1例示了dSLIM分子30L1(如MS)和KG(如ML、GS、GL，GLS)的两种不同二级结构用于由“DNA mfold”所推算的三个环序列。与30L1相反，对KG在所选条件下没有预测到在环中的碱基配对。
各类单体分子和多聚体分子的制备
图3.1.2表示在3％琼脂糖凝胶中分离不同dSLIM分子及30L1ODN的0.3μg连接批次及试验T7消化产物的结果。在其中分离不同分子的全部泳道内，可以在近距离上看到在直至标记物100bp片段迁移抵达的水平下方对应于单体分子的一个条带。在含有30L1ODN的泳道中，可见在单体分子条带下方的一个条带。对于含有L3(GL、GLS)的分子，可以在凝胶的上半区域内直至加样孔处见到DNA的模糊分布，与连接批次对比，该分布在T7消化批次中对于GL分子是明显较强的，而对于GLS是更弱的。对于含有长聚(G)基序的分子(GL、GS、GLS、MS)，在凝胶中的条带与其余分子(30L1、KG、ML)相比是相对模糊的。在其中施加T7消化批次的泳道中，与其中施加连接批次的泳道相比，荧光强度较低，尤其在凝胶的上半区域中。
图3.1.3表示不同分子的后续HPLC纯化的色谱图。每个色谱图将260nm处的吸收(蓝线)对注入待分离样品后流过柱子的体积(粉红虚线)作图。绿线代表1M NaCl缓冲液(T20N1000)的0％、50％及100％的NaCl缓冲液梯度。在2.5ml和0％T20N1000(F2)上具有最大值的第一峰对应于未结合的分子，在8ml和50％T20N1000(F3)上具有最大值的第二峰对应于具有对固定相的低亲和力的分子(尽管与级分F4相比，施加12倍的量，然而在琼脂糖凝胶中对这两种分级检测不到DNA)。在14ml和100％T20N1000(F4)上具有最大值的第三吸收峰对应于单体分子。
图3.1.3：不同单体分子和多聚体分子的HPLC纯化的色谱图。
a)30L1，b)ML，c)KG，d)MS，e)GS，f)GLS，g)GL，柱：1ml DMAE；施加的量：700μg；流速：1ml/分钟；缓冲液A：200mM Tris，pH7；缓冲液B：20mMTris，1M NaCl，pH7；梯度：0％、50％、100％缓冲液B。
当比较不同分子的色谱图时，显而易见F4是针对不含有聚(G)基序的分子(即不是S3，也不是L3(30L1、ML、MS))的单峰。相反，对含有S3的那些分子在F4上观察到肩峰。对于含有L3(GL，GLS)的分子，最大值具有两个峰，而在GL和GLS之间强度分布不同。对于GLS，两个局部最大值具有大致相同的强度，对于GL，在较高体积上观察到的局部最大值比在较低体积上的局部最大值具有更高的强度。分别通过手工操作分级出现的次要最大值(side maximum)或肩峰。所述的级分根据其洗脱时间顺序命名为F1和F2。
在乙醇沉淀后，将HPLC分离法的上述dSLIM级分(即终产物)施加在图3.1.4中表述的琼脂糖凝胶上。在全部泳道中，可以在近距离上在100bp标记片段下方看到对应于单体分子的条带。对于ML和MS，可以在近距离上在上述条带上方辨认出一个较弱的第二条带，其中所述的第二条带对于ML具有较高强度。GL、MS和GLS在凝胶中比其它分子显示略微更高的迁移率。对于不含聚(G)基序的分子(30L1、MS、MS)，可以在dSLIM条带上方辨认出直至约200bp水平的密着强度分布。此外，可以对KG和ML分子辨认出在200bp标记片段的水平上的一条微弱带。
图3.1.4：乙醇沉淀后的各种单体分子和多聚体分子
3％琼脂糖凝胶，施加的量0.3μg，标记100bp0.5μg.(100bp、30L1、30L1、KG，ML，GL-F1、GL-F2、MS-F1、MS-F2、GS-F1、GS-F2 GLS-F1、GLS-F2 100bp)。
