CN102382813A - 一种针对液相非纯化复合靶标的电泳凝胶阻滞-selex技术方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对液相非纯化复合靶标的电泳凝胶阻滞-SELEX技术方法的建立和应用。具体是将非纯化的靶标与单链寡核苷酸文库在液相中孵育，利用电泳凝胶阻滞的原理，通过消减筛选，获得针对筛选样品与消减样品中差异成分的特异寡核苷酸适配子，用作靶标的检测与功能抑制等。获得的寡核苷酸适配子还可用于鉴定和发现疾病相关的分子标志物。

Description

一种针对液相非纯化复合靶标的电泳凝胶阻滞-SELEX技术方法

发明领域：

本发明涉及一种针对液相非纯化靶标的电泳凝胶阻滞-SELEX技术方法的建立和应用，具体是将非纯化的靶标与文库在液相中孵育，利用凝胶阻滞(EMSA)的原理，通过消减筛选，获得针对筛选样品与消减样品中差异成分的寡核苷酸适配子，用于靶标的检测与功能抑制等，例如特定疾病包括肿瘤的检测、辅助诊断、治疗等。获得的寡核苷酸配基还可用于鉴定疾病状态相关的分子标志物，如肿瘤标志物。

背景技术：

指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(Systematic Evolution of Ligands byEXponential Enrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。其原理是利用单链随机寡核苷酸(包括单链DNA和RNA)三维结构灵活易变并易与各种靶标分子结合，形成具有很强结合力复合物的特点，将人工构建合成的单链随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留特异结合的寡核苷酸并经PCR扩增、富集、然后制备成富集的单链文库再与靶分子重新相互作用，如此经反复数个循环，即可筛选获得与该靶子特异结合的寡核苷酸配基(aptamer)(Tuerk C，et al.Science1990；249：505-510)。aptamer具有精确识别、亲和力高、易体外合成与修饰等特性，因此在抗体涉及的领域几乎均可用aptamer代替，在分析化学、基因调控、蛋白质组研究、疾病治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景(邵宁生等，生物化学与生物物理进展2006；33：329-335)。从最初的单一靶标的筛选到后来的从混合体系中筛选某一类已知或未知靶分子的寡核苷酸配基，SELEX显示出了其独特的应用价值。尤其是近年来兴起的复合靶子的SELEX技术，使得人们在能够在不知道靶分子的性质的情况下而对其进行识别成为可能。这种可以不需要完全研究了解靶物质的完整结构，就可以筛选任何状态下的靶物质，甚至可以通过筛选获得的配基来研究复合靶标的分子标志，为生物标志物的鉴定提供了新的思路。

随着SELEX技术方法和研究进展的突飞猛进，涌现出了多种改良SELEX技术。我们实验室一直致力于改良SELEX方法的建立与应用方面的研究，在建立以完整细胞为靶子的消减SELEX基础上(Wang C，et al.J Biotechnol；2003：102：15-22)，继续建立了组织切片SELEX技术(Li S et al.J Pathol；2009，218：327-36)。这些方法的建立为生物标志物的发现、鉴定以及疾病的诊断、靶向治疗提供了基础。但对于多数疾病，早期、敏感的血清学诊断方法是临床迫切需求的，要发展血清学生物标志物及分子探针的研究，除了利用蛋白质组学的技术方法，针对液相标本的消减SELEX技术方法将提供有效的技术补充。因此，本实验将以大肠杆菌诱导表达的含目的蛋白及多种大肠杆菌蛋白的超声上清为靶标模型，利用凝胶阻滞(EMSA)原理分离结合和游离的单链寡核苷酸，建立一种新的液相非纯化靶标的消减SELEX技术方法，即EMSA-SELEX技术方法。

本技术方法是利用凝胶阻滞的方法，将液相标本与单链核酸文库孵育，通过将孵育后的复合物经过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳达到分离结合核酸与游离核酸的目的，通过消减靶标的阴性筛选，最终获得与目的靶子结合的适配子。该发明所述方法可以在医学领域得到广泛应用，包括筛选获得特定疾病的体液标本或血液标本的分子识别探针——aptamer，以及利用aptamer钓取相应的分子标志物，获得的疾病特异aptamer还可以用于靶标分子的检测，以及作为靶标分子或靶标分子特定结构域的功能抑制剂。

