CN104818278A - 能够特异性结合胃癌细胞中的ts/mdep蛋白的适配子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向人TS/MDEP蛋白的核酸适配子及其序列。本发明应用新的组合化学技术SELEX，以TS/MDEP蛋白为靶蛋白，从单链RNA随机文库中筛选出了能与TS/MDEP蛋白特异性结合的DNA适配子。所述适配子在其随机序列区域能形成特殊的茎环结构，能特异性、高亲和力地结合TS/MDEP蛋白或靶向结合至胃癌细胞。该RNA适配子为胃癌诊疗领域提供了一种特异高效的标记分子，并为开发胃癌诊断试剂与治疗药物提供了新的选择。

Description

能够特异性结合胃癌细胞中的TS/MDEP蛋白的适配子

技术领域

本项发明属生物检测领域。

背景技术

核酸适配子(aptamer)是一种生物大分子的人工单链寡核苷酸配体,通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。SELEX技术（即系统进化指数富集技术）是20世纪90年代初研制/发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的核苷酸适配子（aptamers)。该技术己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、 蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肤/肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本。b.具有比抗体更高的亲和性和特异性。c.便于标记，可以在不同部位有选择性的标记。d.重复性好， 稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子/SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX技术是识别癌与非癌细胞间微小差异、 筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。

核酸适配子筛选的基本步骤如下:设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗脱寡核酸，以洗脱的寡核酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育-洗脱-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将从文库中筛选出来并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及两端序列与文库相符者即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。

    世界上与肿瘤相关的疾病中，胃癌占第二位，并且是亚洲人群中最常见的 恶性肿瘤，严重的危害着人类的健康。人们期望能阐明胃癌的发生发展机制， 从而有效的预防和治疗这一恶性肿瘤。尽管大量的研究证实胃癌的发生与多 种因素有关包括寸大食、环境以及细菌或病毒感染，如幽门螺旋杆菌的感染， 近年来分子机制研究发现众多基因参与胃癌的发生发展，如E-cadherin表达 的缺失、p53基因、TGF-0、 c-met、 erbB-2和RUNX3等，这些研究解释了胃 癌部分发病机制，对于胃癌的详细的分子发病机制我们还知之甚少。

与正常细胞相比，肺瘤细胞的最根本的特征之一就是细胞周期调控异常， 正常细胞向恶性细胞转化过程中，多基因变异积累赋予了肿瘤细胞特有的功 能，如肿瘤细胞产生许多自身的生长因子，对于抑止细胞生长的信号不敏感，逃避凋亡，具有无限的复制潜能，均能归结到变异的基因导致细胞周期调控异常，特别是细胞周期checkpoint异常，从而赋予肿瘤细胞失控性生长的特性。现有技术中，比如CN101168566A公开了TS/MEDP蛋白在M期的BGC823 中表达最高，随着细胞分裂的完成，其表达量逐渐降低。更重要的是在配对 的胃癌组织中表达，而正常胃粘膜中未见表达，还证实TS/MEDP基因在多种 细胞增殖旺盛的胚胎组织中表达，因此TS/MEDP基因在组织中具有如下表达 特征：TS/MDEP在细胞增值旺盛的胚胎组织高表达，成年后组织细胞中此基 因被关闭，在肿瘤细胞中又出现高表达，符合癌基因的表达规律。因此，鉴定该蛋白的表达量的多少，对于预测胃癌具有较高的利用价值。 

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA适配子，能够特异性结合胃癌细胞中的TS/MDEP蛋白，可以来实现胃癌治疗药物运送的靶向性，可用于胃癌的诊断与治疗。

本发明采用以下技术方案：

体外合成一个含有38个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库；采用酵母表达的方法体外表达丁型肝炎病毒表面蛋白，以其为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的表面抗原特异性RNA适配子；通过结构预测软件RNA Structure Program分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了多个与表面抗原亲和力高、 特异性强的适配子。所述的适配子都能形成各自的特异茎环结构。所述适配子能特异性、高亲和力地结合胃癌TS/MDEP蛋白。所述适配子序列如下：

TS-002：CTCTCCTTAGACTATTACAATCTATTCATATGTTACAA

TS-005:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCTCCTTAGACTATTACAATCTATTCATATGTTACAATGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-006:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGATGACACATTAACCCTCCCTATCTCAAACAATTTCAAATGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-013:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTTCTCAATACAATATTCAAATTTCTATAACACTATCATGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-014:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGTCAATTCGCAAATTAACCTCCGCTCACACTACACCCACTGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-015:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCCGCACCTTATTAACACAACCTACCTTATTTCCTACACTGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-017:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGACATTACATAATACATTCATCCGCCAACACACCAACACTGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-019:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGACACCAACCACTCACTCTTCCTATTGTTTCACATATTCTGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-024:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCTCCACATACCTTTTTATCAAGAATATATAACAACCTGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-026:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGATATAAGAATACCCAACACCTCCTCTCCACTCCTAAATTGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-028:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCCTAGAATACAATCGCTCAAACTCTACCTAAAGATATGCATAAGGCATCATTGGAA