对于其中观察到多峰分布并且在HPLC纯化法中最大值发生分级的分子，每种级分1主要对应于单体条带，同时施加了级分2的泳道主要显示在所述单体条带上方在广大范围内的强度分布。此处，MS和GS具有相似强度分布，其中所述的强度分布大致从单体条带开始，延伸直至对应于500bp的迁移水平。另一方面，对于GL，该强度分布在200bp上方开始，延伸直至凝胶的加样孔。然而，对于GLS，可以观察到从单体条带开始的遍布整条泳道的DNA分布。
图3.1.6：各种单体分子和多聚体分子的热变性作用。
非变性PAGE，8％凝胶(2.6％C)，施加的量0.25μg，标记25bp0.3μg(25bp，未处理，95℃变性10分钟：30L1、MS、ML、KG、GS、GL-F2、GLS-F2)。
图3.1.6显示不同分子的热变性对其在凝胶中迁移行为的影响。为此目的，将批次等分并且将一部份加热至95℃持续10分钟，并立刻在冰上冷却并施加。观察到的条带对应于在3.1.5中所述的那些在凝胶中的条带，但在这种情况下，对MS和GS也在凝胶加样孔中可见到未分离的DNA，并且对MS，可见到第二条带，该条带在与30L1的第二条带相同的水平上运行。GS和MS涉及不同于图3.1.5中所示凝胶的产物批次(production batch)，其中并未分别收集HPLC分级法中的次要最大值。在凝胶中用变性和未变性的dSLIM进行的条带比较显示：加热后，在全部分子中第一个条带的强度降低而第二条带的强度提高。在ML和KG泳道中出现在凝胶上三分之一区内的条带在变性后不再可见。同样，变性后，不再能够识别在施加MS和GS的泳道的加样孔内的DNA。在GL-F2和GLS-F2泳道中，加样孔内DNA的量类似减少，而另一方面，在第二条带上可见大量规则排列的条带。
为检验因变性引起的变化是否可逆，将变性的样品等分并在4℃和在37℃温育3日。未处理的dSLIM批次贮存在4℃，在3日之后类似地加以等分，并且每次将一个等份试样加热至95℃持续10分钟并且立刻置于冰上。用来分离批次的非变性PAGE的结果示于图3.1.7和3.1.8。未处理和变性的样品在凝胶中显示了如对图3.1.6中所示凝胶描述的相同迁移行为。在它们迁移行为方面，在4℃温育的变性样的品对应于在施加前才变性的样品的迁移行为。在37℃温育的样品在凝胶中显示这样的迁移行为，其大体对应于未处理样品的迁移行为。然而，第二条带的强度对于30L1、MS和GS分子而言高于上文所述。GS和MS的另一种差异体现于留在凝胶加样孔内的DNA量上，该DNA量与未处理样品相比极低。
二聚体分子和单体30L1级分
为检查在上半区中辨认出的条带是否是对应于二聚体的条带，将级分(F3)连同二聚体分子60L1一起施加在非变性PAGE上，其中所述的级分(F3)通过HPLC分离法从大量单体分子中获得并代表该条带应用于非变性PAGE。
图3.1.9：级分3与二聚体分子60L1的比较
非变性PAGE，8％凝胶(5％C)，施加的量0.25μg，标记25bp 0.3μg(25bp、F3、F3 95℃、60 L1、60L 195℃、来自HPLC纯化dSLIM 30 L1、60L1的级分1(F1)、级分2(F2)、级分3(F3)、级分4(F4))。
观察的条带在相同水平上运行。在凝胶上施加变性形式的样品时，与施加未处理样品的泳道相比，在凝胶中找到处于较高水平上的条带。此非变性PAGE的对应泳道示于图3.1.9，此图还显示了分离由HPLC分级法获得的单体30L1的四种不同级分的结果。
温育培养基，蛋白质结合
为研究细胞培养中的条件、尤其蛋白质存在对用于刺激的分子的影响，将所述分子在细胞培养基中于37℃温育0.5小时和27小时并且使用非变性PAGE，连同溶解在水中的所述分子一起在非变性PAGE上分离。在DNA染色后，通过考马斯染色法在凝胶中检测存在于该培养基中的蛋白质。结果示于图3.1.10和3.1.11。
图3.1.10：培养基中单体分子的温育
非变性PAGE，8％凝胶(5％C)，施加的量0.25μg，标记25bp0.3μg，标记50bp0.3μg(50bp，27小时培养基，5小时培养基，0小时培养基，H2O：30L1、ML、F3、KG，25bp)。