发明内容：

本发明目的在于建立一种基于凝胶阻滞的分离技术，以液相的复合靶子标本为靶的消减SELEX方法，并提出该技术方法在临床疾病辅助诊断和鉴定疾病相关分子标志物等方面的应用。

本发明通过以下技术方案建立：首先建立筛选靶与消减靶的模型，以某一融合蛋白的基因工程大肠杆菌诱导表达后超声上清为筛选靶，以标签蛋白的基因工程大肠杆菌诱导后超声上清未消减靶；人工合成的单链DNA寡核苷酸文库；利用凝胶阻滞的原理，对样品进行消减SELEX筛选；经过数十轮筛选，筛选靶标与消减靶标之间的差异成分的寡核苷酸适配子得到富集，对富集的寡核苷酸文库进行鉴定；对富集的文库进行随机测序；挑取数条序列，经化学合成，然后鉴定与靶标结合的特异性，获得单个的特异适配子；对于差异成分未知的样品，通过特异寡核苷酸适配子亲和钓取其结合的靶分子，联合生物质谱鉴定，即可鉴定样品中的差异成分，为生物标志物的鉴定提供新的思路。

本发明优点：

1)本发明以液相的复合靶子为靶进行消减SELEX筛选，适合筛选难以纯化的靶标、要求靶标保持空间构像的样品、以及未知靶标的液相标本的筛选，如血液、唾液、尿液等临床标本的筛选。

2)通过凝胶阻滞分离，可以将结合的寡核苷酸与游离的寡核苷酸有效分离，缩短了筛选轮次。

3)通过引进消减筛选，可以获得针对两类不同来源标本中未知的差异成分的特异适配子，也可以获得针对靶标分子异构体或特定结构域的适配子。

4)利用获得的特异寡核苷酸适配子，可以亲和钓取鉴定未知的靶分子，为生物标志物的鉴定提供了新的思路。也可以利用获得的特异寡核苷酸适配子检测靶分子，或阻断靶标的生物功能。因此，本发明所建立的方法在基础研究、临床医学领域具有广泛的应用价值。

附图说明：

图1：本发明所用的筛选靶标与消减靶标的10％SDS-PAGE分析。其中，1、含消减靶标的未纯化大肠杆菌表达后超声上清；2、含筛选靶标的未纯化大肠杆菌表达后超声上清；3、低分子量蛋白标准；

图2：筛选后文库的鉴定。其中，a.文库与未纯化靶标及消减靶标的结合；b.第10轮富集文库与纯化后消减靶蛋白及不同量的靶蛋白的结合。

具体实施方式：

下面通过以大肠杆菌表达的含目的融合蛋白的未纯化超声上清为靶标，以含标签蛋白的未纯化超声上清为消减靶标，进行消减SELEX筛选，以及对获得的富集文库的鉴定来进一步描述本发明。

1.合成随机单链DNA寡核苷酸文库和相应的引物

GP35文库：

5’-GCAATGGTACGGTACTTCC(35N)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’

引物：

正义引物(Plong-1)：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’

反义引物(P11)：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3

反义引物(Pstem-loop)：

5’-GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’注：N代表A、T、G、C任意一种。

Plong-1与P11用于扩增双链产物，Plong-1与Pstem-loop用于扩增单链产物。

上述单链DNA(ssDNA)均由上海生工公司合成。

2.利用大肠杆菌表达靶分子蛋白

2.1利用基因重组的方法，构建含目的蛋白——葡糖基转移酶(Glucosyltransferase，GTF)催化区(Catalytic，CAT)基因的原核表达质粒，5’端融合NusA标签蛋白基因以促进蛋白可溶性表达。同样的方法构建仅表达NusA标签蛋白的原核表达质粒。

2.2重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，常规IPTG诱导表达，收集表达菌体，超声破碎，离心后分别获得含有目的蛋白NusA-CAT及NusA对照蛋白可溶性表达超声上清；该部分未纯化上清作为筛选靶标及消减靶标。

2.3利用载体上含有的重组蛋白C端的His标签对诱导表达后的超声上清进行纯化，获得纯化的rNusA-CAT蛋白和NusA蛋白便于筛选后适配子的鉴定。

3.基于EMSA分离的消减SELEX筛选

3.1将一定浓度的ssDNA文库溶解于合适体积的三蒸水中，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却(第1轮筛选ssDNA文库的用量为1,500pmol，以后每轮筛选的投入量递减)；