TS-030:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGTAGATCATACAATATCATTATTCCGCCTACATTCCAATTGCATAAGGCATCATTGGAA

本发明的有益效果： (1)获得了一种能够特异高效结合胃癌细胞中TS/MDEP蛋白的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。 (2)以核酸适配子为基础可以制备成为靶向胃癌细胞的诊断和治疗药物。

具体实施方式

  实施例I  TS/MDEP蛋白特异性结合DNA适配子的SELEX筛选

采用本领域常规的TS/MDEP蛋白表达的方法。根据已知的基因序列，通过常规基因合成或者基因组调取的方式来获得相应的基因序列，采用酵母表达的方法体外表达TS/MDEP蛋白，获得了相应的蛋白，命名为TS/MDEP。

化学合成初始寡核苷酸随机文库及引物，序列如下：(5′-GGTAACTAGCGTTACTGCTAG----N38----TGCATAAGGCATCATTGGAA-3′)，其中N38为38个随机寡核苷酸；

引物P1：GGTAACTAGCGTTACTGCTAG;

引物P2：TTCCAATGATGCCTTATGCA。

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。70 μ g RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA 分子，然后与2ug HiAg  37°C孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L尿素，0. 6mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0. 15% SDS)中煮沸4min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ 1 DEPC水中；以RNA为模板 RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。

实施例2  特异性高亲和力的TS/MDEP结合适配子的获得

将RNA适配子分别取1.5μ g，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37°C 消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA ；通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P]ATP于去磷酸化的 RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度（1-200nM)的TS/MDEP 37°C 孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与TS/MDEP的解离常数。结果如下：

名称	解离常数Kd
		TS-002	22nM
TS-005	27nM
		TS-006	25nM
TS-013	29nM
		TS-014	33nM
TS-015	21nM
		TS-017	19nM
TS-019	28nM
		TS-024	27nM
TS-026	22nM
		TS-028	33nM
TS-030	32nM
		PBS空白对照	无结合能力

 实施例3 所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，RASAL1蛋白，YAP蛋白，TRIM59蛋白与12条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与TS/MDEP结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.1ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。

序列表

 

〈110〉刘红卫

〈120〉能够特异性结合胃癌细胞中的TS/MDEP蛋白的适配子

〈160〉12

〈210〉1

〈211〉 38

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

 〈400〉TS-002

CTCTCCTTAGACTATTACAATCTATTCATATGTTACAA

 

〈210〉2

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-005

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCTCCTTAGACTATTACAATCTATTCATATGTTACAATGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉3

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-006

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGATGACACATTAACCCTCCCTATCTCAAACAATTTCAAATGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉4

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-013

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTTCTCAATACAATATTCAAATTTCTATAACACTATCATGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉5

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-014

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGTCAATTCGCAAATTAACCTCCGCTCACACTACACCCACTGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉6

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-015

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCCGCACCTTATTAACACAACCTACCTTATTTCCTACACTGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉7

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-017

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGACATTACATAATACATTCATCCGCCAACACACCAACACTGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉8

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-019

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGACACCAACCACTCACTCTTCCTATTGTTTCACATATTCTGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉9

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-024

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCTCCACATACCTTTTTATCAAGAATATATAACAACCTGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉10

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-026

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGATATAAGAATACCCAACACCTCCTCTCCACTCCTAAATTGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉11

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-028

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCCTAGAATACAATCGCTCAAACTCTACCTAAAGATATGCATAAGGCATCATTGGAA

 

〈210〉12

 〈211〉 79

 〈212〉DNA

 〈213〉人工序列

〈400〉TS-030

GGTAACTAGCGTTACTGCTAGTAGATCATACAATATCATTATTCCGCCTACATTCCAATTGCATAAGGCATCATTGGAA

 

 

Claims (4)

1.一种识别TS/MDEP蛋白寡核苷酸序列，其特征在于为包括SEQ ID No.1-12任一条序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。

2.权利要求1所示的寡核苷酸序列在检测胃癌中的应用。

3.权利要求1所示的寡核苷酸序列用于制备识别TS/MDEP蛋白的试剂盒应用。

4.权利要求1所示的寡核苷酸序列用于制备检测胃癌的试剂盒应用。