非变性PAGE，8％凝胶(2.6％C)，施加的量0.25μg，25bp0.35μg.(27小时培养基，5小时培养基，0小时培养基，H2O：GL，25bp)。
考马斯染色的部分，非变性8％PAGE(5％C)，图3.1.11a)(27小时培养基，5小时培养基，0小时培养基，H2O：ML)。
图3.1.10a)和3.1.10b)显示其上面施加所述分子的溴化乙锭染色的PAGE。图3.1.10c)给出来自考马斯染色凝胶的用来比较迁移距离的示范表示。比较包含不同批次的泳道，显示对于培养基中的全部分子，在凝胶加样孔内出现一个条带，其中该条带在H2O泳道中不存在(GL分子例外)。对于30L1和级分3在H2O中出现在凝胶上半区内的条带显示了在培养基中的较短迁移距离，其中所述的较短迁移距离处在低分子量蛋白质带的水平上。DNA带和蛋白质带的强度随温育时间增加而减弱。对于GL，与H2O相比，第二条带的强度在培养基中提高。
图3.1.11：ODN M362在培养基中的温育。
非变性PAGE，12％凝胶(5％C)，施加的量0.25μg，标记25bp0.3μg(25bp、H2O，0小时培养基，5小时培养基，27小时培养基)。
考马斯染色的部分，非变性PAGE，12％凝胶(5％C)，图3.1.12a).(H2O，0小时培养基，5小时培养基，27小时培养基)。
图3.1.11显示其中施加硫代磷酸酯受保护的对照分子M362的非变性PAGE。如其中清晰所见，在凝胶底边缘处于H2O中可见的DNA带已经在培养基中消散。另外，可以见到在凝胶上缘处的一个条带，其在迁移距离上对应于低分子量蛋白带(图3.1.11b)，和在加样孔中的一个条带。在此情况中也可以观察到DNA带的强度随温育时间增加而减弱。
为验证观察的变化是因蛋白质存在而非培养基的其它组分引起，也将M362分子稀释在不添加FCS的培养基中用于比较。在图3.1.12中，凝胶的相应泳道对dSLIM(KG)和M362举例说明。其中在无FCS的培养基中的ODN和所述分子被分离的泳道在其强度分布方面对应于其中施加了作为在水中溶液的ODN及所述分子的那些泳道。相反，溶解于含FCS的培养基中的ODN和所述分子在非变性PAGE中显示与图3.1.10和3.1.11中对此类泳道所述迁移行为相对应的迁移行为，其中所述的泳道内施加了稀释于培养基内的单体分子和ODN。
免疫刺激作用：PBMC的刺激
不同分子的免疫刺激作用在从人血捐赠分离的PBMC上研究。为此目的，PBM与相应分子或对照分子M362在终浓度1μM上温育48小时，并且使用ELISA测量IL-6、IFN-α和IFN-γ在细胞培养上清液中的量。与无添加剂温育的细胞用作对照。
从4个人血捐赠(供者A-D)中分离的PBMC上清液的ELISA结果以简图形式在图3.2.1a-c中表示。相应值对应于双重测定的平均值，并且误差棒代表自其中所确定的双重标准偏差。对于以＊标记的值，进行针对PBMC刺激的额外双重测定，并且所示值对应于所获得的四个ELISA结果的平均值。误差棒对应的是这四个值的双重标准偏差。
图3.2.1a-c)：IFN-γ(a)、IFN-α(b)、IL-6(c)PBMC的ELISA结果。
用1μl dSLIM/ODN M362刺激48小时的不同供体A-D的PBMC(在600μl中每批次2.4×106个细胞)的上清液，标准测量范围———，*双重测定细胞培养，误差棒：来自ELISA双重测定的2×标准偏差(*双重测定细胞培养+双重测定ELISA＝4个值)。
参见该简图，一个极醒目的特征是：在不同供者的上清液中的细胞因子浓度显示强烈变化，因此妨碍比较数据。在细胞培养中作为双重测定而额外确定的值的标准偏差是与仅在ELISA中从双重测定所确定的标准偏差值可比较的，表明该差异归因于PBMC的差异。在未受刺激的批次中，对于全部供者，未检测到细胞因子浓度或仅检测到极低的细胞因子浓度。在IL-6和IFN-γ浓度的测定中，所测定值中的某些值处在上限或在标准测量范围之外，其中所述的测量范围对于dSLIM是IFN-γ至多到10,000μg/ml，IL-6至多到3,500μg/ml，并且对于M362是7,000μg/ml。