3.2将ssDNA文库与NusA蛋白的未纯化上清在37℃共孵育2h，使ssDNA文库与消减靶充分作用；

3.3ssDNA文库与蛋白的共同孵育体系加入10X上样缓冲液，6％天然PAGE分离；

3.4卸胶，核酸染色后置于紫外灯下观察。对照GP35的原库的位置，将这一位置的胶回收，经凝胶洗脱缓冲液洗脱6h以上后，乙醇沉淀回收。

4.基于EMSA分离的阳性筛选

4.1将消减文库用筛选缓冲液溶解，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；

4.2文库与含rNusA-CAT蛋白的诱导表达菌体超声上清在37℃共孵育2h(随着筛选轮数的增加可适当减少孵育时间，以增加筛选配基的亲和力和特异性)，使消减文库与筛选靶充分作用；

4.3将孵育体系进行6％的天然PAGE分离；

4.4卸胶，核酸染色，置于紫外灯下观察。对照GP35的原库的位置，将高于这一位置以上的胶切胶(由于ssDNA与蛋白相结合后泳动速度变慢，所以高于GP35的位置)，经凝胶洗脱缓冲液洗脱6h以上后，乙醇沉淀回收。

5.结合文库的扩增

5.1将乙醇沉淀回收到ssDNA用适量的水溶解后，加入PCR反应体系直接扩增；

5.2PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，37℃退火80sec，58℃延伸1min，扩增3个循环；最后58℃终延伸5min。

5.3再次PCR确定最终扩增循环数：取10ul上述PCR产物为模板，再次PCR扩增，从12个循环开始，每3个循环取样，8％7M尿素胶分析。选择目标条带PCR产量大、无杂带的循环数为合适循环数，将剩余90ul PCR产物全部扩增。

5.4将全部扩增的PCR产物通过8％7M尿素胶回收，凝胶洗脱缓冲液洗脱后再乙醇沉淀回收，核酸定量仪确定ssDNA的量，用于下一轮的筛选。

6.重复n轮筛选(步骤3-5)

7.放射性同位素检测文库的富集情况

7.1利用T4多核苷酸激酶的末端转移反应将富集文库标记放射性同位素，按试剂盒说明书操作。

7.2将标记好的ssDNA文库置于沸水中煮2-3min，然后冰水浴10min备用；

7.3文库与筛选靶标及消减靶标共同孵育，同前进行凝胶阻滞实验，将胶进行磷屏显影。

7.4富集程度最好的文库与不同浓度的纯化蛋白进行EMSA结合实验。

实验结果：

通过建立的基于EMSA分离的消减SELEX筛选，获得了特异识别融合蛋白中CAT结构域的富集文库。因此，该方法能够从两组液相标本中筛选针对差异成分的寡核苷酸适配子。利用富集的文库还可以对差异成分进行钓取鉴定。

由图2可以得到结论：筛选靶标与消减靶标的差异成分在于前者为重组的融合蛋白，后者为标签蛋白，两者其余的菌体蛋白成分大致相同。

由图3可以得到结论：经过筛选后，第5轮文库、第10轮文库均有富集，第10轮文库富集程度最高。且第10轮富集文库与不同浓度的融合蛋白呈现剂量相关的结合，与标签蛋白无结合，说明富集文库仅结合筛选靶标中差异的CAT结构域。

Claims (6)

1.一种针对液相非纯化复合靶标的电泳凝胶阻滞-SELEX技术方法，其特征是利用电泳凝胶阻滞与SELEX技术结合的原理，针对液相未纯化差异靶标进行消减筛选，获得特异识别差异靶标的特异寡核苷酸适配子。

2.根据权利要求1中所述方法，筛选的靶标可以是大肠杆菌诱导表达后超声上清。

3.根据权利要求1中所述方法，筛选的靶标可以是细胞培养上清或提取的细胞组份。

4.根据权利要求1中所述方法，筛选的靶标可以是血清样品、体液样品、组织提取成分等。

5.根据权利要求1中所述方法，SELEX筛选采用的可以是单链DNA文库，也可以是RNA文库或修饰后的DNA或RNA文库。

6.权利要求1中所述方法在生物医药领域中的应用，包括靶标分子的钓取、检测、纯化和功能抑制剂的筛选。

Images