为允许更好比较来自不同供者的数据，将所得细胞因子值归一化。为此目的，对每位供者计算了所测定的细胞因子浓度在对M362所测定的值中的百分比。经如此归一化的来自四位供者的数据的平均值示于图3.2.2a-c。每种误差棒对应于平均偏差值。鉴于各位供者之间观察到的巨大差异，误差棒是极大的。然而，至少可以借助该简图估计各种分子的趋势。
图3.2.2a-c)：IFN-γ(a)、IFN-α(b)、IL-6(c)的ELISA结果的归一化平均值。
ELISA结果见图3.2.1，归一化：细胞因子量％M362每位供者，4位供者的平均值，误差棒：平均偏差值。
就IFN-γ而言，相对于M362的值，所测试分子的计算值在40％与80％之间，并且KG、MS和GLS-F2的值位于下半区内，并且GL-F2的值位于上半区内。
不同构建体的IFN-α平均值百分数大体上对应于M362的平均值百分数，而对GL-F1、GLS-F1和GL F2所计算的值例外，其中所述的值仅是M362值的约50％)。
M362的IL-6平均值百分数低于30L1、MS、GS、GL-F2和GLS-F2的IL-6平均值百分数的50％，并且MS与GLS-F2(具有最低内毒素浓度的构建体)也具有最低值。相对于M362，GL-F1与GL-F2(无可用的内毒素值)的值略微高于50％。在用KG和ML刺激的细胞中找到最高IL-6值，其对应于M362的IL-6值或高于100％。另外，也对这两个构建体测量到最高内毒素浓度。
图3.3.2：ELISA IL-8HEK293-TLR9的刺激时间的结果：
上清液HEK293-TLR9：400μl/批(5×106个细胞/ml)；用2.5μM ODN2006刺激6小时、24小时、48小时；0.5μg/ml LPS；在细胞接种后(48小时后和进行刺激之前更换培养基)3日进行刺激；误差棒：2×ELISA双重测定标准偏差。
在来自a)的受刺激/未刺激的批次中趋化因子的量的比率；误差棒：ELISA双重测定相对误差的总量。
所测量的趋化因子浓度是相对低的。然而，IL-8/CXCL8量随温育时间的增加可以在全部批次中观察到，其中所述的IL-8/CXCL8量从24小时至48小时变得极低。此处，受LPS刺激和未刺激的细胞的相应值在幅度上大致相等，并且对于用ODN2006刺激的细胞而言，与未刺激的细胞相比，这些值增加达1.5倍。在受刺激和未刺激的批次的IL-8|CXCL8量的比例中未能识别到差异，其中所述的比例在不同时间点上确定，出于此原因，进一步实行刺激24小时。
图3.3.4：各类单体分子的空白ELISA IL-8HEK293的结果。
上清液HEK293空白：400μl/批(1×106个细胞/ml)；用2μMODN2006/dSLIM刺激24小时；0.5μg/ml LPS；在细胞接种后(48小时后和进行刺激之前更换培养基)4日进行刺激；误差棒：2×ELISA双重测定标准偏差。
在来自a)的受刺激/未刺激的批次中趋化因子的量的比率；误差棒：ELISA双重测定相对误差的总量。
与未刺激的批次相比，在与所述不同刺激物温育的任何批次中未观察到IL-8/CXCL8分泌的显著差异。

Claims (30)

1.一种用于调节人或动物免疫系统活性的多聚体分子，所述的分子可以通过包括以下步骤的方法制备：
-提供在水中的5′-磷酸化寡脱氧核糖核酸序列，
-冻干直至获得干燥残留物，随后将其重悬于缓冲液中，
-添加T4 DNA连接酶，从而形成反应混合物，和
-在37℃温育该反应混合物至少30分钟。
2.根据权利要求1所述的分子，其特征在于所述的寡脱氧核糖核苷酸序列包含以下序列：
a)GTTCCTGGAGACGTTCTTAGGAACGTTCTCCTTGACGTTGGAGAGAAC或
b)ACCTTCCTTGTACTAACGTTGCCTCAAGGAAGGTTGATCTTCATAACGTTGCCTAGATCA，或
c)包含具有碱基序列AACG TTCTTCGGGG CGTT的寡脱氧核糖核酸序列，
d)所述寡脱氧核糖核酸序列具有40至1,600个核苷酸的长度。
3.根据前述权利要求所述的分子，其特征在于特征c)的碱基序列被包含于以下序列中：
CCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGG
CGTTCTTAGGTGGTAACCCCTAGGGGTTACCACCTTCA
TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC。
4.根据前述权利要求任一项所述的分子，其特征在于所述分子包含部分单链的共价闭合的脱氧核糖核苷残基链。
5.根据前述权利要求任一项所述的分子，其特征在于所述分子包含N1N2CGN3N4碱基序列，其中N1N2是来自GT、GG、GA、AT或AA的基元，N3N4是来自CT或TT的基元，并且C是脱氧胞苷，G是脱氧鸟苷，A是脱氧腺苷，而T是脱氧胸苷。
6.根据前述权利要求任一项所述的分子，其特征在于碱基序列N1N2CGN3N4位于闭合脱氧核糖核苷残基链的单链区内。
7.根据前述权利要求任一项所述的分子，其特征在于一个或多个取代基经共价键连接于所述分子。
8.根据权利要求7所述的分子，其中所述的取代基选自肽、蛋白质、糖类、抗原结构、DNA和/或RNA之一。
9.一种联合剂，其特征在于该联合剂包含根据权利要求1-6任一项所述的分子和化疗药。
10.根据前述权利要求所述的分子，其特征在于：所述化疗药选自抗体、烷化剂、铂类似物、嵌入剂、抗生素、有丝分裂抑制剂、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物和/或L-天冬酰胺酶、羟基脲、米托坦和/或鹅膏蕈碱。
11.根据前述权利要求任一项所述的联合剂，其特征在于所述烷化剂选自包括以下物质的组：
-氮芥类衍生物，尤其
-环磷酰胺，
-异环磷酰胺，
-曲磷胺，
-美法仑，和/或
-苯丁酸氮芥，
-烷基磺酸酯，尤其
-二甲磺酸丁酯，和/或
-丁四醇磺酯，
-亚硝基脲，尤其
-亚硝基脲氮芥，
-环己亚硝基脲，
-嘧啶亚硝基脲，
-雌氮芥，和/或
-链脲霉素，
-甲基苄肼和达卡巴嗪，
-替莫唑胺，和/或
-塞替派。
12.根据前述权利要求任一项所述的联合剂，其特征在于所述铂类似物选自包括以下物质的组：
-顺铂，
-卡铂，和/或
-奥沙利铂。
13.根据前述权利要求任一项所述的联合剂，其特征在于所述嵌入剂选自包括以下物质的组：
-蒽环类，尤其：
-多柔比星(阿霉素)，
-柔红霉素，
-表阿霉素，和/或
-伊达比星，
-米托蒽醌，
-胺苯吖啶，和/或
-去氧氟尿苷。
14.根据前述权利要求任一项所述的联合剂，其特征在于所述抗生素选自包括以下物质的组：
-博莱霉素
-放线菌素D(更生霉素)，和/或
-丝裂霉素。
15.根据前述权利要求任一项所述的联合剂，其特征在于所述有丝分裂抑制剂选自包括以下物质的组：
-长春花生物碱，尤其
-长春瑞滨，
-长春新碱(安可平)，
-长春花碱和/或
-长春地辛。
16.根据前述权利要求任一项所述的联合剂，其特征在于所述紫杉烷类选自：
-紫杉醇，和/或
-多西他塞。
17.根据前述权利要求任一项所述的联合剂，其特征在于所述拓扑异构酶抑制剂选自包括以下物质的组：
-拓扑异构酶I抑制剂，尤其
-喜树碱，
-托泊替康，和/或
-伊立替康，和/或
-拓扑异构酶II抑制剂，尤其
-足叶乙甙，
-替尼泊苷。
18.根据前述权利要求任一项所述的联合剂，其特征在于抗代谢物选自包括以下物质的组：
-叶酸拮抗剂，尤其
-甲氨蝶呤，
-嘧啶类似物，尤其：
-5-氟尿嘧啶，
-卡培他滨，
-胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)，和/或
-吉西他滨，
-嘌呤类似物，尤其
-6-硫代鸟嘌呤，
-喷司他丁，
-硫唑嘌呤，
-6-巯基嘌呤，
-氟达拉滨，和/或
-克拉屈滨。
19.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-6任一项所述的分子和/或根据权利要求7-17任一项所述的联合剂和任选地有关组合该试剂盒的内容物的信息。
20.根据权利要求1-6任一项所述的分子和根据权利要求6-17任一项所述的联合剂，其用作药物。
21.一种药用剂，其包含根据权利要求1-6任一项所述的分子和/或根据权利要求7-17任一项所述的联合剂，任选地连同可药用载体。
22.根据权利要求1-6任一项所述的分子、根据权利要求7-17任一项所述的联合剂、根据权利要求20所述的药用剂的用途，用于制备调节人或动物免疫系统或者调节所述免疫系统活性的药剂。
23.根据前述权利要求所述的用途，其特征在于所述的调节为刺激或增强所述免疫系统的活性。
24.根据前述权利要求所述的用途，其特征在于刺激包括T细胞介导的或不依赖T细胞的免疫应答。
25.根据前述权利要求所述的用途，其特征在于所述的免疫应答包含B细胞增殖和/或B细胞活化。
26.根据前述权利要求任一项所述的用途，其特征在于对免疫系统的刺激包括细胞因子的分泌。
27.根据前述权利要求任一项所述的用途，其特征在于根据权利要求1-6任一项中所述的分子和/或根据权利要求7-17任一项中所述的联合剂用作治疗性或预防性接种中的佐剂。
28.根据权利要求1-6任一项所述的分子、根据权利要求6-7任一项所述的联合剂以及根据权利要求20所述的药用剂的用途，用于制备治疗细胞生长疾病的药剂。
29.根据前述权利要求任一项所述的用途，其特征在于所述的细胞生长疾病是肿瘤病。
30.根据前述权利要求所述的用途，其特征在于肿瘤病选自包括以下疾病的组：耳-鼻-喉部位肿瘤，其包括内鼻、鼻窦、鼻咽、唇、口腔、口咽部、喉、下咽部、耳、唾液腺和副神经节的肿瘤；肺的肿瘤，其包括非小细胞性支气管癌、小细胞性支气管癌；纵隔的肿瘤；胃肠道的肿瘤，其包括食管、胃、胰脏、肝脏、胆囊及胆道、小肠、结肠与直肠癌和肛门癌；泌尿生殖道肿瘤，其包括肾、输尿管、膀胱、前列腺腺、尿道、阴茎和睾丸的肿瘤；妇科肿瘤，其包括宫颈、阴道、外阴的肿瘤、子宫癌、恶性滋养细胞疾病、卵巢癌、输卵管(Tuba Faloppii)肿瘤；腹腔肿瘤；乳腺癌；内分泌器官肿瘤，其包括甲状腺、甲状旁腺、肾上腺皮质的肿瘤、内分泌性胰腺肿瘤、类癌瘤和类癌综合征、多发性内分泌腺瘤；骨和软组织肉瘤、间皮瘤、皮肤肿瘤、黑素瘤，包括皮肤及眼内黑素瘤；中枢神经系统肿瘤；婴儿期肿瘤，包括视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经纤维瘤病、神经母细胞瘤、Ewing肉瘤肿瘤家族、横纹肌肉瘤；淋巴瘤，其包括非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、中枢神经系统原发性淋巴瘤、霍奇金病；白血病，包括急性白血病、慢性髓细胞性白血病和淋巴细胞性白血病、浆细胞瘤、脊髓增生异常综合征；副肿瘤性综合征、原发灶不明的肿瘤转移(CUP综合征)；腹膜癌病；免疫抑制相关性恶性肿瘤，其包括AIDS相关恶性肿瘤如卡波西肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、中枢神经系统AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关性霍奇金病和AIDS相关性肛殖肿瘤；移植相关性恶性肿瘤；转移肿瘤，包括脑转移、肺转移、肝转移、骨转移、胸膜和心包转移，以及癌性腹水。
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